101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015 Département de biologie Collège Lionel-Groulx TABLE DES MATIÈRES Page 1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE 1 2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon 2 3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une gélose 3 4. COLORATION DE GRAM 4 5. LE MICROSCOPE A) Figure 5 B) Liste des parties 6 C) Utilisation 7 6. ENSEMENCEMENT D’UNE GÉLOSE PAR STRIATION (4 stries) 8 7. MILIEUX DE CULTURE A) Gélose nutritive 9 B) Gélose au sang 9 C) Gélose MacConkey 10 D) Gélose Mannitol-sel 11 E) Gélose Bacillus 12 F) Tubes TSI 13-14 8. TESTS ENZYMATIQUES A) Catalase 15 B) Oxydase 15 C) Coagulase 15 9. CULTURE ANAÉROBIE 16 10.ANTIBIOGRAMME 17-18 FICHES TECHNIQUES de bactériologie
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101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015
Département de biologie Collège Lionel-Groulx
TABLE DES MATIÈRES
Page
1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE 1
2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon 2
3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une gélose 3
4. COLORATION DE GRAM 4
5. LE MICROSCOPE
A) Figure 5
B) Liste des parties 6
C) Utilisation 7
6. ENSEMENCEMENT D’UNE GÉLOSE PAR STRIATION (4 stries) 8
7. MILIEUX DE CULTURE
A) Gélose nutritive 9
B) Gélose au sang 9
C) Gélose MacConkey 10
D) Gélose Mannitol-sel 11
E) Gélose Bacillus 12
F) Tubes TSI 13-14
8. TESTS ENZYMATIQUES
A) Catalase 15
B) Oxydase 15
C) Coagulase 15
9. CULTURE ANAÉROBIE 16
10. ANTIBIOGRAMME 17-18
FICHES TECHNIQUES de bactériologie
101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015
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1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE
COULEUR
COULEUR
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2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon
1. Flamber l’anse bactériologique dans la flamme du brûleur.
2. Laisser refroidir quelques secondes (10) près de la flamme.
3. Bien mélanger la culture par rotation (et non par inversion)
4. Flamber l’entrée du tube à chaque ouverture et fermeture.
5. Prélever une bouclée de bouillon.
6. Étaler le prélèvement à la surface de la lame à la grandeur d’un 10¢
Attention : flamber l’anse avant de la redéposer!
7. Laisser sécher (complètement) à l’air
8. Fixer les bactéries sur la lame en passant celle-ci rapidement
dans la flamme, 3 fois. Laisser tiédir quelques secondes après
chaque passage.
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3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une colonie sur gélose
1. Déposer une petite goutte d’eau sur une lame
2. Flamber l’anse bactériologique dans la
flamme du brûleur
3. Laisser refroidir quelques secondes (10), en
restant près de la flamme
4. Prélever un minuscule fragment d’une
colonie (effleurer à peine une colonie
suffira!). Attention, surveiller l’asepsie :
couvercle entrouvert et rester à proximité
de la flamme.
5. Étaler le prélèvement à la surface de la
lame en le dispersant dans la goutte d’eau.
Étaler à la grandeur d’un 10¢
Attention : flamber l’anse avant de la redéposer!
6. Laisser sécher (complètement) à l’air
7. Fixer les bactéries sur la lame en passant
celle-ci rapidement dans la flamme, 3 fois.
Laisser tiédir quelques secondes après
chaque passage.
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4. COLORATION DE GRAM
1. Couvrir le frottis bactérien de
cristal violet (colorant
primaire); attendre 1 minute.
2. Rincer avec un mince filet
d’eau ; faire «tomber» l’eau
un peu au-dessus du frottis et
non directement dessus.
3. Mettre l’eau iodée (lugol) ;
attendre 1 minutes.
4. Rincer avec un mince filet
d’eau.
5. Décolorer en couvrant
d’alcool ; attendre 30 sec.
6. Rincer avec un mince filet
d’eau.
7. Couvrir de safranine
(colorant secondaire) ;
attendre 1 minute.
8. Rincer avec un mince filet
d’eau.
9. Assécher doucement la lame :
égoutter et essuyer le dessous
de la lame à l’aide d’un papier
à lentille.
10. Observer la lame à l’huile à immersion (G : 1000 X)
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5. LE MICROSCOPE -- A) Figure
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5. LE MICROSCOPE -- B) Liste des parties
PARTIES MÉCANIQUES :
1. Base supporte tout l’appareil.
2. Potence bras recourbé par lequel on saisit l’appareil pour le transporter ; supporte le tube optique et la
platine.
3. Platine plateau sur lequel on dépose la préparation à observer ; elle est percée en son centre pour laisser
passer la lumière.
4. Valets dispositif servant à retenir la lame en place.
5. Chariot pièce métallique située sur la platine ; sert à déplacer la préparation (contrôlé par les vis de
déplacement du chariot).
6. Vis de déplacement permettent de déplacer le chariot (et donc la lame) ; l’une permet les déplacements
du chariot avant-arrière (haut-bas pour l’image) et l’autre les déplacements LATÉRAUX (gauche-droite).
7. Tube optique porte à ses deux extrémités les deux composantes du système optique : l’oculaire et les
objectifs.
8. Revolver pièce circulaire rotative reliée au tube optique et qui porte les objectifs ; permet de placer dans
l’axe optique du microscope l’objectif approprié.
9. Vis macrométrique commande le déplacement en hauteur rapide et visible de la platine ; permet une première mise
au point de l’objet à observer ; ne doit être utilisée qu’avec l’objectif à faible grossissement.
10. Vis micrométrique commande un déplacement en hauteur de la platine de très faible amplitude (mouvement
produit peu visible) ; sert à faire la mise au point fine.
11. Vis du condensateur permet d’ajuster la hauteur du condensateur, pour obtenir l’éclairage optimal ; attention, il s’agit
d’une grosse vis, pas d’une petite (ne touchez pas aux petites vis : le condensateur pourrait
tomber)!
PARTIES OPTIQUES :
12. Source lumineuse fixée sur la base, sous le condensateur ; vous pouvez régler son intensité
(lampe) (attention de ne pas envoyer TROP de lumière : c’est plus fatiguant pour les yeux et on perd des
détails!).
13. Condensateur système de lentilles situé sous la platine ; concentre les rayons lumineux pour augmenter la
clarté de l’image. Sa hauteur est réglable par une vis.
14. Diaphragme intégré dans le condensateur ; dose la quantité de lumière qui traverse l’objet ; contrôlé par un
petit levier qui se déplace latéralement (pas une petite vis : un levier!).
15. Objectif fixés sur le revolver, ils sont au nombre de quatre ; chacun est un système de lentilles pointé
vers l’objet à observer ; produisent des images agrandies de l’objet (4X, 10X, 40X, 100X).
16. Oculaire système de lentilles pointé vers l’œil de l’observateur ; il agrandit une nouvelle fois (10X)
l’image déjà agrandie par l’objectif et la transmet à l’œil.
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5. LE MICROSCOPE – C) Utilisation
10 AVANT D'OBSERVER
1. Allumer la lampe et régler à une intensité moyenne.
2. Centrer la lame au-dessus du rayon lumineux (vis de la platine).
3. Élever la platine au maximum (vis macrométrique).
(Condenseur remonté et diaphragme-iris ouvert)
20 MISE AU POINT AVEC LE PLUS PETIT OBJECTIF (4X ou 5X)
1. Sélectionner l'objectif.
2. Abaisser lentement la platine (vis macrométrique) jusqu'à l'obtention d'une image dans l'oculaire.
3. Ajuster la mise au point (vis micrométrique).
4. Choisir un point de l'image à grossir et l'amener au centre du champ visuel (vis de la platine).
30 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 10X
Répéter les 4 étapes précédentes.
40 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 40X
Répéter en n'utilisant que la vis micrométrique.
50 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF A IMMERSION (100X)
1. Déplacer l'objectif 40X sans amener complètement l'objectif 100X.
2. Déposer une goutte d'huile au centre de la lame (l’indice de réfraction de l’huile étant proche de celui du verre,
cette goutte minimise la réfraction et la perte de lumière lors de son passage entre la lame et la lentille de l’objectif).
3. Amener complètement l'objectif 100X.
4. Faire la mise au point avec la vis micrométrique.
TRUCS POUR AMELIORER LA CLARTE DE L'IMAGE?
1. Ajuster le réglage de l'intensité lumineuse (bouton de réglage de la lampe)
2. Ajuster la hauteur du condenseur. (vis du condenseur)
3. Ajuster le diaphragme-iris.
POUR RETROUVER UNE IMAGE PERDUE?
Recommencer avec le plus petit objectif! (sûr et rapide)
ESSENTIEL APRES UTILISATION DE L'IMMERSION:
Essuyer les objectifs 40X et 100X avec du papier à lentilles
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Strie 1 Série 1
Strie 2
Strie 3
Strie 4
Série 2
Série 3
Série 4
6. Ensemencement d’une gélose par striation (4 stries)
ISOLATION DE COLONIES
Après avoir prélevé aseptiquement un échantillon (près d’un brûleur, avec une anse bactériologique stérile)
1. Effectuer une striation continue (gauche) ou une série
de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au
même endroit. Refermer.
Flamber l’anse bactériologique.
2. Effectuer une 2e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 1ère
strie; ou une 2e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Refermer.
Flamber l’anse bactériologique.
3. Effectuer une 3e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 2e strie; ou une 3
e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Refermer.
Flamber l’anse bactériologique.
4. Effectuer une 4e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 3e strie; ou une 4
e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Incuber.
Colonies isolées après incubation
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7. Milieux de culture A) GÉLOSE NUTRITIVE Description Milieu de base utilisé pour cultiver et isoler les bactéries non exigeantes.
Utilisation Usages multiples, examen de l’eau, du lait, des aliments. Isolation de colonies en vue d’effectuer leur
description, des colorations ou divers tests.
Composition Formule par litre d’eau
Digestion pancréatique de gélatine (peptone)…… 5g
Extrait de bœuf…………………………………... 3g
Agar……………………………………………...15g Note : contrairement à la gélatine, l’agar est toujours
solide quand on incube une gélose à 37oC (point de fusion = 45oC)
pH = 6,8 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1369a.html
7. Milieux de culture B) GÉLOSE AU SANG – 5% mouton
Description Milieu de base légèrement enrichi (avec du sang de mouton) pour cultiver et isoler un large éventail de
bactéries non exigeantes.
Utilisation Utilisé de routine en santé humaine et animale pour isoler des bactéries et les différencier selon le type
d’hémolyse (α, β ou γ)
Composition Formule par litre d’eau
Extrait de tissu cardiaque ...……………………10,0g
Extrait de bœuf ………………………….8,5g
NaCl ……………………………………5,0g
Agar …………………………………………15,0g
Sang de mouton défibrinisé …………………………..50ml
pH = 6,8 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1601a.html
Interprétation Plusieurs bactéries sécrètent des hémolysines, des substances qui lysent les globules rouges.
Hémolyse β ou complète : les colonies sont entourées d’une zone claire et incolore; les globules
rouges sont lysés et l’hémoglobine dégradée en un composé incolore.
Hémolyse α ou partielle : l’hémoglobine est réduite en méthémoglobine et il y a alors une zone