次世代ワクチンとしての 経鼻インフルエンザワクチン...IgA抗体を誘導する経鼻ワクチンの開発研究 1）弱毒生ウイルスワクチン...

次世代ワクチンとしての経鼻インフルエンザワクチン

長谷川秀樹国立感染症研究所

感染病理部

第13回みちのくウイルス塾平成26年7月20日（日）

インフルエンザ

• インフルエンザウイルスによる急性呼吸器感染症。

• 38℃を超える発熱、頭痛、鼻汁、咽頭痛、咳、関節痛、筋肉痛等が特徴。

• 3日位の潜伏後に発症し、約1週間で軽快。

• 乳幼児、高齢者、基礎疾患を持つ人では肺炎などを、小児では脳症を併発し、最悪の場合、死に至る。

インフルエンザウイルスは上気道の上皮細胞に感染する。

A(H1N1)pdm09 H5N1(human) 季節性

気管上皮 ++ ? +

気管支・腺 + ? ++

細気管支 + + +++

肺胞上皮 - ~ ++++ +++ -

マクロファージ -~ ++ +++ ?

A(H1N1)pdm09、 H5N1、季節型インフルエンザ感染症剖検組織におけるNP抗原の検出

HE staining

InfA-NP

ウイルス レセプター 試薬（レクチン）

ヒトに感染するインフルエンザウイルス

(季節型）

[Neu5Ac(α2-6)Gal]-glycoprotein or glycolipid

SNASambucus nigraagglutinin

鳥インフルエンザウイルス

[Neu5Ac(α2-3)Gal]-glycoprotein or glycolipid

MAAMaackia amurensisagglutinin

インフルエンザウイルスと細胞レセプター

豚インフルエンザウイルス

α2-6 とα2-3の両方

次世代シークエンサーによるウイルスゲノム解析

解析手順

• 長野死亡例・左肺上葉 5 µg total RNA

• Invitrogen SuperScript choice systemで、２本鎖cDNAに合成

• イルミナDNAライブラリー(インサート長 300 bp)を作製

• 80 mer 解読

• 塩基精度の高い40〜50 merにトリミング

（念のため80 merまで解読するが、実質、50mer程度で十分）

• Euler-SRにてアセンブル → A/H1N1にヒットすることを確認

（アセンブル・コンティグではsegment両端の配列が繋がっておらず、mappingにて配列確定）

• maq0.71にて、A/Toronto/T0106/2009(H1N1)の配列に対し、40mer.fastqのリードをマッピング解析

40mer.fastq(no trimming): 9,475,890 reads

maq 0.71 [ref‐seq: A/Toronto/T0106/2009(H1N1) gb|CY045951.1 – 8.1 ]

segment 1 – 8 のコンセンサス配列を作製

blastn‐nt 解析

HAのアミノ酸置換

HA-major

HA-minor 2.3シアル酸（鳥型レセプター）に結合

2.6シアル酸（ヒト型レセプター）に結合

Kuroda et.al. PLoS One. 2010 Apr 23;5(4)

各気道部位から回収されたウイルスのレセプター結合部位（HA)の塩基配列の特徴

ヘマグルチニンの239番目のアミノ酸はレセプターとの親和性に重要

アスパラギン酸（239D） ヒト型レセプター(α2,6シアル酸）グリシン（239G） 鳥型レセプター (α2,３シアル酸）

扁桃

気管

左上肺D=G D＜G(鳥型）

D＞G(ヒト型）

＃Quasispeciesで感染＃気管ではヒト型が優位に＃肺胞領域では鳥型が優位に＃免疫組織化学での検出は肺胞領域中心

上気道（咽頭・喉頭・気管）

抗ウイルス剤免疫応答

抗ウイルス剤なし免疫応答 弱い

肺胞領域

増殖不可

Minorだった鳥型クローンが増殖

感染暴露

良く効くワクチンの開発

何故インフルエンザには次世代ワクチンが必要か？

・インフルエンザウイルス感染後の発症、重症化を

予防できるが感染防御するものではない。

・ワクチン株と流行株が一致したときには有効であるが、

株が一致しない場合には効果が低い。

・新型インフルエンザウイルスのパンデミックにおいては

流行株を予測することは不可能である。

・H5N1 沈降全粒子不活化ワクチン（アルミニウムアジュバント）は

発熱問題で小児に対し使用できない。

・ワクチン株と流行株の抗原性がかい離しており（特にH3）流行株に対するHI抗体価が上がりにくい。

感染阻止！！

流行株がワクチン株一致しない変異株場合にも

交叉防御能 (cross‐protection) がある。

予測不能な新型インフルエンザに対応できる！

良く効くインフルエンザワクチンとは！

局所及び全身の副反応の少ないワクチン！

自然感染によって誘導される免疫は、不活化ワクチンの注射によるものよりも、変異ウイルス感染に対する交叉防御能が高い。

（１９６０年代から知られていた事実）

IgA抗体を誘導する経鼻ワクチンの開発研究

１）弱毒生ウイルスワクチン２００３年、米国使用認可（＊２～４９歳の世代に限定して使用）。

２）経鼻不活化ワクチン経鼻不活化ワクチンの試み開始

●不活化ワクチンのみの経鼻投与ではIgA抗体の誘導効率が低い。

アジュバント併用経鼻不活化ワクチンの研究開始

良く効くワクチンへのヒント！

自然感染によって誘導されるIgA抗体が交叉防御の原因

粘膜表面での抗体応答

Mucosal epithelium

Lumen

Lamina propria

Secretory IgA antibody

Polymeric Ig receptor

IgA producing B cellIgG producing B cell

自然感染とワクチンによる抗体応答の違い

Secretory IgA Antibody

IgG Antibody

自然感染 経鼻ワクチン 皮下ワクチン

( weeks )0 4 6

1st 2nd

A/Vietnam/1194/2004(H5N1)

A/Hong Kong/483/97(H5N1)

A/Indonesia/6/2005(H5N1)経鼻

皮下

全粒子不活化ワクチン 1g : NIBRG14 A/Vietnam/1194/2004(H5N1)

アジュバント 10g : PolyI:PolyC12U (Ampligen®)

1000PFU / 2l

マウスでのH5N1 経鼻ワクチン

生存

率(%

)感染後の日数

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 日

経鼻

無皮下

100

80

60

40

20

0

ウイ

ルス

価(P

FU

/m

l)

10

100

1000

10000

1無 皮下 経鼻

鼻粘膜におけるウイルス量 感染後の生存率

鼻からウイルスが見つからない → 感染していない

ワクチン

感染そのものを予防！

ワクチン株と相同Ｈ５Ｎ１ウイルスによる攻撃感染

100000

10

100

1000

10000

1無 皮下 経鼻 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 日

経鼻

無皮下

10080604020

0

10

100

1000

10000

1

100000

無 皮下 経鼻 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 日

経鼻

無皮下

10080604020

0

異なるウイルス株に対しても効果あり！

鼻粘膜におけるウイルス量 感染後の生存率

生存

率(%

)

ウイ

ルス

価(P

FU

/m

l)

生存

率(%

)

ウイ

ルス

価(P

FU

/m

l)ワクチンベトナム株

感染インドネシア株

ワクチンベトナム株

感染香港株

流行するウイルス株の予測が外れても効く！

IgG antibody titer IgA antibody titer

Group No. Vaccination Mark Infection

1 #4616, #4617, #4618 IBCDC‐RG2 Ampligen 450 µg ●

2 #4620, #4621, #4622 IBCDC‐RG2 Ampligen 450 µg + CVP ▲ A/Indonesia/5/05

3 #4623, #4624, #4680 IBCDC‐RG2 Ampligen 900 µg ■

4 #4682, #4684, #4686 IBCDC‐RG2 CVP ×

5 #4871, #4872, #4878 none none A/Indonesia/5/05

カニクイザルでの経鼻ワクチン後の抗体応答

ヒトにおけるIgA抗体、分泌型IgA抗体の種類と構造

HCの種類でIgA1とIgA2が存在

血清中IgA抗体は単量体

粘膜上にはSCと結合した分泌型IgA抗体が存在

分泌型IgA抗体は二量体dIgAが主体

粘膜上には、二量体より大きい多量体pIgAも存在

結語

経鼻インフルエンザワクチンは粘膜上に分泌型IgA抗体を誘導し感染を阻止する。

鼻腔粘膜上に誘導される分泌型IgA抗体は交叉防御効果があり血中のIgG抗体と比較し変異ウイルスに対しても有効である。

不活化全粒子ワクチンの経鼻接種によりヒトにおいて血中に加え鼻腔粘膜上にインフルエンザウイルスを中和する抗体が誘導される。

経鼻ワクチンにより誘導される分泌型IgA抗体は二量体、四量体、更に多量体化しインフルエンザウイルスの中和に寄与している。

経鼻インフルエンザワクチンは鼻粘膜上に分泌型多量体IgA抗体を誘導する事によりインフルエンザウイルスに対する感染防御、交叉防御に寄与する。

謝辞

国立感染症研究所（感染病理部、インフルエンザウイルス研究センター）

相内 章鈴木 忠樹Elly van Riet

伊藤 良泉地 恭輔池田 千将中島典子

田村 愼一佐多徹太郎

倉田 毅浅沼 秀樹

小田切 孝人田代 眞人

一般財団法人 阪大微生物病研究会奥野 良信石川 豊数真鍋 貞夫五味 康行谷本 武史

東興薬品工業株式会社上下 泰造宮崎 隆

東京大学医科学研究所一戸 猛志

被験者のボランティアとして参加していただいた皆さん。

大学院生募集

東北大学大学院医学研究科

連携講座 感染症病理学分野（国立感染症研究所）

客員教授 長谷川 秀樹[email protected]