ý˻ϫ¶Ä¸ÐÃÄÀÏ · hij_^_ey_lky jy^hf h[sbo oZjZdl_jbklbd Wlh Z^]_ab\ghklv d dmevlmjZevghfm ieZklbdm Zdlb\gZyijhebn_jZpby wdkij_kkbyih\_joghklguofZjd_jh\ CD 105, CD 90,

1

Федеральное агентство научных организаций ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ISSN 2077- 6055

КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ

ВЫПУСК 34

CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2018

Федеральное агентство научных организаций ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ISSN 2077- 6055

КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ

ВЫПУСК 34

CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2018

2

ISSN 2077-6055 ДК 576.3, 576.4, 576.5, 576.8.097, М-54

Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Выпуск 34. Отв.

ред. М.С. Богданова. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2018 – 102 с.

Настоящий выпуск сборника содержит информацию об основных направлениях

фундаментальных и прикладных исследований на клеточных культурах.

Сборник «Клеточные культуры» (информационный бюллетень) предназначен для широкого

круга исследователей, работающих в области клеточной биологии, биотехнологии, вирусологии

и медицины.

Электронная версия настоящего выпуска помещена на сайте Института цитологии РАН

(Санкт-Петербург): http://www.cytspb.rssi.ru, http://www.incras.ru

Составитель и ответственный редактор: М.С. Богданова

Редакционная коллегия М.С. Богданова

Г.Г. Полянская

А.М. Кольцова

© Авторы статей, указанные в тексте, 2018

© Составление. Институт цитологии РАН, 2018

http://www.cytspb.rssi.ru/

3

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ХАРАКТЕРИСТИК ЛИНИЙ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫХ В КОЛЛЕКЦИИ

КУЛЬТУР КЛЕТОК ПОЗВОНОЧНЫХ (ОБЗОР)

Г.Г. Полянская

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург; [email protected]

Представлен обзор исследований, проведенных в Коллекции культур клеток позвоночных

Института цитологии РАН (КККП ИНЦ РАН) за период 2012-2017 гг. Проведен сравнительный

анализ характеристик вновь полученных линий мезенхимных стволовых клеток (МСК)

человека, выделенных из разных источников. Показано, что все линии имеют статус МСК. Тем

не менее, обнаружены количественные межлинейные различия по ростовым характеристикам,

по характеру репликативного старения и по кариотипической нестабильности. Причинами этих

различий могут быть: 1. эпигенетические факторы, связанные с условиями культивирования

или с микроокружением, в котором существовали эти клетки до помещения их в условия in vitro;

2. генетические факторы, связанные как с генетическими различиями между донорами, так и,

возможно, с изначальной генетической предрасположенностью конкретных линий МСК к

цитогенетической нестабильности.

Ключевые слова: коллекция клеточных культур, мезенхимные стволовые клетки человека,

репликативное старение, поверхностные маркеры, пролиферация, кариотипическая

нестабильность, дифференцировка.

Всесоюзная (Российская) коллекции клеточных культур (РККК) была создана в 1978 году

решением Государственного комитета Совета Министров СССР по науке и технике и

Президиума Академии наук СССР. Головной организацией был утвержден Институт цитологии

АН СССР. Центральным банком РККК была утверждена Коллекция культур клеток позвоночных

ИНЦ РАН (КККП ИНЦ РАН). Основоположником РККК был профессор Георгий Петрович Пинаев

(1929-2013). Таким образом, КККП ИНЦ РАН, как и другим подразделениям РККК, в 2018 году

исполняется 40 лет. В связи с этим хочется подвести некоторые итоги работы КККП ИНЦ РАН,

проведенной за последние несколько лет. Одним из важнейших направлений работы

коллекции является ее развитие, связанное, в основном, с получением новых коллекционных

клеточных линий.

mailto:[email protected]

4

Расширение фондов КККП всегда определялось запросами фундаментальных

исследований и практическими задачами здравоохранения. В связи с этим в последнее время

большое внимание уделяется получению и характеристике мезенхимных стволовых клеток

(МСК) человека. Сравнительное изучение характеристик, являющихся определяющими в

поддержании статуса МСК, а также других характеристик, ответственных за важнейшие

клеточные процессы, способствует углублению фундаментальных знаний о МСК человека. Это

важно, как для понимания механизмов биологических процессов в клетке, так и для

расширения возможностей использования МСК в регенеративной медицине. Надо подчеркнуть,

что МСК, являясь неиммортализованными, диплоидными клетками, служат наиболее

адекватной моделью для изучения биологических процессов в здоровом организме. Анализ

характеристик МСК человека, выделенных из разных источников, является весьма актуальной

проблемой. Важность таких исследований вытекает из особенностей взаимодействия МСК с их

конкретным микроокружением, характерным для определенной ткани. Происхождение или

источник получения МСК могут определять их функциональные характеристики. Источники

МСК можно условно разделить на постнатальные (взрослые), эмбриональные и

внезародышевые.

За последние 6 лет, нами были получены и охарактеризованы 12 линий МСК человека,

выделенных из разных источников (табл. 1) (1 – 7). В таблице 1 представлены названия всех

линий в порядке убывания возраста источника их получения.

Паспорта 8 линий представлены в каталоге КККП, а также в общем каталоге РККК,

расположенных на сайте ИНЦ РАН. В каталоги включены дополнительные характеристики

коллекционных клеточных линий, относящихся к КККП ИНЦ РАН. Так, в паспорта всех

коллекционных линий включены прижизненные микрофотографии, позволяющие

пользователям контролировать качество линий при самостоятельной работе с полученным

клеточным материалом. Также во все паспорта коллекционных линий человека, введен пункт:

ДНК профиль (STR), позволяющий аутентифицировать с помощью молекулярно-генетического

анализа каждую линию. Эта характеристика введена зарубежными Коллекциями клеточных

культур и является обязательной для коллекционных линий человека при условии публикации

экспериментальных результатов в большинстве рецензируемых зарубежных научных

журналах.

5

Таблица 1. Перечень линий мезенхимных стволовых клеток человека

Аббревиатура клеточной линии Полное название клеточной линии

Взрослые МСК

DF-1 Дермальные фибробласты (мезенхимные

стволовые клетки) из кожи век 37-летнего донора женского пола

DF-2 Дермальные фибробласты (мезенхимные

стволовые клетки) из кожи век 45-летнего донора женского пола

DF-3 Дермальные фибробласты (мезенхимные

стволовые клетки) из кожи век 53-летнего донора женского пола

FRSN Мезенхимные стволовые клетки из крайней

плоти трехлетнего ребенка

FRSN-1 Мезенхимные стволовые клетки из крайней

плоти 2.5 летнего ребенка

FRSN-2 Мезенхимные стволовые клетки из крайней

плоти 2.5 летнего ребенка

Эмбриональные МСК

FetMSC Мезенхимные стволовые клетки из костного

мозга 5-6 недельного эмбриона

M-FetMSC Мезенхимные стволовые клетки из мышцы

конечности 5-6 недельного эмбриона

SC5-MSC Мезенхимные стволовые клетки из линии

эмбриональных стволовых клеток (SC5)

SC6-MSC Мезенхимные стволовые клетки из линии

эмбриональных стволовых клеток (SC6)

Внезародышевые МСК

MSCWJ-1 Мезенхимные стволовые клетки из

Вартонова студня пупочного канатика

MSCWJ-2 Мезенхимные стволовые клетки из

Вартонова студня пупочного канатика

Обновленные электронные версии каталога КККП представлены на странице сайта ИНЦ

РАН – ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» (www.cytspb.rssi.ru/lab_ckp/ckp_lab_ru.htm и

http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog1_2017_with_figs_new.pdf), а также на сайте ИНЦ РАН

(www.cytspb.rssi.ru или www.incras.ru) в рубрике – «Коллекции и каталоги». Помимо русской

версии каталога на сайте ИНЦ РАН представлена английская версия КККП в рубрике

«Collections Сatalogs».

6

Далее рассмотрим более подробно полученные линии МСК человека (табл.1). Для всех

полученных клеточных линий подтвержден статус МСК. Согласно требованиям

Международного общества клеточной терапии, статус МСК разного происхождения

определяется рядом общих характеристик. Это адгезивность к культуральному пластику,

активная пролиферация, экспрессия поверхностных маркеров CD105, CD90, CD73, CD44, HLA

ABC и отсутствие экспрессии CD34, CD45 и HLA DR, способность к дифференцировке в

остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях (8, 9). Наличие или отсутствие

экспрессии поверхностных маркеров, подтверждающих статус МСК всех полученных линий,

представлен в табл. 2.

Таблица 2. Экспрессия поверхностных маркеров в клетках линий МСК, полученных в КККП

Маркер Аббреви- атура линии

CD44

CD73

CD90

CD105

CD34

CD45

HLA-ABC

HLA DR

DF-1 + + + + - - + -

DF-2 + + + + - - + -

DF-3 + + + + - - + -

FRSN + + + + - - + -

FRSN-1 + + + + - - + -

FRSN-2 + + + + - - + -

FetMSC + + + + - - + -

M-FetMSC + + + + - - + -

SC5-MSC + + + + - - + -

SC6-MSC + + + + - - + -

MSCWJ-1 + + + + - - + -

MSCWJ-2 + + + + - - + -

Примечание: знак «+» - наличие экспрессии; знак «–» - отсутствие экспрессии. Анализ

экспрессии преимущественно проведен на 6-8 пассажах после получения клеточных линий. Анализ экспрессии каждого антигена проведен на 3-4 экспериментах.

7

Надо отметить, что уровень экспрессии поверхностных маркеров CD105, CD90, CD73, CD44

стабильно высок во всех линиях. В большинстве линий он достигает 90.0% и выше.

Исключение составляет линия SC5-MSC, в которой уровень экспрессии CD90 значительно

ниже (около 60%), чем в других линиях, но, тем не менее, его присутствие не вызывает

сомнений. Возможно, что сниженный уровень экспрессии этих антигенов отражает иное

физиологическое состояние клеточной популяции по сравнению с остальными монослойными

клеточными культурами. Именно, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) растут

многослойными колониями, прикрепленными к культуральной поверхности. Для получения

МСК из ЭСК предварительно получают эмбриоидные тельца, то есть ЭСК проходят через

стадию клеточных сфероидов (3D) (1). Снижение уровня экспрессии CD90 в клеточных

сфероидах по сравнению с монослойной культурой также показано нами при анализе линий

FetMSC и M-FetMSC в 2D и 3D условиях (10). Есть и другие данные, свидетельствующие о том,

что уровень экспрессии поверхностных маркеров зависит от условий культивирования (11, 12).

Таким образом, по-видимому, колебания в экспрессии поверхностных маркеров связаны с

эпигенетическими изменениями. Но ряд полученных нами данных свидетельствует о

возможном влиянии генетических факторов на изменение уровня экспрессии поверхностных

маркеров. Так, показано снижение экспрессии антигена CD105 (78%) в линии MSCWJ-2, где

обнаружена высокая частота встречаемости клональной перестройки короткого плеча

хромосомы 7. Резкое снижение экспрессии антигена CD90 (15%) в линии SC6-MSC

коррелирует с устойчивым отсутствием одной Х хромосомы в кариотипе этой линии. В этих же

линиях имеет место снижение дифференцировочного потенциала (6, 7). Известно, что уровень

экспрессии поверхностных маркеров CD90 и CD105 связан, в частности, с процессами

дифференцировки (13). Тем не менее, в недавнем исследовании проведен протеомный анализ

белков, связанных с дифференцировочным процессом МСК, выделенных из разных

источников (14). Авторы убедительно показали, что, несмотря на количественное сходство

экспрессии поверхностных антигенов, характерных для МСК из разных источников, имеют

место различия между интенсивностью адипогенной, остеогенной и хондрогенной

дифференцировок МСК. Поэтому пока сложно установить коррелятивные отношения между

уровнем экспрессии поверхностных маркеров и другими характеристиками МСК.

Таким образом, несмотря на разные источники получения линий МСК, на разные

физиологические условия, созданные при варьировании условий культивирования, и даже на

8

некоторые генетические изменения, характеристики, подтверждающие статус МСК в целом

сохраняются. Таким образом, рассмотренные характеристики действительно являются общими

для МСК.

Есть еще ряд характеристик, которые встречаются во всех исследованных МСК. К ним

относятся, в частности, маркеры недифференцированных ЭСК. Причем в разных МСК может

иметь место экспрессия разных маркеров. В полученных нами линиях постоянно наблюдается

экспрессия маркера недифференцированных ЭCК – SSEA-4, уровень которой колеблется

между линиями (1–7). К настоящему времени получено много экспериментальных данных,

подтверждающих наличие экспрессии некоторых маркеров ЭСК в разных по происхождению

линиях МСК. Но пока эти данные находятся на этапе накопления без серьезных попыток

обобщения. В частности, показано, что МСК, выделенные из костного мозга и

экспрессирующие SSEA-4, имеют более высокую пролиферативную активность, чем МСК, не

экспрессирующие этот маркер (15). Показано, что транскрипционные факторы SOX2 и Oct-4

активно участвуют в процессах пролиферации и дифференцировки МСК, выделенных как из

эмбриональных, так и из взрослых тканей (16, 17). Отсутствие связи между стадией онтогенеза

и экспрессией Oct-4 показано также при увеличении его экспрессии в клеточных сфероидах по

сравнению с исходными монослойными культурами (10, 18). Наличие экспрессии маркеров

недифференцированных ЭСК в МСК разного происхождения, возможно, объясняет их

расширенный мультипотентный дифференцировочный потенциал (19). Это предположение

косвенно подтверждается нашими данными о наличии в МСК экспрессии маркеров ранней

дифференцировки ЭСК в производные трех зародышевых листков (1–7). Идентифицированы

следующие маркеры: альфа-актинин (маркер мезодермы), альфа-фетопротеин (маркер

энтодермы), тубулин или нестин (маркеры эктодермы). Наличие экспрессии этих маркеров в

МСК разного происхождения показано и в других исследованиях с использованием разных

методов (20–23). Механизмы взаимосвязи маркеров ранней дифференцировки с

функциональной деятельностью МСК пока неизвестны. Есть разные предположения

противоположного характера: либо эти маркеры связаны с дифференцировочной

пластичностью МСК, либо они связаны исключительно с эмбриональным происхождением МСК

(9, 20).

Линии МСК характеризуются еще рядом признаков, являющихся важнейшими для

жизнедеятельности клеток, но отражающих конкретные свойства определенной линии. К таким

9

характеристикам можно отнести ростовые характеристики: в частности, кривые роста, а также

кариотипические характеристики и репликативное старение неиммортализованных

диплоидных линий, к которым относятся МСК.

Таблица 3. Сравнительный анализ среднего времени удвоения клеточных популяций в

разных линиях МСК

Клеточная

линия

Среднее время

удвоения клеточной

популяции

DF-1 40.0 ± 1.0

DF-2 35.0 ± 0.3

DF-3 33.0 ± 1.6

FRSN 30.0±0.8

FRSN-1 36.9±0.2

FRSN-2 39.0±0.8

FetMSC 33.0±1.4

M-FetMSC 25.0±0.1

SC5-MSC 25.5±0.1

SC6-MSC 26.0±0.4

MSCWJ-1 26.8±0.8

MSCWJ-2 26.8±0.6

Примечание: среднее время удвоения клеточных популяций получены из 3-5 экспериментов. Из результатов этой таблицы следует, что среднее время удвоения, определенное на 6-8

пассажах, колеблется между линиями от 25 ч до 40 ч. В одном случае обнаружены

достоверные различия между линиями, выделенными из одного органа, но из разных доноров

(DF-1 DF-2 и DF3). В остальных случаях достоверных различий нет (MSCWJ-1 и MSCWJ-2;

SC5-MSC и SC6-MSC; FRSN1 и FRSN-2). Но имеют место достоверные различия между

линиями клеток, выделенных из разных тканей одного донора (FetMSC и M-FetMSC).

Возможно, что в данном случае повлияло разное микроокружение. По-видимому, на данный

параметр может влиять как микроокружение конкретной ткани, так, в некоторых случаях, и

генетические особенности донора. Обращает внимание уменьшение среднего времени

10

удвоения клеточных популяций, выделенных из ранних эмбриональных и внезародышевых

тканей по сравнению с взрослыми тканями: 27.1±1.4 % против 35.6±2.4 %. Но эти различия

хоть и достоверны, но невелики. Пока для серьезных выводов о связи между источником

получения МСК и временем удвоения клеточной популяции недостаточно экспериментальных

данных. Важно подчеркнуть, что при длительном культивировании до начала активного

репликативного старения, линии, активно пролиферирующие на 6-8 пассажах, ведут себя по-

разному. Процесс репликативного старения был исследован в 8 линиях: DF-1, DF-2 и DF3;

MSCWJ-1 и MSCWJ-2; SC6-MSC; FRSN1 и FRSN-2. Все линии вошли в фазу активного

репликативного старения, что подтверждает наличие ограниченного срока жизни этих линий,

свойственное неиммортализованным клеточным линиям (24–26). Но процесс репликативного

старения развивается в линиях по-разному. Рассмотрим линии, в которых была проведена

количественная оценка процесса по активности фермента β-галактозидазы (табл. 4).

Таблица 4. Динамика активности β-галактозидазы в процессе культивирования клеток 4-х

линий

Пассаж Доля клеток,окрашенных на β-гал, %

MSCWJ-1 MSCWJ-2 FRSN-1 FRSN-2

6 0.0 ±0.1 9.0 ± 0.7 9.0 ± 1.3 16.2 ± 1.5

9 _ 22.5 ±0.9 _ _

13 15.0 ±0.9 80.6 ±1.0 _ _

20 39.0 ±1.2 _ 21.4 ±1.8 19.3 ±1.8

25 36.0 ±1.2 _ _ _

26 _ _ 40.0 ±2.2 45.0 ±2.0

28 58.1 ±1.4 _ _ _

Примечание: даны средние значения и их ошибки при подсчете не менее 500 клеток в разных полях зрения на одну временную точку. β-гал - β-галактозидаза. Сравнительный анализ данных этой таблицы свидетельствует о том, что характер процесса

старения различается между линиями. Так, в линиях, полученных из внезародышевой ткани

разных доноров (MSCWJ-1, MSCWJ-2) различия связаны с более ранним началом старения в

линии MSCWJ-2 и с ранним наступлением активного старения со значительно большей долей

11

стареющих клеток по сравнению с MSCWJ-1 (7). В линиях, выделенных из крайней плоти двух

доноров одного возраста, также наблюдаются различия, но не такие существенные. Именно, в

линии FRSN-2 уже на 6 пассаже процесс старения идет активнее, чем в FRSN-1. Далее процесс

в FRSN-2 приостанавливается, а в FRSN-1 он равномерно усиливается от 6 до 26 пассажа. В

FRSN-2, остановившись на средних пассажах, процесс старения активизируется к 26 пассажу,

догнав по доле стареющих клеток FRSN-1. Причем индекс пролиферации (ИП) FRSN-2 в

процессе старения существенно ниже, чем в FRSN-1 (5).

Учитывая, что в обоих случаях источник получения клеток находится на одинаковой стадии

онтогенеза, можно предположить, что различия связаны с генетическими особенностями

полученного клеточного материала. Косвенным подтверждением этому могут служить данные,

полученные при качественном анализе активности β-галактозидазы в трех линиях дермальных

фибробластов (DF-1, DF-2 и DF3), выделенных из доноров разного возраста. Так, показано, что

все 3 линии не проявляют признаков старения на 20 пассажа, а вступают с фазу активного

старения на 25 пассаже. При этом отмечено, что единственное различие, которое было

обнаружено при сравнительном анализе ростовых характеристик, относится к увеличению

среднего времени удвоения клеток линии DF-2 на 20 пассаже по сравнению с 6 пассажем: 49.7

± 0.7 против 35.0 ± 0.9. Остальные 2 линии не показали различий между 6 и 20 пассажем по

этой характеристике (3). Этот результат нельзя связать ни с возрастом донора (43 года), ни с

количеством удвоений клеточной популяции (42 удвоения против 48 и 44 у 2-х других линий).

Возможно, что это связано с генетическими особенностями конкретного донора.

Обращает внимание феномен различий между разными линиями МСК на раннем 6 пассаже:

от 0.0% в линии MSCWJ-1 до 16,2% в линии FRSN-2. Таким образом, процесс репликативного

старения специфичен для конкретной линии МСК, что может быть связано с разными

причинами, но, безусловно, не исключает и генетические различия.

Наглядным примером может служить линия MSCWJ-2 (7). Так, в линии MSCWJ-2

обнаружены корреляции между часто встречающейся (39 %) клональной хромосомной

перестройкой (перестройка, встречающаяся более, чем в одной клетке) на раннем пассаже и

ранним репликативным старением с большой долей стареющих клеток, значительным

снижением индекса пролиферации (ИП) при длительном культивировании, уменьшением

уровня экспрессии маркеров недифференцированных ЭСК, снижением дифференцировочного

потенциала. Следует отметить, что на позднем 13 пассаже этой перестройки не обнаружено.

12

Проведенный структурный кариотипический анализ в полученных линиях на 6–8 пассажах

свидетельствует, что в ряде линий встречаются, преимущественно, неклональные

хромосомные перестройки (перестройка, встречающаяся в одной клетке) в небольшом

количестве, не доходящем до 10 %. Помимо рассмотренной хромосомной аберрации в линии

MSCWJ-2, надо обратить внимание на линии DF-1, DF-2 и DF3 (3). В двух линиях из 3-х со

значительной частотой обнаружены клетки с неклональными хромосомными перестройки: в

DF-1 – 13.3%; в DF-3 – 26.7%. Анализ кариотипической структуры МСК большого числа доноров

разного возраста, позволил сделать вывод, что причиной наблюдаемой нестабильности, по-

видимому, являются, главным образом, различия между донорами, хотя нельзя исключить и

возрастную зависимость (27). Наши результаты не позволяют сделать окончательный вывод в

пользу одного из этих предположений. Именно, линия DF-1, полученная от 37-летнего донора

имеет существенную кариотипическую нестабильность, тогда как линия от 45-летнего донора

показывает стабильный кариотип. Но наибольшая кариотипическая нестабильность показана

для линии DF-3, полученной от 53-летнего донора. Следует подчеркнуть, что в большинстве

работ по анализу возрастного влияния на кариотипическую изменчивость, рассмотрены

доноры с большим, чем в нашей работе, возрастным разрывом – 20,30 – 60,70 лет. (28–31).

Следует подчеркнуть, что мы исследовали клетки на 6 пассаже, т.е. когда первоначальный

этап адаптации клеточной линии к условиям in vitro, связанный с возможным повышением

хромосомной нестабильности, уже прошел (27).

Тем не менее, в настоящее время нет предельных критериев для использования в

регенеративной медицине клеточных культур с повышенным уровнем неклональных

перестроек. Есть допустимый критерий только для клеточных линий, имеющих клональные

хромосомные перестройки. Международное общество клеточной терапии и Рабочая группа по

клеточным продуктам рекомендуют исключать клеточные культуры, имеющие 10 % и более

клональных хромосомных нарушений при анализе минимум 20 клеток, используя метод

дифференциального G-окрашивания хромосом (32–34). Тем не менее, выявленная

значительная хромосомная нестабильность в линиях DF-1 и DF-3 может являться признаком

кариотипической нестабильности, который при дальнейшем культивировании может

обеспечить промежуточные этапы канцерогенеза (35). В нашем исследовании косвенным

подтверждением дальнейшего усиления кариотипической нестабильности могут служить

данные о том, что при просмотре 100 клеток DF-1 появляется клональная хромосомная

13

перестройка (3). В приведенных примерах, кроме линий MSCWJ-1 и MSCWJ-2, не был

проведен кариотипический анализ при длительном культивировании. Поэтому о судьбе

обнаруженных аберраций в процессе культивирования и старения клеточных популяций судить

нельзя. Пока только для линии MSCWJ-2 показано исчезновение клональной аберрации в

процессе длительного культивирования. Учитывая высокую частоту встречаемости этой

перестройки и существование метаболической кооперации между клетками (36–38), можно

предположить, что обнаруженная на раннем пассаже часто встречающаяся клональная

перестройка связана с запуском клеточных процессов, которые продолжаются уже в отсутствие

этой хромосомной аберрации.

Проведенный структурный кариотипический анализ при длительном культивировании линии

MSCWJ-1 (7), выявил существенные отличия от линии MSCWJ-2. Если в линии MSCWJ-2, как

указано выше, на 6 пассаже имеет место устойчивая клональная хромосомная перестройка,

затрагивающая короткое плечо хромосомы 7, то в линии MSCWJ-1 на 6-м пассаже в 4-х клетках

обнаружена 1 клональная транслокация хромосом 1 и 9, а также 1 неклональная перестройка с

участием 1 и 5-й хромосом. При продолжении культивирования до 28 пассажа клональная и

неклональная перестройки исчезают, но появляются 2 новые неклональные перестройки:

дицентрическая хромосома (теломерная ассоциация) и структурная перестройка хромосомы

14. Надо подчеркнуть, что в данном случае уровень хромосомных аберраций не превышает

10% от проанализированных 100 метафазных пластинок. Случайность появления описанных

хромосомных нарушений косвенно подтверждается предыдущим анализом клеточной

популяции этой линии, проведенном также на 100 метафазных пластинках на 6-м пассаже (4).

В этой работе кариотипический анализ не выявил клональной хромосомной аберрации, но

обнаружил несколько неклональных нарушений, отличных от нарушений, представленных в

следующей работе (7).

Есть данные, подтверждающие цитогенетическую гетерогенность МСК. Причем судьба этих

цитогенетических нарушений разная: число некоторых нарушений при увеличении числа

пассажей увеличивается, а некоторых – уменьшается или исчезает совсем, что, возможно,

связано с негативной селекцией (39, 40). По-видимому, судьба цитогенетических нарушений в

процессе длительного культивирования определяется степенью адаптивности конкретного

хромосомного изменения.

14

Для понимания цитогенетических процессов в популяциях МСК человека, необходимы

исследования, анализирующие динамику кариотипических изменений в процессе длительного

культивирования, учитывая и сроки репликативного старения. Проблема оценки геномной

стабильности важна для использования МСК в регенеративной медицине. С одной стороны,

можно провести цитогенетический анализ на определенном пассаже и в дальнейшем

использовать эти клетки для прикладных работ только на этом пассаже. С другой стороны, в

связи с тем, что клетки какое-то время могут находиться в условиях in vivo, встает вопрос, не

будет ли усилена геномная нестабильность в процессе жизнедеятельности клеток in vivo.

На этот вопрос ответить сложно, но можно исследовать динамику цитогенетической

изменчивости при длительном культивировании МСК in vitro. Предполагая возможную

предрасположенность некоторых МСК к генетическим нарушениям, можно отбирать для

использования в регенеративной медицине клеточные линии, не проявляющие усиления

кариотипической изменчивости в процессе культивирования. Причем, необходимо исследовать

как частоту возникновения клональных, так и неклональных хромосомных аберраций,

возникающих в процессе культивирования. Такие исследования актуальны в связи с тем, что

неясно, оказывают ли кариотипические изменения, находящиеся в клеточных популяциях

ограниченный срок, влияние на свойства популяций МСК, т.е. не будут ли способствовать

временно присутствующие аберрации запуску клеточных процессов, которые будут

продолжаться уже в отсутствие этих аберраций.

Таким образом, сравнительный анализ характеристик, проведенный в полученных линиях

МСК человека в КККП ИНЦ РАН, свидетельствует, что все линии имеют статус МСК. Тем не

менее, обнаружены количественные межлинейные различия по ростовым характеристикам, по

характеру репликативного старения и по кариотипической нестабильности. Причинами этих

различий могут быть: 1) эпигенетические факторы, связанные с условиями культивирования, а

также с микроокружением, в котором существовали эти клетки до помещения их в условия in

vitro; 2) генетические факторы, связанные как с генетическими различиями между донорами,

так и возможно с изначальной генетической предрасположенностью конкретных линий МСК к

цитогенетической нестабильности.

15

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Крылова Т.А., Кольцова А.М., Зенин В.В, Мусорина А.С., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики новых линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, костного мозга и крайней плоти человека. Цитология, 2012, 54 (1): 5—16.

2. Kрылова Т.А., Мусорина А.С., Зенин В.В., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга и мышцы конечности раннего эмбриона человека. Цитология, 2014. 56 (8): 562—573.

3. Крылова Т.А., Мусорина А.С., Зенин В.В., Кольцова А.М., Кропачева И.В., Турилова В.И., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Получение и характеристика неиммортализованных клеточных линий дермальных фибробластов человека, выделенных из кожи век взрослых доноров разного возраста. Цитология, 2016, 58 (11): 850—864.

4. Крылова Т.А., Кольцова А.М., Мусорина А.С., Зенин В.В., Турилова В.И., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Характеристика двух линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из Вартонова студня пупочного канатика человека. Цитология, 2017, 59 (5): 315—27.

5. Крылова Т.А., Мусорина А.С., Зенин В.В., Турилова В.И., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Получение и сравнительная характеристика линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из крайней плоти двух доноров одного возраста». Цитология, 2018, 60 (4): 261-272.

6. Кольцова А.М., Зенин В.В., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Характеристика новой линии мезенхимных стволовых клеток, выделенных из эмбриональных стволовых клеток человека. Цитология, 2015, 57 (11): 761—770.

7. Кольцова А. М., Крылова Т. А., Мусорина А. С., Зенин В. В., Турилова В. И., Яковлева Т. К., Полянская Г.Г. Динамика свойств двух линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из Вартонова студня пупочного канатика человека, при длительном культивировании. Цитология, 2017, 59 (9): 574—587.

8. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop Dj., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytother., 2006, 8: 315—317.

9. Sensebé L., Krampera M., Schrezenmeier H., Bourin P., Giordano R. Mesenchymal stem cells for clinical application. Vox Sang, 2010, 98: 93—107.

10. Крылова Т.А., Мусорина А.С., Зенин В.В., Полянская Г.Г. Характеристика клеточных сфероидов, полученных из линий мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и зачатка конечности раннего эмбриона человека. Цитология, 2015, 57 (7): 480— 490.

11. Frith J.E., Thomson B., Genever P.G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng. (C) Methods., 2010, 16: 735—749.

12. Alimperti S., Lei P., Wen Y., Tian J., Campbell A.M., Andreadis S.T. Serum-free spheroid suspension culture maintains mesenchymal stem cell proliferation and differentiation potential. Biotechnol. Prog., 2014, 30: 974—983.

13. Maleki M., Ghanbarvand F., Reza Behvarz M., Ejtemaei M., Ghadirkhomi E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int. J. Stem Cells. 2014, 7: 118—126.

14. Jeon Y.J., Kim J., Cho J.H., Chung H.M., Chae J.I. Comparative analysis of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, placenta, and adipose tissue as sources of cell therapy. J. Cell Biochem., 2016, 117: 1112—1125.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dominici%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Le%20Blanc%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mueller%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Slaper-Cortenbach%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marini%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Krause%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Deans%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Keating%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Prockop%20Dj%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Horwitz%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16923606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19811095http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=24616445http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maleki%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25473449http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghanbarvand%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25473449http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reza%20Behvarz%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25473449http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ejtemaei%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25473449http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghadirkhomi%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25473449http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=25473449https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jeon%20YJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26448537https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26448537https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cho%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26448537https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chung%20HM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26448537https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chae%20JI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26448537https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=26448537

16

15. Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A., Visser J.W., Perlingeiro R.C. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow. Blood. 2007, 109: 1743—1751.

16. Park S.B., Seo K.W., So A.Y., Seo M.S., Yu K.R., Kang S.K., Kang K.S. SOX2 has a crucial role in the lineage determination and proliferation of mesenchymal stem cells through Dickkopf-1 and c-MYC. Cell Death Differ., 2012, 19: 534—545.

17. Matic I., Antunovic M., Brkic S., Josipovic P., Mihalic K.C., Karlak I., Ivkovic A., Marijanovic I. Expression of OCT-4 and SOX-2 in bone marrow-derived human mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation. Open Access Maced J. Med. Sci., 2016, 4: 9—16.

18. Guo L., Zhou Y., Wang S., Wu Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. J. Cell Mol. Med., 2014, 18: 2009—2019.

19. Wu R., Gu B., Zhao X., Tan Z., Chen L., Zhu J., Zhang M. Derivation of multipotent nestin(+)/CD271 (-)/STRO-1 (-) mesenchymal-like precursors from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Hum Cell., 2013, 26: 19—27.

20. Riekstina U., Cakstina I., Parfejevs V., Hoogduijn M., Jankovskis G., Muiznieks I., Muceniece R., Ancans J. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev., 2009, 5: 378—386.

21. Huang H.I., Chen S.K., Ling Q.D., Chien C.C., Liu H.T., Chan S.H. Multilineage differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin. Tiss. Eng. (A)., 2010, 16: 1491—1501.

22. Antonucci I., Stuppia L., Kaneko Y., Yu S., Tajiri N., Bae E.C., Chheda S.H., Weinbren N.L., Borlongan C.V. Amniotic fluid as rich source of mesenchymal stromal cells for transplantation therapy. Cell Transplant., 2011, 20: 789—795.

23. Mamidi M.K., Pal R., Mori N.A., Arumugam G., Thrichelvam S.T., Noor P.J., Abdullah H.M., Gupta P.K., Das A.K., Zakaria Z., Bhonde R. Co-culture of mesenchymal-like stromal cells derived from human foreskin permits long term propagation and differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem., 2011, 112: 1353—1363.

24. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res., 1965, 37: 614—636.

25. Matsumura T., Zerrudo Z., Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA synthesis and morphology. J. Gerontol., 1979, 34: 328—334.

26. Bonab M.M., Alimoghaddam K., Talebian F., Ghaffari S.H., Ghavamzadeh A., Nikbin B. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 2006. 7: 14. doi: 10.1186/1471-2121-7—14.

27. Stultz B.G., McGinnis K., Thompson E.E., Lo Surdo J.L., Bauer S.R., Hursh D.A. Chromosomal stability of mesenchymal stromal cells during in vitro culture. Cytother., 2016, 18: 336—343.

28. Gago N., Pérez-López V., Sanz-Jaka J.P., Cormenzana P., Eizaguirre I., Bernad A., Izeta A. Age-dependent depletion of human skin-derived progenitor cells. Stem Cells., 2009, 27: 1164—1172.

29. Kornicka K., Marycz K., Tomaszewski K.A., Marędziak M., Śmieszek A. The effect of age on osteogenic and adipogenic differentiation potential of human adipose derived stromal stem cells (hASCs) and the impact of stress factors in the course of the differentiation process. Oxide. Med. Cell Longev. 2015:309169. doi: 10.1155/2015/309169.

30. Brun C., Maginiot F., Cras A., Wong H., Ly Ka So S., Larghero J., Bensussan A., Oddos T., Michel L. Intrinsically aged dermal fibroblasts fail to differentiate into adipogenic lineage. Exp Dermatol., 2016, doi: 10.1111/exd.13080.

31. Marędziak M., Marycz K., Tomaszewski K.A., Kornicka K., Henry B.M. The influence of aging on the regenerative potential of human adipose derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Int. 2016: 2152435. doi: 10.1155/2016/2152435.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gang%20EJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bosnakovski%20D%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Figueiredo%20CA%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Visser%20JW%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Perlingeiro%20RC%22%5BAuthor%5Djavascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Blood.');https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20SB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seo%20KW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=So%20AY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seo%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yu%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kang%20SK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kang%20KS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=22015605https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Matic%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Antunovic%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brkic%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Josipovic%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mihalic%20KC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Karlak%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ivkovic%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marijanovic%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27275321https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=27275321http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Guo%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25090911http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25090911http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25090911http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25090911http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=25090911http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gu%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhao%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tan%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhu%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=21674199http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huang%20HI%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20SK%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ling%20QD%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chien%20CC%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liu%20HT%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chan%20SH%22%5BAuthor%5Djavascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Tissue%20Eng%20Part%20A.');http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21054947http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mamidi%20MK%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pal%20R%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mori%20NA%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arumugam%20G%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thrichelvam%20ST%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Noor%20PJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Abdullah%20HM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gupta%20PK%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Das%20AK%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zakaria%20Z%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bhonde%20R%22%5BAuthor%5Djavascript:AL_get(this,%20'jour',%20'J%20Cell%20Biochem.');http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bonab%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alimoghaddam%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Talebian%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghaffari%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghavamzadeh%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nikbin%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16529651http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Bonab%20MM%20et%20al.%2C%202006http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stultz%20BG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McGinnis%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thompson%20EE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lo%20Surdo%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bauer%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hursh%20DA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26780865http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Stultz%20BG%20et%20al.%2C%202016http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gago%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=P%C3%A9rez-L%C3%B3pez%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sanz-Jaka%20JP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cormenzana%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eizaguirre%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bernad%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Izeta%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=19418448http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kornicka%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marycz%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tomaszewski%20KA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mar%C4%99dziak%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=%C5%9Amieszek%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=26246868http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brun%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maginiot%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cras%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wong%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ly%20Ka%20So%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Larghero%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bensussan%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oddos%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Michel%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=27194418http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mar%C4%99dziak%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26941800http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marycz%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26941800http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tomaszewski%20KA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26941800http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kornicka%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26941800http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Henry%20BM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26941800http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=26941800

17

32. Meisner L.F., Johnson J.A. Protocols for cytogenetics studies of human embryonic stem cells. Methods., 2008, 45: 133—141.

33. Shaffer I.G., Slovak M.L., Campbell L.J. (Eds). An international system for human cytogenetic nomenclature. 2009, Basel: S. Karger. 138 pp.

34. Barkholt L., Flory E., Jekerle V., Lucas-Samuel S., Ahnert P., Bisset L., Büscher D., Fibbe W., Foussat A., Kwa M., Lantz O., Mačiulaitis R., Palomäki T., Schneider C.K., Sensebé L., Tachdjian G., Tarte K., Tosca L., Salmikangas P. Risk of tumorigenicity in mesenchymal stromal cell-based therapies--bridging scientific observations and regulatory viewpoints. Cytother., 2013, 15: 753—759.

35. Borgonovo T., Vaz I.M., Senegaglia A.C., Rebelatto C.L., Brofman P.R. Genetic evaluation of mesenchymal stem cells by G-banded karyotyping in a Cell Technology Center. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., 2014, 36: 202—207.

36. Cox R. P., Krauss M. R., Balis M. E., Dancis J. Communication between normal and enzyme-deficient cells in tissue culture. Exp. Cell Res., 1972, 74: 251—268.

37. Hooper M.L., Subak-Sharpe J.H. Metabolic cooperation between cells. Int. Rev. Cytol., 1981, 69: 45—104.

38. Шаровская Ю.Ю., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Чайлахян Л.М. Исследование диффузионной связи через щелевые контакты в эмбриональных стволовых клетках человека в процессе спонтанной дифференцировки. ДАН, 2009, 427 (3): 407—410.

39. Redaelli S., Bentivegna A., Foudah D., Miloso M., Redondo J., Riva G., Baronchelli S., Dalprà L., Tredici G. From cytogenomic to epigenomic profiles: monitoring the biologic behavior of in vitro cultured human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Res. Ther., 2012, 3: 47. Doi: 10.1186/scrt138.

40. Kim J.A., Im K.O., Park S.N., Kwon J.S., Kim S.Y., Oh K., Lee D.S., Kim M.K., Kim S.W., Jang M., Lee G., Oh Y.M., Lee S.D., Lee D.S. 2015. Cytogenetic heterogeneity and their serial dynamic changes during acquisition of cytogenetic aberrations in cultured mesenchymal stem cells. Mutat. Res., 2015, 777: 60—68. Doi: 10.1016/j.mrfmmm.2015.04.003.

COMPARATIVE ANALYSIS OF THE LINES OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS

DERIVED IN THE COLLECTION OF CELL CULTURES OF VERTEBRATES (REVIEW)

G.G. Poljanskaya

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, poljansk@incras. ru

The presented mini review of studies conducted in the CCCV SPBIC RAS for the period 2012-

2017. The comparative analysis of characteristics is carried out of the newly obtained lines of human

MSC isolated from different sources. It is shown that all lines have the status of MSС. Nevertheless,

quantitative interline differences in growth characteristics, the nature of replication senescence and

karyotypic instability have been found. The reasons for these differences may be: 1. epigenetic factors

associated with the conditions of cultivation or microenvironment in which these cells existed before

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Barkholt%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Flory%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jekerle%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lucas-Samuel%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ahnert%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bisset%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=B%C3%BCscher%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fibbe%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Foussat%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwa%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lantz%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ma%C4%8Diulaitis%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Palom%C3%A4ki%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schneider%20CK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Senseb%C3%A9%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tachdjian%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tarte%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tosca%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Salmikangas%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602595http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Barkholt%20L%20et%20al.%2C%202013http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Borgonovo%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25031060http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vaz%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25031060http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Senegaglia%20AC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25031060http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rebelatto%20CL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25031060http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brofman%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25031060http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Borgonovo%20T%20et%20al.%2C%202014http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Borgonovo%20T%20et%20al.%2C%202014http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=Borgonovo%20T%20et%20al.%2C%202014https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Redaelli%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bentivegna%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Foudah%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miloso%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Redondo%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Riva%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baronchelli%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dalpr%C3%A0%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dalpr%C3%A0%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dalpr%C3%A0%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tredici%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=23168092https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Im%20KO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20SN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwon%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20SY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oh%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20MK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20SW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jang%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jang%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oh%20YM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=25974687https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?orig_db=PubMed&cmd=search&cmd_current=&term=25974687mailto:[email protected]

18

placing them in conditions in vitro; 2. genetic factors associated with both genetic differences between

donors and possibly the original genetic predisposition of specific MSC lines to cytogenetic instability.

Keywords: Cell culture collection, human mesenchymal stem cells, proliferation, replicative

senescence, surface cell markers, karyotypic instability, differentiation.

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЛИНИЙ

ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ ОПУХОЛЕЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВКИ:

I. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА

Н.П. Терюкова1*, В.В. Малкова2, Е.И. Сахенберг1, В.А. Иванов1, С.А. Снопов1**

1Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

2Педагогический университет им. А.И. Герцена, Санкт-Петербург

*[email protected], **[email protected]

Исследование проведено с целью выявления признаков метаболического

репрограммирования в клетках 10 культивируемых линий гепатоцеллюлярных (ГЦ) опухолей с

разным уровнем цитодифференцировки. О репрограммировании метаболизма в этих клетках

судили по их способности депонировать гликоген: образование гранул гликогена в клетках

гепатоцитарного ряда принято считать функциональным маркером

высокодифференцированных клеток. Мы сравнили клетки высокометастатической гепатомы

Зайдела крысы, ранее переведенной нами из асцита в культуру in vitro, – монослойной

(родительской) линии и ее клональных сублиний с признаками опухолевых стволовых и

опухолевых прогениторных клеток (ОСК и ОПК) с клетками постоянных линий гепатом BWTG3

и MH-22a мыши, гепатомы НТС крысы и гепатобластомы HepG2 человека. Об относительных

уровнях дедифференцировки клеточных линий судили по морфологии клеток, особенностям

роста в монослое и значениям ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО), которые

оценивали на клеточных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Гранулы

гликогена в клетках выявляли с помощью реактива типа Шиффа AuSO2. Мы показали, что по

сравнению с гепатоцитами печени нормальной крысы гликоген в клетках культивируемых

линий либо не определялся, либо обнаруживался в цитоплазме только у части клеток. При

mailto:[email protected]:[email protected]

19

этом какой-либо зависимости между уровнями дедифференцировки клеточных линий и

способностью клеток к депонированию гликогена не наблюдалось. Мы впервые обнаружили,

что туморогенные дедифференцированные клетки гепатомы Зайдела с признаками ОСК –

фибробластоподобные клетки, формирующие рыхлый монослой без плотных межклеточных

контактов, с очень высоким уровнем ЯЦО – накапливали многочисленные гранулы гликогена.

Эту способность клетки сохраняли и после перевода их в асцитную форму опухоли, клетки

которой относятся к наиболее дедифференцированным.

Ключевые слова: гепатома, гликоген, опухолевые стволовые клетки, клонирование,

ядерно-цитоплазматическое отношение.

Исследования последних 10—15 лет показали, что метаболическое перепрограммирование

является неотъемлемым признаком неопластической трансформации клеток и направлено на

обеспечение растущих потребностей активно пролиферирующих клеток в энергии и

необходимых предшественниках для анаболических путей (1). К ключевым механизмам,

обеспечивающим адаптацию и рост опухолевых клеток в условиях гипоксии, относятся

аэробный гликолиз и изменения в метаболизме гликогена (2).

Гликоген представляет собой сильно разветвленный полимер глюкозы, пути синтеза и

деградации которого в клетках разных тканей совпадают, но регуляция его метаболизма

отличается. До недавнего времени образование гранул гликогена в клетках рассматривалось

биохимиками исключительно как примитивный способ резервирования энергии (глюкозы).

Однако гипоксия индуцирует активность основных ферментов метаболизма гликогена, что

приводит к его аккумуляции в клетках и способствует выживаемости клеток в стресс-условиях

(3, 4, 5). Наиболее значимый результат для понимания функциональной роли гликогена в

опухолевых клетках получен Фаваро с соавт. (5), которые обнаружили, что подавление

гликогенфосфорилазы, основного фермента деградации гликогена, в условиях избытка в

окружающей среде глюкозы приводит к сенесценции клеток и их гибели через ROS-зависимый

путь, активирующий р53 (6). По мнению авторов, прохождение глюкозы через ―гликогеновый

шунт‖ необходимо для роста клеток, что может быть связано с дополнительными и пока не

установленными физиологическими функциями гликогена в клетках. Аналогичный вывод

сделали Обель с соавт. (7) при изучении метаболизма гликогена в астроцитах мозга.

20

Гликоген, синтезируемый и резервируемый гепатоцитами, играет важную роль в

поддержании гомеостаза глюкозы в крови. Изучение влияния неопласти