FELIPE ANDRES MONSALVE MARIN AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESTATINAS E COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS POR FUNGOS ISOLADOS DE CANA DE AÇÚCAR EM CULTIVO SEMI-SÓLIDO São Paulo 2015 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
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FELIPE ANDRES MONSALVE MARIN AVALIAÇÃO DA ......RESUMO MONSALVE , F.Avaliação da produção de estatinas e compostos antimicrobianos por fungos isolados de cana de açúcar em
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FELIPE ANDRES MONSALVE MARIN
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESTATINAS E
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS POR FUNGOS
ISOLADOS DE CANA DE AÇÚCAR EM CULTIVO
SEMI-SÓLIDO
São Paulo
2015
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
FELIPE ANDRES MONSALVE MARIN
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESTATINAS E
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS POR FUNGOS
ISOLADOS DE CANA DE AÇÚCAR EM CULTIVO
SEMI-SÓLIDO
São Paulo
2015
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo,
para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Gabriel Padilla Maldonado
Versão corrigida. A versão original eletrônica
encontra-se disponível tanto na Biblioteca do ICB
quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações
da USP (BDTD).
Aos meus pais, Sigifredo Monsalve e Mariela Marin; a minha irmã Anyela Monsalve Marin,
e a minha família em geral por todo o amor, carinho e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
A minha família e amigos na Colômbia, pelo apoio constante, motivação e boas energias.
Apesar da distância sempre estiveram ao meu lado.
À Profa. Dra. Maria Fernanda Rodriguez, por crer e apoiar a ideia de começar uma aventura
no Brasil.
Ao meu orientador o Prof. Dr. Gabriel Padilla Maldonado, pela GRANDE oportunidade de
crescimento profissional e pessoal, assim como pela orientação, conselhos, conversas,
confiança e amizade.
Ao Prof. Dr. André Tempone e a Daiane Ferreira do Laboratório de Toxicologia Aplicada do
Instituto Adolfo Lutz, pela GRANDE colaboração na etapa final do projeto, assim como pelas
conversas, amizade e motivação (Vamos que vamos!).
Ao Prof. Dr. Joao Lago e a Simone Grecco do Laboratório de Química Biorgânica da
Universidade Federal de São Paulo, pela colaboração nas análises químicas das amostras, e
em especial pela vontade de ajudar e contribuir, visando ter os melhores resultados.
A Flavia Damasceno do Laboratório “Unit for Drug Discovery” do Departamento de
Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pela
GRANDE colaboração nos ensaios inicias com T. cruzi, e especialmente pela amizade e pelo
seu interesse e vontade de discutir, sugerir e trabalhar em equipe.
À Dr. Tatiana Alves Reis do Laboratório de Micotoxinas do Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo, pelo constante suporte e ajuda nas diversas etapas do projeto.
À Profa. Dra. Kelly Ishida do Laboratório de Quimioterapia Antifúngica do Departamento de
Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pela
colaboração com os ensaios com Candida albicans, e em especial pela disposição para
discutir e responder as minhas dúvidas. As conversas sempre foram de muita ajuda.
À Profa. Dra. Silvia Reni e à técnica Jenicer Yasunaka, do Laboratório de Leishmanioses, do
Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, pela colaboração com os ensaios com Leishmania amozonensis.
Ao Prof. Dr. Magnus Gidlund e à técnica Silvana Eugênio do Laboratório de
Imunofisiopatologia, assim como ao Dr. Fernando Almeida do Centro de Facilidades para a
Pesquisa (CEFAP) do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pelo
apoio nas análises de cromatografia de alta eficiência.
A Gisele Santana, secretária da Pós-graduação do programa de Microbiologia do Instituto de
Ciências Biomédicas/USP, pelo ótimo atendimento, amizade e paciência a minhas constantes
perguntas. O seu trabalho é vital para a Pós-graduação.
Ao Laboratório de Bioprodutos, especialmente a Zita Gregorio, Leandro Garrido, Simone
Ichiwaki e Renata Furlan.
A Martha Uran e aos amigos da House 116, Margarita Muñoz, Mariana Silva, Elisa Chaparro,
Carolina Manchola, Marcela Hernandez e Jennifer Salguero; vocês foram a minha família no
Brasil.
Aos amigos Taís Kuniyoshi, Lina Lopez, Ivan Acosta, Ivan Pacheco, Felipe Almeida, Lucas
dos Santo Dias e Mariana Doprado, pela amizade, alegrias, forças, boas energias, apoio e
ajuda.
A todos os professores que contribuíram na minha formação acadêmica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro.
À Universidade de São Paulo junto com o programa de Microbiologia do Instituto de Ciências
Biomédicas.
MUITO OBRIGADO
MUCHAS GRACIAS
“What we know is a drop, what we don't know is an ocean.”
Isaac Newton
“Hay que unirse, no para estar juntos, sino para hacer algo juntos”.
Juan Donoso Cortés
RESUMO
MONSALVE , F. Avaliação da produção de estatinas e compostos antimicrobianos por
fungos isolados de cana de açúcar em cultivo semi-sólido. 2015. 93 f. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia) ‐ Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,
São Paulo, 2015.
As estatinas são os agentes mais eficazes para a redução de colesterol no tratamento de
doenças cardiovasculares, e algumas destas moléculas podem ser produzidas através de
processos biológicos como o cultivo semi-sólido de fungos filamentosos. O objetivo deste
estudo foi determinar a capacidade de produção de estatinas e compostos antimicrobianos por
cinco cepas de fungos isolados de cana de açúcar. Para isso, extratos obtidos a partir do
tratamento dos cultivos fúngicos e do substrato (Farelo de trigo) com uma solução de
acetonitrila e água (2:1), foram analisados por métodos analíticos como cromatografia líquida
de alta eficiência e ressonância magnética nuclear para determinar a presença ou ausência de
estatinas nas amostras. Adicionalmente, os extratos foram testados contra diferentes modelos
biológicos incluindo bactérias, leveduras, fungos filamentosos, células de ovário de hamster
chinês, e parasitas como Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi. De acordo com os
resultados obtidos, os cinco fungos avaliados não produzem estatinas, e em relação ao
biomonitoramento dos extratos, foi observado que o extrato de farelo de trigo gerou um efeito
antiparasitário, que além de ser uma novidade, destaca-se como um resultado positivo que
poderia contribuir na busca de compostos para o tratamento de doenças negligenciadas. Os
extratos dos cultivos fúngicos também apresentaram atividade antiparasitária, no entanto, não
foi possível determinar se os compostos produzidos pelos fungos poderiam gerar efeito
obtido, levando em conta que não é possível separar a biomassa fúngica do substrato dos
Para o teste de atividade antifúngica foi utilizada a cepa de Mucor sp. do Laboratório de
Bioprodutos do Departamento de Microbiologia do ICB/USP.
3.1.2 Bactérias
Foram utilizadas a cepas Escherichia coli (ATCC 13706) e Bacillus subtilis do
Laboratório de Bioprodutos do Departamento de Microbiologia do ICB/USP.
3.1.3 Levedura
Foi utilizada a cepa Candida albicans SC5314 do Laboratório de Quimioterapia
Antifúngica do Departamento de Microbiologia do ICB/USP.
3.1.4 Parasitas
3.1.4.1 FASE I
Foram utilizadas as cepas CL14 de Trypanosoma cruzi do Laboratório “Unit for Drug
Discovery” do Departamento de Parasitologia do ICB/USP; e a cepa M2269 de Leishmania
amazonensis do Laboratório de Leishmanioses do Departamento de Parasitologia do
ICB/USP.
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3.1.4.2 FASE II
Foi utilizada a cepa Y de Trypanosoma cruzi do Laboratório de Toxicologia Aplicada
do Departamento de Parasitologia do Instituto Adolfo Lutz, localizado na cidade de São
Paulo, Brasil.
3.1.5 Células de mamífero
Foi utilizada a linha celular de Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO-K1) do
Laboratório “Unit for Drug Discovery” do Departamento de Parasitologia do ICB/USP, usada
como padrão nos protocolos dos testes de citotoxicidade do laboratório mencionado.
3.2 Processo de produção das estatinas
Para avaliar a capacidade de produção de estatinas do grupo de fungos filamentosos
selecionados, foram realizados cultivos em estado semi-sólido nas mesmas condições de
cultivo (temperatura, umidade, substrato), utilizando a linhagem Aspergillus terreus (CBMAI
0193) como controle positivo, descrita em numerosos estudos como produtora de Lovastatina
(BARRIOS-GONZALES, 2012).
3.2.1 Inóculo
3.2.1.1 Método I (Metodologia proposta por Quevedo et al. 2012)
Foi realizado inóculo de um grama (1 g) da biomassa obtida do cultivo estático de
cada um dos fungos em Erlenmeyers de 250 mL com 50 ml de caldo farelo de trigo (175 g/L).
O tempo de incubação foi de 15 dias a 28 °C.
3.2.1.2 Método II
Inoculação de 10 discos de ágar (5 mm) farelo de trigo com o fungo crescido, obtidos
de cultivos em placa a 28 °C durante 7 ou 15 dias, dependendo das características de
crescimento de cada fungo.
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3.2.2 Condições do cultivo semi-sólido
(O farelo de trigo foi selecionado como substrato e suporte dos cultivos, e foi obtido do mercado local da
cidade de São Paulo, Brasil).
Foram colocados 10 gramas do farelo de trigo em Erlenmeyers de 250 ml,
autoclavando o material a 121 °C durante 40 minutos. O inóculo foi adicionado ao meio de
cultivo estéril, e o conteúdo de umidade foi ajustando entre 60 e 65%. O tempo de incubação
avaliado para cada fungo foi de 7 e 15 dias, a 28 °C, com porcentagens de umidade relativa
entre 85 e 90% (câmara úmida). Como controle abiótico dos experimentos, 10 gramas de
farelo estéril foram incubados nas mesmas condições de cultivo dos fungos.
3.3 Procedimentos analíticos
3.3.1 Determinação da porcentagem de umidade e de biomassa
Na determinação da umidade final dos cultivos, 10 gramas de cada cultivo (mistura de
farelo de trigo com o fungo crescido) foram secos a 40 °C durante 48 horas. A porcentagem
de umidade foi determinada segundo a fórmula descrita por Baños et al., (2009):
% de umidade =Massa de amostra úmida − Massa da amostra seca
Massa de amostra úmida× 100
No cálculo foi considerada a umidade inicial do farelo de trigo, e assim como as
alterações geradas na etapa de esterilização (autoclavagem).
A biomassa foi determinada segundo a diferença dos valores de peso seco do final dos
cultivos em relação ao peso seco inicial.
3.3.2 Análise elementar (C, N, H) do farelo de trigo e dos cultivos dos fungos
Trichoderma sp., e Penicillium pinophilum.
Segundo o protocolo da Central Analítica do Instituto de Química (IQ) da
Universidade de São Paulo, 1 mg das amostras pesadas em balança analítica em um cadinho
de estanho, foram lacradas e foram introduzidas no Analisador Elementar (Perkin-Elmer
Modelo 240 CHN series II) o qual é submetido a combustão em atmosfera de oxigênio puro
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na presença de gás hélio como arraste a 925 °C. Os gases produzidos, Gás Carbônico, Água e
Óxidos de Nitrogênio, são arrastados até um tubo contendo Cobre puro, no qual os óxidos de
Nitrogênio são reduzidos à gás Nitrogênio. Estes gases são separados em coluna
cromatográfica e detectados por Detector de Condutividade Térmica e comparados os sinais
produzidos com padrões previamente analisados. O resultado produzido se dá em
porcentagem de Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio.
3.3.3 Obtenção dos extratos
Foram avaliados dois protocolos para obter os extratos dos cultivos fúngicos e do
controle de farelo de trigo. No primeiro protocolo, 10 gramas dos cultivos foram tratados com
nitrogênio líquido e triturados em morteiro até formar uma pasta. No segundo protocolo, 10
gramas dos cultivos foram secos a 40 °C durante 48 horas, e triturados em mortero até formar
pó. Três gramas de cada um dos materiais obtidos pelos procedimentos mencionados foram
tratados com uma solução de acetonitrila e água (2:1), e sonicados em banho ultrassônico (25
kHz) durante 30 minutos. Após, as misturas obtidas foram agitadas durante 12 horas, e
centrifugadas a 5000 g, a 4 °C, durante 20 minutos. Os pellets foram descartados e os
sobrenadantes foram filtrados em filtros de celulose regenerada de 47 mm de diâmetro e poro
com diâmetro de 0,45 µm. Posteriormente, os extratos filtrados foram concentrados a 45 °C
em rotaevaporador e armazenados a 4 °C.
3.3.4 Determinação da presença de estatinas nos extratos
3.3.4.1 ETAPA I
As amostras concentradas foram resuspendidas em 2 mL de acetonitrila 100% e
analisadas mediante cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando um sistema
Shimadzu Prominence equipado com um detector Diode Array e uma coluna Novapack C18
(250 × 4.6mm i.d., 5 μm); No método de gradiente desenvolvido, o tempo das corridas foi de
70 minutos, com uma fase móvel de acetonitrila e água, e com um fluxo de 0,8 mL/min.
Como controles foram utilizadas soluções padrão de Lovastatina (50 μl/mL) comercial Merck
(Merck S.A., São Paulo, SP., Brasil) em sua forma lactona (Prodroga) e em sua forma
hidróxiácida (forma ativa da molécula) que foi gerada a partir da forma lactona utilizando a
metodologia proposta por Friedrich et al. (1995).
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3.3.4.2 ETAPA II
Baseando-se nas análises dos cromatogramas obtidos na etapa I, e dos resultados da
atividade biológica dos extratos, foram selecionados os extratos dos cultivos dos fungos
Trichoderma sp. e Penicillium pinophillum, e o extrato de farelo de trigo (controle) para assim
dar continuidade nos testes de caracterização das amostras, visando caracterizar as amostras e
purificar frações de interesse. Os extratos foram produzidos segundo as condições de cultivo
já padronizadas, e foram fracionados em colunas Sep-Pak C18 da Waters. A lavagem das
colunas foi realizada inicialmente com 10 mL de acetonitrila 100%, seguido de 15 mL acetato
de etila 100%; gerando assim duas frações por cada extrato (Figura 3). As seis frações obtidas
foram concentradas e analisadas em colaboração com o Laboratório de Química Biorgânica
da UNIFESP coordenado pelo Professo Doutor Joao Lago, através de técnicas analíticas como
cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC), CLAE, Cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), e Ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (RMN-1H).
Figura 3- Fluxograma da etapa II da determinação da presença de estatinas nos extratos. Acetonitrila (ACN);
Acetato de etila (AcOEt); Cromatografia de camada delgada (CCDC); Cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE); Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM); Ressonância magnética nuclear
de hidrogênio (RMN-1H).
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3.3.4.2.1 Cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC)
As placas de cromatografia em camada delgada comparativa foram utilizadas
cromatofolhas de gel de sílica 60 F254 sob suporte de alumínio da Merck, e o sistema de
solventes foi Hexano: Acetato de etila (7:3). Nas revelações das placas foram utilizadas,
irradiação no ultravioleta (254 e 356 nm), solução aquosa ácida de sulfato cérico (2,6 mg/mL)
e vapores de iodo.
3.3.4.2.2 Cromatografia de alta eficiência (CLAE)
As amostras filtradas foram analisadas mediante cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), usando um sistema Shimadzu Prominence equipado com um detector
Diode Array e uma coluna CLC-C8 (250 × 4,6mm i.d., 5 μm); No método desenvolvido
gradiente, o tempo das corrida foi de 50 minutos com uma fase móvel de acetonitrila e água
(2:1), com um fluxo de 1,0 mL/min.
3.3.4.2.3 Ressonância magnética nuclear (RMN-H+)
Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H foram registrados em
espectrômetro Ultrashield 300 Bruker advance III operando a 300 MHz. Como solvente foi
utilizado Dimetil sulfoxido deuterado (DMSO-d6) com tetrametilsilano (TMS.
3.3.4.2.4 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM)
Todas as análises foram realizadas em aparelho Shimadzu GCMS-QP2010 Plus,
equipado com injetor tipo “split”, coluna Rtx-5MS (sílica fundida, 30 m, 0,25 mm D.I., 0.25
μm de espessura de filme; Restek, Co., EUA) e detector por ionização em chama acoplado a
um detector de massas com fragmentação por impacto de elétrons a 70 eV. Os parâmetros
operacionais foram: temperatura do detector e injetor de 280 °C. A temperatura da coluna de
180 °C por 10 min foi programada a 2 °C/min até 210 °C e 10 °C/min até 280 °C por 2 min.
A pressão do gás de arraste (He) foi ajustada de modo a obter velocidade linear de 25,0 cm/s
(1,0 mL/min). A vazão na purga do septo foi mantida em 1,0 mL/min. O parâmetro testado na
CG-EM foi temperatura inicial da coluna, 180 °C [Gradiente 1: 180 °C (10’) + 2 °C/min até
210 °C (20’) + 10 °C/min até 280 °C (2’)].
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3.4 Avalição da atividade biológica dos extratos
3.4.1 Testes de atividade antibacteriana
As bactérias foram cultivadas em caldo Mueller Hinton a 37 °C, 150 rpm, durante 10
horas. Alíquotas de 100 µL das diluições dos cultivos com uma densidade ótica de 0,2 a
600 nm foram inoculadas, e espalhadas com alça de Drigalski em placas de Petri com agar
Muller Hilton. Posteriormente, foram colocados sobre a superfície do ágar vários discos de
papel filtro estéril de 5 mm de diâmetro que foram impregnados com 10 µL de cada extrato
fúngico (2 mg/mL), e com o controle de acetonitrila 100% e do extrato de farelo de trigo
(2 mg/mL). As placas foram incubadas durante 10 horas a 37 °C, monitoradas a cada 2 horas.
3.4.2 Teste de atividade antifúngica sobre Mucor sp.
A partir de uma placa de Petri com o fungo Mucor sp. crescido sobre ágar Sabouraud
durante 15 dias a 28 °C, foi feita uma suspenção de conídios utilizando 10 mL de uma solução
0,85% (p/v) de Cloreto de sódio (NaCl), cujo número foi determinado com a contagem em
câmara de Neubauer, e ajustado mediante diluições até obter uma concentração final de 1x106
conídios/ml. Alíquotas de 100 µL da suspensão de conídios foram inoculadas, e espalhadas
com alça de Drigalski em placas de Petri com ágar Sabouraud. Após, na superfície das placas
foram colocados canudos de 5 mm de diâmetro, que foram inoculados com 50 µL de cada
extrato concentrado, e com 50 µL dos extratos a 2.0 mg/mL. Como controles foram utilizados
o acetonitrila 100% e extrato de farelo de trigo a 2.0 mg/mL. As placas foram incubadas
durante 7 dias a 28 °C, monitoradas a cada dia.
3.4.3 Teste de atividade antifúngica sobre Candida albicans
(Metodologia padrão do Laboratório de Quimioterapia Antifúngica do Departamento de Microbiologia
do ICB/USP)
O ensaio foi feito segundo o método de microdiluição em caldo para o estudo de
susceptibilidade antifúngica de leveduras (CLSI - Clinical and Laboratory Standards
Institute, 2008). Em microplaca de 96 poços de fundo chato, as leveduras foram tratadas com
os extratos (2,0 – 0,1 mg/mL) diluídos em série 1:2, incubadas a 35 °C durante 48 horas,
utilizando como controle positivo de inibição do crescimento o fármaco padrão fluconazol
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(64 µg/mL); os controles adicionais foram o extrato de farelo de trigo (2 mg/mL), o
acetonitrila 100%, leveduras sem tratar e meio de cultura (RPMI) sem inocular.
3.4.4 Teste de atividade antiparasitária sobre Leishmania amazonensis (Metodologia padrão do Laboratório de Leishmanioses do Departamento de Parasitologia do ICB/USP)
Foi avaliado o efeito de diferentes concentrações (0,2 mg/mL e 2,0 mg/mL) dos
extratos (fúngicos e do farelo de trigo) sobre a proliferação de promastigotas de
Leishmania amazonensis em uma concentração de 3 x 106
parasitas/mL; os controles foram
parasitas não tratados e parasitas tratados com acetonitrila 100%. Isto foi feito em meio 199,
incubando em microplacas de 96 poços, a 25 °C durante 48 horas. Após o tempo de
incubação, acrescentou-se em cada um dos poços 30 µL de MTT (Brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio), incubando por 2 horas a 25 °C. Por último,
adicionaram 50 µL de SDS 20% e foi feita a leitura de densidade ótica no comprimento de
onda de 595 nm, e de 690 nm como comprimento de onda de referência. Os valores das
absorbâncias foram convertidos em porcentagens de sobrevivência relacionados com os
controles de proliferação de parasitas não tratados com os extratos, os que seriam equivalentes
a 100% de viabilidade celular.
3.4.5 Teste de atividade antiparasitária sobre Trypanosoma cruzi
3.4.5.1 FASE I
(Metodologia padrão do Laboratório “Unit for Drug Discovery” do Departamento de Parasitologia do ICB/USP)
Formas epimastigotas de T. cruzi na fase exponencial de proliferação (5,0 – 6,0 x 107
parasitas/mL) foram cultivados em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) a 28 °C. Alíquotas
com 2,5 x 106 parasitas/mL foram transferidas a microplacas de 96 poços, cultivadas em meio
LIT e tratadas com diferentes concentrações dos extratos (2,0 – 0,2 mg/mL), atingindo um
volume final de 1 mL; cada experimento foi feito em quadruplicata. A proliferação celular foi
quantificada mediante leituras de densidade ótica (DO) a 620 nm durante 8 dias. A DO foi
convertida em valores de densidade celular (parasitas/mL) usando a equação da regressão
linear previamente obtida em testes de proliferação. Como controle positivo de inibição da
proliferação foi utilizada uma solução de Rotenona (60 µM) e Antymicina (0,5 µM).
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Adicionalmente foram feitos controles com extrato de farelo de trigo (0,33 – 1,34
mg/mL), acetonitrila (0,1-1,0 µM) e parasitas não tratados.
3.4.5.2 FASE II
(Protocolo padrão do Laboratório de Toxicologia Aplicada do Departamento de Parasitologia do
Instituto Adolfo Lutz).
3.4.5.2.1 Cultivo in vitro
Formas tripomastigotas de T. cruzi (cepa Y) foram cultivadas em células LLC-MK2
com meio RPMI-1640, suplementado com 2% de SFB a temperatura de 37 °C em estufa com
5% CO2 (KESPER et al., 2000; REIMÃO et al., 2008).
3.4.5.2.2 Determinação in vitro da concentração inibitória 50% (IC50)
Os extratos selecionados segundo os resultados obtidos na etapa II da “Determinação
da presença de estatinas nos extratos”, foram dissolvidos em Dimetil sulfóxido (DMSO), e
diluídos em meio de cultura em diferentes concentrações (diluição seriada em base 2) a partir
de uma concentração inicial de 300 µg/mL; após, foram e incubados com os parasitas para se
determinar as respectivas IC50. A concentração do solvente não ultrapassou 0,5% para não
causar danos aos parasitas.
As amostras foram diluídas em série utilizando-se meio RPMI-1640, sem adição de
antibióticos em placas de 96 poços e em seguida formas tripomastigotas de T. cruzi foram
adicionadas na concentração de 1x106
parasitas/poço. As placas foram mantidas à temperatura
de 37 °C em estufa com 5% de CO2 durante 24 horas. Após esse período para a determinação
da viabilidade dos parasitas, foi adicionado 20 µL de Alamar Blue® a 10%. As placas
permaneceram incubadas por mais 20 horas sobre as mesmas condições.
Ao final do ensaio, a leitura foi realizada por absorbância em espectrofluorímetro de
placas (Filter Max F5 Multi-Mode Microplate Reader) com filtro de excitação de 540 nm e
emissão de 570 nm (Gehrke et al., 2013). Como controle positivo de inibição (100% de
células mortas), utilizou-se o fármaco padrão Benzonidazol, devido sua utilização na terapia
clínica; e como controle negativo de inibição (100% de células vivas), utilizaram-se as células
não tratadas. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
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3.4.6 Testes de citotoxicidade sobre Células de Hamster Chines (CHO)
(Metodologia padrão do Laboratório “Unit for Drug Discovery” do Departamento de Parasitologia do
ICB/USP)
As células foram cultivadas durante 48 horas a 37 °C com uma atmosfera umidificada
com 5% de CO2, no meio de cultura RPMI suplementado com 0,15% (p/v) Na2CO3, 100 µg/ml
de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 10% de SFB inativado com calor. Alíquotas de
5,0 x 105 células/mL foram transferidas a placas de 24 poços, e cultivadas em meio RPMI
com diferentes concentrações dos extratos fúngicos (2,0 – 1,0 mg/mL), do extrato de farelo de
trigo (1,34 – 0,67 mg/mL) e do acetonitrila (0,1 – 0,7 µM), atingindo um volume final por
poço de 500 µL. A viabilidade celular foi determinada com o ensaio de MTT após 48 horas de
incubação, no qual foram adicionados 50 µL de MTT (5mg/mL) a cada um dos poços,
incubando por 3 horas. Após, foram adicionados 200 µL de SDS 10% e foi feita a leitura da
DO no comprimento de onda de 595nm.
3.5 Determinação da espécie da cepa Trichoderma sp. (CBMAI 1018)
(Metodologia padrão do Laboratório de Micotoxinas do Departamento de Microbiologia do ICB/USP)
A determinação da espécie do fungo Trichoderma sp. (CBMAI 1018) foi feita pelo
Laboratório de Micotoxinas do ICB/USP, mediante a análise do sequenciamento do
fragmento da região ITS, realizado no Centro de Estudos do Genoma Humano da
Universidade de São Paulo (USP). A separação eletroforética em capilar foi realizada em um
sequenciador ABI Prism 3100 (Applied Biosystems), e as sequências consenso foram obtidas
usando o programa CodonCode Aligner Versão 3.7.1. (CodonCode Corporation, Centerville,
MA, EUA). A sequência obtida foi pesquisada no BLASTn (www.ncbi.nlm.nih.gov) de forma
a confirmar identificações preliminares.
3.6 Análise estatística
O programa GraphPadPrism5 foi utilizado para construção dos gráficos e seus ajustes,
segundo os resultados obtidos nos ensaios com T. cruzi, e com as células CHO. O método
ANOVA de uma via seguido do teste Dunnett’s foi utilizado nas análises estatísticas dos
tratamentos em relação ao controle não tratado. Para análise de diferença de grupos foi
utilizado o teste Dunnett’s. O valor de p<0.05 foi considerado estatisticamente significativo.
Tabela 1- Imagens dos cultivos (7 dias) dos conídos de Mucor sp. tratados com os extratos fúngicos, utilizando
as concentrações iniciais de cada extrato (Extrato bruto) e uma concentração padronizada de 2,0 mg/mL.
4.4.3 Teste de atividade antifúngica sobre Candida albicans
A levedura Candida albicans é o principal agente gerador de candidíase sistêmica
(KANEKO et al., 2013), é a quarta causa mais comum de infecção da corrente sanguínea
(Candidemia) em pacientes hospitalizados, como pacientes com queimaduras, oncológicos
neutropênicos, recém-nascidos prematuros e pacientes em recuperação de cirurgia cardíaca ou
cirurgia abdominal (LIU et al., 2009). Atualmente, a incidência de infeções causadas por
fungos oportunistas está aumentando, assim como o aumento na resistência a vários dos
medicamentos utilizados no tratamento, o que gera uma grande necessidade de focar estudos
para o de desenvolvimento de novos fármacos e opções terapêuticas alternativas (CABRAL,
FIGUEROA e FARIÑA, 2013).
Dos seis extratos fúngicos avaliados em Candida albincas, só o extrato (2 mg/mL) do
cultivo de A. terreus apresentou atividade inibitória do crescimento da levedura. No entanto a
inibição gerada pelo extrato foi parcial, considerando que só até as 48 horas de cultivo foi
observada uma leve turbidez no poço da placa com as leveduras tratadas com o extrato do
fungo mencionado. O efeito observado poderia estar relacionado com a possível produção de
Lovastatina do fungo, já que segundo Gyetvai et al. (2006) este tipo de estatina gera um efeito
fungistático em C. albicans, alterando de forma negativa a fluidez da membrana como
resultado de modificações adaptativas na composição de ácidos graxos, fosfolipídeos e
acumulo de intermediários biossintéticos como o ergosterol. Vale ressaltar que os controles
com leveduras tratadas com acetonitrila 100% e com o extrato de farelo de trigo (2 mg/mL)
não apresentaram atividade inibitória do crescimento.
40
4.4.4 Teste de atividade antiparasitária sobre Leishmania amazonensis
Parasitas do gênero Leishmania são os agentes etiológicos da leishmaniose, uma
doença amplamente distribuída com uma prevalência de 12 a 14 milhões de pessoas e uma
população de risco de 350 milhões de pessoas em 88 países diferentes (DESJEUX, 2004).
Estima-se que anualmente ocorrem 1,3 milhão de novos casos, e de 20000 a 30000 mortes
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014). O tratamento da leishmaniose depende de
vários fatores como a forma clínica da doença, espécies de parasitas e localização geográfica;
usualmente são administrados compostos antimoniais altamente tóxicos e pouco tolerados
(ARRUDA et al., 2005). A terapia com antimônio penta valente é comumente associada com
altos índices de não conformidade, e a resistência do parasita a estas moléculas aumenta de
forma alarmante (ARRUDA et al., 2009). É por isso que os extratos produzidos neste estudo
foram testados contra os parasitas em colaboração com o Laboratório de Leishmanioses do
ICB/USP coordenado pela Professora Doutora Silvia Reni, contribuindo assim na busca de
compostos que possam ser alternativas terapêuticas.
Os resultados obtidos (Figura 7) apresentaram que os extratos (2 mg/mL) dos cultivos
dos fungos A. terreus, Fusarium sp., Trichoderma sp., e Penicillium Pinophilum, geraram as
menores porcentagens de sobrevivência das formas promastigotas dos parasitas com valores
de: 1%, 3%, 2% e 3% respectivamente.
É importante ressaltar que o extrato de farelo trigo também teve um efeito sobre
viabilidade dos parasitas, gerando uma porcentagem de sobrevivência dos parasitas de 45%.
Isto quer dizer que o resultado obtido com os extratos fúngicos poderia ser a resposta do um
efeito sinérgico entre os compostos dos extratos fúngicos e os compostos do farelo de trigo.
No caso do controle com acetonitrila, foi observado que o solvente não apresentou efeito
sobre a proliferação dos parasitas.
41
Figura 7- Viabilidade celular dos cultivos de formas promastigotas de Leishmania amazonensis tratados com
concentrações de 0.2 mg/mL (Azul) e 2.0 mg/mL (vermelho) dos extratos fúngicos e do extrato de farelo de
trigo. Em verde, o controle com os parasitas não tratados.
Adicionalmente, foram feitas observações no microscópio ótico (Tabela 2) dos poços
com os parasitas tratados com o extrato do fungo A. terreus, e evidenciou-se que a
concentração de 2 mg/mL gera um efeito de lises sobre os parasitas; com concentrações
menores a 2 mg/mL observou-se uma diminuição do número de parasitas, mas sem alterações
na morfologia.
Observações no microscópio ótico
a) Parasitas tratados com o extrato do cultivo de
A. terreus (2 mg/mL)
Fragmento dos parasitas lisados.
b) Parasitas tratados com o extrato do cultivo de
A. terreus (0,25 mg/mL)
Parasitas com as mesmas características morfológicas dos
parasitas não tratados (controle)
Tabela 2- Imagens microscópicas (20X) dos das formas promastigotas de Leishmania amazonenses tratadas com
o extrato do cultivo do fungo A. terreus. Na figura a) os parasitas tratados com o extrato (2 mg/mL) foram
lisados. Na figura b) o extrato (0,25 mg/mL) foi observado uma diminuição da quantidade de parasitas em
comparação ao controle de parasitas não tratados. Não foram observadas alterações na morfologia ou na
motilidade dos parasitas.
200 µm 200 µm
42
4.4.5 Testes de atividade antiparasitária com Trypanosoma cruzi - FASE I
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, que no mundo todo
afeta entre 7 e 8 milhões de pessoas, a maioria habitantes de Latinoamérica onde a doença é
endêmica, (WHO, 2014). O parasita tem um ciclo de vida complexo que alterna entre um
inseto vetor e hospedeiros mamíferos (os seres humanos entre eles) e a evolução clínica da
doença em seres humanos pode ser dividida em duas fases: aguda e crônica. Até 30% das
pessoas cronicamente infectadas desenvolvem alterações cardíacas, e até 10% desenvolvem
alterações digestivas, neurológicas ou mistas que podem exigir tratamento específico. Nos
anos posteriores, a infecção pode levar à morte súbita ou insuficiência cardíaca causada pela
destruição progressiva do músculo cardíaco (DAMASCENO et al., 2014). O tratamento da
doença depende de dois medicamentos que foram descobertos cerca de 40 anos atrás, o
nifurtimox e o benzonidazol. Ambas as drogas são eficazes para o tratamento da fase aguda
da doença. No entanto, sua eficácia diminui no tratamento da fase crônica, quando a maioria
dos pacientes é diagnosticada. Além disso, desvantagens para ambas as drogas têm sido
relatadas, como graves efeitos colaterais e mais recentemente, o surgimento de parasitas
resistentes ao medicamento (BOSCARDIN et al., 2010). Como exemplo, só na Colômbia o
custo anual dos cuidados médicos para todos os pacientes com a doença foi estimado em
cerca de 267 milhões dólares em 2008 (WHO, 2014). Esses fatos reforçam a necessidade
urgente de intensificar a busca de novas drogas contra T. cruzi (URBINA, 2010), o que é
principal motivo da avaliação do efeito dos extratos produzidos neste estudo sobre T. cruzi.
Os testes desta etapa foram feitos em colaboração com o Laboratório “Unit for Drug
Discovery” do Departamento de Parasitologia do ICB/USP, coordenado pelo Professor
Doutor Ariel Silber.
Os resultados obtidos nos ensaios de proliferação das formas epimastigotas de T. cruzi
tratadas como os extratos fúngicos e com o extrato de farelo de trigo são apresentados na
Tabela 3. Segundo o perfil dos gráficos, concentrações dos extratos fúngicos acima de 2
mg/mL interferem com a leitura inicial da concentração de parasitas, isto é, pela reação entre
o meio de cultura e os extratos, gerando assim um precipitado. Além disso, outro aspecto que
compartilham todos os gráficos é que com concentrações de 2 mg/mL dos extratos fungicos é
obtido o mesmo perfil que o controle positivo de inibição da proliferação. Observações no
microscópio ótico (imagens não mostradas), indicaram que os parasitas tratados com
concentrações de 2 mg/mL ou superiores dos extratos fúngicos, os parasitas são lisados. Nas
figuras 8c; 8d e 8f, foi observado que os cultivos tratados com os extratos a concentrações de
43
1 mg/mL e 2 mg/mL, apresentaram o mesmo perfil que o controle positivo de inibição, no
entanto, segundo as observações no microscópio (imagens não apresentadas), os parasitas
tratados com as concentrações de 1 mg/mL não foram lisados, mas a sua morfologia foi
modificada, virando de uma forma alargada e móbil, a uma forma arredondada e imóvel,
incapaz de proliferar.
Figura 8a. Teste com o extrato do cultivo de A.
terreus.
Figura 8b. Teste com o extrato do cultivo de
Saccharicola sp.
Figura 8c. Teste com o extrato do cultivo de
Fusarium sp.
Figura 8d. Teste com o extrato do cultivo de
Trichoderma sp.
Figura 8e. Teste com o extrato do cultivo de A.
flavus.
Figura 8f. Teste com o extrato do cultivo de
Penicillium pinophilum.
Tabela 3- Figuras da avaliação da atividade de diferentes concentrações dos extratos fúngicos sobre a
proliferação de formas epimastigotas de T. cruzi. No controle positivo da inibição de proliferação dos parasitas
(C+) foi utilizada uma solução de Rotenona (60 µM) e Antymicina (0.5 µM). Como controle negativo de inibição (C-) foram utilizados parasitas não tratados.
44
Como controle, foram feitos testes para determinar o efeito de diferentes
concentrações de acetonitrila sobre a proliferação dos parasitas (Figuras 9a; 9c; 9e; 9g; 9i;
9k), determinado assim a concentração máxima do solvente que poderia ser utilizada sem
interferir significativamente sobre a proliferação do parasita.
Avalição do efeito do acetonitrila sobre a
proliferação dos parasitas
Analises de variância
Figura 9a. Ensaio 1
Figura 9b.
Figura 9c. Ensaio 2
Figura 9d.
Figura 9e. Ensaio 3
Figura 9f.
Aceto1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80
100C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
) day_5(1)
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80
ns***
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
Aceto2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80
100C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
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sit
y (
nu
mb
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of
ce
lls X
10
6 m
L-1
) day_5(2)
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80 ns
* ***
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
Aceto3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
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sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
) day_5(3)
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80
ns * ***
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
45
Figura 9g. Ensaio 4
Figura 9h.
Figura 9i. Ensaio 5
Figura 9j.
Figura 9k. Ensaio 6
Figura 9l.
Tabela 4- Figuras da avaliação da atividade de diferentes concentrações de acetonitrila (0,1 µM – 1,0 µM) sobre
a proliferação de formas epimastigotas de T. cruzi (Figuras 9a; 9c; 9e; 9g; 9i; 9k) cultivados durante 8 dias. No
controle positivo da inibição da proliferação dos parasitas (C+) foi utilizada uma solução de Rotenona (60µM) e
Antymicina (0.5µM). Como controle negativo de inibição (C-) foram utilizados parasitas não tratados. Análises de variância quando p<0,05 (Figuras 9b; 9d; 9f; 9h; 9j; 9l) do efeito das concentrações do solvente sobre a
proliferação dos parasitas: (ns) Efeito não significativo; (**) Efeito medianamente significativo; (***) Efeito
significativo.
Segundo a análise de variância (Figuras 9b; 9d; 9f; 9h; 9j; 9l), foi determinado que
utilizando concentrações menores a 0.3 µM de acetonitrila, o solvente não interfere de forma
significativa (quando p<0,05) na proliferação do parasita. Por tanto é descartado que o
solvente seja o responsável dos resultados obtidos na avalição dos extratos em concentrações
Aceto4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80
100C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
) Aceto4_day5
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
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0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80
100
ns
****
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
Aceto5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80
100C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
) Aceto5_day5
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
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0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80
100ns
***
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
Aceto6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
20
40
60
80
100C-
C+
0.1 uM
0.2 uM
0.3 uM
0.4 uM
0.5 uM
0.6 uM
0.7 uM
0.8 uM
1.0 uMDay
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
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ce
lls X
10
6 m
L-1
) Aceto6_day5
C-
C+
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.8
uM
1.0
uM
0
20
40
60
80
100 ns
*****
Acetonitrila
Ce
ll D
en
sit
y (
nu
mb
er
of
ce
lls X
10
6 m
L-1
)
46
menores o iguais a 2 mg/mL, já que para preparar estas concentrações foram utilizados menos
de 0,3 µM de acetonitrila.
Na avaliação do efeito extrato de farelo de trigo sobre a proliferação dos parasitas
(Figura 10), foi observado que em concentrações de 1,34 mg/mL, a densidade celular obtida
tem o mesmo perfil que o controle de positivo de inibição (C+). Este resultado é grande
importância, considerando que parte da composição dos extratos fúngicos é extrato de farelo
de trigo, o que poderia ser a causa das similitudes dos resultados obtidos na avaliação dos
extratos sobre a proliferação dos parasitas.
Figura 10- Avaliação da atividade de diferentes concentrações do extrato de farelo de trigo sobre a proliferação de formas epimastigotas de T. cruzi cultivadas durante 8 dias. No controle positivo da inibição da proliferação
dos parasitas (C+) foi utilizada uma solução de Rotenona (60µM) e Antymicina (0.5µM). Como controle
negativo de inibição (C-) foram utilizados parasitas não tratados.
4.4.6 Testes de citotoxicidade com células de Ovários de Hamster Chinês (CHO)
O objetivo principal do experimento foi avaliar o efeito dos extratos e do acetonitrila
sobre a viabilidade das células de mamífero, considerando que uma das etapas ciclo biológico
dos parasitas avaliados neste estudo (T. cruzi e Leishmania amazonenses) é intracelular, o que
é um alvo adicional na busca de tratamentos. Nos ensaios dos tratamentos das células CHO
com os extratos fúngicos (2 mg/mL) e com o extrato de farelo de trigo (1,34 mg/mL), os
valores obtidos da viabilidade celular foram próximos ao zero (Figuras 11a e 11b), o que dizer
que nas concentrações avaliadas os extratos são altamente tóxicos. É por isso que foi feito
outro teste tratando as células com a metade da concentração dos extratos, obtendo como
resultado (Figura 11c) um incremento nos valores da viabilidade celular das células tratadas
47
com os extratos dos cultivos de Saccharicola sp., Trichoderma sp., A. flavus, e do extrato de
farelo de trigo, no entanto estes valores ainda não atingem os valores de viabilidade do
controle de células não tratadas.
Figura 11a.
Figura 11b.
Figura 11c.
Tabela 5- Figuras da avaliação da atividade de diferentes concentrações dos extratos fúngicos e do extrato de
farelo e trigo sobre a viabilidade das células CHO. Como controle negativo (C-) foram utilizadas células não
tratadas. Análises de variância quando p<0,05: (*) Efeito pouco significativo do extrato sobre a viabilidade
celular; (**) Efeito medianamente significativo; (***) Efeito significativo sobre a viabilidade celular.
Extratos_assay1
C-
A. t
erre
us (2
mg/m
L)
Sac
char
icola
sp. (
2mg/m
L)
Fusarium
sp. (
2mg/m
L)
Trichoder
ma
sp. (
2mg/m
L)
A. f
lavu
s (2
mg/m
L)
Pen
icill
ium
pin
ophilum
(2m
g/m)
Farel
o (1.3
4 m
g/mL))
0.0
0.1
0.2
0.3
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
Extratos_assay2
C-
A. t
erre
us (2
mg/m
L)
Sac
char
icola
sp. (
2 m
g/mL)
Fusarium
sp. (
2 m
g/mL)
Trichoder
ma
sp. (
2 m
g/mL)
A. f
lavu
s (2
mg/m
L)
Pen
icill
ium
pin
ophilum
(2m
g/mL)
Farel
o (1.3
4 m
g/mL))
0.0
0.1
0.2
0.3
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
Extratos_assay3
C-
A. t
erre
us (1
mg/m
L)
Sac
char
icola
sp. (
1 m
g/mL)
Fusarium
sp. (
1 m
g/mL)
Trichoder
ma
sp. (
1 m
g/mL)
A. f
lavu
s (1
mg/m
L)
Pen
icill
ium
pin
ophilum
(1m
g/mL)
Farel
o (0.6
7 m
g/mL))
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
***
**
*** ***
**
***
*
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
48
A partir da placa com os cultivos celulares tratados com a metade da concentração dos
extratos, foram feitas observações com o microscópio ótico para determinar o efeito dos
extratos sobre a morfologia das células (Tabela 6). Nas Figuras 12c, 12e e 12h é possível
observar que as células não estão aderidas e espalhadas na superfície da placa, o que sim
acontece no controle com as células não tratadas (Figura 12a) e com as células tratadas com o
extrato de farelo de trigo (Figura 12b). Em relação aos extratos fúngicos, cada extrato
apresentou um efeito de dano celular diferente nas células CHO, caso do extrato do cultivo de
Saccharicola sp. que gerou grumos e alterações na morfologia celular (Figura 12d); células
arredondadas com o extrato do cultivo A. terreus (Figura 12c.) e células alargadas com
partículas no interior com o extrato do cultivo de Trichoderma sp. (Figura 12f.).
Figura 12a- Controle – Células não tratadas.
Figura 12b- Células tratadas com o extrato de farelo
de trigo (0.67 mg/mL).
Figura 12c- Células tratadas com o extrato do cultivo
de A. terreus (1mg/mL).
Figura 12d- Células tratadas com o extrato do cultivo
de Saccharicola sp. (1mg/mL).
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm
49
Figura 12e- Células tratadas com o extrato do cultivo
de Fusarium sp. (1mg/mL).
Figura 12f- Células tratadas como o extrato do
cultivo de Trichoderma sp. (1mg/mL).
Figura 12g- Células tratadas com extrato do cultivo de
A. flavus (1mg/mL).
Figura 12h- Células tratadas com o extrato do cultivo
de P. pinophillum.
Tabela 6- Imagens de microscópio ótico (20X) das células CHO tratadas com os extratos fúngicos (12c; 12d;
12e; 12f; 12g; 12h) (1 mg/mL) e com extrato de farelo de trigo (12b). Controle com células não tratadas (12a.)
Na avaliação do efeito do acetonitrila (0,1 – 1,9 µM) sobre a viabilidade celular
(Tabela 7), foi determinado que concentrações do solvente menores a 0,8 µM não tem um
efeito significativo (quando p<0,05) na viabilidade das células. Esta concentração é superior
às concentrações utilizadas na preparação dos extratos fúngicos (2 mg/mL) e do extrato farelo
de trigo (1,34 mg/mL).
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm
50
Figura 13a.
Figura 13b.
Figura 13c.
Figura 13d.
Tabela 7- Figuras da avaliação da atividade de diferentes concentrações de acetonitrila (0,1 – 1,9 µM) sobre a
viabilidade celular de células CHO (Figuras 13a; 13b; 13c; 13d). Analises de variância quando p<0,05, (ns) =
Efeito não significativo sobre a viabilidade celular das células tratadas com as diferentes concentrações do
acetonitrila.
4.4.7 Testes de atividade antiparasitária com Trypanosoma cruzi - FASE II
Os resultados dos ensaios da FASE I apresentaram uma atividade biológica dos
extratos contra T. cruzi. No entanto nos ensaios foram utilizadas formas epimastigotas dos
parasitas, e segundo o ciclo de vida do parasita (BERN, 2015), este tipo de formas encontra-se
no vector e não no hospedeiro onde é gerada a doença; adicionalmente, as concentrações dos
extratos utilizadas nos tratamentos foram relativamente altas, além que os resultados não são
compráveis com outros estudos É por isto que nesta etapa foram avaliadas formas
tripomastigotas do parasita, assim como diferentes concentrações dos extratos (300 µg/mL –
2,3 µg/mL) dos cultivos de Trichoderma sp. e Penicilluim pinophillum, e o extrato de farelo
de trigo, para assim determinar os valores do IC50 (Tabela 8). Os experimentos foram feitos
MTT_CHO07-05-14
C-
0.1
uM
0.2
uM
0.4
uM
0.8
uM
1.1
uM
1.5
uM
1.9
uM
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4ns
***
Acetonitrila
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
MTT_CHO 12-05-14
C-
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.8
uM
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
ns
Acetonitrila
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
MTT_CHO 09-05-14(2)
C-
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
uM
0.7
uM
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
ns
Acetonitrila
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
MTT_CHO 09-05-14 (1)
C-
0.1
uM
0.2
uM
0.3
uM
0.4
uM
0.5
uM
0.6
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uM
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0.4
ns
Acetonitrila
Cell V
iab
ilit
y (
ab
s 5
95-6
90 n
m)
51
no Laboratório de Toxicologia Aplicada do Instituto Adolfo Lutz, coordenado pelo Professor
Doutor André Tempone.
Tabela 8- Valores da concentração inibitória de 50 % dos parasitas (tripomastigotas de T. cruzi) tratados como
as frações do extrato de farelo de trigo, e dos cultivos dos Trichoderma sp. e Penicillium pinophillum com
concentrações entre 300 µg/mL e 2,35 µg/mL; Como controle positivo de inibição foi usada a droga padrão
Benzonidazole; CI95%: 95% de intervalo de confiança);* (SANTOS et al., 2015).
Partindo dos valores de IC50 obtidos nos ensaios de formas tripomastigostas tratadas
com o extrato de farelo de trigo (IC50= 11.26) e com os extratos fúngicos de Trichoderma sp.
(IC50=10.69) e Penicillium pinophillum (IC50= 20.47), destaca-se a diferença com o valor
obtido com o fármaco padrão benzonidazol (IC50= 139.00). Apesar de obter atividades
promissárias é necessário isolar os compostos presentes nos extratos dado que a resposta
obtida poderia ser a causa de um efeito sinérgico; adicionalmente é necessário determinar a
sua concentração citotóxica (CC50), para assim determinar o índice de seletividade. Na
avaliação da viabilidade de um composto de interesse é necessário determinar a sua
toxicidade a traves da relação entre os valores do IC50 e da CC50 (IC50/CC50), quanto menor a
concentração do composto para causar a morte do parasita, mais eficaz ele é. Por outro lado,
com as células de mamífero devem-se apresentar valores mais altos, pois quanto maior a
concentração necessária para produzir a morte da célula saudável, maior é a resistência da
célula frente ao composto. Deve-se ressaltar que o extrato de farelo de trigo apresentou
atividade, o que foi uma constante nos ensaios feitos com os parasitas, e poderia ser inferido
que ele é a causa da atividade obtida com os extratos fúngicos, considerando que parte da sua
composição é farelo de trigo.
Segundo Prückler et al. (2014), anualmente são produzidas mais de 650 milhões de
toneladas de trigo no mundo, sendo o farelo o seu principal subproduto, que desde o ponto de
vista histológico, é composto de tecidos diferentes com distintas propriedades e composições,
AMOSTRAS
IC50 (µg/mL) CI 95%
Tripomastigotes de T. cruzi
Extrato de Farelo de trigo
(Fração 1)
11,26
(7,71 – 16,43)
Extrato do cultivo de
Trichoderma sp.
(Fração 3)
10,69
(8,78 – 13,02)
Extrato do cultivo de
Penicillium pinophillum
(Fração 5)
20,47
(7,34 – 57,04)
Benzonidazole*
139,00
(118,80 – 162,74)
52
incluindo componentes menores como flavonoides, lignanos e compostos fenólicos como
ácidos fenólicos e alkylresorcinois (lipídios fenólicos), os quais apresentam atividades como
antimicrobianos, anti-inflamatórios, antioxidantes e anticancerígenos (APPRICH et al., 2014).
Embora na literatura não seja reportado o efeito anti- T. cruzi a partir de compostos
isolados do farelo de trigo, os estudos de Grecco et al. (2014) apresentaram uma atividade in
vitro anti-Leishmania e anti-T. cruzi gerada por derivados fenólicos isolados da planta
Baccharis uncinella tratada com etanol, usada na medicina popular para o controle ou
tratamento de várias doenças como malária, úlceras, diabetes, anemia, diarreia, inflamações
urinárias, amigdalite e infecções parasitárias (FABIANE et al., 2008).
O farelo de trigo contém entre 3,5 e 3,9% de graxas (APPRICH et al., 2014), e dentro
dos ácidos graxos insaturados os mais abundantes são o ácido linoleico e o ácido oleico com
57% e 15% respectivamente; dentre os ácidos graxos saturados presentes o ácido palmítico é
o mais abundante com 18% (EL-SHAMI et al., 2011; JUNG et al., 2010). O anterior é de
grande importância considerando os resultados obtidos neste estudo, incluindo as
características dos extratos e as análises de RMN, CCDS e CG/EM (Apêndice F), os quais
indicaram a presença de ácidos graxos nas amostras, o que poderia estar diretamente
relacionado com os resultados obtidos na avaliação da atividade biológica dos extratos com os
parasitas, levando em conta as informações e os resultados obtidos no estudo de Cunningham,
Kazan e Kuwahara (1972), no qual foi avaliado o efeito de diferentes ácidos graxos de cadeia
longa como os ácidos Esteárico, Láurico, Linoleico, Behénico, Araquídico, Mirístico e
Palmítico, sobre vários parasitas da família Trypanosomatidae, incluindo T. cruzi (nas formas
epimastigota e tripomastigota) e duas espécies de Leishmania; obtendo como resultado que
este tipo de compostos podem induzir a lisis dos parasitas flagelados tratados, assim como
possíveis alterações na sua morfologia. Apesar de que vários ácidos graxos são fatores de
crescimento em T. cruzi, pode-se esperar que o mecanismo para o transporte de ácidos graxos
através da membrana seja relativamente especifico, portanto ácidos graxos tóxicos para o
parasita poderiam-se ligar em proteínas transportadoras e penetrar a membrana do organismo
sem ser transportado no interior da célula, gerando assim instabilidade e perturbações na sua
estrutura. A interrupção irá depender da natureza do ácido, a concentração, a estrutura da
membrana e a capacidade do sistema de transporte de reconhecer os ácidos graxos
(CUNNINGHAM, KAZAN E KUWAHARA, 1972).
53
4.5 Determinação da espécie da cepa Trichoderma sp. (CBMAI 1018)
Segundo as análises para identificar a espécie do fungo Trichoderma sp. (CBMAI
1018), realizadas no Laboratório de Micotoxinas do Departamento de Microbiologia do
ICB/USP, coordenado pelo Professor Doutor Benedito Correa, foi determinado (com uma
porcentagem de identidade de 99%) que a espécie do fungo é: Trichoderma koningiopsis.
Este fungo é considerado uma espécie comum, cosmopolita e essencialmente tropical
(SAMUELS et al., 2006); e como endofítico segundo o estudo de Razinger et al. (2014), e
com potencial como biocontrolador segundo Saxena, Raghuwanshi e Singh (2015).
Espécies de Trichoderma caracterizam-se pelo seu crescimento rápido, capacidade
para degradar diversos substratos, promover o crescimento vegetal, pela sua capacidade de
produção de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana, enzimas (hemicelulase,
celulase), resistência a produtos químicos nocivos, expressão de proteínas heterólogas e pelo
uso como agentes de controle de nematódos e fungos patógenos de plantas (CARVAJAL,
ORDUZ e BISSET et al., 2009; CORONA et al., 2008; LOPES et al., 2012; QUINTERO et
al., 2013; SANTOS et al., 2012; SUN et al., 2012; XIA et al., 2011). Enquanto Trichoderma
não é patogénico em mamíferos saudáveis, há um número crescente de indivíduos
imunocomprometidos que sofrem de infecções oportunistas por algumas espécies, assim
como a produção de reações alérgicas geradas por compostos voláteis (BŁASZCZYK et al.,
2011).
Não foram encontradas publicações que indiquem que o fungo
Trichoderma koningiopsis seja produtor de compostos antiparasitários, ou compostos do
grupo das estatinas. No entanto a sua identificação vai contribuir no melhoramento da base de
dados do CBMAI, assim como na possível geração de projetos baseando-se em suas
características.
54
5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
Com base nos resultados obtidos na avaliação da capacidade de produção de estatinas
por os fungos filamentosos Saccharicola sp. (CBMAI 1030); Fusarium sp. (CBMAI 1015);
Trichoderma koningiopsis (CBMAI 1018); Aspergillus flavus (CBMAI 1023) e
Penicillium pinophillum (CBMAI 1022) mediante um cultivo em semi-sólido, determinou-se
que nas condições de cultivo utilizadas neste estudo os fungos avaliados não produzem este
tipo de moléculas.
Ao não ser possível separar a biomassa fúngica do substrato dos cultivos (farelo de
trigo), não foi possível determinar se os compostos produzidos pelos fungos poderiam gerar
um efeito antiparasitário. É por isso que sugere-se modificar as condições de cultivo dos
fungos de tal forma que no momento da extração dos metabolitos o substrato utilizado não
esteja presente. Isto também vai contribuir na etapa de purificação das frações de interesse.
De igual forma, sugere-se modificar o sistema de solventes visando extrair um espectro maior
de metabolitos, levando em conta que neste estudo só foi utilizado um único sistema de
extração, focado na extração das moléculas alvo, as estatinas. É importante ressaltar que em
estudos prévios, os extratos do grupo de fungos selecionados cultivados em meio liquido,
apresentaram atividade antimicrobiana sobre bactérias e fungos.
Destacam-se os resultados obtidos nos testes de atividade antiparasitária do extrato de
farelo de trigo, especialmente os resultados da atividade sobre as formas epimastigota e
tripomastigota de T. cruzi, considerando que é o agente causal de uma doença negligenciada
que precisa de novas alternativas para ser tratada, e o farelo de trigo apesar de ser um
substrato amplamente estudado, não há estudos descrevendo o efeito obtido, portanto poderia
ser um possível objeto de estudo na busca de compostos com atividade antiparasitária.
A pesar das dificuldades de trabalhar com produtos naturais, este tipo de produtos é de
grande importância para a expansão da diversidade de compostos químicos, assim como a
geração de produtos de alto impacto, lembrando que tem sido a principal fonte de moléculas
para o desenvolvimento de drogas para diferentes usos terapêuticos. Esta variedade de
compostos está diretamente relacionada com a biodiversidade, e o Brasil, país imensamente
biodiverso, tem um grande potencial de bioprospecção.
55
*De acordo com:
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação:
referências: elaboração. Rio de Janeiro, 2002.
REFERÊNCIAS*
ALBERTS, A. Discovery, biochemistry and biology of Lovastatin. The American Journal
of Cardiology, v. 62, p. 10J–15J, 1988.
APPRICH, S.; TIRPANALAN, Ö.; HELL, J.; REISINGER, M.; BÖHMDORFER, S.;
SIEBENHANDL-EHN, S.; NOVALIN, S.; KNEIFEL, W. Wheat bran-based biorefinery 2:
Valorization of products. LWT - Food Science and Technology, v. 56, p. 222–231, 2014.
ARRUDA, D.; D’ALEXANDRI, F.; KATZIN, A.; ULIANA, S. Antileishmanial Activity of
the Terpene Nerolidol. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 49, n. 5, p. 1679–1687,