Resistenza genetica alle malattie negli animali da reddito: presente e futuro Fattori genetici di Fattori genetici di resistenza/suscettibilit resistenza/suscettibilit à à alla scrapie alla scrapie nella capra nella capra Simone Peletto Torino – 16 maggio 2013
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Resistenza genetica alle malattie negli animali da reddito: presente e futuro
Fattori genetici di Fattori genetici di resistenza/suscettibilitresistenza/suscettibilitàà alla scrapie alla scrapie
nella capranella capra
Simone Peletto
Torino – 16 maggio 2013
La suscettibilità alla TSE è influenzata dai polimorfismi del gene PRNP
Polimorfismo: presenza di diverse forme (alleli) di uno stesso gene all’interno di una specie o razza
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Polimorfismi del gene PRNP
I142MI142M
Associato con un allungamento del periodo di incubazione in capre inoculate con scrapie e BSE e con aumento di resistenza alla scrapie naturale in uno studio caso-controllo francese
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R154HR154H
Associato con moderata protezione nei confronti della scrapie classica in studi caso-controllo in Grecia, Italia, Cipro e Francia.Associato con elevata suscettibilità alla scrapie atipica in uno studio caso-controllo italiano
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R211QR211QAssociato con resistenza in studi caso-controllo francesi e in Spagna
N146S/D N146S/D Associato con resistenza in studi caso-controllo a Cipro
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Q222KQ222KAnalizzati 177 capre di cui 25 positive, da 6 focolai: il polimorfismo K222 è risultato statisticamente associato ai controlli, assente in tutti i casi (P-value: 0.029)
La Lisina al codone 222 sembra quindi agire quale fattore di resistenza verso la scrapie classica
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Stessa associazione trovata da:
• Vaccari in Italia
• Barillet e Corbiere in Francia
• Bouzalas in Grecia
• Indagare l’effetto del polimorfismo al codone 222 sulla suscettibilità alla scrapie classica nella capra tramite infezione sperimentale
• Studio della sintomatologia clinica e della distribuzione della PrPSc nell’organismo nella scrapie classica
Scopo del lavoroScopo del lavoro
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Materiali e MetodiMateriali e Metodi
• Selezione dei soggetti con genotipo adeguato per le prove di infezione sperimentale (10 caprini di cui 5 di genotipo 222 Q/Q e 5 222 Q/K).
Scrapie classica i.c. (0.5 ml)
Q/Q Q/K
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• Gli animali sono stati trasportati allo stabulario dell’IZS di Brescia, in cui sono state condotte le prove sperimentali, ed inoculati a 5 mesi di età.
• Registrazione dei segni clinici giornaliera, visita clinica mensile
• Esame autoptico sugli animali deceduti e prelievo di campioni di tessuto.
• Diagnosi di scrapie mediante test rapido (TeSeE Sheep and goat; BIORAD) esame istologico, immunoistochimico e Wb
Materiali e MetodiMateriali e Metodi
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RisultatiRisultati
GenotipoGenotipo Animali Animali decedutideceduti
Animali Animali positivipositivi
Tempo medio di Tempo medio di sopravvivenzasopravvivenza
Durata Durata sintomisintomi
222Q/Q222Q/Q 5/55/5 5/55/5 569 giorni569 giorni 33--20 20 giornigiorni
222Q/K222Q/K 1/51/5 0/50/5 1458 giorni1458 giorni ------
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L’analisi statistica ha dimostrato che la probabilità di sopravvivenzadelle capre Q/K 222 versus le capre Q/Q 222 è significativamentemaggiore (χ2= 9.34, p = 0.002).
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 500 1000 1500giorni di sopravvivenza
Q/K Q/Q
Curve di sopravvivenza Kaplan-Meier
La prova sperimentale conferma l’associazione di K222 con resistenza
alla scrapie
K222 candidato a costituire il fattore genetico da utilizzare per il controllo
della scrapie caprina
ConclusioniConclusioni
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Elementi necessari per stabilire
l’applicabilità della selezione genetica
• Identificazione di polimorfismi associati a resistenza e valutazione del loro grado di protezione
• Correlazione polimorfismi-ceppi di EST
• Frequenza dei polimorfismi nelle diverse popolazioni e razze
• Possibili effetti sui caratteri produttivi
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Frequenza dei polimorfismi nelle diverse popolazioni e razze
*CA= Camosciata delle Alpi; *CA= Camosciata delle Alpi; SA=SA= SaanenSaanen ; ; RO=RO= RoccaveranoRoccaverano ; ; VA=VA= Valdostana; Valdostana; GA=GA= GarganicaGarganica ; ; MA=MA= Maltese; Maltese; IO=IO= Ionica; Ionica; RM=RM= Red Red MediterraneanMediterranean
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Effetti sui caratteri produttivi?Effetti sui caratteri produttivi?
Un notevole numero di studi e dataset è oggi disponibile per valutare effetti della selezione sui caratteri produttivi nelle pecore, ma non vi sono dati relativi alle capre.
La probabilità che vi siano effetti collaterali associati alla selezione di alcune varianti alleliche nelle capre èconsiderata in generale bassa.
Rimane comunque il rischio di un “effetto fondatore”.
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AIMS:
Provide scientific support for genetic selection to control goatTSEs & mobilize goat sector to implement genetics-basedresistance breeding programs, focusing on three issues:
1) Strengthening scientific data on link between TSE resistance & candidate PrP alleles.
2) Involving goat sector in participating countries to generate a reservoir of resistance allele carriers & recording production trait information.
3) Providing information towards policy makers & goat sectorabout strategies to control TSEs in goat herds at European, national or regional scale.
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Progetto GOAT-TSE-FREE EMIDA National Working Document – Italia
Livello Nazionale
• Obiettivo: identificare becchi resistenti alla scrapie classica nel gruppo di becchi controllato da ASSONAPA e valutarne il possibile impiego come diffusori dell’allele di resistenza.
• Azioni: ASSONAPA produrrà un elenco di becchi da genotipizzare. I campioni verranno inviati a IZSTO che effettuerà l’analisi al codone 222, al fine della ricerca di becchi portatori dell’allele di resistenza K222.
• I risultati ottenuti verranno valutati collegialmente ai fini diindagare la fattibilità di un piano di selezione genetica in Italia.
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Regione Sardegna
Sono stati presi contatti con l’associazione provinciale allevatori (APA) della provincia di Nuoro ed Ogliastra. Nella razza Sarda la frequenza dell’allele K222 è stata stimata intorno al 4%.
• Obiettivo: Esistendo una banca dati delle produzioni, il lavoro sarà principalmente orientato a stabilire correlazioni tra K222 e produzioni.
Regione Sicilia
Sono stati presi contatti con allevatori interessati e con i responsabili regionali Agricoltura. E’ stato fatto un piano di campionamento su razze autoctone, anche se non iscritte ai libri: Maltese, Girgentana, Rossa Mediterranea, Argentata dell’Etna e Messinese.
• Obiettivo: stimare la frequenza dell’allele di resistenza e la variabilità genetica nelle razze siciliane.
• Nuovo gene riportato da Premzl et al. (2003) in zebrafish
• Comprende due esoni, con l’intera open reading frame (ORF)
contenuta nell’esone 2
• Codifica per una proteina di 130-150 aminoacidi (Shadoo)
• Il gene è stato chiamato SPRN (Shadow of Prion Protein)
• Il gene SPRN è stato identificato in pesci (zebrafish, fugu) e
mammiferi
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PRND
PRNP
SPRN
La glicoproteina Shadoo ha proprietàprotettive PrPC-like e mostra livelli ridottinelle infezioni prionicheWatts et al., EMBO J (2007) 26, 4038–4050
Approfondire la variabilità del gene SPRN nella capra e di
effettuare uno studio caso-controllo per individuare
un’eventuale associazione tra mutazioni e
suscettibilità/resistenza alla malattia
Approfondire la variabilità del gene SPRN nella capra e di
effettuare uno studio caso-controllo per individuare
un’eventuale associazione tra mutazioni e
suscettibilità/resistenza alla malattia
Scopo del lavoroScopo del lavoro
Materiali e Metodi• 21 capre scrapie POSITIVE
• 403 controlli NEGATIVI da focolaio
• PCR dell’intera ORF e frammento della 3’UTR
� Analisi statistica:
• Test del chi-quadro
• Analisi multivariata
• Modello di simulazione (Monte Carlo)
gene SPRN
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Nella ORF, la maggior parte dei polimorfismi identificati risultano
essere mutazioni sinonime
Nella ORF, la maggior parte dei polimorfismi identificati risultano
essere mutazioni sinonime
Analisi multivariata ha escluso confondenti (età, focolaio).Possibile bias effetto prevalente del gene PRNP
(esclusi 49 controlli 222K, modello di simulazione per allele 154H)
Human precursor miR-149
stem-loop is processed into
two miRNAs, miR-149 and
miR-149*(adapted from the miRBase;
http://microrna.sanger.ac.uk/sequence
s/index.shtml)
L’analisi in silico per la ricerca di siti target di microRNA effettuata con il
programma Patrocles (http://www.patrocles.org) ha predetto multipli siti di
legame putativi per miR-149* in questa regione specifica del gene SPRN
L’analisi in silico per la ricerca di siti target di microRNA effettuata con il
programma Patrocles (http://www.patrocles.org) ha predetto multipli siti di
legame putativi per miR-149* in questa regione specifica del gene SPRN
miR-149 expression levels at various tissues
(www.microrna.org)
Midbrain
Frontal cortex
miR-149* has been demonstrated to be involved in apoptosis inductionin neuroblastoma, Be2C and HeLa cells (Lin et al., 2010)