FALLSTUDIE DNA MICROARRAY …Die DNA CHIPs sowie die cDNA wird erhitzt, damit die doppelsträngigen Moleküle denaturieren und sich später wieder aneinander anlagern können. Anschliessend

Illustration 1: High density OGT custom DNA microarray, http://www.combichem.co.uk/research/DNAmicroarraytechnologiesPNA.htm

FALLSTUDIE MIKROSYSTEMTECHNIK DNA MICROARRAY

LST TZ 2008, Gruppe TZ-A-2011 Lukas Camenzind, Marco Pegurri, Baris SaricaJuni 2011

InhaltsverzeichnisEinleitung.............................................................................................................................................2Funktion................................................................................................................................................3Arten.....................................................................................................................................................5Herstellung...........................................................................................................................................5

Presynthesized.................................................................................................................................6In situ Synthese................................................................................................................................7

Einsatzgebiete.......................................................................................................................................8Beispiele in der Leukämie und Brustkrebsforschung....................................................................10

Ausblick..............................................................................................................................................11Literaturverzeichnis............................................................................................................................12Abbildungsverzeichnis.......................................................................................................................13

1

EinleitungEin gesamtes Genom zu entschlüsseln, stellt schon seit geraumer Zeit kein grosses Problem mehr

dar. 2001 wurde durch das Human Genom Project das menschliche Genom vollständig

entschlüsselt. Doch allein mit der Kenntnis einer Basenpaarabfolge lässt sich noch keine Aussage

über Gene und deren Proteine machen. Die Genexpression ist wichtig für das Verständnis

physiologischer und pathologischer Prozesse und es lassen sich Rückschlüsse über

Umwelteinflüsse machen. Dank der Microarray Technologie ist es möglich die Genexpression

schnell und einfach zu untersuchen. Innerhalb kürzester Zeit liefert ein Chip die Resultate von

einigen tausend bis zehntausend Reaktionen unter Verwendung sehr geringen Probenmaterials. Die

ersten Mikroarrays wurden durch photolithographische Verfahren hergestellt, was sonst zur

Fertigung integrierter Schaltkreise („Computerchips“) genutzt wird, deshalb findet man häufig auch

den Begriff „DNA-Chip“.

DNA-Microarray’s werden aber nicht nur in der Genetik eingesetzt, sondern finden in vielen

verschiedenen Forschungsgebieten, wie med. Diagnostik, Pharmazie oder Mikrobiologie ihren

Einsatz. In der Medizin wird diese Technik vor allem in der Tumordiagnostik eingesetzt. Dank

dieser Methode lassen sich Tumore frühzeitig identifizieren und deren Entwicklung besser

prognostizieren.

In dieser Seminararbeit soll das Thema der DNA-Microarray Technologie näher besprochen

werden. Das Schwergewicht der Arbeit liegt im Aufbau und Funktion von Microarrays sowie deren

Herstellung und Einsatzgebiete. Abschliessend wird ein Blick in die Zukunft geworfen, um die

Richtung der Entwicklung dieser Technologie aufzuzeigen.

2

FunktionMittels DNA-Micorarray wird entweder die Menge an mRNA (messenger RNA) eines Genoms

oder die rRNA (ribosmale RNA) eines Organismus detektiert. Die mRNA ist eine Kopie eines

bestimmten Gens, welches anschliessend durch die Ribosomen in ein Protein umgeschrieben wird,

somit zeigt die Menge an mRNA die Aktivität eines Gens in einer Zelle dar. Je nach Art,

Konditionierung oder Krankheit einer Zelle kann die Genexpression ändern. Eine Tumorzelle hat

z.B. eine ganz andere Physiologie als eine normale Zelle, was sich mit einem DNA-Chip ganz

einfach und schnell aufzeigen lässt.

Es gibt Grundsätzlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays (dazu in nächsten Abschnitt

mehr), solche mit cDNA resp. PCR Produkten die auf ein Trägermaterial gedruckt werden „Spotted

Microarray“ und solche mit künstlich hergestellten Oligonucleotiden –„Oligonucleotide

Microarrays“. Diese DNA-Fragmente werden wie in einem Raster auf Spots von ca. 10-100µm

Durchmesser auf das Trägermaterial aufgebracht und immobilisiert. Aus einer Gendatenbank

werden die entsprechenden Gensequenzen, welche für eine spezifische Anwendung interessieren,

ausgesucht. Somit lassen sich für jede Charakterisierung von Zellen oder Tumoren diejenigen Gene

anschauen, die von Interesse sind.

Das Probenmaterial wird aus einer Gewebeprobe gesammelt. Die RNA wird aus der jeweiligen

Probe extrahiert, dazu gibt es verschiedene Kits. Die Extraktion ist aber dennoch sehr schwierig, da

die RNA sehr instabil ist. Um die RNA aus den Zellen zu isolieren, müssen die Zellen zerstört

werden. Dazu kommt das gekühlte Gewebe zusammen mit einer Metallkugel in ein Gefäß, das sehr

schnell geschüttelt wird. Dabei pulverisiert die Metallkugel das gefrorene Gewebe. Anschließend

werden RNAse-deaktivierende Chemikalien zugegeben. Nun kann die RNA bei Raumtemperatur

aus dem Gemisch isoliert werden. Als nächstes wird die RNA mittels Reverser Transrkitption in

cDNA umgewandelt. Dies ist nötig, da auf dem CHIP ebenfalls cDNA ist. Während dieses

Prozesses werden Fluoreszenzmoleküle in die DNA eingebaut. Die DNA CHIPs sowie die cDNA

wird erhitzt, damit die doppelsträngigen Moleküle denaturieren und sich später wieder aneinander

anlagern können. Anschliessend wird die DNA Lösung über Nacht auf dem CHIP inkubiert. Durch

Hybridisierung lagern sich die Proben, der DNA spezifischen Moleküle, auf dem Microarray an.

Überschüssige DNA wird vor der Messung weggewaschen1, 2, 3.

3

Zum Schluss wird der DNA-Chip in einem Laser-Scanner

untersucht. Bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert

der Farbstoff. Je besser, d.h. je mehr cDNA auf einen Spot

gebunden haben, desto stärker wird das Signal. Ein

Computerprogramm wertet das entstandene Bild aus, womit

nun Rückschlüsse über die Genexpression einer Probe

gemacht werden kann. Will man die Genexpression in zwei

verschiedenen Geweben miteinander vergleichen, kann man

für jedes Gewebe einen anderen Fluoreszenzfarbstoff

benutzen (zum Beispiel einen, der grün fluoresziert, und

einen, der rot fluoresziert). Die cDNA von beiden Geweben

wird dann gleichzeitig auf den Chip zum Hybridisieren

gegeben. Anschließend werden im Scanner die beiden

Farbstoffe mit den entsprechenden Wellenlängen angeregt. Je nach dem, in welchem Gewebe ein

Gen exprimiert wurde, gibt es anschließend dunkle Spots (in keinem Gewebe vorkommende

Sequenz), rote bzw. grüne (jeweils nur in einem der beiden Gewebe vorkommende Sequenz) und

gelbe Spots (wenn die Sequenz in beiden Geweben exprimiert wurde: rot + grün = gelb).

4

Illustration 4: Visualisierung der Genexpression mit verschiedenen Farben, http://www.microarray.ntnu.no/html/micrarray_scanning_services.html

Illustration 2: Prinzip eines Microarray-Experiments, http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/lehre/ws06/sem_inferenz/Microarrays_CDreischer.pdf

Illustration 3:DNA Microarray- Chip, http://www.agilent.com/

ArtenEs gibt hauptsächlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche, bei denen

cDNA, Oligonukleotide oder Fragmente von PCR-Produkten die der mRNA entsprechen auf das

Trägermaterial gedruckt werden ("Spotted Microarrays") und solche, die auf synthetisch

hergestellten Oligonukleotiden beruhen ("Oligonukleotide Microarrays"). Diese dienen als Sonden,

die an definierte Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von

der Art der verwendeten Arrays wird RNA zunächst aus dem zu untersuchenden Objekt extrahiert

und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten in cDNA oder cRNA

umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Eine bedeutende Ausnahme

stellen sogenannte Phylochips dar. Hier wird DNA extrahiert, amplifiziert, und auf dem Array mit

organismenspezifischen Sonden hybridisiert. Bei der Hybridisierung binden markierte

einzelsträngige DNA/cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array.

Nach Abwaschen der nicht gebundenen DNA/cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal

jeder Position des DNA-Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität wird

üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekten, verschieden guten Extraktionen und anderen

Effekten Rechnung zu tragen4.

HerstellungBei den Herstellungsarten wird unterschieden, ob auf dem Substrat bereits komplette DNA

Sequenzen angebracht werden sollen (presynthesized DNA- Sequences), oder ob die

Nukleotidsequenzen später direkt auf dem Wafer synthetisiert werden (in situ Synthese).

Es kommt eine grosse Auswahl an Herstellungsverfahren zum Einsatz, so kann das Substrat z.B.

mit feinen Spitzen, im Ink-Jet verfahren, per Photolitographie über vorgefertigte Masken oder

elektrochemisch bedruckt werden.

Als Substrat werden u.a. Speziell beschichtete Kunststoffe, Gläser oder Silizium verwendet5.

Das verwendete Substrat wird zuerst aufgereinigt, dann beschichtet. Als Reinigungsmethode für

Siliziumsubstrate kann die Substratoberfläche mit alkalischen Glasreinigern behandelt werden, um

Schmutzpartikel und hydrophobe Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Über eine

Hydroxylierung entsteht auf der Substratoberfläche eine Oxidschicht, welche die

Siliziumoberfläche negativ lädt6.

Bei der darauf folgenden Beschichtung (z.B. über Layer-by-Layer Technik) werden Polyelektrolyt-

Multischichten auf der Substratoberfläche abgeschieden6, 7.

5

Presynthesized

Hierbei dienen im vorraus synthetisierte Oligonukleotide, cDNA oder Fragmente von PCR-

Produkten als Sonden. Nach der Synthetisierung werden sie auf der Array- Oberfläche angelagert.

Die Sonden werden mittels mechanischem Microspotting oder Inkjetting auf dem Träger

angebracht. In der Regel werden diese Arrays für spezifische Aufgaben vorgefertigt.

Derzeit sind viele verschiedene Produkte auf dem Markt erhältlich, die Plattform “CodeLink” des

Herstellers GE Healthcare z.B. setzt silanisierte Glasslides ein. Das Funktionsprinzip des

“CodeLink” Produkts basiert auf der kovalenten immobilisierung von Amino- modifizierter DNA.

Das Produkt der Firma Applied Biosystems, “Genome Survey Microarray”, basiert auf

Glassubstraten mit Nylonbeschichtung. 60- basige Oligonukletide dienen als Probes wobei

schlussendlich über Chemilumineszenz Ausgewertet wird8.

6

Illustration 5: Spottingprozess mittels "ink-stamping", http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Printing/Microarray_Pins_ChipMaker_Tech/microarray_pins_chipmaker_tech.html

In situ Synthese

Bei der in situ Synthese werden die angestrebten Nukleotidsequenzen direkt auf der Trägematrix

synthetisiert. Je länger die Sequenz wird, desto aufwändiger ist die Herstellung.

Der Vorteil der in situ Synthese liegt vorallem darin, dass man auf teure, vorgefertigte Arrays

(Design, Herstellung, Qualitätskontrolle) verzichten kann. Jedes Array kann spezifisch,

kostensparend synthetisiert werden9

Eine von Ryan D. Egeland et al. vorgeschlagene Methode, Arrays in situ zu synthetisieren besteht

darin, dass man Korrosionsbeständige 40μm breite, Elektroden als Druckwerkzeuge verwendet. So

lassen sich mit einem Werkzeug beliebig viele Arrays herstellen. Als Herstellungsverfahren für die

Elektroden kommt Dünnfilm- Litographie zum Einsatz.

Hierbei setzt die Oxidation einer

Elektrolytlösung, nach anlegen einer

Spannung an den Mikroelektroden,

Säure an den Anoden frei. Die

gleichzeitige Reduktion an der Kathode

reduziert die Säure. Die Ionen und

Radikale, die durch diese Redox-

Reaktionen an der

Elektrodenoberfläche erzeugt werden,

wandern weg von den Elektroden, hin

zum Substrat (durch eine Kombination

von Diffusions-, Konvektions- und

Migrationseffekten). Während dieser

Laufzeit können die

Elektrodenprodukte weiter reagieren.

Sobald die primären oder sekundären

Produkte das Substrat erreicht haben,

können sie entweder die

Schutzgruppen entfernen

(deblockieren), die Kopplung der

nächsten Nukleotide erleichtern oder

die bereits synthetisierten Oligonukleotide zerstören10.

7

Illustration 6: Chemischer Reaktionszyklus der in Situ Synthese nach Egeland et al, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183109/figure/fig3/

EinsatzgebieteDie DNA Microarray sind ein wichtiges Werkzeug in der Forschung. Sie gehören heute zu den

wichtigsten Instrumenten in der biomedizinischen Forschung. Sie sind unerlässlich zur effizienten

Analyse von biologischen Prozessen. Was zu Anfangszeiten vor allem in der Genanalyse genutzt,

findet heute mehr und mehr Nutzen in verschiedensten Bereichen. Inzwischen profitieren auch die

molekulare Medizin, die Pharmaforschung sowie die Lebensmittel- oder Umweltanalytik von dieser

Technologie. Sie bieten die Möglichkeit im Bereich der Pharmaforschung um mögliche Wirkstoffe

aus einer Menge von Substanzen herauszupicken. Genetisch veränderte Lebensmittel können des

Weiteren in der Lebensmittelindustrie eruiert werden. Weiter ist es auch möglich, verschiedenste

Keime in Lebensmittel nachzuweisen. Im Bereich Umweltschutz können Microarrays in der

Analyse von Bakterien in Klärschlamm eingesetzt werden11. Die molekulare Medizin befasst sich

vor allem mit der Genexpressionsanalyse, sie bezeichnet eine Untersuchung der Umsetzung der

genetischen Information (Genexpression) mit molekularbiologischen und biochemischen

Methoden12. Einen grossen Nutzen findet die Genexpression in der Onkologie (Krebsforschung). Im

folgenden Abschnitt wird nun die Anwendung von DNA Microarray in der Tumordiagnostik

besprochen.

Mit Hilfe der Technik ist es heute möglich, mit einer hohen Sensitivität und Spezifität genomweit

quantitative Genexpressionsanalysen durchzuführen13. Genexpressionsanalysen mit der Microarray-

Technologie stellen einen Ansatz dar, mit welchem die Diagnostik von Tumoren schneller, sicherer

und exakter zu gestalten um gleichzeitig den Aufwand zu reduzieren. Diese Analyse ermöglicht eine

Analyse von mehreren zehntausend Gene in kürzester Zeit und verschafft damit einen Grossteil des

Genbestands, während man mit anderen Technologien wie PCR oder FISH nur eine oder wenige

ausgewählte Gensonden einsetzen konnte. Sämtliche Microarray basierte Genexpressionsanalysen

lassen sich auf das Prinzip der Hybridisierung, welche in dieser Arbeit unter dem Kapitel

„Funktion“ beschrieben ist, zurückführen14.

„Die Krebsforschung hat mit Hilfe der Microarray-Technologie enorme Fortschritte gemacht.

Mittlerweile können für viele Tumore molekulare Untergruppen von Patienten aufgrund von

Unterschieden in komplexen genomischen, epigenetischen oder transkriptionellen Mustern

bestimmt werden, bis hin zur Definition gänzlich neuer Tumorentitäten.“15

Im Folgenden werden die Anwendungen von Microarrays anhand von Beispielen in der Leukämie

wie auch der Brustkrebsforschung erläutert.

8

Illustration 8: Vergleich normale Zellen mit Tumor Zellen mittels Microarray

Illustration 7: Röntgenaufnahme bei einer Brustkrebspatientin

9

Illustration 10: DualChip Human breast cancer

Beispiele in der Leukämie und Brustkrebsforschung

Erste grosse Meilensteine in der Tumorforschung, mittels der Microarray Technologie, wurde im

Bereich der Diagnostik von Leukämie erzielt. Hierbei gelang es einer Gruppe von Wissenschaftlern

mit Hilfe von der Genexpressionsanalyse eine Klassifikation von ALL nach zytogenetischen,

immunologischen und molekularen Subtypen vorzunehmen. Weiter konnte anhand der Analyse eine

Aussage über den Erfolg der Therapie wie auch Rezidivrisikos gemacht werden. Der Einsatz von

Microarray erlaubt eine bessere Klassifikation und weiter auch detaillierte Aussagen bezüglich

Therapieansprechens, Rezidivhäufigkeit und therapie-assoziierter Sekundärneoplsien. In der

Brustkrebsforschung wurde durch die Entwicklung eines „Dual Chip human breast cancer„ die

Möglichkeit gegeben, hochparallele Analysen differentieller Genexpression in Krebszellen zu

ermöglichen. Durch das Screening vieler verschiedener Tumore geben diese Aufschluss über die

Klassifizierung unterschiedlichster Krebsformen und Stadien. Da jeder Tumor sich in Bezug auf

deren Ursprung unterscheidet, ist es wichtig möglichst viele verschiedene Tumore auf molekularer

Ebene zu untersuchen16. Der „Dual Chip human breast cancer“ enthält über 210 relevante

Brustkrebsgene. Fehlfunktionen dieser Gene werden direkt mit der Entstehung von Brustkrebs in

Verbindung gebracht. Ziel ist nebst der erfolgreichen Klassifizierung und Charakterisierung eine

exakte Prognose und therapeutische Massnahmen für den Patienten zu definieren16.

Illustration 9: DualChip human breast cancer

10

AusblickDie DNA Microarray Chip Technologie ermöglicht eine vielfältige und schnelle Analyse von Daten

in kürzester Zeit. Eine Vision für deren Einsatz liegt sicherlich darin, Patienten mit dieser

Technologie individuelle personifizierte Behandlungen zu ermöglichen. Jedem Patienten das

passende Medikament und die richtige Dosierung11.

Folgende Aussagen zeigen den technologischen Fortschritt sowie die Zukunft dieser Technologie in

der Krebsforschung:

„Aufgrund der Heterogenität und Komplexität von Krebs hat sich die DNA-Microarray Technologie

in den letzten Jahren zu einem wichtigen Werkzeug der Diagnostik entwickelt“17

„The dream, says M.D Anderson’s Mendelsohn, is that Mrs. Smith gets a breast biopsy, we’ll be

able to say: Here are for genes that are abnormal in her tumor, pull open a drawer, pick out the

antibodies or small molecules designed against the abnormal product of those genes, and give her

a cocktail targeting the genes that caused her cancer”18

Aufgrund der Effektivität dieser Technologie setzten sich mehr und mehr Firmen ein, diese

Technologie auch mehr auszubauen, um den oben erwähnten technologischen Schritt zu erreichen.

Die Genexpressionsanalyse mittels DNA-Microarray wird einen wichtigen Schritt in dieser

Technologie einnehmen.

Firmen wie Roche sind daran DNA-Microarray Chips nach den gängigen GMP (Good

Manufacturing Pratice) Konformen herzustellen, um die eigenen Prozesse in Diagnostik, Forschung

und Entwicklung zu beschleunigen und die gewünschte Qualität zu bekommen19. Solche

technologische Erweiterungen zeigen die Wichtigkeit solcher Technologien und zeigen auch, dass

die Zukunftsaussichten für DNA Microarray vielversprechend sind11.

11

Literaturverzeichnis1. DNA Microarray. at <http://www.nhlcyberfamily.org/tests/microarray.htm>2. Einführung. at <http://www.medizinische-genetik.de/index.php?id=1543>3. DNA-Microarray - Lexikon - biosicherheit.de. at

<http://www.biosicherheit.de/lexikon/841.dna-microarray.html>4. Microarray – Wikipedia. at <http://de.wikipedia.org/wiki/Microarray>5. Biochip – Wikipedia. at <http://de.wikipedia.org/wiki/Biochip>6. Borchers, K. Mikrostrukturierte Schichten aus biofunktionalisierten Nanopartikeln als

dreidimensionale Affinitätsoberfläche zum Proteinnachweis auf Microarrays. (Stuttgart, 2007).7. Okorn-Schmidt, H.F. Characterization of silicon surface preparation processes for advanced

gate dielectrics. IBM J. Res. Dev. 43, 351–365 (1999).8. Dill, K., Liu, R.H. & Grodzinski, P. Microarrays: Preparation, Microfluidics, Detection

Methods, and Biological Applications. (Springer: 2008).9. Postier, B. et al. Benefits of in-situ synthesized microarrays for analysis of gene expression in

understudied microorganisms. J. Microbiol. Methods 74, 26-32 (2008).10. Egeland, R.D. & Southern, E.M. Electrochemically directed synthesis of oligonucleotides for

DNA microarray fabrication. Nucleic Acids Research 33, e12511. Marion Strehle & Jürgen Popp Microarray-Biochips - Tausend Reaktionen auf kleinster Fläche.

Photonik (2005).12. Genexpressionsanalyse – Wikipedia. at <http://de.wikipedia.org/wiki/Genexpressionsanalyse>13. Kurz, S. cDNA-Microarray basierte Identifizierung von molekularen und prognostischen

Subgruppen bei der akuten myeloischen Leukämie mit einer Inversion inv(16)/ Translokation t(16;16) und einer Translokation t(8;21). doi:6492

14. Haferlach, T. et al. Microarray-Genexpressionsanalysen in der Leukämiediagnostik. Med Klin 101, 908-914 (2006).

15. Robert Fleischer, Marcus Frohme & Jörg D. Hoheisel Komplexe microarrays in krebsforschung und -diagnose. BioSpektrum 10, 434-436 (2004).

16. Monika Scheidel Jeder Brustkrebs ist anders – mit Microarrayszur personalisierten Therapie? BIOspektrum 4/04,

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18. Lemonick, M.D. & Park, A. New hope for cancer. Time 157, 62-69 (2001).19. Roche NimbleGen stellt Microarray-Produktion auf GMP um und plant Einreichung zur FDA-

Zulassung - Roche Diagnostics GmbH - PresseBox. at <http://www.pressebox.de/pressemeldungen/roche-diagnostics-gmbh/boxid/335460>

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AbbildungsverzeichnisIllustration 1: High density OGT custom DNA microarray, http://www.combichem.co.uk/research/DNAmicroarraytechnologiesPNA.htm..................................1Illustration 2: Prinzip eines Microarray-Experiments, http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/lehre/ws06/sem_inferenz/Microarrays_CDreischer.pdf.................................................4Illustration 3:DNA Microarray- Chip, http://www.agilent.com/..........................................................4Illustration 4: Visualisierung der Genexpression mit verschiedenen Farben, http://www.microarray.ntnu.no/html/micrarray_scanning_services.html............................................4Illustration 5: Spottingprozess mittels "ink-stamping", http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Printing/Microarray_Pins_ChipMaker_Tech/microarray_pins_chipmaker_tech.html..............................................................................................................6Illustration 6: Chemischer Reaktionszyklus der in Situ Synthese nach Egeland et al, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183109/figure/fig3/.................................................7Illustration 7: Röntgenaufnahme bei einer Brustkrebspatientin...........................................................9Illustration 8: Vergleich normale Zellen mit Tumor Zellen mittels Microarray...................................9Illustration 9: DualChip human breast cancer....................................................................................10Illustration 10: DualChip Human breast cancer.................................................................................10

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