Page 1
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2010 – 2011
Risicoanalyse van microbiële en chemische aphiciden op hommels
(Bombus terrestris) als vector in de bestrijding van bladluizen
Sarah Labiese
Promotor: Prof. Dr. ir. Guy Smagghe
Tutor: Dr. Veerle Mommaerts
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master na Master in de Milieusanering en het Milieubeheer
Page 2
2
Dankwoord
Een thesis schrijven is een werk van lange adem waarbij veel mensen een deel uitmaken van het proces
om de thesis tot een goed einde te brengen. Daarom wil ik al deze mensen die hebben bijgedragen tot
het vormen van deze thesis bedanken. Uiteraard zijn er mensen die extra benadrukt moeten worden voor
de hulp die ze mij geboden hebben.
Ik zou graag mijn promotor Prof Smagghe willen bedanken voor het interessante onderwerp dat ik voor
mijn thesis heb mogen behandelen. Ik wil Prof Smagghe ook bedanken voor de goede ondersteuning en
opvolging tijdens het hele jaar. Dr. Veerle Mommaerts zou ik graag bedanken voor haar grote inzet en
energie tijdens de begeleiding, haar deskundige inzicht wanneer het voor mij niet allemaal duidelijk was
en voor de eindeloze steun in de periodes dat alles wat moeilijker ging voor mij.
Verder dank ik Ellen Van Campenhout voor de leuke labogesprekken en voor haar hulp tijdens het
labowerk. Het was leuk een maatje te hebben om over hommelzaken te praten.
Ik zou mijn ouders willen bedanken voor het begrip, de tijd en de mogelijkheden om mij nog een extra
masteropleiding te laten starten en mij steeds te motiveren om het dan ook tot een goed eind te brengen.
Tamara Van Dam, Vanessa Cocquereaux en Stijn Van Onsem wil ik bedanken voor het nalezen van
stukken thesis en voor de motivatie die zij mij tijdens het jaar hebben gegeven.
Ik zou graag de Universiteit van Gent bedanken om het mogelijk te maken tijdens de masteropleiding
deze masterproef te mogen uitvoeren. Daarvoor gaat mijn appreciatie voornamelijk uit naar de secretaris
Prof Van Heede van het Centrum voor Milieusanering en de immer hulpzame mevrouw Veerle
Lambert.
Ten slotte gaat mijn appreciatie uit naar Biobest N.V., zij hebben alle hommels en benodigdheden steeds
op een waanzinnig snel tempo bereid en ter beschikking gesteld, zodat ik altijd heel snel aan mijn
experimenten kon beginnen. Daarnaast was het dan voor mij mogelijk onder begeleiding van Prof
Smagghe, een bedrijfsbezoek te mogen uitvoeren zodat ik een beeld heb van hoe hommels gekweekt
kunnen worden op een industriële schaal.
Augustus 2011
Sarah Labiese
Page 3
3
Inhoudstabel
Dankwoord .................................................................................................................................................. 2
Inhoudstabel ................................................................................................................................................ 3
Lijst van figuren .......................................................................................................................................... 5
Lijst van tabellen ......................................................................................................................................... 7
Samenvatting ............................................................................................................................................... 8
Doelstelling ............................................................................................................................................... 10
Inleiding..................................................................................................................................................... 11
1. De biologie van de hommel Bombus terrestris ................................................................................. 12
1.1. Fylogenie van de hommel Bombus terrestris ............................................................................. 12
1.2 Levenscyclus kolonie .................................................................................................................. 12
1.2.1. Nestinitiatie en kolonieontwikkeling................................................................................... 12
1.2.2. Het omslagpunt.................................................................................................................... 14
1.2.3. Het competitiepunt .............................................................................................................. 14
2. Economisch belang van de hommel .................................................................................................. 14
2.1 Foerageergedrag .......................................................................................................................... 14
2.2 De entomovectortechnologie ....................................................................................................... 15
3. Aphiciden .......................................................................................................................................... 19
3.1. Bladluis als doelorganisme ......................................................................................................... 19
3.2. Werkingsmechanismen van aphiciden ....................................................................................... 20
3.3 Risico-analyse: hommels en pesticiden ....................................................................................... 22
Materiaal en methoden .............................................................................................................................. 23
1. Hommels ....................................................................................................................................... 24
2. Proefopzet voor de risicoschatting van neveneffecten ...................................................................... 25
2.1 Klassieke opstelling met orale blootstelling ................................................................................ 25
2.2 Foerageerproef: opstelling met orale blootstelling ...................................................................... 25
2.3 Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering .............................. 26
2.4 Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering (herhaling
chemische aphiciden) ........................................................................................................................ 27
3. Blootstelling aan aphiciden ............................................................................................................... 27
4. Dataverzameling en -verwerking ...................................................................................................... 29
4.1. Orale blootstelling aan de MFRC ............................................................................................... 29
4.1.1 Waarneming ......................................................................................................................... 29
Page 4
4
4.1.2 Grafieken .............................................................................................................................. 29
4.1.3 Werkster mortaliteit .............................................................................................................. 29
4.1.4 Darrenproductie .................................................................................................................... 30
4.2. Blootstelling aan de poederformulering van pesticiden ............................................................. 30
4.2.1 Waarneming ......................................................................................................................... 30
4.2.2 Grafieken .............................................................................................................................. 30
4.2.3 Werkster mortaliteit .............................................................................................................. 30
4.2.4 Darrenproductie .................................................................................................................... 30
5. Kwaliteitscontrole van de microbiële aphiciden ............................................................................... 30
Resultaten .................................................................................................................................................. 31
1. Kwaliteitscontrole van de microbiële preparaten .............................................................................. 32
2. Toxiciteitsproeven: orale blootstelling .............................................................................................. 32
2.1 Klassieke toxiciteitsproef ............................................................................................................ 32
2.2. Foerageerproef............................................................................................................................ 33
3.Toxiciteitsproeven: blootstelling aan een poederformulering via de miniatuurdispenser ................. 35
4. Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering (herhaling chemische
aphiciden) .............................................................................................................................................. 37
Discussie .................................................................................................................................................... 38
en suggesties voor verder onderzoek ......................................................................................................... 38
1. Letale en subletale neveneffecten na orale blootstelling ................................................................... 39
1.1. Letale effecten op de hommels ................................................................................................... 39
1.2. Subletale neveneffecten .............................................................................................................. 40
2. Letale en subletale neveneffecten na blootstelling poederformulering ............................................. 41
2.1 Letale effecten ............................................................................................................................. 41
2.2 Subletale effecten ........................................................................................................................ 42
3. Gebruik in entomovectoring .............................................................................................................. 42
4. Verder onderzoek .............................................................................................................................. 43
Conclusie ................................................................................................................................................... 44
Referenties ................................................................................................................................................. 45
Page 5
5
Lijst van figuren
Figuur 1:Tekening van het bandenpatroon van B. terrestis ........................................................................... 12
Figuur 2: schematische voor stelling van de levenscyclus van B. terrestris. (Bron: Benton, 2006).............. 13
Figuur 3: Schematische voorstelling van de verschillende factoren welke het succes van de
entomovectortechnologie bepalen. (bron: Mommaerts et al. 2011) ............................................ 16
Figuur 4 Overzicht van dispensers ontwikkeld voor B. inpatiens en B. terrestris met (a) one-way
dispenser van Yu & Sutton (1997) (b) one-way SSP (c) two-way OP, (d) two-way dispenser
van Houle en (e) de Mommaerts-dispenser. (bron:Mommaerts et al., 2011).............................. 18
Figuur 5: van links naar rechts, (i) aantasting door toxische stoffen door bladluizen op paprika, (ii)
bladaantasting door virussen overgebracht door bladluizen, (iii) vervellingshuidjes op een
tomatenplant, en (iv) misvormde groeipunten als reactie op de aantasting van bladluizen.
(Bron: Malias & Ravensberg, 2002) ........................................................................................... 19
Figuur 6: De levenscyclus van bladluizen zonder waardplantwisseling. De legende: a = stichter van de
kolonie, b = levendbarend vrouwtje (apteer), levendbarend vrouwtje (lente-migrant), d =
levendbarend vrouwtje (zomer-migrant), e = seksueel nageslacht producerende luis, f =
alaat, g = eileggend vrouwtje, h = mannetje en i = ei . (Bron: Malais & Ravensberg, 2002
naar Jones, 1942) ......................................................................................................................... 20
Figuur 7: Een microkolonie opstelling met bovenaan het nest waar pollen worden gegeven en met
onderaan het suikerwatercompartiment (16 cm lang x 10 cm breed x 5.5 cm hoog). .
Hommels zuigen het suikerwater op via een wiek. De nestkast is zo ontworpen dat het past
en vastgeklikt kan worden op het suikerwatercompartiment. ..................................................... 24
Figuur 8: Schematische voorstelling van de foerageerproef. Werksters stichten een nest in compartiment
A en moeten zich verplaatsten door de 20 cm-lange buis naar compartiment B om pollen en
suikerwater te verzamelen. .......................................................................................................... 26
Figuur 9: Schematische voorstelling van de miniatuurdispenserproef. Werksters stichten een nest in
compartiment A en moeten zich verplaatsten door de miniatuurdispenser om te foerageren
voor suikerwater en keren terug naar het nest (compartiment A) via de 25 cm-lange buis. ....... 26
Figuur 10: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV, gecorrigeerd door gebruik van Schneider- Orelli
formule van de 5 geteste aphiciden na 5 weken van orale blootstelling. De mortaliteit in de
negatieve controle met onbehandeld suikerwater bedroeg 5±0% en in de positieve controle
met imidacloprid aan zijn MFRC (200 ppm) 100±0%. De cijfers 2 en 3 duiden de
verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan. ................................................................................. 32
Figuur 11: Effect op de gemiddelde darrenproductie na 5 weken van orale blootstelling aan de 5 geteste
aphiciden. Data werd geanalyseerd met ANOVA en resulteerde in 3 groepen (F=41,019;
df=6,55; p<0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter (A-C) zijn
significant verschillend na een post-hoc Tukey-Kramer met α=0,05. ........................................ 33
Figuur 12: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider –Orelli formule
voor de 5 verschillende aphiciden na 5 weken van orale blootstelling. De mortaliteit in de
negatieve controle met onbehandeld suikerwater bedroeg 5±0% en in de positieve controle
met imidacloprid aan 20 ppb 68±1%. De cijfers 1 tot 2 duiden de verschillende IOBC
toxiciteitsklassen aan. .................................................................................................................. 34
Page 6
6
Figuur 13: Effect op de gemiddelde darrenproductie 5 weken van na orale blootstelling aan de 5
aphiciden. Data werden geanalyseerd met ANOVA en resulteerde in 5 groepen (F=35,487;
df=6,56; p<0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter (A-E) zijn
significant verschillend na een post-hoc Tukey-Kramer met α=0,05. ........................................ 34
Figuur 14 Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider- Orelli formule
per aphicide na 5 weken van blootstelling aan de poederformulering. De mortaliteit in de
negatieve controle bedroeg 17±2% en in de positieve controle 100±0%. De cijfers 1 tot en
met 4 duiden de verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan. ...................................................... 35
Figuur 15: Effect op de gemiddelde darrenproductie na 5 weken van blootstelling aan de
poederformulering van de 5 aphiciden. Data werden geanalyseerd met ANOVA en
resulteerden in 3 groepen (F=222,963; df=7,56; p<0.001). De gemiddelde waarden gevolgd
door een verschillende letter (A-C) zijn significant verschillend na een post-hoc Tukey-
Kramer met α=0.05...................................................................................................................... 36
Figuur 16: links; contaminatie van het nest door afzetting van poeder (Pirimor), rechts; wiek bevuild
door poeder (Pirimor). De pijlen duiden aan waar het poeder zich situeert op het nest en op
de wiek......................................................................................................................................... 36
Figuur 17: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider- Orelli formule
per aphicide na 2 weken blootstelling aan de poederformulering van de aphiciden. De
mortaliteit in de negatieve controle (Maïzena) bedroeg 15±2% en in de positieve controle
(Kaolien) 100±0%. De cijfers 4 duiden de verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan. ............. 37
Figuur 18: Overzicht van de nestopbouw wanneer microkolonies gedurende 5 weken blootgesteld
werden aan de poederformulering van (a) van Maïzena.; (b) Preferal+Maïzena (verhouding
1/10), en (c) Botanigard 107+Maïzena (verhouding 1/100) in de miniatuurdispenserproef. ...... 42
Page 7
7
Lijst van tabellen
Tabel 1 : Fylogenetische classificatie B. Terrestris. ...................................................................................... 12
Tabel 2: Voor- en nadelen van hommels en honingbijen als vector. ............................................................. 16
Tabel 3: Gebruikte aphiciden weergegeven met hun actieve stof en hun werking ........................................ 21
Tabel 4: Overzicht van de 5 geteste aphiciden.: hun commerciële naam, type, actieve stof, producent,
dosering van de aphiciden in het suikerwater en dosering van de poederformulering .................... 28
Tabel 5: Toxiciteitsklassen voor uitgebreide laboratoriumtesten, zoals voorgesteld door de IOBC
Working Group “Pesticides and benefical organisms” (Hassan, 1992) ........................................... 29
Tabel 6: Overzicht van de bekomen werkstermortaliteit en darrenproductie vergeleken met de
controlegroep (100%) in de klassieke toxiciteitsproef en in de foerageerproef. .............................. 39
Tabel 7: Overzicht van de bekomen werkstermortaliteit en darrenproductie vergeleken met de
controlegroep (100%) in de miniatuurdispenserproef ...................................................................... 41
Page 8
8
Samenvatting
Hommels zijn inheemse insecten die een belangrijke rol spelen in de natuur als bestuiver van bloemen.
Ook in de landbouw spelen ze een belangrijke rol. Het gebruik van hommels als bestuivers levert een
aantal voordelen op: (i) een hogere kwaliteit van de vruchten, (ii) een hogere kwantiteit aan vruchten, en
(iii) een lager aantal misvormde vruchten. Hierdoor passen hommels in het concept van de
entomovectortechnologie. Bij entomovectoring brengt een insect het pesticide direct naar de plant. De
entomovectortechnologie realiseert een duurzame landbouwstrategie doordat het een stimulans is om
microbiële pesticiden te gaan gebruiken. Tevens zorgen hommels voor een meer gerichte afzetting,
hierdoor wordt de bodem niet meer gecontamineerd, wat zorgt dat de milieubelastingpunten dalen. Om
deze technologie verder te ontwikkelen moeten er pesticiden gebruikt worden die het targetorganisme
efficiënt bestrijden en onschadelijk zijn voor de vector en het milieu. Hommels worden veelal gebruikt
voor de bestuiving, wat hen ideale testorganismen voor het vectorsysteem maakt. In dit werk werd
gekozen om te werken met aphiciden die ingezet worden in de bestrijding van bladluizen. Bladluizen
brengen veel schade aan economisch belangrijke gewassen en zijn door hun explosieve groei moeilijk te
bestrijden. Bladluizen laten honingdauw op de plant achter waardoor de algemene “fitness” van de plant
daalt, maar welke ook de ideale groeibodem is van verschillende plantpathogenen.
De onderzoeksvragen die hieruit voorvloeien zijn: welke aphiciden, bestrijdingsmiddelen gericht tegen
bladluizen, zijn compatibel met hommels en welke kunnen gebruikt worden in een
entomovectorsysteem? De compatibiliteit van de verschillende aphiciden werd nagegaan door middel
van een risicoanalyse. Vijf pesticiden (3 chemische en 2 microbiële aphiciden) werden gebruikt waarbij
één product in twee concentraties getest werd: Teppeki, Plenum, Pirimor, Botanigard 108, Botanigard
107 en Preferal. Van deze vijf werd dan bepaald welke potentieel toegepast kunnen worden in de
entomovectortechnologie.
In een eerste proef, namelijk een klassieke toxiciteitsproef, werden de letale en subletale effecten
onderzocht. De proef werd opgestart met microkolonies bestaande uit 5 werksters. Er waren vier
microkolonies per product met telkens een herhaling van de proef. Bij deze klassieke toxiciteitsproef
werden de hommels oraal blootgesteld aan de pesticiden via het suikerwater aan de “Maximum Field
Recommended Concentration” (MFRC). Op basis van de bekomen mortaliteit werden de 5 geteste
aphiciden ingedeeld als „zwak toxisch‟ (IOBC klasse 2), met uitzondering voor de hoogste concentraties
van Botanigard. Botanigard 108 (IOBC klasse 3) resulteerde in 55 ± 11% mortaliteit na 5 weken
blootstelling. Op vlak van subletale effecten hadden Botanigard 107( 32 ± 11 darren), Botanigard 10
8
(33 ± 1 darren) en Preferal (27 ± 1 darren) een reproductie die het dichtste bij de controlegroep lag maar
toch significant verschillend volgens de One-way Anova analyse met post hoc Tukey Kramer.
Blootstelling aan Plenum veroorzaakte een significante daling in de reproductie (10 ± 2 darren). De
toxiciteitsproef is een “worst case scenario” en daarom besluiten we op basis van deze resultaten dat alle
geteste aphiciden compatibel zijn met B. terrestris.
In een tweede proef, zijnde de foerageerproef, werd nagegaan of de vijf aphiciden een effect hadden op
het foerageergedrag van B. terrestris wanneer werksters oraal werden blootgesteld via het suikerwater
aan de MFRC van de verschillende aphiciden. Hiervoor werd een opstelling gemaakt waarbij twee
nestkasten, namelijk het nestcompartiment en het voedselcompartiment, met elkaar verbonden waren
Page 9
9
door een 20 cm lange buis. Om voedsel te verzamelen moesten de werksters dus doorheen deze buis. De
resultaten van deze opstelling toonden aan dat er geen bijkomend effect is op mortaliteit/reproductie
wanneer werksters moeten foerageren voor hun voedsel. Daardoor kan men stellen dat de pesticiden
geen nadelige effecten veroorzaken bij hommels en dus gebruikt kunnen worden in combinatie met B.
terrestris.
Binnen de entomovectortechnologie wordt gebruik gemaakt van een poederformulering van het actief
ingrediënt om door de vector te laten verspreiden. Een tweede onderzoeksvraag die dient gesteld te
worden is: welke poederformulering van de vijf geteste aphiciden is geschikt om te gebruiken met B.
terrestris binnen deze technologie? Om dit na te gaan werd in het labo een nieuwe methode ontwikkeld,
namelijk de miniatuurdispenserproef. De proefopzet is als volgt: een nestcompartiment werd verbonden
met het voedselcompartiment door een miniatuurdispenser en door een 25 cm lange buis. Bij de
heenweg naar het voedselcompartiment wandelden de hommels door het poeder in de
miniatuurdispenser en bij de terugweg door de 25 cm lange buis vrij van poeder. De éénrichting werd
verzekerd door klepjes te voorzien op de doorgangen en door de uitgangen hoog te plaatsten en de
ingangen laag te plaatsten. Uit deze proef bleek dat blootstelling aan de poederformulering van alle
geteste chemische aphiciden resulteerde in een mortaliteit van 100% na 2 weken. De microbiële
aphiciden, Preferal en Botanigard 107, gaven een zwak toxisch effect (IOBC klasse 2) na 5 weken
blootstelling aan de poederformuleringen, Botanigard 108 resulteerde in een matig toxisch (IOBC klasse
3) effect op de werksters na 5 weken. Voor de subletale effecten resulteerde enkel Preferal in een
darrenproductie die niet significant (p>0.05) verschillend was met de negatieve controle groep.
Uit dit onderzoek kunnen we besluiten dat de MFRC van de vijf geteste aphiciden wanneer oraal
blootgesteld via het suikerwater, neveneffecten veroorzaakt op hommels. Ook toont de
miniatuurdispenserproef aan dat de poederformulering van de chemische aphiciden sterk toxisch is.
Hieruit besluiten we dat verdere optimalisatie van de poederformuleringen van biologische aphiciden
het potentieel gebruik van deze middelen binnen de entomovectortechnologie zal vergroten. Voor de
chemische aphiciden zal verder onderzoek bepalen of ze al dan niet gebruikt kunnen worden binnen de
entomovectortechnologie. In de huidige studie werden potentiële neveneffecten nagegaan in een
laboproef waarin de hommels beperkt konden vliegen. Deze factor speelt een niet onbelangrijke rol
aangezien hommels een deel van hun lading (poeder) verliezen gedurende hun vlucht naar het gewas.
Om een overschatting van de risico‟s te vermijden zouden risicoanalyses in de toekomst ook proeven
met vliegkooien of vrij vliegende hommels moeten beschouwen. Bovendien dient er ook opgemerkt te
worden dat de geteste poederformuleringen initieel niet ontwikkeld zijn voor gebruik binnen de
entomovectortechnologie waardoor verdere optimalisatie van de formulering kan leiden tot een
efficiëntere bestrijding van de pest aan een lagere concentratie van het product.
Page 10
10
Doelstelling
Hommels zoals Bombus terrestsris worden in de land- en tuinbouw ingezet als bestuivers voor
economisch belangrijke gewassen zoals tomaten, paprika en aardbeien. Momenteel worden ze zelfs
commercieel gekweekt waardoor ze beschikbaar zijn gedurende het gehele jaar. Naast hun rol als
bestuiver werd gedurende de laatste 10 jaar hun rol onderzocht als vector voor de verspreiding van
biologische pesticiden binnen de entomovectortechnologie. Deze alternatieve milieuvriendelijke
methode maakt gebruik van bestuivers waaronder ook hommels om poederformuleringen van
biologische pesticiden doelgericht te transporteren naar het gewas.
Binnen de entomovectortechnologie gebeurt de blootstelling via poedervorm. Bladluizen werden
gekozen als targetorganisme omdat ze veel schade berokkenen aan gewassen. Ze laten honingdauw
achter op de plant welke een broedplaats is voor verschillende plantpathogenen en waardoor de vruchten
niet meer verkocht kunnen worden. Bladluispopulaties kunnen een explosieve groei hebben waardoor ze
moeilijk te controleren zijn. Het hoofddoel van dit onderzoek was de compatibiliteit van vijf aphiciden
(Preferal, Botanigard, Teppeki, Pirimor en Plenum) te evalueren met B. terrestris binnen de
entomovectortechnologie.
Een eerste stap in dit onderzoek in het domein van de entomologie en ecotoxicologie bestaat erin om
mogelijke neveneffecten van aphiciden te onderzoeken op B. terrestris, waarbij letale en subletale
(reproductie en foerageergedrag) effecten onderzocht worden. Hiervoor werden microkolonies oraal
blootgesteld via het suikerwater aan de MFRC van de verschillende aphiciden.
Een tweede stap in dit onderzoek, is nagaan welke neveneffecten er ontstaan wanneer hommels
blootgesteld werden aan de poederfomulering van de vijf aphiciden in een miniatuurdispenserproef.
Deze proef heeft als doel een overzicht te geven van potentiële toepasbare aphiciden binnen de
entomovectortechnologie.
Page 12
12
1. De biologie van de hommel Bombus terrestris
1.1. Fylogenie van de hommel Bombus terrestris
Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), de aardhommel kan als volgt fylogenetisch worden onderverdeeld:
Tabel 1 : Fylogenetische classificatie B. Terrestris.
Rijk: Animalia
Stam: Arthropoda
Onderstam: Hexapoda
Klasse: Insecta
Onderklasse: Pterygota
Superorde: Holometabola (Endopterygota)
Orde: Hymenoptera
Onderorde: Apocrita
Infra-orde: Aculeata
superfamilie: Apoidae
Familie: Apidae
Onderfamilie: Apinae
Geslacht: Bombus
Soort: B. terrestris Figuur 1:Tekening van het bandenpatroon van B. terrestis
(Bron: Albert de Wilde, 2001)
Hommels behoren tot de orde van de Hymenoptera (zie tabel 1), wat vliesvleugelig betekent. Dit slaat
op de vliezige relatief grote vleugels die deze insecten bezitten. De Hymenoptera bezitten twee paar
vleugels waarbij de voorvleugels steeds de grootste zijn. Het lichaam van deze insecten bestaat uit een
kop, een thorax en een abdomen. Hun monddelen zijn aangepast aan het kauwen door middel van goed
ontwikkelde mandibula. Sommige soorten hebben naast goed ontwikkelde monddelen ook een
proboscis waarmee ze vloeibare substanties kunnen opnemen zoals nectar. Hymenoptera bezitten
eveneens grote facetogen met 3 ocelli. De onderorde van de Apocrita heeft als kenmerk het voorkomen
van een wespentaille of propodeum gevormd door een of meer achterlijfsegmenten. Het abdomen is
opgedeeld in een mesosoma en een metasoma. De infra-orde waartoe hommels behoren, heet de
Aculeata. Ze vormen een groep door het kenmerk dat hun ovipositor een angel is geworden waarmee gif
gespoten kan worden. De Apidae vormen de groep van de bij-achtigen. Daarin kan men de soort B.
terrestris terugvinden waarmee alle experimenten in dit onderzoek werden uitgevoerd (zie figuur 1).
1.2 Levenscyclus kolonie
1.2.1. Nestinitiatie en kolonieontwikkeling
De levenscyclus van B. terrestris volgt een jaarlijks patroon waarbij het nest sterft in de herfst en de
bevruchte koningin overwintert in een schuilplaats. Eens de koningin in de lente ontwaakt uit haar
overwinteringsplaats (figuur 2E) start ze een nieuw nest op. Het succes van deze jaarlijkse cyclus hangt
af van het aantal beschikbare overwinteringsplaatsen, van de aanwezigheid van nestplaatsen om een
nieuwe kolonie op te starten en van de diversiteit en de densiteit van de omgevende flora (Kells &
Page 13
13
Goulson, 2003; Goulson, 2006; Osborne et al, 2008). Bij B. terrestris, ontwaken de koninginnen,
afhankelijk van de temperatuur, uit hun winterslaap tussen eind februari en begin april. De eerste dagen
na de winterslaap foerageert de koningin voor nectar (energiebron) en pollen (eiwitbron voor de
ontwikkeling van de ovaria) (figuur 2A).Vervolgens zal ze op zoek gaan naar een ondergrondse
nestplaats om haar nest te stichten. (figuur 2, B) (Benton, 2006).
Vanaf dit moment start de kolonieontwikkeling (zie figuur 2C). Haar broed bestaat uit 8 tot 16 diploïde
eitjes waaruit de larven ontluiken na 4 dagen. De jonge larven worden gevoed met een mengsel van
nectar en pollen. De koningin houdt de temperatuur van het nest stabiel op 30°C door middel van haar
lichaamswarmte.
Figuur 2: schematische voor stelling van de levenscyclus van B. terrestris. (Bron: Benton, 2006)
Hommels zijn holometabole insecten, de ontwikkeling van ei tot larve tot adult duurt 4 tot 5 weken
(Alford, 1975). Uit de eitjes ontluiken larven welke 4 stadia doorlopen (L1, L2, L3 en L4). Na ongeveer
2 weken spinnen de L4-larven een cocon waarin ze zich verpoppen. De metamorfose, de ontwikkeling
A
B C
D
E
Productie werksters
Kolonievorming
Darren sterven
Paring
Koningin overwintering
Koningin foerageert
Opladen van pollen
Nest initiatie
Page 14
14
van pop tot adult, duurt 2 weken (Goulson, 2006). Na adult ontluiking hebben werksters een wit/zwart
bandenpatroon. Hun definitief kleurenpatroon (figuur 1) verkrijgen ze na 24 uur (Goulson, 2006).
1.2.2. Het omslagpunt
Het aantal werksters in het nest blijft toenemen totdat de drempelwaarde bereikt is. Bij B. terrestris ligt
deze tussen 100 tot 300 werksters (Thompson & Hunt, 1999; Goulson, 2006). Chemische communicatie
gebeurt vaak bij sociale insecten. Wanneer de drempelwaarde van de nestgrootte bereikt is, zal de
koningin stoppen met de productie van het sexferomoon waardoor de bouw van koninginnencellen stopt
en ook de eierstekontwikkeling van werksters afgeremd wordt hierdoor kunnen deze geen eitjes meer
leggen. Dit sexferomoon dat de koningin uitscheidt, beïnvloedt de productie van juveniel hormoon bij
de larven. Juveniel hormoon reguleert belangrijke processen zoals de groei en de metamorfose van de
larven. Door het blokkeren van juveniel hormoon, zullen koninginnen ontluiken uit diploïde eitjes in
plaats van werksters. Het nieuwe broed dat de koningin legt zal uitgroeien tot darren, aangezien
haploïde eitjes geproduceerd worden (Goulson, 2006).
1.2.3. Het competitiepunt
Dan start het competitiepunt. Vanaf nu legt de koningin minder regelmatig eitjes en zal ze conflict
ondervinden met de elitewerksters. De elitewerksters proberen zelf haploïde eitjes te leggen en plegen
eiroof op de eitjes van de koningin. Hierdoor kunnen ze meer genetisch verwante nakomelingen
verwerven, dit fenomeen wordt omschreven als kin-selectie (Bourke & Ratnieks, 2001). In de laatste
fase komen de darren en de nieuwe koninginnen uit. De darren verschijnen eerst en verlaten na enkele
dagen het nest. De darren foerageren voor voedsel waarbij ze op bepaalde plaatsen een feromoonspoor
achterlaten voor jonge koninginnen. De jonge koninginnen paren maar met één dar. Het sperma wordt
daarbij afgezet in de spermatheca zodat ze het in bewaring kunnen houden voor een nieuw nest in het
voorjaar. De darren sterven uit na de paarperiode en de jonge koninginnen gaan af en toe terug naar het
nest. Tussen eind augustus en begin september verlaten de jonge koninginnen definitief het nest en gaan
ze foerageren om voldoende vetreserves aan te leggen voor de winter waarna ze op zoek gaan naar een
overwinteringsplaats.
2. Economisch belang van de hommel
2.1 Foerageergedrag
Om te overleven foerageren hommels voor pollen en nectar. Dit doen ze van zonsopgang tot
zonsondergang, maar de weersomstandigheden (temperatuur, neerslag en lichtintensiteit) gaan de
foerageerintensiteit sterk beïnvloeden (Thompson & Hunt, 1999). Hommels zijn polylectisch, dat
betekent dat hommels foerageren op verschillende plantensoorten (Heinrich, 1979). De beslissing om
een bloem al dan niet te bezoeken wordt beïnvloed door zowel plant- als insectgerelateerde factoren.
Plantgerelateerde factoren zoals de bloemkleur is belangrijk voor het vinden van de bloemen en voor de
keuze van de bloemen. Van op afstand moet de kleur in contrast staan met de overheersende groene
kleur van de achtergrond. De keuze van de bloem zelf hangt af van de voorkeur in kleur en in het
Page 15
15
aangeleerd proces om bloemen te vinden die rendabel zijn (Chittka et at, 1997; Gumbert 2000, Spaethe
et al, 2004; Simonds & Powright, 2004; Dyer et al, 2007). Andere belangrijke plantgerelateerde factoren
zijn de fluorescentie, de bloemmorfologie en de grootte van de bloem. Verschillende studies toonden
aan dat de detectie van kleine artificiële bloemen (diameter van 4 mm) 10 maal langer duurde (tijd) dan
artificiële bloemen van 28 mm (Cresswell & Galen, 1991; Shykoff et al, 1997; Spaethe et al, 2001; Ishii
et al, 2008). Naïeve B. terrestris werksters verkiezen tevens bloemen met een bilateraal patroon, dit
wordt geassocieerd als rendabel en een lage bezoektijd (West & Laverty, 1998; Rodriguez et al, 2004;
Goulson et al., 2007). Het foerageergedrag van hommels wordt ook sterk beïnvloed door bloemgeur
welke reeds in het nest werd aangeleerd wanneer een succesvolle foerageerster haar kropinhoud ledigt in
de suikerpotten (Molet et al, 2009). Ten slotte hebben een aantal studies aangetoond dat
bloemtemperatuur ook een rol kan spelen in de bloemvoorkeur van hommels. Zo zouden warmere
bloemen een metabolische beloning zijn ten opzichte van koudere bloemen waardoor ze ook meer
bezocht zouden worden (Seymour et al, 2003; Dyer et al, 2006; Sapir et al, 2006; Rands & Whitney,
2008).
Een insectgerelateerde factor die het foerageergedrag beïnvloedt, is de hommelgrootte. Grote werksters
zijn namelijk beter in het verzamelen van pollen terwijl kleinere exemplaren foerageren voor nectar
zoeken (Goulson et al, 2002). Daarnaast hebben verschillende studies aangetoond dat de tijd nodig om
een bloem te bezoeken korter is bij grotere hommels (Stout, 2000; Goulson et al, 2002), en dat grotere
hommels een beter leervermogen hebben wat verklaart waarom ze pollen verzamelen in plaats van
nectar (Riveros & Gronenberg, 2009), dat ze een beter zicht hebben door een grotere facetdiameter en
een lager aantal ommatidia (Spaethe & Chittka, 2003) en dat ze een beter reukvermogen hebben door de
aanwezigheid van een hogere densiteit van poriesensilla op de antennen (Chittka et al, 1999; Spaethe et
al, 2007). Tot slot hebben grotere hommels in verhouding kortere pootjes. Hierdoor verliezen ze minder
snel warmte en blijven ze langer actief dan hun kleinere soortgenoten (Heinrich, 1979; Peat et al, 2005).
Momenteel worden er 5 soorten hommels commercieel gekweekt namelijk; B terrestris, B.t.
canariensis, B. lucorum, B. ingitus, B. occidentalis en B. impatiens. De voornaamste soort is de
Euraziatische B. terrestris. Deze heeft een wijde distributie over geheel Europa, in de kuststreken van
Noord Afrika en in West en Centraal Azië. Deze wijde verspreiding is 1 van de redenen om deze soort
commercieel te kweken. Deze soort is tevens gekend voor de grote kolonies en kunnen zich goed
aanpassen in artificiële situaties. De wereldwijde verkoop van B. terrestris wordt geschat op 900 000
kolonies per jaar. Het gewas dat hommels het vaakst bestuiven zijn serretomaten. Verder bestuiven ze
pepers, aubergines, meloenen, watermeloenen, komkommers, aardbeien en enkele bessensoorten
(Velthuis & van Doorn, 2006)
2.2 De entomovectortechnologie
De term „entomovector‟ werd ontwikkeld door Hokkanen & Menzler-Hokkanen (2007). De
verschillende aspecten van de technologie werden recent besproken door Mommaerts et al (2011). Het
succes van de technologie is afhankelijk van verschillende factoren: de keuze van de vector, de
efficiëntie van het pesticide, het transport van het pesticide en de veiligheid voor mens en het milieu
(figuur 3). Het transport van het pesticide wordt beïnvloed door de veiligheid van het pesticide voor de
vector, door de efficiëntie van de formulering/draagstoffen en van de dispenser. Ieder onderdeel zal
hieronder kort besproken worden.
Page 16
16
Figuur 3: Schematische voorstelling van de verschillende factoren welke het succes van de entomovectortechnologie bepalen.
(bron: Mommaerts et al. 2011)
Bij de keuze van de vector is het belangrijk dat het gewas efficiënt bezocht wordt door de vector
(Blacquière, 2005). Een overzicht van de verschillende gewassen met hun meest efficiënte bestuivers is
recent gepubliceerd door Goulson (2010) en Mommaerts et al. (2011). Tot op heden werden reeds 3
verschillende bestuivers gebruikt binnen de entomovectortechnologie: de honingbijen (Apis mellifera),
de hommels (Bombus terrestris en Bombus impatiens) en de metselbijen (Osmia cornuta). Het lage
aantal soorten dat als vector gebruikt wordt is gerelateerd met hun commerciële beschikbaarheid.
Bijvoorbeeld Osmia sp. zijn moeilijk te kweken, maar momenteel werden gestandaardiseerde protocols
ontwikkeld die dit mogelijk maken (Pitts-Singer, 2008; Sgolastra et al, 2010). Honingbijen en hommels
zijn het hele jaar door beschikbaar waardoor de bestuiving gesynchroniseerd kan worden met de
bloeiperiode van de gewassen. Tabel 2 geeft een overzicht van de voor- en nadelen van het gebruik
hommels en honingbijen als vector.
Tabel 2: Voor- en nadelen van hommels en honingbijen als vector.
Hommels Honingbijen Jaarlijkse koloniecyclus Nest heeft geen jaarlijkse cyclus Geen productie van producten die geconsumeerd
worden door de mens Productie van honing, propolis en koningenbrij;
producten die geconsumeerd worden door de mens en
onderworpen worden aan strenge controles Belangrijke bestuiver van verscheidene
glasteeltgewassen zoals tomaat Niet geschikt voor de bestuiving van lange-teelt
gewassen onder glas Actief bij slechtere weersomstandigheden; bijvoorbeeld
actief bij lagere temperaturen, 10°C Actief bij een temperatuur van 15 °C
Door het commercieel kweken van hommels
vormen pathogenen geen probleem
Inzetbaarheid als entomovector is beperkt door de
enorme sterfte van populaties wereldwijd
Koloniegrootte kan gekozen worden Koloniegrootte kan gekozen worden
Het is belangrijk het pestorganisme goed te kennen, de bladluizen worden in detail besproken onder 3.1.
Page 17
17
Het volgend aspect dat besproken moet worden is de acquisitie/transport van het pesticide naar het
doelwit, namelijk de bloemen. Huidige formuleringen zijn ontwikkeld om te spuiten en dus om een
efficiënte acquisitie/transport naar de bloemen te verkrijgen zullen draagstoffen toegevoegd worden aan
commercieel beschikbare poederformuleringen van pesticiden. Belangrijk hierbij is dat de activiteit en
houdbaarheid van de MCA niet beïnvloed worden. Binnen de entomovectortechnologie werden tot op
heden minerale (silicagels, kwarts, zeolieten, palygorskiet, illiet, talk, vermiculiet, kaolien,..) en
sedimentaire draagstoffen (zand, kalksteen, perliet,…) en polymeren (houtzaagsel of schilfers, humus,
compost, veen, voedingsbindmiddelen, granen, meel van de granen, zoetmiddelen, cellulose,
paraffine,…) gebruikt (Bernhard et al, 1998). De vector wordt geladen met de poederformulering van
het pesticide+draagstof door doorheen het product in een dispenser te lopen. Over de laatste 20 jaar
werd meerdere malen gerapporteerd over de ontwikkeling van verschillende dispensers die aan/in het
nest werden aangebracht. Volgens Mommaerts et al. (2011) moet een optimale dispenser voldoen aan 3
criteria, namelijk (i) de vector genoeg beladen met poeder, (i) niet interfereren met het foerageergedrag
en (iii) hervullen moet pas na minimum 1 dag gebeuren. De huidige dispensers kunnen in 2 klassen
opgedeeld worden: de one-way dispenser: de vector wandelt doorheen het poeder wanneer ze het nest
verlaat en terugkeert; en de two-way dispenser: de vector wandelt door enkel doorheen het poeder
wanneer ze het nest verlaat. Over het algemeen zijn one-way systemen zoals de SSP-dispenser (figuur 4)
minder geschikt voor gebruik binnen de entomovectortechnologie omdat ze resulteren in een lage
acquisitie van de vector met uitzondering van de “over-and-under oneway” dispenser van Yu & Sutton
(1997) (figuur 4) die leidt tot een efficiënte acquisitie van de hommels ( > 104 CFU/hommel). Voor de
“Gross” dispenser werd gemeld dat het pathogenen onderdrukte of dat er minder overleving van de
pestorganismen was (Gross et al, 1994). De “Houle” dispenser is een optimalisatie van de “Gross”
dispenser. Deze dispenser geeft een 4±2 x102 CFU/bij. Two-way dispensers (figuur 4) zoals de
“overlapping-passageway (OP) dispenser” (Maccagnani et al.,2005) en de “Mommaerts-dispenser”
(Mommaerts et al., 2010) resulteerden in een betere acquisitie dan de SSP-dispenser. De “Mommaerts-
dispenser” had naast een goede acquisitie (>104 CFU/hommel) ook geen effect op het foerageergedrag
en een herladingsinterval van 3 dagen.
Page 18
18
Figuur 4 Overzicht van dispensers ontwikkeld voor B. inpatiens en B. terrestris met (a) one-way dispenser van Yu & Sutton
(1997) (b) one-way SSP (c) two-way OP, (d) two-way dispenser van Houle en (e) de Mommaerts-dispenser.
(bron:Mommaerts et al., 2011)
De belangrijkste redenen om de entomovector technologie te introduceren als strategie voor biologische
bestrijding zijn:
Page 19
19
(i) het verminderen van de hoeveelheid synthetische pesticiden. Het voorkomt tevens de ontwikkeling
van resistentie van pestorganismen tegen veel gebruikte chemische pesticiden.
(ii) De veronderstelling dat de entomovector meer effect heeft dan besproeien berust op het idee dat de
producten op doellocaties afgezet worden, namelijk de bloemen.
3. Aphiciden
3.1. Bladluis als doelorganisme
Bladluizen (Hemiptera, Aphididae) zijn wereldwijd verantwoordelijk voor oogstverliezen. Bladluizen
zijn polyfage soorten met andere woorden ze richten zich niet op één specifieke plantensoort. Ze
verkiezen groeipunten zoals de toppen van jonge stengels met groeiend blad en bloemknoppen omdat de
sapstroom daar veel voedingstoffen bevat (Malais & Ravensberg, 2002). Deze insecten voeden zich
door middel van hun zuigende monddelen (stiletten) met floëemsap. Bij het aanprikken van planten
kunnen groeiremmingen ontstaan, wat uiteindelijk resulteert in het afvallen van aangetaste bladeren.
Deze reductie in de algemene fitness van de plant zal leiden tot een daling van de opbrengst (figuur 5).
Bladluizen produceren honingdauw dat een ideale broedplaats creëert voor verschillende
plantpathogenen zoals de roetdauwschimmel (Cladosporium sp.). De aanwezigheid van honingdauw op
de plant is ook verantwoordelijk voor een verminderde fotosynthese en kan leiden tot vergroeiingen van
de plant. Tot slot verspreiden bladluizen plantenvirussen wanneer ze met hun stilet het floëem
aanprikken, bijvoorbeeld het aardappel-y-virus bij tomaat (Malais & Ravensberg, 2002).
Figuur 5: van links naar rechts, (i) aantasting door toxische stoffen door bladluizen op paprika, (ii) bladaantasting door
virussen overgebracht door bladluizen, (iii) vervellingshuidjes op een tomatenplant, en (iv) misvormde groeipunten als
reactie op de aantasting van bladluizen. (Bron: Malias & Ravensberg, 2002)
Een reden voor hun succes is dat ze zich snel kunnen voortplanten. In de zomer doen ze aan
parthenogenese, dit is een vorm van ongeslachtelijke voortplanting (figuur 6). De maagdelijke vrouwtjes
baren levend ongeveer 40 tot 100 nakomelingen per individu; dit komt neer op 3 tot 10 per dag en dit
het gehele seizoen (Malais & Ravensberg, 2002).
Page 20
20
Figuur 6: De levenscyclus van bladluizen zonder waardplantwisseling. De legende: a = stichter van de kolonie, b =
levendbarend vrouwtje (apteer), levendbarend vrouwtje (lente-migrant), d = levendbarend vrouwtje (zomer-migrant), e =
seksueel nageslacht producerende luis, f = alaat, g = eileggend vrouwtje, h = mannetje en i = ei . (Bron: Malais &
Ravensberg, 2002 naar Jones, 1942)
De huidige bestrijding van bladluizen is onvoldoende omdat: (i) bladluizen reeds resistentie ontwikkeld
hebben tegen verschillende chemische insecticiden, (ii) bespuitingen beperkt zijn omwille van residu‟s
van pesticiden, en (iii) bladluispopulaties een explosieve groei kennen doordat ze zich zowel
ongeslachtelijk als ongeslachtelijk kunnen voortplanten.
3.2. Werkingsmechanismen van aphiciden
Aphiciden zijn pesticiden die een soortspecifieke werking hebben op bladluizen. Tabel 3 geeft een
overzicht van de verschillende aphiciden: de actieve stof en de werking. Teppeki is een
waterdispergeerbaar granulaat waarvan 50% van het granulaat het actieve bestanddeel flonicamid bevat.
De werking van flonicamid is systemisch en translaminair. (Belchim, 2011). Het verstoort het
voedingspatroon van de bladluis waardoor de bladluis binnen het uur stopt met eten en uiteindelijk sterft
na 5 tot 7 dagen door uitdroging (Palmer et al, 2002; Staetz et al, 2006).
Pirimor is een waterdispergeerbaar granulaat dat 50% pirimicarb bevat als actief bestanddeel. Pirimicarb
heeft een contact-, translaminaire en dampwerking. Door de dampwerking worden de bladluizen die aan
de onderkant van de bladen schuilen, behandeld (Syngenta, 2011). De actieve stof pirimicarb werkt als
een inhibitor van acetylcholine-esterase. Dit enzym wordt gebruikt om de neurotransmitter acetylcholine
af te breken. Indien acetylcholine niet wordt afgebroken, geeft het een continu signaal naar de hersenen
toe. Dit veroorzaakt continue samentrekking van de spieren wat kan leiden tot de dood. Pirimicarb heeft
een hoge orale toxiciteit en is eveneens toxisch bij inademing door de dampwerking (EFSA, 2005)
Plenum is een insecticide dat door Syngenta geproduceerd wordt. Het werkt specifiek tegen bladluizen.
Er wordt aangeraden het product niet te gebruiken tijdens de vluchturen van bijen of hommels. Het is
Page 21
21
net zoals de voorgaande chemische aphiciden een waterdispergeerbaar granulaat met 50% pymetrozine
als actief bestanddeel. Het product heeft een systemische en translaminaire werking. Wanneer de
werkzame stof door de plant wordt opgenomen, zal het schade aan de bladluisstilet veroorzaken. Dit
gebeurt enkele minuten na opname. De bladluis sterft een paar dagen later na uitdroging aangezien de
stilet beschadigd is en ze geen vocht meer kunnen opnemen (Syngenta, 2011).
Paecilomyces fumosoroseus (PreFeRal), heeft een entomopathogene werking die initieel ontwikkeld
werd voor de kaswittevlieg Het infecteert alle stadia van de kaswittevlieg en het wordt aangeduid als
niet schadelijk voor hommels. Aangezien het een biologisch insecticide is, is het succes ervan
afhankelijk van het klimaat. Het product werkt optimaal bij 26-28°C en een luchtvochtigheid van 80%
gedurende 12u per dag (Biobest, 2011). De schimmel, P. fumosoroseus groeit op arthropoden; wanneer
de sporen in contact komen met de gastheer penetreren ze de cuticula en groeien ze in het lichaam van
de gastheer waardoor het insect door nutriëntenverlies en beschadiging van weefsel binnen enkele dagen
sterft (Hashim & Ibrahim, 2003, EC, 2002).
Beauveria bassiana (BotaniGard) werkt als contactinsecticide. Het werkt tegen allerlei insecten en is
dus niet soortspecifiek, al wordt het veelal gebruikt voor de bestrijding van kaswittevlieg (Certis, 2011;
Kapongo, 2008). De sporen penetreren de cuticula van het insect, kiemen in de hemocoel waarna ze zich
verspreiden via de hemolymfe. Het insect sterft door verlies van nutriënten, beschadiging van weefsel en
afgifte van toxinen ( Wagner & Lewis, 2000).
Tabel 3: Gebruikte aphiciden weergegeven met hun actieve stof en hun werking
De aphiciden kunnen in veldcondities niet enkel toxische effecten hebben op bladluizen maar ook op
andere nuttige insecten.
Recent werden de neveneffecten van verschillende chemische insecticiden waaronder Pirimor en
Teppeki onderzocht op een belangrijke bladluispredator, de zweefvlieg Episyrhus balteatus (Moens et
al., 2011). Zij toonden aan dat Pirimor (pirimicarb), een hoge mortaliteit (100.0±0.0% larvale mortaliteit
bij MFRC) veroorzaakte op de larven van E. balteatus, terwijl Teppeki (flonicamid) zwak toxisch
(12.5±5.3) was voor de zweefvliegen. Deze blootstelling werd uitgevoerd door middel van het
contamineren van petriplaten en daarop de larven te plaatsen en de toxiciteitsproeven volgens het IOBC
protocol uit te voeren. Voor Pymetrozine (Plenum) was toxisch voor de parasitaire wesp Trichogramma
chilonis (Preetha et al, 2009).
Product Actieve stof Werking
Teppeki 50% flonicamid Systemisch & translaminair
Plenum 50% pymetrozine Systemisch & translaminair
Pirimor 50% pirimicarb Contact, translaminair & damp
Botanigard 3,7x1010
CFU/g Beauveria bassiana Contact
Preferal 2x109 CFU/g Paecilomyces fumosoroseus Contact
Page 22
22
Microbiële aphiciden zoals B. bassiana en P. fumosoroseus veroorzaakten een hoge mortaliteit op
larven en poppen van B. terrestris wanneer er 10 conidia per individu voorzien werd (mortaliteit van
93% en 90% op de larven) maar waren veel minder schadelijk voor het adultstadium (Espinosa-Ortiz et
al., 2011).
3.3 Risico-analyse: hommels en pesticiden
Binnen de gewasbestuiving vervult B. terrestris een belangrijke rol. Het is daarom ook cruciaal dat
potentiële neveneffecten worden geëvalueerd. De meest kwetsbare hommels zijn de foerageersters. Zij
zijn namelijk verantwoordelijk voor het voedseltransport naar de kolonie.
Momenteel omvat een risicoschatting/analyse 4 niveaus (Besard, 2011; Kevan et al, 2007; Malone et al,
2000; Mommaerts et al, 2009; Thompson & Hunt, 1999; Mommaerts & Smagghe, 2011):
1) is er een risico?,
2) evaluatie van de letale toxiciteit voor de werksters
3) studie naar de subletale effecten op reproductie
4) analyse van de subletale effecten op het foerageergedrag en -activiteit van werksters
In het labo worden hommels blootgesteld aan een “worst case scenario” via het drinken van
gecontamineerd suikerwater. Vervolgens kan de test nog strenger gemaakt worden door de werksters te
laten foerageren voor hun voedsel. Er dient ook opgemerkt te worden dat risicoschattingen vaak gebruik
maken van toxiciteitdata op honingbijen om neveneffecten op hommels zoals B. terrestris te
voorspellen, maar recent hebben een aantal studies aangetoond dat extrapolatie niet steeds mogelijk is
(Mommaerts & Smagghe, 2011). Honingbijen zijn nauw verwant met hommels maar verschillen in
grootte, metabolisme, foerageergedrag, foerageeractiviteit en bloembezoek waardoor de blootstelling
ook verschillend is.
De entomovectortechnologie is een nieuwe strategie om de pesticiden naar het gewas te transporteren
waardoor de hommelwerksters niet langer worden blootgesteld aan een oplossing van het pesticide maar
aan een poederformulering ervan. Om de effecten van de poederformulering op de hommels te
evalueren zal een nieuwe proefmethode ontwikkeld moeten worden die toelaat om letale en subletale
effecten te scoren.
Page 23
23
Materiaal en methoden
Page 24
24
1. Hommels
De hommels, Bombus terrestris die gebruikt werden in de experimenten waren afkomstig van Biobest
N.V. (Westerlo, België).
Gedurende de proefperiode werden hommels voorzien van pollen (hun eiwitbron) en suikerwater (hun
carbohydraatbron). Het commercieel suikerwater (50% siroop, BIOGLUC, Biobest N.V.) werd
aangeboden onder het nest, en de pollen (Soc. Coop. Apihurdes, Pinofranqueado – Càceres) werden
gekneed tot een bol en aangeboden in het nest (figuur 7).
Figuur 7: Een microkolonie opstelling met bovenaan het nest waar pollen worden gegeven en met onderaan het
suikerwatercompartiment (16 cm lang x 10 cm breed x 5.5 cm hoog). . Hommels zuigen het suikerwater op via een wiek. De
nestkast is zo ontworpen dat het past en vastgeklikt kan worden op het suikerwatercompartiment.
Voor alle toxiciteitsproeven werd er gebruik gemaakt van pas uitgekomen B. terrestris werksters. Deze
werden per 5 ondergebracht in een plastieken nestkast (15,5 cm lang x 15 cm breed x 10 cm hoog) en
vormden een microkolonie (figuur 7). Bovenaan de nestkast is er een opening voorzien waardoor
manipulaties worden uitgevoerd zoals het voorzien van pollen. Manipulatie van de hommels gebeurt
onder rood licht (golflengte 680 nm) omdat dit buiten hun gezichtsveld (340 nm -540 nm) valt.
Tijdens het experiment werden de nesten ondergebracht in een donkere klimaatkamer met
gestandaardiseerde laboratoriumcondities, 28-30°C en 60-70% relatieve vochtigheid.
Page 25
25
Een microkolonie bevat 5 werksters van eenzelfde leeftijd. Na enkele dagen (2 tot 3 dagen) wordt 1
werkster dominant en ontwikkelde ze haar ovaria waardoor zij de enige is die eitjes legt. De andere
werksters zullen voor het broed zorgen. Na een week legt de dominante werkster haar onbevruchte eitjes
die dan na 3 tot 4 weken zullen ontwikkelen tot volwassen darren.
2. Proefopzet voor de risicoschatting van neveneffecten
2.1 Klassieke opstelling met orale blootstelling
Systemische pesticiden worden opgenomen door de plant, en kunnen via het xyleem-floëem transport
terecht komen in de nectar van bloemen, zijnde de energiebron van hommels. In de proefopzet werd
nectar vervangen door een suikerwateroplossing. Voor ieder chemisch aphicide werd de MFRC zoals
weergegeven in tabel 4 gemaakt in 2 liter suikerwater. Daarna werd het behandeld suikerwater verdeeld
over 4 suikerwatercompartimenten van 4 microkolonies. Voor de biologische aphiciden werd de MFRC
bereid in suikersiroop (72% suiker), vrij van hexanen, en aangelengd met milli-Q water tot een 50%-ige
suikeroplossing. Het behandeld suikerwater werd dan analoog als voor de chemische aphiciden verdeeld
over 4 nesten. In de negatieve controle werden de nesten blootgesteld aan onbehandeld suikerwater. Als
positieve controle werden de werksters ad libitum blootgesteld aan suikerwater behandeld met de
MFRC van imidacloprid (0.1%; 200 ppm). Alle behandelingen werden gevoed met onbehandelde
pollen. De pollenbollen werden 3 maal per week verwijderd uit de microkolonies en vervangen door
nieuwe pollen.
2.2 Foerageerproef: opstelling met orale blootstelling
Opname van voedsel gecontamineerd met pesticiden kan interfereren met het foerageergedrag van
hommels en kan nefast zijn voor het koloniesucces. Voor dit experiment werd gebruik gemaakt van 2
nestkasten, zijnde een microkolonie en een lege nestkast die met elkaar verbonden zijn door een 20 cm
lange buis met diameter van 1,5 cm. Bij de start van het experiment werd onbehandeld voedsel
(suikerwater en pollen) toegediend in nestkast A (figuur 8). Wanneer in compartiment A de eerste larven
verschijnen (na 2 weken) werd het voedsel verplaatst naar compartiment B. Na 2 dagen wanneer de
hommels de weg vlot van compartiment A naar B aflegden werd het onbehandeld suikerwater
vervangen door behandeld suikerwater. De suikerwaterbehandeling voor de verschillende aphiciden
werd uitgevoerd met de MFRC (zie 4.1.1). In de negatieve controlenesten werden werksters blootgesteld
aan onbehandeld suikerwater en in de positieve controlenesten aan suikerwater behandeld met
imidacloprid gedoseerd aan een verdunning 1/10.000 van de MFRC (20 ppb). Het suikerwater werd
wekelijks ververst en de onbehandelde pollen werden 3 maal per week ververst en vervangen door
nieuwe pollen zoals beschreven onder 2.1.
Page 26
26
Figuur 8: Schematische voorstelling van de foerageerproef. Werksters stichten een nest in compartiment A en moeten zich
verplaatsten door de 20 cm-lange buis naar compartiment B om pollen en suikerwater te verzamelen.
2.3 Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering
Tijdens de miniatuurdispenserproef werden de hommels blootgesteld aan de poederformulering van de
aphiciden. De opstelling bestond uit twee nestkasten die in verbinding stonden via een
miniatuurdispenser (20 cm x 5 cm x 10 cm) en een buis van 25 cm (figuur 9). Bij de start van het
experiment werd onbehandeld voedsel (suikerwater en pollen) toegediend in nestkast A (figuur 9). Na 2
weken, wanneer in compartiment A de eerste larven aanwezig waren, werd het voedsel verplaatst naar
compartiment B. Na 2 dagen wanneer de hommels de weg vlot van compartiment A naar B aflegden
werd de miniatuurdispenser gevuld met 11 g poederformulering van het te testen aphicide. De
miniatuurdispensers werden om de 3 dagen gevuld met nieuw poeder. Op de bodem van de
miniatuurdispenser werd eerst ribkarton geplaatst om verplaatsing van het poeder door de hommels te
minimaliseren. Om de éénrichting te verzekeren doorheen de miniatuurdispenser was de ingang naar de
miniatuurdispenser laag in het nestcompartiment en de uitgang hoog in het voedselcompartiment en vice
versa voor de 25 cm-lange buis. Daarnaast werd ook iedere uitgang voorzien van een klepje.
Figuur 9: Schematische voorstelling van de miniatuurdispenserproef. Werksters stichten een nest in compartiment A en
moeten zich verplaatsten door de miniatuurdispenser om te foerageren voor suikerwater en keren terug naar het nest
(compartiment A) via de 25 cm-lange buis.
A
B 20 cm
A B
25 cm
Page 27
27
2.4 Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering (herhaling chemische
aphiciden)
Een herhaling van deze proef werd uitgevoerd met alleen de chemische aphiciden. Enkele aanpassingen
moesten uitgevoerd worden om te voorkomen dat de wieken bevuild werden. Daarom werd de wiek
ververst om de 2 dagen. Op die manier kon nagegaan worden wat de overschatting aan toxiciteit was
door het bevuilen van de wiek. De opstelling en voorbereiding voor de blootstelling waren gelijkaardig
aan de eerste maal. De blootstelling liep 2 weken om na te gaan indien er een verschil was met de hoge
mortaliteit van de eerste maal.
3. Blootstelling aan aphiciden
In deze studie werden 3 chemische aphiciden: Teppeki, Pirimor en Plenum, en 2 microbiële aphiciden:
Preferal en Botanigard, getest op hun compatibiliteit met B. terrestris (tabel 4). Voor elk aphicide
werden 4 microkolonies opgestart bestaande uit 5 werksters van eenzelfde leeftijd. Parallel met de
aphicide behandeling werd er ook een reeks van 4 negatieve controlenesten en vier positieve
controlenesten opgestart. De effecten werden gedurende 7 weken gevolgd voor de orale blootstelling en
voor de poederformulering. De proeven werden 2 maal herhaald.
Voor de orale blootstelling via suikerwater werden de werksters blootgesteld aan de MFRC van de
verschillende aphiciden met uitzondering van Botanigard. Voor Botanigard werd de optimale
concentratie gebruikt zoals beschreven door Kapongo et al. (2008).
Voor de blootstelling aan de poederformulering (tabel 4) werd de kleefstof Maïzena toegevoegd aan de
bestaande poederformuleringen van de chemische aphiciden in een gewichtsverhouding van 1/1. Voor
de microbiële aphiciden werd de zelfde concentratie als bij de MFRC gebruikt maar dan omgezet naar
gram. Van de 110 g werd voor Preferal 11 g van het product toegevoegd, voor Botanigard 108 1,1 g en
voor Botanigard 107 werd er 0,11 g van het product toegevoegd
De poederformulering van de chemische aphiciden werd bekomen door in een mortier de korrels te
pletten tot poeder. Daarna werd het toegevoegd aan een mixer die het fijngemalen poeder mengde met
de kleefstof. De microbiële aphiciden, die reeds in poedervorm waren, werden in de mixer gebracht en
vervolgens met de kleefstof gemengd zodat de actieve stof gelijkmatig verdeeld was over de gehele
poederformulering.
Page 28
28
Tabel 4: Overzicht van de 5 geteste aphiciden.: hun commerciële naam, type, actieve stof, producent, dosering van de aphiciden in het suikerwater en dosering van de
poederformulering
Product Type Actieve stof Producent Dosering
suikerwater
Dosering poederformulering
Teppeki Chemisch 50% flonicamid Ishihara Sangyo Kaisha Ltd 0,16 g/l 0,25g actieve stof/g met Maïzena
Plenum Chemisch 50% pymetrozine Syngenta 0,4g/l 0,25g actieve stof/g met Maïzena
Pirimor Chemisch 50% pirimicarb Syngenta 0,4g/l 0,25g actieve stof/g met Maïzena
Botanigard 108 Microbieel 3,7x10
10 CFU/g Beauveria bassiana Certis Europe 3,7x10
8 CFU/l 3,7x10
8 CFU/g met Maïzena
Botanigard 107 Microbieel 3,7x10
10 CFU/g Beauveria bassiana Certis Europe 3,7x10
7 CFU/l 3,7x10
7 CFU/g met Maïzena
Preferal Microbieel 2x109
CFU/g Paecilomyces fumosoroseus Biobest N.V., België 2x108 CFU/l 2x10
8 CFU/g met Maïzena
Page 29
29
4. Dataverzameling en -verwerking
4.1. Orale blootstelling aan de MFRC
4.1.1 Waarneming
De microkolonies werden wekelijks gedurende een periode van 7 weken (waarvan 5 weken
blootstelling) opgevolgd en de waarnemingen werden genoteerd. De compatibiliteit van de verschillende
aphiciden met B. terrestris werd nagegaan op volledige organismen. Hiervoor werd de acute/chronische
toxiciteit (werkstermortaliteit) van de verschillende aphiciden geëvalueerd en werden de subletale
effecten op de reproductie gescoord. Effecten op de reproductie werden nagegaan door wekelijks de
nieuw verschenen darren te verwijderen uit de microkolonies. Werksters en darren werden
onderscheiden van elkaar op basis van hun morfologische eigenschappen.
4.1.2 Grafieken
Voor de verschillende behandelingen werd de werkstermortaliteit en het effect op de reproductie
weergegeven in een grafiek (Microsoft Excel 2010).
4.1.3 Werkster mortaliteit
De data werd verkregen door wekelijks het aantal levende werksters te scoren. Per week werd de
mortaliteit van de verschillende behandelingen inclusief de controlegroepen weergegeven als een
percentage. Bijvoorbeeld 50% mortaliteit betekent dat 10 B. terrestris werksters stierven. Om rekening
te houden met de mortaliteit in de negatieve controlegroep werd de gecorrigeerde mortaliteit berekend
door gebruik te maken van de Schneider-Orelli formule:
Gecorrigeerde mortaliteit% = mortaliteit% bij behandeling – mortaliteit bij controle x 100
100% - mortaliteit% bij de controle
Vervolgens werden de verschillende pesticiden ingedeeld in toxiciteitsklassen voor “extended laboratory
testing” zoals beschreven door de “The International Organisation for Biological Control of Noxious
Animals and Plants” (IOBC) (zie tabel 5)
Tabel 5: Toxiciteitsklassen voor uitgebreide laboratoriumtesten, zoals voorgesteld door de IOBC Working Group “Pesticides
and benefical organisms” (Hassan, 1992)
Klasse IOBC grenzen Toxiciteit 1 < 25% Niet toxisch 2 25% - 50% Zwak toxisch 3 51% - 75% Matig toxisch 4 >75% Sterk toxisch
Page 30
30
4.1.4 Darrenproductie
Het aantal darren geproduceerd in de 4 microkolonies tijdens de experimentele periode van 5 weken
blootstelling werd omgerekend naar een gemiddeld aantal darren met standaarddeviatie. Aangezien de
proef 2 maal herhaald werd, berekenden we het gemiddelde van het gemiddelde en de bijhorende
standaardfout (SEM). Vervolgens werden alle data gecontroleerd op hun normaal-verdeeld-zijn door
middel van een Kolmogorov-Smirnof test. Na bevestiging van normalisatie werd de significantie van de
bekomen gemiddelden nagegaan ten opzichte van de negatieve controle door een one-way ANOVA
gevolgd door een post-hoc Tukey-Kramer test (α=0.05) waardoor de behandelingen in groepen werden
ingedeeld die aangeduid werden met een verschillende letter. De statistische analyse werd uitgevoerd in
SPSS 16.0.
4.2. Blootstelling aan de poederformulering van pesticiden
4.2.1 Waarneming
De data werd verkregen via wekelijkse evaluatie en scoring beschreven onder 4.1.1.
4.2.2 Grafieken
Alle grafieken werden opgesteld zoals onder 4.1.2.
4.2.3 Werkster mortaliteit
Dit deel werd identiek behandeld als onder 4.1.3.
4.2.4 Darrenproductie
Dit deel werd identiek behandeld als onder 4.1.4.
5. Kwaliteitscontrole van de microbiële aphiciden
Om de activiteit van de verschillende biologische aphiciden (Preferal en Botanigard) na te gaan werd
een germinatieproef uitgevoerd. Van elk pesticide werd 1 g opgelost in 100 ml leidingswater waaraan
een druppel Tween werd toegevoegd. Per product werden 5 druppels van 100 µl gebracht op een
dekglaasje bedekt met microbiële agar De microbiële agar werd bereid in 50 ml milli-Q water en
vervolgens 20 minuten geautoclaveerd.
De dekglaasjes werden geïncubeerd in een petrischaal afgesloten met parafilm op 28°C en 60% relatieve
vochtigheid. Na 24 uur en 48 uur werd het aantal kiemende sporen (aanwezigheid van een kiembuis) per
100 sporen gescoord onder een lichtmicroscoop (vergroting 10x40). Dit werd 5 maal uitgevoerd om
daaruit een gemiddeld kiemgetal met standaarddeviatie te berekenen.
Page 32
32
1. Kwaliteitscontrole van de microbiële preparaten
Om de kwaliteit van de microbiële preparaten te bepalen werd er een germinatieproef uitgevoerd. Voor
Preferal was het gemiddeld percentage gekiemde sporen 90±8% na 24 uur. Bij Botanigard was dit
slechts 30±11% na 24 uur en 84±11% na 48 uur. Hiermee wordt bevestigd dat de microbiële preparaten
gebruikt kunnen worden in verdere proeven en dat de bekomen effecten omwille van de toxiciteit van de
microbiële aphiciden zijn.
2. Toxiciteitsproeven: orale blootstelling
2.1 Klassieke toxiciteitsproef
Figuur 10 geeft een overzicht van het gemiddeld percentage werkstermortaliteit na orale bloostelling aan
de 5 verschillende aphiciden. Botanigard 107 en Preferal resulteerden respectievelijk in 43±2% en
45±8% werkstermortaliteit na 5 weken blootstelling (figuur 10) m.a.w beiden waren zwak toxisch
(IOBC klasse 2). Orale blootstelling aan een hogere concentratie Botanigard 108 veroorzaakte 55±11%
mortaliteit (IOBC klasse 3: matig toxisch). De 3 geteste chemische aphiciden werden geklasseerd als
zwak toxisch aangezien ze 39±11% mortaliteit (Teppeki), 34±19% mortaliteit (Pirimor) en 26±0%
mortaliteit (Plenum) veroorzaakten na 5 weken. De mortaliteit in de positieve controle (200 ppm
imidacloprid) bedroeg 100%.
Figuur 10: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV, gecorrigeerd door gebruik van Schneider- Orelli formule van de 5
geteste aphiciden na 5 weken van orale blootstelling. De mortaliteit in de negatieve controle met onbehandeld suikerwater
bedroeg 5±0% en in de positieve controle met imidacloprid aan zijn MFRC (200 ppm) 100±0%. De cijfers 2 en 3 duiden de
verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan.
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Gem
iddel
de
gec
orr
igee
rde
wer
kst
erm
ort
alit
eit
(%
± S
TD
V)
(2) (2) (2) (2)
(2) (3)
Page 33
33
De resultaten van de subletale effecten op de reproductie na 5 weken van blootstelling zijn weergegeven
in figuur 11. Hieruit blijkt dat de darrenproductie in de nesten blootgesteld aan de verschillende
aphiciden significant (p<0.05) lager was dan in de negatieve controlegroep (53±2 darren). Daarnaast is
ook duidelijk dat blootstelling aan biologische aphiciden resulteert in een intermediaire productie van
darren, terwijl de nesten blootgesteld aan de chemische aphiciden de laagste reproductie hebben (figuur
11).
Figuur 11: Effect op de gemiddelde darrenproductie na 5 weken van orale blootstelling aan de 5 geteste aphiciden. Data werd
geanalyseerd met ANOVA en resulteerde in 3 groepen (F=41,019; df=6,55; p<0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door
een verschillende letter (A-C) zijn significant verschillend na een post-hoc Tukey-Kramer met α=0,05.
2.2. Foerageerproef
Figuur 12 geeft de gemiddelde werkstermortaliteit weer na 5 weken van orale blootstelling aan de
verschillende aphiciden via de foerageerproef. Hieruit blijkt dat enkel Botanigard 107 niet toxisch is,
14±12% mortaliteit (IOBC klasse 1). Alle andere aphiciden resulteerden in een zwakke toxiciteit (IOBC
klasse 2): Teppeki (50±12%), Pirimor (50±8%), Plenum (45±5%), Preferal (34±7%) en Botanigard 108
(41±2%). De positieve controle met imidacloprid aan 20 ppb resulteerde in 68±1 % mortaliteit na 5
weken van blootstelling.
0,0
20,0
40,0
60,0
Gem
idd
eld
e d
arre
n p
rod
uct
ie (
aan
tal
± S
EM
)
C C C
B B
B
A
Page 34
34
Figuur 12: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider –Orelli formule voor de 5
verschillende aphiciden na 5 weken van orale blootstelling. De mortaliteit in de negatieve controle met onbehandeld
suikerwater bedroeg 5±0% en in de positieve controle met imidacloprid aan 20 ppb 68±1%. De cijfers 1 tot 2 duiden de
verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan.
Naast letale effecten werden ook de subletale effecten op de reproductie voor de vijf aphiciden
geëvalueerd (figuur 13). Voor alle geteste aphiciden is de darrenproductie significant (p<0.05) lager dan
in de negatieve controle groep met onbehandeld suikerwater (40±1 darren).
Figuur 13: Effect op de gemiddelde darrenproductie 5 weken van na orale blootstelling aan de 5 aphiciden. Data werden
geanalyseerd met ANOVA en resulteerde in 5 groepen (F=35,487; df=6,56; p<0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door
een verschillende letter (A-E) zijn significant verschillend na een post-hoc Tukey-Kramer met α=0,05.
0
25
50
75
100
Gem
idd
eld
e gec
orr
igee
rde
wer
kst
erm
ort
alit
eit
(% ±
ST
DV
)
(2) (2) (2) (2) (2)
(1)
0
20
40
60
Gem
ild
del
de
dar
ren
pro
du
ctie
(aa
nta
l ±
SE
M)
CD DE E
B D BC
A
Page 35
35
3.Toxiciteitsproeven: blootstelling aan een poederformulering via de
miniatuurdispenser
De resultaten van de letale effecten van de miniatuurdispenserproef worden weergeven in figuur 14. De
3 chemische pesticiden (Teppeki, Pirimor en Plenum) veroorzaken 100± 0% mortaliteit na 2 weken
(IOBC klasse 4). In vergelijking met de chemische aphiciden waren de biologische aphiciden minder
toxisch. Botanigard 107
en 108 en Preferal hadden een respectievelijke mortaliteit van 40±1% (IOBC
klasse 2) en 67±1% (IOBC klasse 3) en 25±1% (IOBC klasse 2) na 5 weken van blootstelling aan de
poederformulering.
Figuur 14 Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider- Orelli formule per aphicide na 5
weken van blootstelling aan de poederformulering. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 17±2% en in de positieve
controle 100±0%. De cijfers 1 tot en met 4 duiden de verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan.
Figuur 15 geeft de neveneffecten weer op darrenproductie na 5 weken van blootstelling aan de
poederformulering van de verschillende aphiciden. In de nesten blootgesteld aan de 3 chemische
aphiciden en aan Botanigard was de hoge werkstermortaliteit verantwoordelijk voor het verlies van
reproductie. Hier dient ook opgemerkt te worden dat er veel poeder meegedragen en afgezet werd op de
wieken (figuur 16).
0
25
50
75
100
week 1 week 2 week 3 week 4 week 5
Gem
idd
eld
e gec
orr
igee
rde
wer
kst
erm
ort
alit
eit
(% ±
ST
DV
)
Teppeki
Pirimor
Plenum
Botanigard 10^8
Botanigard 10^7
Preferal
(4)(4)(4)(3)(2)(2)
Page 36
36
Figuur 15: Effect op de gemiddelde darrenproductie na 5 weken van blootstelling aan de poederformulering van de 5
aphiciden. Data werden geanalyseerd met ANOVA en resulteerden in 3 groepen (F=222,963; df=7,56; p<0.001). De
gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter (A-C) zijn significant verschillend na een post-hoc Tukey-Kramer
met α=0.05.
Figuur 16: links; contaminatie van het nest door afzetting van poeder (Pirimor), rechts; wiek bevuild door poeder (Pirimor).
De pijlen duiden aan waar het poeder zich situeert op het nest en op de wiek.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
Teppeki Pirimor Plenum Preferal Botanigard10^8
Botanigard10^7
controle
gem
idd
eld
e d
arre
np
roduct
ie
(aa
nta
l ±
SE
M)
C C C
B B
A A
Page 37
37
4. Miniatuurdispenser: opstelling met blootstelling aan de poederformulering
(herhaling chemische aphiciden)
Omwille van de hoge mortaliteit bij de miniatuurdispenserproef werd een bijkomend experiment
uitgevoerd waarbij de wieken vervangen werden om de 2 dagen. Figuur 17 toont dat de chemische
aphiciden nog steeds sterk toxisch zijn (klasse 4, IOBC)
Figuur 17: Gemiddeld percentage mortaliteit ± STDV gecorrigeerd door de Schneider- Orelli formule per aphicide na 2
weken blootstelling aan de poederformulering van de aphiciden. De mortaliteit in de negatieve controle (Maïzena) bedroeg
15±2% en in de positieve controle (Kaolien) 100±0%. De cijfers 4 duiden de verschillende IOBC toxiciteitsklassen aan.
0
25
50
75
100
Teppeki Pyrimor Plenum
Gem
idd
eld
e gec
orr
igee
rde
wer
kst
erm
ort
alit
eit
(% ±
ST
DV
)
(4) (4) (4)
Page 38
38
Discussie
en suggesties voor
verder onderzoek
Page 39
39
1. Letale en subletale neveneffecten na orale blootstelling
Onderstaande tabel 6 geeft een samenvatting van de bekomen resultaten met de klassieke
toxiciteitsproef en met de foerageerproef.
Tabel 6: Overzicht van de bekomen werkstermortaliteit en darrenproductie vergeleken met de controlegroep (100%) in de
klassieke toxiciteitsproef en in de foerageerproef.
Klassieke toxiciteitsproef Foerageerproef
Mortaliteit Darren Mortaliteit Darren
Aphiciden IOBC klasse % tov controle IOBC klasse % tov controle
Teppeki 2 32 2 40
Pirimor 2 26 2 35
Plenum 2 19 2 18
Preferal 2 51 2 60
Botanigard 108 3 62 2 38
Botanigard 107 2 62 2 50
1.1. Letale effecten op de hommels
Op basis van de mortaliteit bekomen in de twee proeven, blijkt dat alle aphiciden soortspecifiek zijn. Er
is een effect op de hommels maar dit effect is zwak toxisch (met uitzondering van Botanigard 108;
IOBC, klasse 3) in de klassieke toxiciteitsproef. In de foerageerproef werden alle microbiële aphiciden
geklasseerd als zwak toxisch. De chemische aphiciden veroorzaken zowel in de klassieke
toxiciteitsproef als de foerageerproef een mortaliteit die zwak toxisch is.
De resultaten van de microbiële aphiciden zijn in overeenstemming met de studies van Sterk et al.
(1995), Mommaerts et al. (2008;2009) en Kapongo et al. (2008). Deze studies toonden al aan dat de
microbiële aphiciden compatibel zijn met hommels wanneer men ze oraal blootstelt aan de aphiciden.
Blootstelling aan de MFRC via besproeiing van de chemische pesticiden Teppeki, Pirimor en Plenum
werd reeds door eerdere studies gerapporteerd als niet/zwak toxisch (Fanigliulo et al, 2009; Thompson,
2001). In de studie van Fanigliulo et al (2009) werd 14 dagen na behandeling door middel van
besproeiing van de gewassen aan het MFRC geen enkele dode adult gevonden. Echter werd vastgesteld
dat de pollenopslag significant lager was dan bij de controlegroep.
Men kan stellen dat op dit punt van de risicoanalyse alle gebruikte aphiciden in het experiment
compatibel zijn met hommels. De aphiciden kunnen verspoten worden op de gewassen zonder dat er
grote mortaliteit optreedt. Door vergelijking van de klassieke toxiciteitsproef met de foerageerproef kan
men waarnemen dat de microbiële en de chemische aphiciden geen hogere mortaliteit veroorzaken
Page 40
40
wanneer het element van foerageren aan de toxiciteitsproeven werd toegevoegd. Er ontstaat geen
verhoogde mortaliteit door het foerageren.
1.2. Subletale neveneffecten
De andere aspecten van de risicoanalyse evalueren subletale effecten op reproductie en op het
foerageergedrag. De klassieke toxiciteitsproef maakt gebruik van een eenvoudige nestkast met
eenvoudige toegang tot suikerwater en pollen. De hommels moeten geen energie verbruiken om te
foerageren want alles ligt in de nabijheid van het nest. Voor de risicoanalyse geeft deze proef enkel de
letale effecten en de subletale effecten op vlak van reproductie. Deze proef geeft een duidelijk beeld
over de direct zichtbare effecten. Echter zijn andere aspecten van een risicoanalyse ook belangrijk te
beschouwen. De foerageerproef geeft aan wat de subletale effecten op foerageergedrag zijn. Het
verruimt de resultaten van de klassieke toxiciteitsproeven ook omdat de combinatie van de toxiciteit en
het verbruik van energie in acht neemt, wat een extra stressfactor voor de hommels is. Door het
vergelijken van beide proeven kan men vaststellen of de extra stressfactor meer letale of subletale
effecten teweegbrengt.
De subletale effecten tonen aan dat alle microbiële aphiciden een effect hebben op de darrenproductie en
dit zowel in de klassieke toxiciteitsproef als in de foerageerproef. In de foerageerproef ontstaat een
gemiddeld genomen daling van 15% in darrenproductie, dit komt door de toxische werking van de
aphiciden, die versterkt wordt door de extra stressfactor van het foerageren. Mommaerts et al. (2009)
ondervonden al dat deze daling niet komt door mortaliteit van de werksters want die is gelijkaardig aan
die van de klassieke toxiciteitsproeven maar doordat het foerageren extra energie kost. Dit resulteerde
volgens het onderzoek van Mommaerts et al. (2009) ook in een verminderd aantal suikerbekers. Het
eerste wat lijdt onder de verminderde activiteit in het foerageren zijn de nakomelingen (Heinrich, 1979).
Adulten leven voornamelijk op het suikerwater en de larven hebben voornamelijk pollen nodig (Ribeiro
et al, 1996; Génissel et al, 2002; Tasei & Aupinel, 2008a,b).
De subletale effecten op de reproductie zijn gelijkaardig in beide proeven voor de chemische aphiciden.
Hieruit kan men besluiten dat er geen bijkomende effecten zijn wanneer de factor foerageren beschouwd
wordt in de proefopzet. Toch kan het zijn dat foerageren extra energie vergt waardoor een hogere
toxiciteit van de aphiciden ontstaat, dit leidt dan tot meer subletale neveneffecten.
Uit deze proeven kan men stellen dat het effect op de reproductie ligt en niet op de mogelijkheid om te
foerageren gezien de mortaliteit van de werksters er niet door beïnvloed wordt. Doordat er geen effect
op foerageergedrag vastgesteld werd, konden de 5 aphiciden in de miniatuurdispenserproef getest
worden.
Page 41
41
2. Letale en subletale neveneffecten na blootstelling poederformulering
Onderstaande tabel 7 geeft een samenvatting van de resultaten bekomen met de
miniatuurdispenserproef.
Tabel 7: Overzicht van de bekomen werkstermortaliteit en darrenproductie vergeleken met de controlegroep (100%) in de
miniatuurdispenserproef
Miniatuurdispenserproef
Mortaliteit Darren
Aphiciden IOBC klasse % tov controle
Teppeki 4 0
Pirimor 4 0
Plenum 4 0
Preferal 2 100
Botanigard 108 3 10
Botanigard 107 2 29
2.1 Letale effecten
De mortaliteit van de microbiële aphiciden valt na 5 weken blootstelling in de categorie zwak toxisch
voor Preferal en de laagste concentratie van Botanigard. Dit is een erg goed resultaat en lijkt
veelbelovend te zijn voor de toepassing van deze aphiciden in de entomovectortechnologie. De hoogste
concentratie van Botanigard geeft een matig toxisch effect. Dit betekent dat het belangrijk is dat de
concentratie nauwlettend gekozen wordt. Door het juiste evenwicht te kiezen tussen welke concentratie
van het actieve bestanddeel in de poederformulering komt, kan zowel de bladluis efficiënt bestreden
worden en ondervindt de vector geen nadelige effecten. Kapongo et al. (2008) testten 3 verschillende
concentraties van B. bassiana op B. impatiens. Een lage concentratie van 9x109, een middelhoge van
6,24x1010
en een hoge van 2x1011
conidia per gram poeder. Het bleek dat hoe hoger de concentratie
was, hoe meer hommels er stierven. Voor de laagste concentratie van B. bassiana was er een sterfte van
54% en een mortaliteit van 73% bij de hoge concentratie van de aphicide. Desondanks deze hoge
mortaliteit werden goede resultaten geboekt in het onderdrukken van de bladluispopulaties. Kapongo et
al (2008) concludeerden net zoals deze studie dat B. bassiana geschikt is voor entomovectoring.
Bij de chemische aphiciden trad er een 100% mortaliteit op na 2 weken van blootstelling. Deze hoge
toxiciteit kan deels verklaard worden door het feit dat de poederformulering niet voorbestemd is om te
gebruiken binnen de entomovectortechnologie. De huidige formulering is zo ontworpen om opgelost te
worden in water om te verspuiten op het gewas. De toxiciteitsproeven via orale blootstelling tonen aan
dat de chemische aphiciden compatibel zijn met hommels. Daarom zijn we er ook van overtuigd dat
mits optimalisatie van de poederformulering, deze aphiciden toegepast kunnen worden binnen de
entomovectortechnologie. Voorbeelden van biologische pesticiden die geoptimaliseerd werden voor
entomovectoring, zijn Prestop-Mix en Binab-T-vector. Verder kan er nog een deel van de toxiciteit
verklaard worden door het feit dat de hommels weinig moeten vliegen om te foerageren. Volgens
Mommaerts et al. (2010) verliezen hommels (B. terrestris) 80 tot 90% van hun lading waardoor de
huidige proefmethodiek een overschatting van de toxiciteit kan geven. Dezelfde proefmethode
Page 42
42
resulteerde ook in het bevuilen van de wieken/nest door de werksters welke ook kan bijdragen tot de
hoge werkstermortaliteit. Bij herhaling van de proef maar met verversen van de wieken werd echter
eenzelfde hoge mortaliteit waargenomen als voorheen. Op basis van deze waarnemingen kan uitgesloten
worden dat het fenomeen op zich van het bevuilen van de wieken/nest met poeder oorzaak is van de
hoge mortaliteit.
2.2 Subletale effecten
Bij de biologische aphiciden, had Preferal een normale nestopbouw aangezien de darrenproductie niet
significant (p>0,05) verschillend was van de controlegroep. Botanigard 108 en 10
7 hebben een normale
nestopstart, maar de productie van darren daalde met een toename in blootstellingstijd.
Figuur 18: Overzicht van de nestopbouw wanneer microkolonies gedurende 5 weken blootgesteld werden aan de
poederformulering van (a) van Maïzena.; (b) Preferal+Maïzena (verhouding 1/10), en (c) Botanigard 107+Maïzena
(verhouding 1/100) in de miniatuurdispenserproef.
Over de reproductie van de chemische aphiciden kan er niets gezegd worden aangezien alle werksters al
dood waren in een vroege fase van de nestopstart.
3. Gebruik in entomovectoring
Door een stapsgewijze aanpak van de studie werden meerdere opstellingen gebruikt om de toepassing
van de verschillende aphiciden binnen de entomovectortechnologie te testen in het laboratorium.
Het verschil tussen de foerageerproef en de miniatuurdispenser ligt aan de manier van blootstelling.
Hommels moeten door de poederformulering wandelen, wat een effect kan hebben op hun mobiliteit. De
hommel heeft nooit 100% van het poeder verloren dus ze dragen steeds een deel mee dat dan afgezet
wordt op het nest. Daardoor treden enkele problemen op zoals de overschatting van de toxiciteit omwille
van de poederafzettingen op het nest. De proeven van Pettis et al. (2004) toonden aan dat met het
gebruik van poederformuleringen er poeder aanwezig is op de broedcellen van honingbijen als ze hun
broed verplaatsen, en dat het effect ook afhankelijk is van het soort poeder. Indien men een kleefstof
kiest, moet men rekening houden dat het niet toxisch is en dat het de hommels niet aanzet tot overmatig
poetsgedrag van hun lichaam. Bijvoorbeeld talk beïnvloedt honingbijbroed doordat het mortaliteit van
de larven veroorzaakt (Pettis et al, 2004). Het is tevens meer irriterend waardoor de honingbijen meer
poetsen (Israel & Boland, 1993) dan met bloem. Kevan et al. (2008) rapporteerden een daling van 50%
van het poetsgedrag wanneer honingbijen werden blootgesteld aan bloem. In de huidige experiment
werd overmatige blootstelling aan de poederformulering vermeden door de éénrichting in de
miniatuurdispenser door de positie van de in- en uitgangen en de aanwezigheid van klepjes op de
Page 43
43
uitgangen. Ondanks deze aanpassing waren alle werksters dood na 2 weken van blootstelling aan de
poederformulering van de chemische pesticiden. Ook de bijkomende proef waarbij de wieken om de 2
dagen ververst werden bevestigde de hoge werkstermortaliteit. Hieruit besluiten we dat de
poederformulering van de chemische aphiciden verder geoptimaliseerd moet worden vooraleer gebruik
binnen de entomovectortechnologie kan worden overwogen. Tevens kan gesteld worden dat de
technologie die in deze studie ontwikkeld werd om de entomovectoring in het laboratorium na te
bootsen succesvol was. De two-way dispenser met verlaagde ingang en verhoogde uitgang en met
klepjes op de uitgangen is bruikbaar om de neveneffecten van de biologische aphiciden te testen.
4. Verder onderzoek
Deze studie toont aan dat microbiële pesticiden toepasbaar zijn binnen een entomovectorsysteem in de
strijd tegen pestinsecten zoals bladluizen. Dit potentieel om pestinsecten te bestrijden werd reeds
bevestigd door andere studies met B. bassiana (Al-mazra‟awi et al., 2006; Kapongo et al., 2008).
Om een beter beeld krijgen van de toepassingsmogelijkheden van huidige pesticideformuleringen
zouden toekomstige studies zich moeten concentreren op de concentratie van het pesticide, maar hier
dient dan de efficiëntie t.o.v. de plantpathogeen/pest insect nagegaan te worden. Daarnaast zouden
toekomstige risico-analyses ook studies moeten beschouwen waarbij de vector vrij kan vliegen.
Mommaerts et al. (2010) rapporteerden namelijk dat 80-90% van de lading verloren gaat na een vlucht
van 60 s. Dit ladingsverlies zou wel eens kunnen resulteren in een daling van de negatieve effecten
(werkstermortaliteit en darrenproductie) welke we waargenomen hebben in deze studie. Tenslotte
moeten er ook proeven op semi-veld niveau uitgevoerd worden om eventuele andere neveneffecten te
evalueren zoals bijvoorbeeld het effect van de aanwezigheid van een poederformulering in de bloem op
het bloembezoek door de vector.
Page 44
44
Conclusie
De 5 pesticiden Teppeki, Pirimor, Plenum, Preferal en Botanigard zijn compatibel met B. terrestris. De
risicoanalyse van de pesticiden was gebaseerd op een zeer strenge toxiciteitsproef door middel van
contaminatie van het suikerwater. Uit de risicoanalyse blijkt dat de geteste aphiciden zwakke letale
effecten veroorzaken op B. terrestris. Daarnaast werden ook subletale effecten waargenomen op de
reproductie en op het foerageergedrag. Hier was duidelijk dat de chemische aphiciden een sterkere
daling veroorzaakten van de darrenproductie dan de biologische aphiciden en dat er geen bijkomend
effect kon worden waargenomen wanneer de factor foerageren ingesloten werd in de test. Algemeen kan
men dus stellen dat de geteste aphiciden soortspecifiek genoeg zijn om ze te gebruiken op velden waar
hommels de bestuiving verzorgen.
Op vlak van de entomovectortechnologie zijn er in de toekomst toepassingen mogelijk voor Preferal en
Botanigard. Blootstelling aan de poedervorm van Preferal en Botanigard 107 was zwak toxisch en enkel
Botanigard veroorzaakte een reductie in het aantal geproduceerde darren. Toch zou verdere
optimalisatie van de formulering/concentratie kunnen resulteren in een daling van de neveneffecten.
Voor de chemische aphiciden bleek uit de verschillende proefopzetten dat ze niet geschikt zijn voor de
entomovectortechnologie met de huidige productformulering. Toch moeten deze resultaten genuanceerd
worden aangezien alle testen onder zeer strenge omstandigheden getest werden. Door aanpassing van
bijvoorbeeld de concentratie is hun gebruik misschien toch mogelijk, maar hier dient dan nagegaan te
worden of de bladluizen nog efficiënt bestreden worden. Om een beter inzicht te krijgen in de potentie
van het gebruik van deze aphiciden is het daarom ook aangewezen om proeven uit te voeren met vrij-
vliegende hommels in vliegkooien.
Page 45
45
Referenties
Artikels
Alford D.V., (1975) Bumblebees. Davis- Pointer Limited, London
Al-mazra‟awi MS, Shipp JL, Broadbent AB, Kevan PG (2006) Biological control of Lygus lineolaris
(Hemiptera: Miridae) and Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) by Bombus
impatiens (Hymenoptera: Apidae) vectored Beauveria bassiana in greenhouse sweet pepper.
Biological Control 37:89–97
Benton T., (2006) Bumblebees, HarperCollins Publishers, London, pp 580
Bernhard K., Holloway P.J., Burges H.D., (1998) Appendix I: a catalogue of formulation additives:
function, nomenclature, properties and suppliers. In: Burges H.D (eds) Formulation of Microbial
biopesticides: beneficial microorganisms, nematodes and seed treatments
Besard L., Mommaerts V., Abdu-Alla G., Smagghe G., (2011) Lethal and sublethal assessment
supports a more benign profile of spinetoram compared with spinosad in the bumblebee Bombus
terrestris Pest Management Science; DOI 10.1002/ps.2093
Besard L., Mommaerts V., Vandeven J., Cuvelier X., Sterk G., Smagghe G., (2010) Compatibility of
tradional and novel acaricides with bumblebees ( Bombus terrestris): a first laboratory assessment
of toxicity and sublethal effect. Pest Management Science; 66:786-793
Bilu A., Dag A., Elad Y., Shafir S., (2004) Honey bee dispersal of biocontrol agents: an evaluation
of dispensing devices. Biocontrol Science Technology 14:607–617
Blacquière T., (2005) the use of pollinators as disseminators of crop protection agents. DIARP
workshop 26-27 September 2005, Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, Bijen, Wageningen, The
Netherlands
Butt T.M., Copping L.G., (2000) Fungal biological control agents. Pesticide Outlook 11: 186-191
Bourke A.F.G., Ratnieks F.L.W., (2001) Kin-selected conflict in the bumblebee Bombus terrestris
(Hymenoptera: Apidae) Proceedings of the Royal society of London Series B 268:347-355
Chittka L., Williams N.M., Rasmussen H., Thomson J.D., (1999) Navigation without vision:
bumblebee orientation in complete darkness. Proceedings of the Royal Society London B 266: 45-50
Cresswell J.E., Galen C., (1991) Frequency-dependent selection and adaptive surfaces for floral
character combinations. The pollination of polemium-viscosum. American Naturalist 138: 1342-
1353
Desneux N., Decourtye A., Delpuech J.M., (2007) The sublethal effects of pesticides on beneficial
arthopods. Annual Reviews Entomology 52: 81-106
Page 46
46
Dryer A.G., Withney H.M., Arnold S.E.J., Glover B.J, Chittka L., (2007) Mutations pertubing petal
cell shape and anthocyanin synthesis influences bumblebee perception of Atirrhinum majus flower
colour. Athropod Plant interact 1: 45-55
European commission, (2002) Review report for the active substance Paecilomyces fumosoroseus
(Apopka strain 97, PFR 97 or CG 170, ATCC20874), Finalised in the Standing Committee on Plant
Health at its meeting on 27 April 2001 in view of the inclusion of Paecilomyces fumosoroseus (Apopka
strain 97, PFR 97 or CG 170, ATCC20874) in Annex I of Directive 91/414/EEC
EFSA, (2005) Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active
substance pirimicarb, EFSA Scientific Report 43, 1-76
Espinosa-Ortiz G.E., Lara-Reyna J.; Otero-Colina G.; Alatorre-Rosas R., Valdez-Carrasco J., (2011)
Susceptibility of larval, pupal and adult honeybees to isolates of Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.,
Metarhizium anisopliae (Sorokin) AND Paecilomyces fumosoroseus (Wize) ,Interciencia: 36, 2: 148-
152
Fanigliulo A, Filì V, Pacella R, Comes S, Crescenzi A (2009) Teppeki, selective insecticide about
Bombus terrestris. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences;74(2):407-10
Génissel A., Aupinel P., Bressac C., Tasei J.N., Chevrier C., (2002) Influence of pollen origin on
performance of Bombus terrestris micro-colonies. Entomologia Experimentalis et Applicata 104: 329-
336
Goulson D., (2006) Bumblebees: their behaviour and ecology. Oxford University Press, Oxford, 235p
Goulson D., (2010) Bumblebees behaviour, ecology and conservation. Oxford University Press,
Oxford, 317p
Goulson D., Cruise J.L Sparrow K.R., Harris A.J., Park K.J., Tinsley M.C., Gilburn A.S., (2007)
Choosing rewarding flowers; perceptual limitations and innate preferences influence decision
making in bumblebees and honeybees. Behavioural Ecological Sociobiology 61: 1523-1529
Gross H.R., Hamm J.J., Carpenter J.E., (1994) Design and application of a hive-mounted device that
uses honeybees (Hymenoptera: Apidae) to disseminate Heliothis nuclear polyhedrosis virus.
Biological control 23: 492-501
Goulson D., Peat J., Stout J.C., Tucker J., Darvill B., Derwent L.C., Hughes W.O.H., (2002) Can
alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging
efficiency. Animal Behaviour 64: 123-130
Gumbert A., (2000) Color choices by bumblebees (Bombus terrestris): innate preferences and
generalization after learning. Behavioral ecology and Sociobiology 48: 36-43
Hassan S.A., (1992) Guidelines for testing the effects on beneficial organisms: description of test
methods. IOBC/WPRS Bulletin 15(3):186p
Page 47
47
Hashim N., Ibrahim Y.B., (2003) Efficacy of Entomopathogenic Fungi, Paecilomyces fumosoroseus,
Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae var. majus Against Crocidolomia binotalis
(Lepidoptera; Pyralidae). Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science , 26 (2). pp. 103-108.
ISSN 1511-3701
Heinrich B., (1979) Bumblebee economics. Havard University Press, Cambrigde, Massachusetts, 245p
Hokkanen H.M.T., Menzler- Hokkanen I., (2007) Use of honeybees in the biological control of plant
disease. Bulletin of Entomological Research 37: A62-A63
Hynes R.K;, Boyetchko S.M., (2006) Research initiatives in the art and science of biopesticide
formulations. Soil Biology & Biochemistry 38: 845-849
Ishii H.S., Hirabayashi Y., Kudo G., (1993) Combined effects of inflorescence architecture, display
size, plant density and empty flowers on bumble bee behaviour: experimental study with artificial
inflorenscences. Oecologia 156:341-350
Israel M.S., Boland G.J., (1993) Influence of formulation on efficacy of honet bees to transmit
biological controls for management of Sclerotinia stem rot of Canola. Canadian Journal Plant
Pathology 14:244
Jones M.G., (1942) A description of Aphis (Doralis) rumicis and the comparison with Aphis
(Doralis) fabae. Bulletin of entomological research 33:5-20
Kapongo J.P., Shipp L., Kevan P., Broadbent B., (2008) Optimal concentration of Beauveria bassiana
vectored by bumble bees in relation to pest and bee mortality in greenhouse tomato and sweet
pepper. BioControl 53:797–812
Kells A.R., Goulson D., (2003) Preferred nesting sites of bumblebee queens (Hymenoptera:
Apidae) in agroecosystems in the UK. Biological conservation 109:165-174
Kevan P.G., Al-Mazra‟awi M.S., Sutton J.C., Tam L., Boland G., Broadbent B., Thomson S.V., Brewer
G.J., (2003) Using pollinators to deliver biological control agent against crop pests. In R. A.
Downer. J. C. Mueninghoff. & G. C. Volgas (Eds.). Pesticideforrnulations and delivery systems:
Meeting the challenges of the current crop protection industry (148-152). West Conshohocken. PA:
American Society for Testing and Materials International.
Kevan P.G., Kapongo J-P, Al-mazra‟awi M., Shipp L., (2008) Honey bees, bumble bees and
biocontrol. In: James R.R., Pitts-singer T., (eds.) Bee Pollination in Agriculture Ecosystems, Oxford
University Press, New York, pp 65-79
Kevan P.G., Straver W.A., Offer M;, Laverty T.M., (1991) Pollination of greenhouse tomatoes by
bumble bees in Ontario. Proceedings of Entomology Society of Ontaria 122:15-19
Kevan P.G., Sutton J., Shipp L, (2007) Pollinators as vectors of biocontrol agents - the B52 story. In
Vincent C., Goettel M., lazarovits G (eds) Biological control: a global perspective- case studies from
around the world. CABI Publishing, UK, pp 319-327
Page 48
48
Kovach J., Petzoldt R., Harman G.E., (2000) Use of honeybees and bumble bees to discriminate
Trichoderma 1295-22 to strawberries for Botrytis control. Biological Control 18: 235-242
Maccagnani B., Mocioni M., Ladurner E., Gullino M.L., Maini S., (2005) Investigation of hive-
mounted devices for the dissemination of microbiological preparations by Bombus terrestris.
Bulletin of Insectology 58:3-8
Malais M.H., Ravensberg W.J., (2002) Kennen en herkennen – levenswijzen van kasplagen en hun
natuurlijke vijanden. Koppert Biological Systems, tweede herziene druk
Malone LA, Burgess EPJ, Stephanovic D and Gatehouse HS, (2000) Effects of four protease
inhibitors on the survival of worker bumblebees Bombus terrestris L. Apidologie 31:25–39
Moens, J; De Clercq P.; Tirry L (2011) Side effects of pesticides on the larvae of the hoverfly
Episyrphus balteatus in the laboratory. Phytoparasitica 39, 1:1-9, DOI: 10.1007/s12600-010-0127-3
Molet M., Chittka L., Raine N.E., (2009) How floral odours are learned inside the bumblebee
(Bombus terrestris) nest. Naturwissenschaften 96: 213-219
Mommaerts V., Platteau G., Boulet J., Sterk G., Smagghe G., (2008) Trichoderma-based biological
control agents are compatible with the pollinator Bombus terrestris: a laboratory study. Biological
Control 46:463-466
Mommaerts V., Put K., Smagghe G., (2011) Bombus terrestris as pollinator-and-vector to supress
Botrytis cinerea in greenhouse strawberry Pest Management Science DOI 10.1002/ps.2147
Mommaerts V., Put K., Van deven J., Jans K., Sterk G., Hoffman L., et al (2010) Development of a
new evaluation for microbiological control agents and evaluation of dissemination by bumblebees
in greenhouse strawberries. Pest Management Science 66:1199-1207
Mommaerts V., Reynders S., Boulet J., Besard L., Sterk G., Smagghe G., (2010) Risk assessment for
side-effects of neonicotionids against bumblebees with and without impairing foraging behavior,
Ecotoxicology 19:207-215
Mommaerts V., Smagghe G, Side-effects of pesticides on the pollinator Bombus: an overview. In:
"Pesticides in the Modern World / Book 5", ISBN 978-953-307-457-3, in druk, 2011.
Mommaerts V., Sterk G., Hofmann L., Smagghe G., (2009) A laboratory evaluation to determine the
compatibility of microbiological control agents with the pollinator Bombus terrestris. Pest
Management Science 65:949-955
Ngugi H.K., Scherm H., (2006) Biology of flower-infecting fungi. Annual Review of Phytopathology
44:261-282
Osborne J.L., Martin A.P., Shortall C.R., Todd A.D., Goulson D., Knight M.E., Hale R.J., Sanderson
R.A., (2008) Quantifying and comparing bumblebee nest densities in gardens and countryside
habitats. Journal of Applied Ecology 45:784-792
Page 49
49
Palmer C.L., Cashion G.J., Cramer G.C., and Novosel K.M., (2002) Flonicamid: A new active
ingredient to control foliar insect pests on ornamental plants, FMC Corporation, Specialty Products
Business, 1735 Market St, Philadelphia, PA, (2) TruGreen Chemlawn, 135 Winter Road, Delaware, OH
Peat J., Goulson D., (2005) Effects of experience and weather on foraging efficiency and pollen
versus nectar collection in the bumblebee, Bombus terrestris. Behavioral Ecology and Sociobiology
58: 152-156
Peng G., Sutton J.C., Kevan P.G., (1992) Effectiveness of honeybees for applying the biocontrol
agent Gliocladium rosea to strawberry flowers to supress Botrytis cinerea Canadian Journal of Plant
Pathology 14: 117-129
Pettis J.S., Kochansky J., Feldlaufer M.F., (2004) Larval Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae)
mortality after topical application of antibiotics and dusts. Journal of Economic Entomology 97:
171-176
Pitts-singer T.L., (2008) Past and present management of alfalfa bees In: James R.R., Pitts-Singer T
(eds.) Bee pollination in agriculture ecosystems, Oxford University Press, New York, pp 105-122
Preetha G.; Stanley J.; Suresh S., Kuttalam S.; Samiyappan R., (2009) Toxicity of selected insecticides
to Trichogramma chilonis: Assessing their safety in the rice ecosystem. Phytoparasitica 37,3: 209-
215 DOI: 10.1007/s12600-009-0031-x
Rands S.A., Withney H.M., (2008) Floral temperature and optimal foraging: Is heat a feasible
floral rewardd for pollinators? PloS One 3: 1-7
Ribeiro M., Duchateau M.J., Velthuis H.H.W., (1996) Comparison of the effects of two kinds of
commercially available pollen on colony development and queen production in the bumblebee
Bombus terrestris L. (Hymenoptera: Apidae). Apidologie 27: 133-144
Riveros A.J., Gronenberg W., (2009) Olfactory learning and memory in the bumblebee Bombus
occidentalis. Naturwissenschaften 96: 851-856
Rodriguez I., Gumbert A., de Ibarra N.H., Kunze J., Giurfa M., (2004) Symmetry is the eye of the
beeholder: innate preference for bilaterale symmetry in flower-naïve bumblebees.
Naturwissenschaften 91:374-377
Röseler P.-F., (1985) A technique for year-round rearing of Bombus terrestris (Apidae, Bombini)
colonies in captivity. Apidologie 16(2):165-170
Sapir Y., Shmida A., Ne‟ewan G., (2006) Morning floral heat as a reward to the pollinators of the
Oncocyclus irises. Oecologia 147: 53-59
Seymour R.S., White C.R., Giberneau M., (2003) Heat reward for insect pollinators. Nature 426:
243-244
Page 50
50
Sgolastra F., Bosch J., Molowny-Horas R., Maini S., Kemp W.P., (2010) Effect of temperature regime
on diapause intensity in an adult-wintering Hymenopteran with obligate diapause. Journal of
Insect Physiology 56:185-194
Shafir S, Dag A, Bilu A, Abu-Toamy M, Elad Y (2006) Honeybee dispersal of the biocontrol agent
and Trichoderma harzianum T39: effectiveness in suppressing Botrytis cinerea on strawberry
under field conditions. European Journal of Plant Pathology 116:119-128
Shykoff A., Bucheli E., Kaltz O, (1997) Anther smut disease in Dianthus silvester
(Caryophyllaceae): natural selection on floral traits. Evolution 51: 383-392
Simonds V., Powright M.S., (2004) How do bumblebees first find flowers? Unlearned approach
responses and habituation. Animal Behaviour 67: 379-386
Spaethe J., Brockmann A., Halbig C., Tautz J., (2007) Size determines antennal sensitivity and
behavioural threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften 94:733-739
Spaethe J., Chittka L., (2003) Interindividual variation of eye optics and single object resolution in
bumblebees. Journal of Experimental Biology 206:3447-3453
Spaethe J, Tautz J, Chittka L (2001) Visual constraints in foraging bumblebees: flower size and
color affect search time and flight behaviour. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 98:3898–3903
Staetz C., Black B., Hayashi J., Kinne L., Kelly G., Treacy K., and Joost H.. (2006) Flonicamid - A
novel mode of action for piercing sucking insects. Belt cotton conferences FMC Corporation, Box 8,
Princeton, NJ 08543
Sterk, G., Bolkmans K., De Jonghe R., De Wael L., and Vermeulen J. (1995) Side-effects of PreFeRal
WG (Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith, strain Apopka 97), on Bombus
terrestris. Mededelingen van de Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische
Wetenschappen, Universiteit Gent 60 (3a): 713-717
Stout J.C., (2000) Does size matter? Bumblebee behaviour and the pollination of Cystisus scoparius
L. (Fabaceae) Apidologie 31: 129-139
Tasei J.N., Aupinel P., (2008a) Validation of a method using queenless Bombus terrestris micro-
colonies for testing the nutritive value of commercial pollen mixes by comparison with queenright
colonies. Journal of Economic Entomology 101: 1737-1742
Tasei J.N., Aupinel P., (2008b) Nutritive value of 15 single pollens and pollen mixes tested on larvae
produced by bumblebee workers (Bombus terrestris, Hymenoptera: Apidae). Apidologie 39:397-
409,
Thompson H.M., (2001) Assessing the exposure and toxicity of pesticides to bumblebees (Bombus
sp.) Apidologie 32, 305–321 305
Page 51
51
Thompson H.M., Hunt L.V., (1999) Extrapolating from honeybees to bumblebees in pesticide risk
assessment Ecotoxicology 8(3): 147-166
Velthuis H.H.W., van Doorn A., (2006) A century of advances in bumblebee domestication and the
economic and environmental aspects of its commercialization for pollination Apidologie 37:421-
451
Wagner B.L. and Lewis L.C. (2000) Colonization of corn, Zea mays, by the entomopathogenic
fungus Beauveria bassiana, Applied and Environmental Microbiology, p. 3468-3473, Vol. 66, No. 8
Yu H., Sutton J.C., (1997) Effectiveness of bumblebees and honeybees for delivering inoculum of
Gliocladium roseum to raspberry flowers to control Botrytris cinerea. Biological Control 10:113-122
Websites
Albert De Wilde 2011, foto‟s: [http://www.ahw.me/indexhommel.html]
Belchim 2011, informatie over Teppeki: [http://www.belchim.com]
Biobest 2011, informatie over Preferal: [http://www.biobest.be]
Certis 2011, informatie over Botanigard: [http://www.certiseurope.nl]
Syngenta 2011, informatie over Plenum en Pirimor: [http://www.syngenta.be]