UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGÍA Tesis para la obtención del Título de Biólogo “EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN CAFÉ (Coffea canephora y Coffea arabica) PARA SU APLICACIÓN Y ADOPCIÓN DE SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN MASAL.” José Andrés Acosta Andrade GUAYAQUIL - ECUADOR 2015
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
Tesis para la obtención del Título de
Biólogo
“EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN CAFÉ (Coffea canephora y Coffea arabica) PARA SU APLICACIÓN Y ADOPCIÓN DE
2.5. Factores que alteran el desarrollo del café 9
2.6. Cultivo de tejidos en café 10
2.6.1. Microestacas 13
2.6.2. Embriogénesis somática 13
2.7. Reguladores de crecimiento 13
2.8. Resultados en otros países 13
3. Materiales y Métodos 15
3.1. Localización 15
3.2. Factores en estudio 15
x
3.2.1. Cultivares 16
3.2.2. Etapas de desarrollo 18
3.3. Etapa de inducción de callos de primera generación 18
3.3.1. Etapa de inducción de callos de segunda
generación
18
3.3.2. Suspensiones celulares 21
4. Manejo del Ensayo 22
4.1. Colección y desinfección de las muestras de hoja 22
4.2. Etapas de crecimiento de los explantes 23
4.2.1. Etapa de inducción de callos de primera
generación
23
4.2.2. Etapa de inducción de callos de segunda
generación
23
4.2.3. Suspensiones celulares 24
4.3. Variables evaluadas 25
4.3.1. Porcentaje de explantes que presentaron callos en
los
tratamientos aplicados
25
4.3.2. Producción de embriones somáticos a partir de
células callosas
25
4.3.3. Disgregación de células embriogénicas 25
5. Resultados 26
5.1. Inducción de callos de primera generación 26
5.2. Inducción de callos de segunda generación 32
xi
5.3. Nuevos tratamientos frente al cultivar NP 3056 37
5.4. Nuevos tratamientos frente al cultivar NP 2044 39
6. Discusión 40
7. Conclusión 43
8. Recomendación 45
9. Literatura citada 46
10. Anexos 51
xii
Índice de Gráficos
Página
Gráfico 1. Evaluación de los 4 cultivares vs. 24 tratamientos de inducción de callos de primera generación……….…….…31
Gráfico 2. Evaluación de tratamientos vs. cultivares,
en la Inducción de callos secundarios………………………..35 Gráfico 3. Comparación entre los tratamiento con nuevas
dosis hormonales frente al cultivar NP 3056…………………38
Gráfico 4. Comparación entre los tratamiento con nuevas
dosis hormonales frente al cultivar NP 3056…………………39
xiii
Índice de Tablas
Página
Tabla 1. Porcentaje de formación de callos primarios 27 en el cultivar Sarchimor común
Tabla 2. Porcentaje de formación de callos primarios 28
en el cultivar Sarchimor mejorado Tabla 3. Porcentaje de formación de callos primarios 29 en el cultivar NP 2044 Tabla 4. Porcentaje de formación de callos primarios 30
en el cultivar NP 3056 Tabla 5. Promedio general de la respuesta callogénica 31
de los 4 cultivares frente a los 24 tratamientos Tabla 6. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 32
sarchimor común a la inducción de callos secundarios Tabla 7. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 33
sarchimor mejorado a la inducción de callos secundarios Tabla 8. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 33
NP 2044 a la inducción de callos secundarios Tabla 9. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 34
NP 3056 a la inducción de callos secundarios Tabla 10. Promedio general de respuesta de los 4 cultivares 35
de café a la inducción de callos secundarios Tabla 11. Comparación porcentual general de los nuevos 37
tratamientos probados con el cultivar NP3056 Tabla 12. Comparación porcentual general de los nuevos 39
tratamientos probados con el cultivar NP 2044
xiv
Índice de Cuadros
Página
Cuadro 1. Combinación de los tratamientos utilizados en los cultivares de café………………………….………..........17
Cuadro 2. Variación de la concentración de los macronutrientes fitohormonas y aditivos entre tratamientos………………….…19 Cuadro 3. Variación de la concentración del ácido indol acético
y 2, 4 D de acuerdo a los resultados del primer ensayo.............20 Cuadro 4. Variación de la concentración del ácido indol acético
y 2, 4 D de acuerdo a los resultados del segundo ensayo, utilizando 50% y 100% de los macronutrientes de MS normal…………………………………………………..….....21
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1. INTRODUCCIÓN
En Ecuador existen alrededor de 199.215 hectáreas de café, de las
cuales 62.830 ha son de Coffea canephora Pierre ex A. Froehner y 136.385 ha
de Coffea arabica L. La industria cafetera ecuatoriana procesa cada año
aproximadamente 102.300 toneladas de café (Cofenac, 2011), especialmente
como materia prima para café soluble.
El cultivo de café en Ecuador se basa en su mayoría en C. arabica la
cual se cultiva en el país desde zonas próximas al nivel del mar hasta los 2000
m de altura, distribuidas principalmente en las provincias Manabí, Loja, El Oro,
Zamora Chinchipe, Pichincha, Guayas, Los Ríos, Bolívar, Imbabura,
Esmeraldas y Napo. De esta especie algunas variedades como Typica y
Caturra rojo se han adaptado bien y producen en zonas tropicales secas donde
muchas otras especies no crecen satisfactoriamente. La especie C. canephora
se cultiva en zonas tropicales húmedas, por debajo de los 600 msnm,
principalmente en las provincias Esmeraldas, Santo Domingo de los Tsáchilas,
Los Ríos, Napo, Sucumbíos y Orellana.
En la actualidad el gobierno ecuatoriano está impulsando un proyecto de
siembra de 50.000 hectáreas con café “Robusta” lo cual significarían alrededor
de 37.000 toneladas por año. La disponibilidad de material vegetal para esta
siembra es deficiente al momento por lo que se necesitarían más de 125
millones de plantas para el área requerida.
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La multiplicación vegetativa de “Robusta” es lenta, por lo que es
necesario utilizar otras alternativas de multiplicación como lo es la propagación
in vitro. En esta área existen varias tecnologías que pueden aplicarse para
dicha propagación. Dentro de estas técnicas, la embriogénesis somática es, sin
duda, el método más viable de micropropagación como técnica para la
producción masiva de plantas.
En café pocos trabajos se han realizado en los que describen la
obtención de embriones somáticos a partir de la inducción de callos
embriogénicos formados de segmentos de hojas. Staritsky (1970) fue el
primero en reportar el desarrollo de embriones somáticos en Coffea canephora
a partir de tallos ortotrópicos. Posteriormente Sondhall y Sharp (1977)
describen un procedimiento para obtener un callo embriogénico a partir de
explantes foliares de Coffea arabica.
La técnica de producción de embriones somáticos se puede destinar a
programas de mejoramiento o a la propagación a gran escala de genotipos
superiores, especialmente en cultivos perennes de alto valor. La embriogénesis
somática se puede desarrollar de forma directa sobre la superficie de un tejido
organizado (hoja, tallo, microsporas, etc.) o por vía indirecta a través de una
etapa intermedia de formación de callos o suspensión celular.
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1.1. OBJETIVOS
1.1.1. General
Evaluar la técnica de embriogénesis somática para la multiplicación in
vitro en cultivares de café “Arábigo” y café “Robusta”.
1.1.2. Específicos
Generar una metodología de propagación rápida a partir de hojas de 2
variedades de Coffea arabica y 2 variedades de Coffea canephora.
A partir de la metodología de propagación rápida generada, producir
callos primarios y secundarios de C. canephora y C. arabica para su
multiplicación en medio líquido.
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1.2. HIPÓTESIS
1.2.1. Hipótesis Afirmativa
Los cultivares de café Coffea arabica y Coffea canephora seleccionados para
este estudio responden favorablemente a la inducción de embriones somáticos.
1.2.2. Hipótesis Nula
Los cultivares de café Coffea arabica y Coffea canephora seleccionados para
este estudio no responden a la inducción de embriones somáticos.
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2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Taxonomía del café
EL café pertenece al género Coffea con aproximadamente 104 especies.
No obstante, únicamente tres de estas se mencionan como cultivadas
comercialmente, destacándose las dos primeras en el siguiente orden: Coffea
arabica, Coffea canephora y por último la especie Coffea liberica Bull ex Hiern.
La taxonomía de acuerdo a Alvarado y Rojas (1994) es:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
sub.-División: Angiospermae
Clase: Magnoliatae
sub.-Clase: Asteridae
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae
Género: Coffea
2.2. Diversidad genética
Los recursos fitogenéticos del café que poseen un genoma común están
conformados por 104 especies descritas en el género Coffea y las especies
menos conocidas del género Psilanthus (Anthony, et al. 1999; Davis, et al.
2006; Bridson, 1987). Entre estas especies que constituyen los recursos
genéticos del cultivo de café existe una alta variabilidad, por ejemplo en un
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estudio con microsatélites, Ponce, et al. (2004) encontraron alta diversidad
genética y alto índice de loci polimórficos (más de 80%) en C. canephora y C.
pseudozanguebariae.
Según el número cromosómico el género Coffea se divide en dos
grupos, el grupo grande de las especies diploides (2n=22 cromosomas)
conformado por C. canephora, C. liberica C. stenophyla, C. racemosa y
otros, y el grupo de los tetraploides (2n=4x=44 cromosomas) conformado por
C. arabica (Regalado, 2006). C. arabica es una especie alotetraploide
producto de una cruza interespecífica natural entre dos especies diferentes con
un número básico de cromosomas x=11 (Regalado, 2006).
Los recursos genéticos de una planta cultivada corresponden a la
totalidad de las plantas con las que ella puede intercambiar genes. Todas estas
especies poseen un genoma de base común que permite la obtención de
híbridos y la transferencia de genes entre las especies (Francois, Astorga y
Bertrand, 2000).
2.3. Historia y distribución
El café es uno de los productos más importantes en el mercado
internacional, y uno de los que muchos países dependen para obtener divisas.
Ésta especie representa una importante fuente de ingresos para millones de
personas relacionadas con el cultivo de la misma, desde el punto de vista
comercial, sólo dos especies de café se cultiva extensivamente: C. arabica
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(Arábica) y C. canephora (Robusta); C. arabica es nativa de las tierras altas del
sudoeste de Etiopía, y fue traído de África tropical y se introdujo en el
continente americano en las primeras décadas del siglo XVIII. Ha contribuido al
desarrollo económico y cultural de los países donde se ha cultivado. Café
arábico, representa aproximadamente el 75% del café del mundo comercial y
para toda la producción de café en América Latina. Por otro lado, C. canephora
tiene una distribución geográfica muy amplia, que se extiende desde el oeste
hacia las regiones centrales tropicales y subtropicales del continente africano,
de Guinea y Liberia, el Sudán y el bosque de Uganda, con una alta
concentración de tipos en la República Democrática del Congo (Carneiro,
1999).
El género Coffea incluye 104 especies; no obstante únicamente se citan
cuatro en cultivo comercial, con marcado énfasis en las dos primeras según el
siguiente orden: C. arabica L., C. canephora P., C. liberica Hiern y C. dewevrei.
La especie C. arabica se cultiva en un 85 % de los países caficultores. En el
continente americano es donde ha tenido mayor difusión. En cuanto a la
especie C. canephora (Robusta), el auge de su cultivo es debido a su gran
resistencia a La Roya Hemileia vastatrix (Rojas, 1987).
2.4. Cultivo de café en Ecuador
En términos generales se distinguen cuatro zonas de producción de café
arábigo: 1) Manabí-Guayas, de 300 a 700 msnm (las partes altas del sistema
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montañoso Chongón Colonche); 2) la zona sur, de 500 a 2.000 msnm (El Oro-
Loja); 3) las estribaciones occidentales, de 500 a 1750 msnm (vertiente
occidental de Los Andes); y, 4) las estribaciones orientales, de 500 a 1500
metros de altura, en la parte centro-norte, y de 1000 a 1800 msnm, en la parte
suroriental (Anecafé, 2002 ; Cofenac, 2012).
El café robusta se adapta en las zonas tropicales húmedas de la costa y
la Amazonía ecuatoriana, cultivándose principalmente en las provincias Los
Ríos, Santo Domingo de los Tsáchilas, Esmeraldas, Sucumbíos, Napo y
Orellana; desde alturas cercanas al nivel del mar hasta los 600 msnm.
Todas estas áreas antes mencionadas abarca una superficie total de
199.215 ha en todo el país, de este total la provincia de Manabí es la que
posee la mayor superficie cafetalera (70.050 ha) y así mismo la mayor área de
producción efectiva (52.538 ha) a nivel nacional. En los últimos años se está
evaluando la posibilidad de producir café robusta usando irrigación en las
zonas tropicales secas de Guayas y Santa Elena (Cofenac, 2012).
2.5. Factores que afectan el desarrollo del café
Como todos los vegetales, el café también tiene rangos óptimos de
factores climáticos para su mejor desarrollo, muchas veces la falta de definición
de estos umbrales afecta la producción y el desarrollo de las plantas.
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La intensidad lumínica tiene una influencia directa con el número y el
tamaño de las hojas de la planta de café, dado el caso que a más exposición
solar tenga el cultivo las hojas serán de menor tamaño pero a la vez habrá
mayor número de hojas y nudos en las plantas (Carvajal, 1972); el fotoperiódo
necesario para los cultivos de este género es corto, menos de 13 horas de luz
solar diaria acentuándose en la mayoría de cultivos un promedio que va de 4,4
a 5,6 horas de luz por día con una temperatura media de 17 – 23 °C (Valencia,
2005).
Carvajal (1972) nos sugiere que la precipitación óptima media anual
debe estar entre los 1600 y los 1800 mm, soportando una mínima de hasta
1000 mm anuales considerando que el establecimiento de un periódo seco
favorece al crecimiento del café, especialmente en el desarrollo de la raíz. Por
otra parte la humedad relativa es un factor de importancia debido a que cuando
es mayor al 85% se propicia el ataque de enfermedades fungosas que se ven
notablemente favorecidas (Rojas, 1987).
Para la etapa de siembra es apropiado tener en cuenta los niveles de
densidad que se encuentran establecidos entre 3.000 y 4.000 plantas por
hectárea en cafetales arábigos y 1.111 plantas por hectárea en plantaciones de
robusta, ya que si se sobrepasa de los niveles apropiados tendremos
consecuencias como el crecimiento lento y desarrollo disparejo de manera muy
marcada entre planta y planta (Cofenac, 2012)
10
2.6. Cultivo de tejidos en café
El cultivo de tejidos se define como el conjunto de técnicas que permiten
cultivar un explante con potencial de diferenciación en un medio de
composición química definida, bajo condiciones de asepsia y bajo condiciones
ambientales controladas (Abdelnour y Escalant, 1994).
En café, varios trabajos se han realizado en los que describen la
obtención de embriones somáticos a partir de la inducción de callos
embriogénicos formados de segmentos de hojas. Staritsky (1970) fue el
primero en reportar el desarrollo de embriones somáticos en Coffea canephora
a partir de tallos ortotrópicos. Posteriormente, Sondahl y Sharp (1977)
describieron un procedimiento para obtener un callo embriogénico de alta
frecuencia a partir de explantes foliares de Coffea arabica.
A partir del trabajo pionero de Staritsky (1970), quien indujo con éxito la
embriogénesis somática en Coffea canephora, se han descrito varias técnicas
aplicadas al cultivo in vitro del café, tales como el cultivo de meristemos
embriones cigóticos, anteras o polen, suspensiones celulares y el cultivo de
protoplastos (Carneiro, 1999).
Las técnicas de cultivos de tejidos son utilizados en café principalmente
con dos fines: 1) recortar el ciclo de selección para Coffea arabica L. por medio
de la micropropagación de híbridos y por la utilización de plantas haploides. 2)
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multiplicar rápidamente los genotipos de Coffea canephora en las regiones en
donde la multiplicación por esquejes presenta problemas, o bien, para acelerar
la instalación de jardines clonales (Berthouly, 1997).
La multiplicación vegetativa del café utilizando las técnicas de cultivo in
vitro se puede llevar a cabo por dos vías: las microestacas y la embriogénesis
somática (Berthouly, 1997).
2.6.1. Microestacas
La propagación in vitro por microestacas, consiste en el cultivo de un
nudo o entrenudo proveniente de la planta, con el fin de obtener nuevos
vástagos mediante el desarrollo de yemas preexistentes o neoformadas, las
cuales podrán, a su vez, proporcionar nuevos esquejes, o ser enraizados,
obteniéndose así múltiples plantas, idénticas a la planta madre (García y
Rafael, 1989).
2.6.2. Embriogénesis somática
La embriogénesis somática es la más grande expresión de totipotencia
celular enunciado por Haberland en 1902 (Etienne, 2006). La totipotencia, es la
capacidad de las células vegetales para formar un nuevo individuo
genéticamente idéntico al que proporcionó la célula madre (Berthouly, 1997).
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Dublin (1991) describe al proceso de embriogénesis somática como el
método por medio del cual se obtiene embriones perfectamente organizados a
partir de las células somáticas. Estos embriones somáticos se desarrollan al
pasar por las fases: globular, torpedo y cotiledonar en dicotiledóneas.
Los embriones somáticos presentan una estructura bipolar, con
meristemos apicales y radicales en extremos de un mismo eje, en los cuales
las características morfológicas son idénticas a las encontradas en los
embriones cigóticos (Abdelnour y Escalant, 1994). Además los embriones
somáticos se caracterizan por no tener conexión vascular con el tejido materno
(Litz y Jarret, 1991).
2.7. Reguladores de crecimiento
La mayoría de los sistemas embriogénicos requieren, para la inducción
de los embriones, de una concentración alta de auxinas (generalmente 2,4 D)
en el medio de cultivo. Otras auxinas sintéticas tales como el Picloram, el 2,4,5
T, el ácido 2-benzothiazol acético, y el ácido paraclorofenoxiacetico han
demostrado ser muy efectivas. La concentración usual de 2,4-D está dentro del
rango de 0,5 – 27,6 µM (Evans, Sharp y Flick, 1981).
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2.8. Resultados en otros países
En varios países se han realizado investigaciones sobre la
embriogénesis somática del café, tal es el caso de la investigación que se
realizó en el estado de Chiapas-México en la cual evaluaron el potencial
callogénico que poseían tres diferentes tipos de explantes provenientes de
hojas inmaduras, jóvenes y maduras. Esta investigación nos muestra que el
tejido con mayor potencial callogénico es el extraído de hojas inmaduras e
incluso poseen menor probabilidades de contaminación, aunque nos indica
también que las probabilidades que los explantes se oxiden son altas, pero de
igual manera nos dice que la obtención de embriones a través de esta técnica
es viable (Gómez, et al., 2010).
En otro trabajo realizado en Venezuela se reportó la estabilidad genética
en las plantas de café cv. “Catimor” regeneradas por embriogénesis somática.
(Menéndez y Ríos, 2008). Por su parte, Moncada, Vielma y Mora (2005)
trataron de optimizar la embriogénesis somática en Coffea arabica L. variedad
Catuai Amarillo, observando que en el medio de inducción de embriones
somáticos (MS + BAP) estimula el desarrollo de embriones somáticos. El BAP y
el 2,4-D juntos promueven el desarrollo de callos con raíces y con potencial
embriogénico; las concentraciones bajas de estos dos reguladores de
crecimiento inducen un mayor desarrollo de callos embriogénicos. Sin
embargo, al ser llevados a un medio sin ANA y KNO3 desarrollaron embriones
somáticos pero en muy baja cantidad.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Localización
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología
de la Estación Experimental del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del
Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP). La
estación está ubicada en las coordenadas geográficas 2º 15’ 15’’ S. y 79º 30’
40’’ O. en el km. 26 al este de Guayaquil en la vía Durán – Tambo, parroquia
Virgen de Fátima, cantón Yaguachi, provincia del Guayas.
3.2. Factores en estudio
3.2.1 Cultivares
Los cultivares utilizados fueron: las variedades de la especie C.
canephora P., “NP 2044” y “NP 3056”, y las variedades “Sarchimor Mejorado” y
“Sarchimor Común” de C. arabica L. Estos materiales genéticos son cultivares
seleccionados del INIAP altamente productivos y adaptados en condiciones de
zonas cafetaleras del Ecuador.
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3.2.2 Tratamientos
Se realizaron dos ensayos, uno para cada especie: C. canephora y C.
arabica. En este ensayo los factores estudiados fueron: 4 variedades de café y
24 medios de cultivo más 4 testigos (blanco).
En el Cuadro 1 se describen los tratamientos utilizados en el
experimento el mismo que se repite para todas las variedades en estudio.
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Cuadro 1. Combinación de los tratamientos utilizados en los cultivares de