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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE
BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE
PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A
POLPAÇÃO Q~ÍMICA
Sirlene Maria da Costa
Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca
Universitária em Junho/2004 Proc. nº 202/04
Lorena -SP- Brasil 1999
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE
BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE
.PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A
POLPAÇÃO QUÍMICA
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (presidente)
Ora Elisa Esposito Ora Angela Elena Machuca Herrera
Estudante: Sirlene Maria da Costa
Lorena -SP- Brasil 1999
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE
BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS
DE PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE
ANTECEDE A POLPAÇÃO QUÍMICA
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação de
mestrado aprovada pela banca examinadora.
Dr. Adilson Robe cfonçalves Orientador e Presidente da banca
examinadora
Lorena -SP- Brasil 1999
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Dedico este trabalho aos meus pais, José Carlos da Costa in
memoriam, Maria de Lourdes Costa e irmãos (Silgia, Jeane, Renato,
Vilson, Celso e Anilson)
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íí
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AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Adilson Roberto Gonçalves pelo apoio, incentivo,
dedicação e
. orientação desde a iniciação cientifica até a realização desta
tese.
À Ora. Elisa Esposito , pelo incentivo, pelas sugestões e
orientação durante a
etapa biológica do trabalho.
Ao Dr. Pedro Edson Fardim e a empresa Suzano, pela realização
dos testes
físicos das polpas Acetosolv.
À Ora Anqela Machuca e Priscila Bernar pelas sugestões durante
este trabalho.
Aos amigos Andersen e Régis pela paciência e sugestões e
principalmente
pela _atenção.
À todos os professores da Pós-Graduação do DEBIQ (Departamento
de
Biotecnologia) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena.
Aos colegas de curso Carla, Luciane, Water , Luciano, Hellen,
Mareia e Luane
e companheiros do laboratório José Moreira,. José Carlos e
Jussara, pela
amizade e alegria do convívio diário.
Aos demais funcionários e colegas do DEBIQ que não foram
citados, mas que
de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
Aos meus familiares, pelo carinho e grande incentivo.
À CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.
iii
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CONTEÚDO Páginas
· Lista de tabelas vi
Lista de figuras vii
Resumo xi
Astract. xii
Lista de abreviações, acrônimos e símbolos utilizados xiii
1- INTRODUÇÃ0 , 1
1.1 Composição química 1 1.2 Bagaço de cana-de-açúcar 3 1.3
Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal 5 1.4
Processos de separação dos constituintes do bagaço 7
1.4.1 Processo de polpação Kraft 7 1.4.1.1 Terminologias
empreqadas no processo de polpação kraft. 9
1.4.2 Polpação Acetosolv 11 1.4.3 Separação alternativa 11
1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa 12 1.6
Fungos de decomposição branca. 13 1.7 Enzimas Ligninolíticas e
Hidrolíticas 14 1.8 Utilização de PGA na seleção de cepas com
capacidade ligninolítica e
hidrolítica : 20
2. OBJETIVOS ; 21
3. PARTE EXPERIMENTAL 22 3.1 Fungos 22 3.2 Bagaço de
cana-de-açúcar 22 3.3 Condições de cultura 22 3.4 lnóculo 25 3.5
Avaliação das atividades enzimáticas 25
3.5.1 Lacase (Lac) 26 3.5.2 Lignina peroxidase (LiP) 26
3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP) 26
iv
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3.5.4 Xilanase (Xyl) 27
3.6 Diálise 27
3.7 Análise química da composição do bagaço 28 3.8 Análise do
bagaço autoclavado 30 3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
31 3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR) e
análise por componentes principais (PCA) 31 3.11 Determinação da
composição do licor de polpação kraft pelo teste
ABC 32 3.11.1 Polpação kraft 33
3.12 Polpação Acetosolv do bagaço 33 3.13 Determinação do número
kappa ." 35 3.14 Viscosidade 36 3.15 Propriedades óptico-mecânicas
das folhas obtidas a partir das polpas
Acetosolv 37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .40 4.1 Crescimento fúngico ~ .40 4.2
Atividades enzimáticas : .42
4.3 Composição Química do bagaço original e pré-tratado 46 4.4
Morfologia das floras 56 4.5 FTIR- PCA 58 4.6 Polpação 63
4.6.1 Polpação kraft 63 4.6.2 Polpação Acetosolv 69
4.6.2.1 Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das
polpas Acetosolv feitas em escala ampliada , 73
4. 7 FTIR das polpas kraft e Acetosolv 75
5. CONCLUSÕES 80
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81
V
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LISTA DE TABELAS Páginas
Tabela 1. Atividades enzimáticas produzidas pelo P. tigrinus no
bagaço de
cana-de-açúcar, determinadas após 1 O dias de incubação .43
Tabela 2.Atividades enzimáticas para as três cepas do Panus
tigrinus
(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) produzida durante a
degradação do bagaço de cana-de-açúcar nas bolsas,
determinadas
antes e após diálise ." 45
Tabela 3. Comparação dos resultados encontrados na análise
química do
bagaço in natura com os da literatura .47
Tabela 4. Composicão química do bagaço degradado e não
degradado
(controle) em dez dias de incubação com agitação (série 1)
48
Tabela 5. Composição química do bagaço tratado e controle
durante dez dias
sob agitação (série 2) 50
Tabela 6. Composicão química do bagaço tratado e controle
durante dez dias
em regime estacionário (frascos), série 2 51
Tabela 7. Composição química do bagaço tratado e controle
durante trinta dias
em bolsas em regime estacionário 52
Tabela 8. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado
durante
1 O dias por Panus tigrinus nos frascos sob agitação ( série 2)
53
Tabela 9. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado
durante
1 O dias por Panus tigrinus nos frascos em regime estacionário
54
vi
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Tabela 10. Perda de massa e de componentes do bagaço
biodegradado
durante 30 dias por Panus tigrinus em bolsas 55
Tabela 11. Resultados da polpação kraft com o bagaço in natura
em vários
tempos de reação 64
Tabela 12. Resultados da polpação kraft do bagaço tratado e
controle utilizando
bolsas, em vários tempos de reação 66
Tabela 13. Resultados da polpação kraft obtidas a partir do
bagaço tratado e
controle nos frascos Erlenmeyer com e sem agitação, com 20
min
de reação 68
Tabela 14. Resultados da polpação Acetosolv do bagaço de
cana-de-açúcar
in natura degradado pelas três cepas do Panus tigrinus
(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) e do controle nos
sistemas
com agitação, estacionário e bolsas 70
Tabela 15. Resultados da polpação Acetosolv com a ampliação de
escala para
o bagaço de cana-de-açúcar in natura., controle e inoculado
nas
bolsas pelas três cepas do Panus tigrinus (FTPT-4741,
FTPT-4742
e FTPT-4745) 72
Tabela 16. Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das
polpas
Acetosolv 7 4
vii
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LISTA DE FIGURAS Páginas
Figura 1- Estrutura de um fragmento de celulose de madeira 1
Figura 2- Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus
sylvatica) proposta
por Nimz (1974) 3
Figura 3- Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo
traqueídeos (Ft).
A- Componente da parede celular, P1: parede primária; P2:
parede
8- secundária e as camadas S1, S2 e S3, ML: lamela média. 8
Disposição dos componentes químicos· da parede celular, Cm:
microfibrilas de celulose, Hc: hemicelulose (polioses), MLHc:
matriz de
lignina e polioses. Os elementos fibrilares das microfibrilas
estão
formadas de celulose que apresentam regiões cristalinas: ZC
e
amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk, (1976) e Goring, (1975)
..... 6
Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por
lacase
R1 = cadeia propànica R2 e R3 = H ou OCH3 15
Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A•
substrato na
forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual
age
como doador de elétrons para o grupamento heme; O(P.+)
enzima
com átomo de oxigênio na forma de radical cátion 16
Figura 6- Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH
substrato
doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima
com
átomo de oxigênio na forma de radical cátion 17
Figura 7- (A) enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da
xilana.
(8) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela f3-xilosidase. Ac:
grupo
acetil; a-4-0-Me-GlcA: Ácido a-4-0 metil glucurônico e
a-araf:
arabinofuranose 19
viii
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Figura 8- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 1
) 23
Figura 9- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 2)
24
Figura1 O- Cultivo de Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar
em
Erlenmeyer sob agitação após 1 O dias de tratamento 40
Figura 11- Cultivo do Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar
em bolsas
plásticas após 30 dias de tratamento .41
Figura 12- MEV do bagaço de cana-de-acúcar, após 1 O dias de
tratamento com
Panus tigrinus sob agitação (série 1 ). (a) controle, (b) P.
tigrinus
FTPT-4741, (c) P. tigrinus FTPT-4742, (d) P. tigrinus FTPT-4745
(1
mm= 3,6 um). 57
Figura 13- Espectros FTIR das amostras do bagaço degradado e
não
degradado (controle) 58
Figura 14- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas
diferentes
cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série
1)
durante 1 O dias 60
Figura 15- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas
diferentes
cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série
2)
durante 1 O dias 60
Figura 16- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas
diferentes
cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário ( série
2)
durante 1 O dias , 61
ix
-
Figura 17- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas
diferentes
cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário em
bolsas
durante 30 dias 62
Figura 18- Gráfico dos resultados da polpação kraft do bagaço in
natura,
obtidos da tabela 11 [rendimento (r), número kappa (k),
lignina
residual (Ir), viscosidade(v)] 64
Figura 19- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
polpas Acetosolv obtidas a partir das amostras de bagaço de
cana- de-açúcar degradado e não degradado para os três sistemas
.. 75
Figura 20- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros
FTIR das
amostras de polpas kraft obtidas a partir do bagaço de
cana-de-
açúcar degradado e não degradado para os três sistemas com
20
min de reação 77
Figura 21- Loadings CP1 e CP2 referente a região 1400 a 1800
cml.a)
Gráficos dos loadings dos dois primeiros componentes principais
das
amostras kraft. b) Gráficos dos loadings dos dois primeiros
componentes principais das amostras Acetosolv 79
X
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RESUMO
Avaliação de um pré-tratamento biológico com cepas de Panus
tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar que antecede a polpação
química. Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de
Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de
Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena.
Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (departamento de
Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil).
Banca examinadora: Ora. Elisa Esposito e Ora. Angela Machuca
Herrera, Setembro de 1999.
Foi realizado um pré-tratamento do bagaço de cana com três cepas
do fungo de decomposição branca Panus tigrinus (FTPT-4741,
FTPT-4742, FTPT- 4745). A fermentação semi-sólida foi realizada a
28ºC, sem adição de fonte de carbono, em frascos Erlenmeyer com e
sem agitação por 1 O dias, utilizando-se 6 g de bagaço, e em bolsas
plásticas por 30 dias, utilizando 100 g de bagaço. A ação fúngica
foi investigada por medidas de atividade enzimática, análise
química, perdas de componentes, microscopia eletrônica de varredura
e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR). Após a fermentação, o extrato líquido foi filtrado em
membrana e foram medidas as atividades enzimáticas de lignina
peroxidase (LiP}, manganês-peroxidase (MnP), lacase (Lac) e
xilanase (Xyl). Para a fermentação conduzida em bolsas foram feitas
medidas de atividade enzimática com os extratos com 1 O e 30 dias
antes e após dialise. Foram realizadas palpações kraft e Acetosolv
com o bagaço in natura, biodegradado e com os controles nos três
sistemas. Das polpas kraft e Acetosolv foram determinados o
rendimento, número kappa e a viscosidade e obtidos espectros por
FTI R. As propriedades óptico-mecânicas, índice de tração, rasgo e
estouro, comprimento de auto-ruptura e alvura foram determinadas
para as polpas Acetosolv. O uso de bolsas plásticas para inoculação
do bagaço com Panus tigrinus aumentou a atividade para a MnP e Xyl.
A LiP não foi encontrada em nenhum dos três sistemas. A análise por
microscopia eletrônica mostrou um crescimento satisfatório para as
três cepas, sendo que a cepa FTPT-4745 ocasionou maior rupturanas
fibras. Os espectros de FTIR foram obtidos diretamente das amostras
de bagaço e tratados por PCA (Análise por Componentes Principais).
Uma clara separação foi observada entre a cepa FTPT-4742 e o
controle. A análise química foi realizada e foi calculada a
seletividade, sendo que a cepa FJPT.,.47: 45 foi a mais seletiva
para degradar lignina. Os rendimentos para as polpas kraft foram
baixos: de 20 a 45% para as bolsas e de 12 a 38% para os frascos. O
valor de número kappa foi de 1 a 18 e os valores de viscosidade
variaram de 2,3 a 6,8 cP. Para as polpas Acetosolv o rendimento foi
na faixa de 43,5 a66~º2%,-· número kappa de 16,8 a 44,6 e
viscosidade de 4 a 13 cf=> .. As propriedades óptico-mecânicas
das polpas Acetosolv foram muito semelhantes entre as diferentes
cepas. A cepa FTPT-4745 foi a que menos sobreu infuência do sistema
utilizado. Os resultados mostraram que o Panus tigrinus é adequado
para o pré-tratamento do bagaço de cana e que as três cepas são
muito semelhantes entre si. O uso de bolsas plásticas aumentou as
atividades MnP e Xyl ao mesmo tempo que representa numa vantagem
e/ou facilidade numa eventual aplicação industrial em larga
escala.
xi
-
ABSTRACT
Evaluation of a biological pre-tretament with Panus tigrinus
strains on Surgacane bagasse applied before chemical pulping.
Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de
Pós-graduação em Biotecnologia
. Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de
Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson Roberto
Gonçalves ( departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116,
12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Ora. Elisa
Esposito e Ora. Angela Machuca Herrera, Setembro de 1999.
Biological pre-treatment of sugarcane bagasse with three strains
of the white-rot fungus Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742 and
FTPT-4745) was performed. The semi-solid fermentation was carried
out at 28°C with no additional carbon source in Erlenmeyer flasks
with and without shaking for 1 O days (using 6 g of bagasse) or in
plastic bags for 30 days (using 100 g of bagasse). The action of P.
tigrinus was evaluated by enzymatic activities, chemical analysis
and component lasses, scanning electronic microscopy (SEM) and
Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR) of the decayed and
non-decayed (contrai) bagasse samples. After fermentation the
liquid extract was filtered in membrane and measured the enzymatic
activity, before and after dialysis, of lignin-peroxidase (LiP),
manganese-peroxidase (MnP), laccase (Lac) an the hydrolytic enzyme
xylanase (Xyl). Kraft and Acetosolv pulping experiments were
carried out using in natura bagasse, decayed and contrai samples.
Pulp yields, kappa number and viscosity of ali pulps were
determined and FTIR spectra from the samples were recorded. Tear,
burst and tensile indices and brightness were determined for
Acetosolv pulps. The growth of Panus tigrinus strains in plastic
bags increased the MnP and Xyl activities. LiP was not detected in
the three systems (shaked and non-shaked flasks and plastic bags ).
SEM analysis showed a satisfactory growth of the three strains over
the bagasse fibers and the FTPT-47 45 was most effective with
rupture of the fibers. FTIR spectra was reduced to their Principal
Components anda clear separation between FTPT-47 42 and the contrai
was observed. The selectivity was calculated from the chemical
analysis data of the decayed and contrai bagasse samples. FTPT -47
45 strain was more selective to decay lignin, in the three systems
utilized. Yields of kraft pulping were low, ranging from 20 to 45%
for the plastic bags samples and from 12 to 38% for the flasks
samples. Kappa numbers were 1-18 and viscosity varied from 2.3 to
6.8 cP. For Acetosolv pulps these results were: pulp yield
43.5-66.2%, kappa number 16.8-44.6 and viscosity 4-13 cP.
Mechanical properties and brightness of the Acetosolv pulps showed
no difference between the samples. The results show that the three
strains of P. tigrinus are very similar and the action of FTPT-4 7
45 strain was not modified within the different systems. Thpp use
of plastic bags to grow P. tigrinus strains increases the MnP and
Xyl activities at sarne time that represents an advantage/easiness
in the industrial process. Enzymatic activities related to chemical
composition after action of P. tigrinus shows the efficiency of
this fungus as a pre-treatment of sugarcane bagasse.
xii
-
LISTA DE ABREVIAÇÕES, ACRÔNIMOS E SÍMBOLOS UTILIZADOS
AA ABTS AE ASTM AT CAA ·cAE CAR CLAE COPERSUCAR Cv DNS FTIR
FTPT ISO Lac LiP LR K MEV MnP PCA TAPPI uv V Xyl
: Álcali ativo : 2,2 azino-(3 etil benzenotiazolina-6-sulfonato)
: Álcali efetivo : Americam Standard T est Methods : Álcali total
titulável : Carga de álcali ativo : Carga de álcali efetivo :
Comprimento de auto-ruptura : Cromatografia líquida de alta
eficiência : Cooperativa de Produtores de Açúcar e Álcool :
Constante do viscosímetro · : Ácido 3,5-dinitrossalicílico :
Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
: Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia : lnternational
Standard Office : Lacase : Lignina peroxidase : Lignina residual :
Número kappa : Microscopia eletrônica de varredura :
Manganês-peroxidase : Análise por componentes principais :
Technical Association of the Pulp and Paper lndustry : Ultravioleta
: Viscosidade : Xilanase
~ -. -
xiii
-
1. INTRODUÇÃO 1.1 Composição química
Atualmente existe um grande interesse da indústria e da
sociedade em
geral em relação ao uso de recursos . renováveis, principalmente
para a
obtenção de combustíveis e de produtos químicos de base,
incluindo-se aí a
polpa celulósica. Desta forma, o uso da biomassa vegetal
(materiais
lignocelulósicos) é estimulado. Juntamente com o aumento do
interesse na
utilização completa e racional de todos os constituintes dos
materiais
lignocelulósicos, principalmente daqueles obtidos como
resíduos.
O bagaço de cana é um desses resíduos agrícolas abundante em
várias
regiões. do Brasil como por exemplo nos estados· de São Paulo,
Pernambuco,
Rio de Janeiro, Alagoas, Minas Gerais e Paraíba ( Orlando Filho
e Zambello, .
1983).
Os materiais lignocelulósicos são constituídos por três
principais
componentes macromoleculares: celulose, polioses e lignina.
Celulose: é um polímero linear (parte amorfo e parte cristalino)
formado
por moléculas de anidro-glicose unidas através de ligações ~-1,4
glicosídicas,
de fórmula geral (CsH100s). A celulose é composta unicamente por
unidades
moméricas de celobiose que se repetem apresentando sempre o
oxigênio que
liga os anéis glicosídicos na posição equatorial (Ferraz, 1999),
conforme
mostrado na figura 1 .
me ·Aff ~e O #?'OH 'o o o/ o o/ °'20! o K) . °'20! o Figura 1.
Estrutura de um fragmento de celulose de madeira.
No bagaço de cana, a celulose é intimamente ligada com
ligninas,
pentasanas, gomas, gordura, material colorido e taminos. As
diferenças nas
propriedades da celulose são devidas basicamente aos diferentes
graus de
polimerização. A celulose de bagaço é um polímero com cadeias
com cerca de
2000 a 3000 unidades de glicose (Paturau, 1969).
1
-
Polioses: (ou hemiceluloses) são compostas pelos açúcares
glicose,
manose e galactose (hexoses) e xilose e arabinose (pentases),
podendo ainda
apresentar quantidades variáveis de ácidos urônicos e
desoxiexoses em alguns
tipos de vegetais. As polioses apresentam-se na forma de
polímeros
ramificados de menor massa molar que a celulose e podem ser
homopolímeros
(exemplo: xilana, formado por xilose) ou heteropolímeros
(exemplo:
glicomanana formado por glicose e manose ). O teor de polioses
em diferentes
tipos de vegetal é bastante variável, com um valor médio de 20%
(Fengel e
Wegener, 1989).
As pentasanas de bagaço de cana submetidas a hidrólise resultam
em
xilose, arabinose e ácido urânico. Com a ação de HCI fervente,
as pentasanas
resultam em furfural (Paturau, 1969).
Lignina: depois da celulose, a lignina é o composto orgânico
mais
abundante dentre os materiais lignocelulósicos. Ela é composta
basicamente
de unidades fenilpropano formando uma macromolécula
tridimensional e
amorfa, representando cerca de 20 a 30% do total da madeira. O
acoplamento
das unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e
repetitiva, o que é
atribuído ao mecanismo da biossíntese da lignina, que se
processa via
radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois
cinamílicos precursores.
Os diferentes tipos de acoplamentos entre os precursores dão
origem a vários
tipos de ligações entre as unidades fenilpropano. A mais
abundantes são: p-0-4
e p-0-4, P-1 e p-5, 5-5 e p-p. A figura 2 mostra um modelo de
estrutura de lignina. A lignina possui uma função estrutural no
complexo celular da parede
de plantas superiores, agindo como uma cola que confere coesão
ao conjunto
de células. A quantidade de lignina varia entre as diferentes
espécies de
plantas superiores e também entre plantas da mesma espécie
(Fengel e
Wegener, 1989). A lignina de bagaço de cana é do tipo HGS,
típica de
gramíneas, segundo a classificação de Faix (1991 ).
2
-
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Figura 2. Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus
sy/vatica) proposta
por Nimz (1974)
1.2 Bagaço de cana-de-açúcar A cana-de-açúcar, · uma gramínea
perene . pertencente ao gênero
Saccharum, é originária da Índia e, com o decorrer do tempo, sua
cultura
expandiu-se por várias regiões do mundo, e foi introduzida no
Brasil logo após
seu descobrimento (Paiva, 1980).
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) cresce na maioria dos
países
tropicais e subtropicais e seu uso principal é na obtenção de
açúcar e álcool.
Após moagem, o principal subproduto é o bagaço. Em muitas áreas
do mundo
tem aumentado o valor econômico do bagaço, notadamente na
produção de
polpa celulósica, papel e papelão. O bagaço parece satisfazer
também os
requerimentos necessários para a obtenção de papel de impressão
já que o
material cru é até melhor que outras fibras (Atchison,
1993).
3
-
As características, composição e disponibilidade do bagaço de
cana têm
impulsionado diferentes grupos de pesquisas a desenvolver
tecnologias
alternativas que viabilizem seu aproveitamento. A composição
típica do bagaço
de cana in natura, determinada por um trabalho realizado na
África do Sul é a
seguinte: celulose 45,3%, pentasanas 24, 1 %, lignina 22, 1 % e
cinzas 1,6%
(Paturau, 1969). Como comparação a composição determinada no
nosso
laboratório é a seguinte: glucana 43%, xilana 25%, grupos acetil
2%, lignina
Klason 20%, lignina solúvel em H2S04 1 %, extrativos 8%, cinzas
totais 1 %
(Urbano e Gonçalves, 1996).
Os custos dos processos de colheita e lavagem do bagaço já
são
incluídos ao processo de extração do açúcar, tornando assim as
condições
econômicas excelentes para o processamento do bagaço como polpa
moída.
As fibras do bagaço são finas, flexíveis e fortes e, portanto,
úteis para a
manufatura do papel; no entanto, cerca de 30% da massa do bagaço
consiste
de medula e células de parênquimas e cerca de 5% de material
epidérmico
denso. Nenhum desses componentes é fibroso in natura e, se
levado à
polpação, têm efeito negativo na qualidade do papel.
Aproximadamente 50%
da massa do caule consiste de alta quantidade de feixe de fibras
concentradas,
uma estrutura compacta que protege os reservatórios de açúcar.
As fibras do
anel são camadas mais largas do que os elementos fibrosos no
interior do
caule e mais resistentes a ação química, em comparação com a
medula interior
da fibra; 15% da massa do caule consiste de feixe de fibras
curtas de baixa
resistência e células de vasos.
As características dimensionais das fibras do bagaço são
similares às de
madeiras de fibras curtas (folhosas ), porém são mais curtas do
que madeiras
de fibras longas (coníferas). As características químicas do
bagaço variam de
um país para o outro dependendo do solo e duração da estação
de
crescimento (Atchison, 1993).
O Brasil possui uma vasta área de plantação de cana de açúcar e
os
produtos principais são açúcar e etanol usado como combustível.
A produção
de cana-de-açúcar foi relatada como sendo de 287x106 ton em
1998
(Matioli et ai., 1998) e, segundo cálculos de Lora et ai.
(1997), a quantidade de
bagaço produzida é cerca de 15 % do total de cana colhida.
Assim, o bagaço é
4
- ·--
-
produzido em quantidades acima de 40x106 ton/ano, mas a maior
parte é
queimada para obtenção de energia para as destilarias de álcool
(Armas e
Bianchi, 1990). No entanto, calcula-se que há ainda cerca de
1x106 ton/ano
de excesso (2,5% do total de bagaço) que causa sérios problemas
de
estocagem e impacto ao meio ambiente e que pode ser aproveitado
para fins
mais nobres. Esses valores podem ser ainda maiores como mostram
os dados
da Copersucar: além do bagaço consumido nas próprias usinas de
açúcar e
destilarias de álcool com fins energéticos para geração de vapor
e energia
elétrica, ainda há um excedente médio de bagaço de 7 % em
relação à
produção total do subproduto (Fornai, 1991 ). A possibilidade do
uso da polpa
de bagaço para a produção de papel de jornal vem sendo estudada
desde
1950 (Johnsrud et ai., 1987), mas muitos projetos fracassaram,
mostrando que
o bagaço não é uma matéria-prima de fácil uso, em função do
baixo
rendimento e da qualidade da polpa.
1.3 Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal
Estruturalmente, a parede celular do vegetal é composta pela
parede
primária e secundária e a lamela média (Essau, 1984). A parede
primária
representa 15% do volume total da parede celular. As
microfibrilas de celulose
são o principal componente da parede primária e estão
organizadas em
lâminas formando uma armação cristalina que rodeia a célula
(figura 38)
(Cowling e Kirk, 1976; Kollman e Côte, 1984).
5
-
e
MLHc
Figura 3. Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo
traqueídeos (Ft).
A- Componente da parede celular, P1: parede prlmárla; P2: parede
secundária
e as camadas 81, 82 e 83, ML: lamela média. 8- Disposição
dos
componentes químicos da parede celular, Cm: microfibrilas de
celulose, Hc:
hemicelulose (polioses), MLHc: matriz de lignina e polioses. Os
elementos
fibrilares das microfibrilas estão formadas de celulose que
apresentam regiões
cristalinas: ZC e amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk,
(1976) e Goring,
(1977).
As xiloglicanas formam parte da parede primária na mesma
proporção que
a celulose. A parede secundária é o componente espesso formado
por 60% de
celulose e 27% do seu volume é de lignina (Kollman e Côte,
1984);
ultraestruturalmente ela é composta de três camadas 81, 82 e 83
com
dilerentes orientação e espessura das microfibrilas de celulose
(figura 3 8). A
82 é a camada de maior espessura, concentração e grau de
polimerização da
celulose na parede celular ( Fujita e Harda, 1991, Saka, 1991
).
A lamela média é uma camada fina que une as células vizinhas
entre si,
composta por 60% de lignina, 14% de celulose, e taninos
fortemente unidos a
proteínas estruturais (figura 3 A) (Fengel e Wegener, 1989;
Kollman e Côte,
1984). 6
-
Em geral, a porcentagem de lignina na parede celular
reduz-se
gradualmente em direção ao lúmen (Speranza, 1998).
1.4 Processos de separação dos constituintes do bagaço
Para a utilização dos diferentes componentes dos materiais
lignocelulósicos, uma separação seletiva é requerida. Isso
implica na ruptura
do complexo lignina-carboidrato e na remoção de cada fração por
técnicas de
pré-tratamento e deslignificação.
Os processos de separação dos componentes de materiais
lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos,
biológicos ou uma
combinação de todos esses, o que dependerá do grau de separação
requerido .
e do fim proposto (Clark et ai., 1989; Cápek-Mênard et ai.,
1992; Kokta e
Ahmed, 1992; Heitner et ai., 1993; Ferraz et ai., 1994, Silva,
1995; Reni e Silva,
1999 a e b; Maciel e Silva, 1999; Gravitis et ai, 1999;
Consentino e Silva, 1999).
A separação química é feita em larga escala através da polpação.
A
celulose e parte das polioses constituem o produto principal
(polpa) sendo a
lignina um subproduto. A produção em larga escala de lignina é
restrita à
indústria de polpa. Várias possibilidades de uso têm sido
propostas para a
lignina, tais como a obtenção de fenóis, surfactantes e
estabilizantes para
borracha (Chum eta/.,1985), quelantes (Oviedo, 1998, Gonçalves
et ai., 1999)
e como matriz polimérica, tanto na forma in natura como em
formas
modificadas, para obtenção de sistemas de liberação controlada
de defensivos
agrícolas, como por exemplo herbicidas e pesticidas (Silva e
Wilkins, 1992,
Ferraz et ai. 1997).
1.4.1 Processo de polpação Kraft O processo sulfato ou kraft
teve grande desenvolvimento a partir de
1940 e hoje domina totalmente os processos de polpação. A
principal
vantagem desse processo é a possibilidade de um sistema de
recuperação dos
produtos químicos utilizados. Outro fator favorável é que o
processo sulfato
pode ser utilizado tanto para madeiras de fibras longas
(coníferas) como para
madeiras de fibras curtas (folhosas) e plantas anuais como
bagaço de cana e
7
-
bambu. Os ciclos de cozimentos são mais curtos que os dos
processos sulfito
ácidos e a pasta obtida pode ser branqueada a altos níveis de
alvura. O
processo sulfato também apresenta vantagens como a produção de
pastas de
alta resistência e a produção de valiosos subprodutos, como
resina da polpa e
terebentina, no caso da utilização de madeiras resinosas. O
processo também
apresenta algumas desvantagens como alto custo de investimento
na
construção da fábrica, problemas de odor dos gases produzidos,
baixa alvura
da polpa não-branqueada quando comparada com polpas sulfito,
baixo
rendimento de polpação e alto custo de branqueamento (Assumpção
et ai.,
1988; Biermann, 1993). A principal crítica quanto a esse
processo está
relacionado com a contaminação do meio ambiente (Mendonça,
1997). O
processo sulfato é denominado também processo' kraft, devido às
excelentes
características de resistência mecânica da celulose obtida
(kraft provém do
alemão e significa "forte"). O kraft é um processo alcalino que
tem como
agentes deslignificantes o hidróxido de sódio (NaOH) e o sulfeto
de sódio
(Na2S), sendo que a adição deste último, produz íons
hidrogenossulfeto (HS-)
que aceleram a remoção da lignina (aumento na velocidade de
polpação)
resultando em uma polpa de melhor qualidade. Outros sais de
sódio também
são encontrados no licor de polpação em menor quantidade, como
carbonato
de sódio, tiossulfato de sódio, sulfito de sódio e silicato de
sódio. Pequenas
quantidades de íons polissulfeto também estão presentes quando o
enxofre
elementar é adicionado ao licor branco para manter a sulfidez
alta (Assumpção
et ai., 1988; Biermann, 1993; Mimms et ai., 1993).
No processo kraft a deslignificação ocorre em 3 etapas bem
definidas:
inicial, principal e residual (MacDonald e Franklin, 1969;
Biermann, 1993;
Mimms et ai., 1993). Na etapa inicial a solubilização de lignina
é pequena, da
ordem de 15 a 25% do total, dependendo da espécie de madeira e
das
condições de cozimento. Nessa etapa, parte dos carboidratos é
dissolvida e
cerca da metade da carga de álcali efetivo é consumida,
neutralizando os
ácidos formados na dissolução de extrativos e na degradação de
carboidratos.
Na etapa principal, ocorre a remoção da maior parte da lignina,
havendo uma
ligeira diminuição da quantidade de carboidratos e da
concentração de álcali no
licor. Na etapa residual, a quantidade de carboidratos
decresce
8
- ·-
-
significativamente, acompanhada por um aumento no consumo de
álcali,
enquanto a velocidade de deslignificação diminui. Portanto, um
cozimento
alcalino ideal não deve atingir o estágio de deslignificação
residual, pois
haveria prejuízo quanto ao rendimento. Com coníferas, a etapa
final inicia-se
geralmente com teores de lignina residual entre 2,5 e 3%. Na
prática industrial
para a produção de polpas branqueáveis de madeira moles
(coníferas),
evita-se atingir teores de lignina inferiores a 4 ou 5% ( 45 a
50% de rendimento)
correspondentes a números kappa entre 26 e 33. A deslignificação
de
madeiras duras (folhosas) é mais rápida que coníferas, e a etapa
de
deslignificàção residual é atingida em níveis mais baixos de
lignina, permitindo,
na maioria dos casos, cozimentos até teores de lignina de 2% sem
efeitos
danosos ao rendimento da qualidade da polpa (Assurnpção et ai.,
1988).
Na polpação kraft do bagaço de cana é prevista uma redução
na
porcentagem de lignina de 20% a cerca de 3% no final do
processo. Essa
lignina residual ou recalcitrante não é desejável pois escurece
o papel e exige
um processo de branqueamento mais drástico, com o uso de
oxidantes fortes
(Cl2, CI02, 02, 03, H202, etc). A lignina residual em polpa
kraft não branqueada
é altamente modificada por reações de condensação alcalina. As
polpas
branqueadas são obtidas removendo-se a lignina residual por uma
série de
tratamentos baseados principalmente em compostos de cloro e os
efluentes
desses processos de branqueamento contêm numerosas
substâncias
orgânicas cloradas que têm mostrado uma atividade mutagênica
(Fujita et ai.,
1993).
1.4.1.1 Terminologias empregadas no processo de polpação
kraft
Na polpação alcalina, segundo a norma TAPPI, empregam-se as
definições relacionadas a seguir. De um modo geral, na América
do Norte
(Estados Unidos e Canadá), os compostos são expressos em base de
Na20
equivalente, enquanto que na Europa, principalmente países
escandinavos, os
compostos são reportados em base da quantidade de NaOH
equivalente. No
Brasil o padrão empregado varia de uma fábrica para outra,
podendo ser
empregada tanto uma relação quanto outra (Assumpção et ai.,
1988).
9
-
Álcali total titulável (AT): soma de todas as bases no licor
branco que podem
ser tituladas com ácido forte.
Álcali ativo (AA): soma dos ingredientes ativos no licor de
polpação kraft.
AA = NaOH + Na2S
Álcali efetivo (AE): soma dos ingredientes que produzem OH nas
condições
de polpação.
AE = NaOH + % Na2S
Freqüentemente têm-se AA e AE e para calcular as concentrações
individuais
usa-se a relação:
Na2S = 2(AA-AE)
sulfidez: a razão ( em % ) entre o teor de Na2S e o teor de
álcali ativo.
SULFIDEZ = Na2S X100% NaOH+Na2S
Causticidade: a razão (em%) entre o teor de NaOH e o teor de
álcali ativo.
CAUSTICIDADE= NaOH X100% NaOH+Na2S
Sulfidez + Causticidade = 100%.
álcali ativo Carga de ãlcali ativo : CAA = X100% massa bagaço
seco
10
-
álcali efetivo Carga de álcali efetivo: CAE = X100% massa bagaço
seco
1.4.2 Polpação Acetosolv Como processo alternativo, os processos
organosolv de polpação têm
recebido uma atenção significativa nos últimos 20 anos (Aziz e
Sarkanen,
1989; Vázquez et ai., 1995; Benar, 1992; Curvelo e Pereira,
1995; Baeza
et a/.,1999 a e b). Dentro da polpação Organosolv destaca-se o
processo
Acetosolv, que consiste no cozimento com ácido acético de
madeiras e outros
materiais lignocelulósicos, cujas polpas são semelhantes às
obtidas nos
processos convencionais (Benar e Schuchardt, 1991; Nimz e
Casten, 1986). O
processo Acetosolv foi adaptado para a polpação do bagaço de
cana com
excelentes resultados (Benar, 1992). O objetivo é utilizar
solventes orgânicos
(ou misturas de solventes) como nucleófilo para a remoção da
lignina. Uma
grande vantagem desse tipo de processo é a reutilização do
solvente e a
obtenção da lignina com alta pureza que pode ser utilizada de
forma mais
nobre.
O desenvolvimento de processos conhecidos como Organosolv pode
em
grande parte colaborar com a diminuição do impacto ambiental
causado por
processos de deslignificação convencionais, além de
possibilitarem um uso
integral dos componentes dos materiais lignocelulósicos e
apresentarem
vantagens quanto ao baixo capital de investimento e a
possibilidade de
instalação de plantas para produção em pequena escala (Aziz e
Sarkenen,
!989, Mac Donald e Franklin, 1969, Bendzala e Kokta, 1995).
1.4.3 Separação alternativa Uma possibilidade promissora na
separação dos constituintes dos
materiais lignocelulósicos é a combinação de processos, por
exemplo,
utilizando um pré-tratamento biológico seguido da polpação
química. O
processo biológico é baseado na utilização de microrganismos
(fungos e
bactérias) capazes de produzir enzimas envolvidas principalmente
na
degradação da lignina. Tais microrganismos podem promover
uma
deslignificação parcial dos materiais lignocelulósicos, com
concomitante perda
11
-
de outras frações em diferentes intensidades, dependendo do
microrganismo
empregado.
Os desafios principais a serem vencidos para utilização desse
tipo de
processo são relacionados com o aumento .da seletividade dos
microrganismos
para degradar preferencialmente ou exclusivamente a lignina,
reduzindo, desta
forma, as perdas das frações desejáveis, com o aumento da
atividade
ligninolítica.
1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa Uma revisão
recente da literatura mostra diversas possibilidades de
aplicação da biotecnologia na indústria de polpa e papel
(Ferraz, 1999, Ferraz
et ai., 1998), desde o uso da engenharia genética para a
obtenção de mudas de
árvores mais resistentes e de melhor produção, até o uso de
microrganismos
degradadores de lignina na polpação e no branqueamento. As
indústrias
continuam a desenvolver novas tecnologias de biobranqueamento
com o intuito
de eliminar o uso do cloro, investigando processos de
branqueamento da polpa
kraft com fungos de decomposição branca (Bourbonnais e Paice,
1996). As
propriedades ópticas e mecânicas e o rendimento das polpas
biobranqueadas
são comparáveis com as polpas convencionalmente branqueadas,
resultando
em um consumo significativamente menor de cloro (Fujita et ai.,
1993).
Outra aplicação da biotecnologia na indústria papeleira envolve
o uso de
celulases e hemicelulases na reciclagem de papel. As enzimas
atuam
hidrolisando parcialmente a celulose e as polioses, o que
facilita
consideravelmente a flotação dos pigmentos na etapa de
destintamento. Uma
das mais antigas aplicações da biotecnologia na indústria
papeleira é o
tratamento de efluentes em lagoas aeróbias (Ferraz, 1999). Esses
efluentes
contêm principalmente produtos originados da lignina, o que
levou a uma
grande expansão da pesquisa relacionada à biodegradação da
lignina. O bagaço de cana-de-açúcar é um substrato complexo mas que
também
pode ser eficientemente biodegradado, especialmente por fungos
de
decomposicão branca (Zadrazil e Puniya, 1995, Esposito et ai.,
1995,
Esposito et el., 1996, Gao et et., 1996, Breccia et el.,
1997).
12
-
1.6 Fungos de decomposição branca
A maioria dos fungos de decomposição branca pertence à classe
dos basidiomicetos. Os fungos dessa classe degradam a celulose,
polioses e
lignina, sendo alguns deles degradadores seletivos de
lignina.
Os fungos de decomposição branca têm a habilidade para
deslignificar
os materiais lignocelulósicos ou degradar as ligações
lignina-carboidrato; a
porcentagem de lignina removida neste pré-tratamento pode ser
pequena ( da
ordem de 2% ), mas o resíduo é menos recalcitrante o que pode
facilitar o
processo de branqueamento, sendo menos prejudicial ao meio
ambiente.
Vários fungos têm sido propostos para a deslignificação de
bagaço de
cana-de-açúcar. Breccia et ai. (1997) fizeram um estudo
sistemático com 42
fungos de decomposição branca. Nesse trabalho foram determinadas
as
composições do bagaço antes e após a degradação com 30 e 60 dias
e foi
calculada a razão de lignina residual por celulose residual
(RURC) para as
amostras do bagaço tratado e não tratado. Os fungos que
apresentaram os
melhores resultados na degradação da lignina foram
Phanerochaete
chrysosporium, Punctularia artropurpurascens, Trametes
versicolor, Athelia sp,
Phebia sp, Ganoderma applanatum, Spongypellis pachyodon,
Hyphodontia sp
e Panus tigrinus. Os fungos desse tipo de decomposição colonizam
o material pelas vias
anatômicas de mais fácil acesso e menor resistência e movem-se
por áreas
com nutrientes mais facilmente assimiláveis. As células
parenquimais de raio
são normalmente as primeiras a serem atingidas e, a partir
delas, as hifas
movimentam-se pelo lúmen em direção à parede celular e lamela
média
(Fengel e Wegener, 1989; Blanchete et al.,1992; Messner e
Srebotnik, 1994;
Shimada, 1996). A biodegradação da lignina por esse tipo de
fungo tem início e
é mais intensiva na parede celular secundária das células e é
progressiva até
atingir a lamela média. Os mecanismos de colonização e invasão
do lúmen das
células da madeira são conhecidos devido aos estudos por
microscopia
eletrônica (Daniel, 1994; Evans et ai., 1994; Blanchette et a/.,
1997; Speranza,
1998).
13
-
Uma propriedade comum aos fungos de decomposição branca é a
capacidade de oxidação de compostos fenólicos e não-fenólicos
relacionados
com a lignina, devido à atividade de suas enzimas ligninolíticas
extracelulares (Blanchette, 1991; Blanchette et ai., 1997, Ortega
et ai., 1993). A produção e as
características de enzimas ligninolíticas e. hemicelulolíticas
têm sido bastante
estudadas nos útimos tempos (Prasad et ai., 1996 a e b; Pessoa
et ai., 1997;
Abd EI-Nasser et el., 1997, Cazemier et ai., 1999; Bium et ai.,
1999; Kang et ai.,
1999).
1. 7 Enzimas Ligninolíticas e Hidrolíticas Dentre o vasto
arsenal de enzimas extracelulares degradadoras de
lignina, particularmente o grupo das fenoloxidasés é tido como o
de maior
importância (Hatakka, 1994; Peláez et ai., 1995; Tuor et el.,
1995; Pai
et ai., 1995). Fazem parte desse grupo as enzimas lignina
peroxidase (LiP),
rnanqanês-peroxidase (MnP) e lacase (Lac) que estão diretamente
envolvidas
na degradação da lignina. Dada sua baixa especificidade as
enzimas oxidativas
como as peroxidases atuam sobre uma ampla gama de substratos de
difícil
degradação.
A lacase (EC 1.10.3.2, benzenodiol: oxigênio oxi-redutase)
representa
um grupo de enzimas encontradas principalmente em fungos e
plantas
superiores, onde são abundantes. A maioria das diferentes
lacases conhecidas
(provenientes de diferentes fontes) apresentam massa molar (MM)
de 60 a
70 kDa, sendo conhecidas lacases no intervalo de 60 a 100 kDa
(Thurston,
1994). Possuem uma estrutura de glicoproteína com conteúdo
relativo de
carboidrato variando de 15 a 20 % (Thurston, 1994). Todas as
lacases
conhecidas contêm cobre no seu sítio ativo, sendo em geral 4
átomos de cobre
por molécula, os quais apresentam número de oxidação +2. Tais
átomos de
cobre estão diferentemente coordenados, podendo assim ser
distinguidos três
tipos ou estados de coordenação denominados 1, li, Ili, sendo
esse último constituído por um par de átomos de cobre
(Messerschmidt e Hubert, 1990;
Reinhammar, 1984; Thurston, 1994).
A lacase é tipicamente uma oxidase que catalisa reações de
oxidação, na ausência de H202, utilizando 02 como oxidante, o qual
é reduzido a H20
14
-
num processo de oxidação envolvendo no total quatro elétrons
(Kirk e Farrel,
1987; Thurston, 1994). Essa enzima não apresenta uma
especificidade muito
estrita quanto à estrutura do substrato, podendo catalisar a
oxidação de uma
grande variedade de estruturas aromáticas, especialmente
estruturas fenólicas,
como mono-, dl-, poli- e metoxifenóis. Estudos mais recentes
demonstraram
que a lacase também foi capaz de degradar estruturas não
fenólicas na
presença de mediadores específicos (Bourbonnais e Paice, 1990;
Johannes et
ai., 1996). O mecanismo de oxidação do substrato é pela retirada
de um elétron
com formação inicial de um radical cátion, o qual,
subseqüentemente, pode
reagir através de mecanismo não enzimático (figura 4)
(Bourbonnais e Paice,
1990, Kersten et ai., 1990, Thurston, 1994, Tuor et ai.,
1995).
Neste caso são freqüentes as reações de acoplamento
radical-radical,
desproporcionamento, retirada de próton e ataque nucleofílico
pela molécula de
H20, resultando em polimerização, clivagem de ligações tipo
alquil-aril,
oxidação no carbono a e desmetoxilação das estruturas fenólicas
(Hatakka,
1994; Kirk e Farrel, 1987).
R,
O, +46 == fü~R,-
OH
~. ~~rno
o
! R'
Reações. não.en~ticas* pollrrlenzaçao
R2 R., o.
> /~. À R2~R,
o
Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por
lacase.
R1 = cadeia propânica, R2 e ~ = H ou OCH3
Diversos estudos com substâncias modelos de subestruturas de
lignina
mostram que as lacases podem catalisar a clivagem de ligações
tipo Ca-Cí3
das cadeias laterais. de estruturas ditnéricas tipo (3-1 e
(3-0-4 15
-
(Kawai et ai., 1988), bem como catalisar a clivagem de anéis
aromáticos de
estruturas como 4,6-di(tert-butil)guaiacol (Kawai et ai., 1988).
Esses resultados
demonstraram que as lacases podem degradar e despolimerizar a
lignina.
A lignina peroxidase (LiP) constitui um grupo de glicoproteínas
contendo
um grupamento heme [Fe(lll)-protoporfirina IX] como grupo
prostático por
molécula. Requer H202 para sua atividade catalítica e apresenta
massa molar
em torno de 38-43 kDa (Kirk e Farrel, 1987; Kuwahara et ai.,
1984; Tuor et ai., 1995).
Durante o ciclo catalítico, o ferro contido no grupamento heme
da LiP
passa por etapas de reações de oxi-redução (figura 5). A
oxidação do Fe(III) da
enzima nativa para Fe(IV) se dá através da ação do peróxido de
hidrogênio,
formando o composto 1. A redução do composto I via transferência
de um
elétron forma o composto li. O agente redutor pode ser álcool
veratrílico ou
peróxido de hidrogênio. A redução via um elétron retorna a
enzima a seu
estado nativo, completando o ciclo catalítico. Na ausência do
substrato redutor,
o composto li é oxidado pelo peróxido de hidrogênio, formando o
composto Ili
(uma forma de LiP com capacidade catalítica limitada), que com
excesso de
peróxido de hidrogênio é rapidamente inativado (Cai e Tien,
1993; Schoemaker
et ai., 1994; Barr e Aust, 1994; De-Jong et ai., 1994 ).
H20 H202 ~ composto I
Fe~~~ ~ ~:: O(P~.)
AH FeIV =O A.•
comf:; (excesso) Fe III 02 .:!.
composto Ill
Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A•
substrato· na
forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual
age como
doador de elétrons para o grupamento heme; O(P:) enzima com
átomo de
oxigênio na forma de radical cátion.
16
-
A enzima lignina peroxidase catalisa reações de uma variedade
de
compostos modelo de lignina não fenólicos (Kirk e Farrel, 1987;
Buswell e
Odier, 1987; Gold et ai., 1989; Higuchi, 1990; Schoemaker, 1990;
Valli e Gold,
1991; Valli et ai., 1992) bem como lignina sintética (Hammel e
Moen 1991 ).
Essas reações incluem oxidações de álcool benzílico, clivagem de
cadeia
lateral, reações de abertura do anel, desmetoxilações e
desclorinação
oxidativa. Todas essas reações são relacionadas com mecanismo
envolvendo
a retirada inicial de um elétron do núcleo aromático, formando
um radical cátion
arila, e esse pode sofrer várias reações não enzimáticas,
formando outros
produtos (Reneganathan et ai., 1985; Marquez et ai., 1988;
Schoemaker,
1990).
A MnP (peroxidase-manganês dependente, EC.1.11.1. 7) é uma
heme-
enzima e a maioria de suas propriedades estruturais são
semelhantes às da
LiP. É uma glicoproteína de massa molar em torno de 45-47 kDa
contendo
também um grupamento prostético tipo Fe(lll)-protoporfirina IX.
A diferença é
que, além de H202, essa peroxidase requer Mn +2 como cofator e
sua atividade
é potencializada ou estabilizada por um derivado de
a.-acetoácido, como
lactato, malonato e outros (Mester et ai., 1995; Moilanen et
ai., 1996; Perez e
Jeffries, 1992).
H20 }L(h .L composto l
Felll~ k, ~:::o(P+~AH A,~ Mnll FeIV -o Mnlll X.A.
) composto II
AH -~ H,O, (excesso)
t'-1-120 Fe III 02 s
composto III
Figura 6-. Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH
substrato
doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima com
átomo de
oxigênio na forma de radical cátion. 17
-
Seu ciclo catalítico é semelhante ao da LiP (figura 6), com
formação de
composto 1, li, Ili (Wariishi et ai., 1988). Porém nesse caso,
ocorre a oxidação
de Mn(II) para Mn(III), que atua como espécie ativa nos
processos de oxidação
catalisados por MnP (Kuwahara et ai., 1984). Devido a alta
reatividade de
Mn(III), a disponibilidade para oxidar os substratos de MnP
depende da
presença de ácidos orgânicos que atuam como quelantes de
Mn(III), formando
um complexo mais estável de alto potencial de oxi-redução
(Moilanen et ai.,
1996; Perez e Jeffries, 1992). Como consequência, o potencial de
oxi-redução
do sistema oxidante é diferente do apresentado pela LiP,
determinando
diferenças na especificidade entre as duas enzimas, com relação
às estruturas
aromáticas dos substratos. Assim por exemplo, MnP oxida apenas
estruturas
fenólicas, mas, por outro lado, a inativação de MnP por H202,
via formação do
composto Ili, parece requerer concentrações mais altas de
peróxido, indicando
uma maior estabilidade dessa enzima (Wariishi et ai., 1988). O
fato de que
essa enzima oxida apenas estruturas fenólicas impõe uma
limitação a sua
capacidade de degradar integralmente lígninas de alta massa
molar (Kirk e
Farrel, 1987; Owens, 1991 ).
Devido a heterogeneidade das xilanas, sua hidrólise requer um
conjunto
de isoenzimas para a sua degradação que pode ser visto na figura
7
(Coughnlan e Hazzewood, 1993, sunna e Antranikian 1997).
As endo-!3-1,4-D-xilanases são enzimas que atuam sobre a
xilana
produzindo grandes quantidades de xilo-oligossacarídeos
substituídos e não
substituídos de diversos tamanhos (figura 7). As
exo-13-1,4-D-xilanases atuam
removendo somente unidades de xilose a partir das extremidades
da cadeia de
xilana. As !3-xilosidase hidrolisam dissacarídeos como xilobiose
e
xilo-olígossacarídeos maiores até xilose. Algumas xilanases
produzidas pelo
fungo Penicillium janthinellum por exemplo apresentam massa
molar de
20 kDa e 50 kDa ( Milagres e Lacis, 1991, Milagres et ai., 1993,
Rodrigues,
1997).
18
-
o;-4-0-Me-GlcA
IACETIL(XILAN.\IES'IERASE I
-
que visam a produção e recuperação de enzima em larga escala são
de
grande relevância (Milagres e Duran, 1992).
1.8 Utilização de PCA na seleção de cepas com capacidade
ligninolítica e
hidrolítica
Em estudo recente, Gonçalves et ai. (1998) propuseram o uso
da
espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR) como
técnica auxiliar para seleção de cepas de Panus tigrinus que
atuam no bagaço
de cana-de-açúcar, em conjunto com determinações das
atividades
enzimáticas de MnP, t.ac e LiP e o monitoramento da ação fúngica
sobre o
bagaço, utilizando microscopia eletrônica de varredura. A
espectroscopia no
infravermelho é uma técnica muito utilizada na identificação de
compostos
orgânicos (Silverstein et ai., 1979); a porção de mais utilidade
para os químicos
orgânicos está situada entre 4000 e 666 cm" (2,5 a 15,0 µm), mas
até
moléculas simples podem produzir espectros extremamente
complexos. Os
espectros de compostos desconhecidos são comparados ao de uma
amostra
conhecida, e a correlação pico a pico constitui boa· identidade,
\Visto ser pouco l.-
provável que dois compostos diferentes tenham o mesmo espectro
no
infravermelho, à exceção de pares enancioméricos. É a presença
de bandas características de grupos que permite a obtenção, através
de simples exame
do espectro e consulta a tabelas, de informações estruturais
úteis.
Já no caso de moléculas mais complexas, como é o caso dos
constituintes dos materiais lignocelulósicos, a simples
comparação de
espectros não resulta necessariamente em identificação. Isso
mesmo quando
os espectros são obtidos com alta resolução, em equipamento
interferométrico
e tratados com transformadas matemáticas (FTIR).
Os conjuntos de espectros FTIR de materiais lignocelulósicos
são
melhor avaliadas pela Análise por Componentes Principais (PGA),
cujo
fundamento é reduzir as várias informações contidas nos
espectros
(absorbância X número de onda) em um número pequeno de
vetores
(componentes principais) que expliquem a maioria dessas
informações. Esse
tipo de análise foi empregada recentemente para a classificação
de ligninas de
20
-
diferentes origens (Cotrim et ai., 1999) e no acompanhamento
da
hidroximetilação de ligninas (Benar et ai., 1999).
Nesse estudo de seleção de cepas do Panus tigrinus (Gonçalves et
ai.,
1996, Gonçalves et ai., 1998) foi também utilizada a análise
química das
amostras de bagaço antes e após tratamento, bem como das polpas
obtidas
dessas amostras. A análise química baseia-se na hidrólise das
amostras e
quantificação dos componentes macromoleculares. A maior parte da
lignina
não é hidrolisada e é quantificada por gravimetria. Na fração
líquida
(hidrolisado) quantifica-se a lignina solúvel por espectroscopia
na região de
UV-visível (Goldschimd, 1977) e os carboidratos derivados da
celulose e
hemicelulose por cromatografia líquida de alta eficiência.
No estudo citado (Gonçalves et ai., 1998) foram utilizadas sete
cepas de
P. tigrinus e selecionadas três (FTPT-4741, FTPT-4742 e
FTPT-4745) como as
mais promissoras para a deslignificação do bagaço de cana como
um
pré-tratamento para uma posterior polpação química.
2. OBJETIVOS O objetivo principal desse trabalho é a avaliação
de um pré-tratamento
biológico do bagaço de cana-de-açúcar com o fungo ligninolítico
Panus tigrinus,
que antecede a polpação convencional kraft e a polpação
alternativa
Acetosolv.
Para atingir este objetivo foram propostas as seguintes etapas:
- Avaliação do pré-tratamento fúngico em relação ao regime
estacionário e
agitado.
- Estudo das atividades enzimáticas e sua correlação com a
eficiência da
biodeslignificação do bagaço de cana por P. tigrinus.
- Estudo da polpação química do bagaço pré-tratado e
determinação das
propriedades da polpa.
- Monitoramento da ação fúngica sobre as fibras do bagaço por
microscopia
eletrônica de varredura e FTI R.
21
-
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Fungos: Foram utilizadas três cepas de Panus tigrinus FTPT
-47 41,
FTPT-4742 e FTPT-4745 cedidas gentilmente. pela professora
Mariela
Speranza (Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade de La
República-
Uruguai) e preservadas na Fundação Tropical de Pesquisa e
Tecnologia André
Tosello (Campinas, SP, Brasil). Essas linhagens foram mantidas
em ágar
extrato de malte 4% a 28ºC durante 5 dias. Elas foram
selecionadas a partir de
resultados obtidos previamente ( Gonçalves et ai., 1998).
3.2 Bagaço de cana-de-açúcar: Foi utilizado o bagaço de
cana-de-açúcar
desmedulado e previamente caracterizado, contendo 51 % de
glucana, 23% de
polioses, 2% de grupos acetil, 21 % de lignina Klason, 1 % de
lignina solúvel em
H2S04 e 3% de cinzas. O tamanho médio das partículas do bagaço
utilizado
foi de 2, 1 cm de comprimento e O, 12 cm de largura.
3.3 Condições de cultura: As culturas de fermentação em meio
semi-sólido
foram realizadas em duas séries.
Série 1: Nesta primeira série os experimentos foram realizados
em triplicatas
utilizando-se Erlenmeyer de 250 ml sob agitação a 150 rpm por 1
O dias a
30ºC. O bagaço de cana-de-açúcar foi 'suplementado a uma
concentração de
6% (m/v) somente com 1 ml de solução de sais [NaN03 (2 g/L),
K2HP04
(1 g/L), MgS04 (0,5 g/L). KCI (0,5 g/L) , CaCb (0,3 g/L),
CuS04.5H20 (O, 10
mg/L), FeS04.7H20 (0,20 mg/L), MnS04 (0,02 mg/L), z-ci, (O, 15
mg/L)] e 49 ml de água destilada. Nenhuma outra fonte adicional de
carbono foi utilizada.
O meio foi esterilizado por autoclavagem a 121 ºC durante 20
min.
Série 2: As fermentações foram realizadas em duplicatas e
conduzidas em
sistemas sob agitação e estacionário. Foram realizados
experimentos sob
agitação constante utilizando-se 6 g de bagaço em frascos
Erlenmeyer de 250
ml. Em sistema estacionário foram realizados experimentos
utilizando-se 6 g
de bagaço em frascos Erlenmeyer de 250 ml e também
experimentos
utilizando quantidades maiores de bagaço (100 g) em bolsas de
polipropileno.
Nas bolsas foram adicionados 17 ml da solução de sais e 816 ml
de água
destilada. A solução de sais adicionada aos experimentos da
série 2 foi uma
22
-
solução com um número reduiid,b de sais (CaCb (0,3 g/L),
(NH4)2HP04 (2g/L),
FeCI (0,2 mg/L), KH2P04, MgS04( 0,5 g/L). O bagaço nas bolsas
foi incubado
por 30 dias. O meio foi esterilizado por autoclavagem durante 30
min a 121 ºC.
Nessa série 2 o bagaço de cana-de-açúcar foi suplementado a uma
concentração de 5% (m/v).
O procedimento experimental do cultivo do Panus tígrínus no
bagaço de
cana-de-açúcar e análise do bagaço biodegradado e do controle
foi
esquematizado nas figuras 8 e 9.
r- 49 ml de água destilada f 1 ml de solução de sais (NaN03,
MEIO DE CULTURA~ K2HP04, MgS04, KCI, CaCl2,
CuS04.5H20, FeS04.7H20, MnS04, ZnCl2)
,.~;: ~ ~~:- 6 g de bagaço
Autoclave por 20 min.121°C
+ 50 ml do caldoô
contendo as cepas . FTPT 4741 FTPT 4742 ..... FTPT 4745 -
...
...
INÓCULO
Bagaço pré-tratado
+ t gAnálise química FTIR MEV . Caldo filtrado Ri Atividade LJI
enzimática Figura 8. Fluxograma de todo procedimento experimental
(série 1 ).
23
-
49 mL H20 + 1 mL de solução
(CaCl2, (NH4)2HP04, FeCI, KH2P04, MgS04)
6 g de bagaço
Agitação (série 2)
Autoclave por 20 min, 121ºC
ontrole
10 dias
13 placas contendo fungo 1866 mL H20
+ + bagaço i
+ Caldo filtrado
Atividade Análise química enzimática FTIR
17mL de solução de sais+ 816 mL de H20
i 100 g de bagaço
Polpação Rendimento kraft Número Kappa
Viscosidade FTIR
Controle
30 dias
1
o Caldo filtrado
Atividade enzimática com 10 dias e com
30 dias (antes e após a diálise)
OBS: Para as bolsas a polpação Acetosolv foi realizada em escala
ampliada e foi feita a medida das propriedades óptico-mecânicas
da polpa
Pigura 9~ Fluxograma de todo procedimento experimem~(§érie
2).
24
-
3.4 lnóculo: Para a primeira série de experimentos sob agitação,
o inóculo foi
preparado retirando-se o micélio submerso . de duas placas
contendo
Panus tigrinus, e triturando-o em 50 ml de água destilada
esterilizada. Uma
alíquota de 50 ml desse caldo obtido foi adicionado aos frascos
Erlenmeyer
contendo o bagaço de cana, que foram mantidos nas condições
descritas no
item 3.3. Para os experimentos da série 2, 13 placas
contendo
Panus tigrinus foram trituradas em 1866 ml de água destilada e
esterilizada;
do caldo obtido foram adicionados 833 ml em cada bolsa e 50 ml
em cada
Erlenmeyer. As bolsas e frascos Erlenmeyer foram mantidas nas
condições
descritas no item 3.3. Para as duas séries, os bagaços
autoclavados (item
3.3) nos frascos e bolsas sem inóculo serviram de controle do
processo.
3.5 Avaliação das Atividades Enzimáticas: Após fermentação, o
extrato líquido foi separado do bagaço, filtrado a vácuo em
membrana Millipore
(OA7µm) para determinação das enzimas presentes, recuperando-se
cerca de
50 ml de caldo nos frascos Erlenmeyer de 100 ml e cerca de 500
ml nas
bolsas de 1666 ml. O pH do extrato líquido foi ·medido em um
potênciometro
Metrohm 632 pH Meter com eletrodo de vidro e foi cerca de 4,2.
As atividades
da lignina peroxidase (LiP) (Tien e Kírk, 1984),
manganês-peroxidase (MnP)
(Kuwahara et ai., 1984), lacase (Lac) (Szklarz et ai., 1989) e
xilanase (Xyl)
(Bailey et ai., 1992) foram determinadas por métodos publicados.
Foram
medidas as atividade enzimáticas dos extratos obtidos das duas
séries após
1 O dias e para as bolsas, o sistema de fermentação foi mantido
até 30 dias,
uma vez que o crescimento fúngico foi demorado. Com o extrato
líquido das
bolsas após 30 dias de incubação foram feitas as medidas de
atividades
enzimáticas antes e após diálise, nas condições descritas no
item 3.6. Foram
medidas as atividades enzimáticas nos controles e descontados os
valores.
25
-
3.5.1 Lacase (Lac): A atividade de lacase foi determinada
segundo
metodologia descrita por- Szklarz e/ ai. (1989). A 600 µL do
caldo enzimático
foram adicionados 300 µL de tampão citrato-fosfato 50 mM pH=5,0,
100 µL de
o-dianisidina 1 mM e a absorbância foi lida a 11,=460 nm
(s=29400 M-1cm-1),
durante 1 O min em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra
20. Uma
unidade de atividade enzimática de Lac foi definida como a
quantidade de
µmoles de o-dianisidina oxidado L-1 min".
3.5.2 Lignina peroxidase (LiP): Para determinação da enzima
lignina
peroxidase foi utilizado o método modificado de Tien e Kirk
(1984), baseado na
oxidação do álcool veratrílico a aldeído veratrílico na presença
de peróxido de
hidrogênio. A reação foi acompanhada durante 5 min a 310 nm
(s=9300 M-1cm-1) em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra
20. A 250 µL
do caldo enzimático foram adicionados 125 µL de álcool
veratrílico 4,0 mM,
50 µL de H202 0,4 mM, 375 µL de tampão tartarato de sódio 0,33
mM a pH=3,0
e 450 µL de água destilada. Uma unidade de atividade enzimática
de LiP foi
definida como sendo a quantidade de enzima necessária para
oxidar 1,0 µmal
de substrato L-1min-1.
3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP): A atividade manganês-peroxidase
foi
determinada pelo método de Kuwahara et ai. (1984) e baseia-se na
oxidação
do vermelho de fenol em presença de Mn(II) e peróxido de
hidrogênio. A
absorção foi medida a 610 nm (s= 4460 M-1cm"1) em um
espectrofotômetro
UV/visível GBS-Cintra 20. A 500 µL do caldo filtrado foram
adicionados 100 µL
de solução de vermelho de fenol O, 1 %, 100 µL de lactato de
sódio 250 mM,
200 µL de albumina bovina 0,5%, 50 µL de sulfato de manganês(II)
2 mM,
50 µL de tampão succinato de sódio/ H202 20 mM a pH = 4,5. O
volume final
foi 1 ml. A mistura de reação foi incubada por 5 min a 30ºC e a
reação foi
interrompida pela adição de 40 µL de NaOH 2 N. Uma unidade de
atividade
enzimática de MnP foi definida como a quantidade de enzima que
oxida 1,0 µmal de vermelho de fenol L''rnin".
26
-
3.5.4 Xilanase: A atividade de xilanase extracelular foi
determinada pela medida da quantidade de açúcares redutores
liberados a partir de xilana, de
acordo com o método de Bailey et ai. (1992). Os açúcares
redutores foram
dosados pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS)
(Miller, 1959). Uma
unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade
de enzima
necessária para produzir 1 µmol de xilose por minuto a 50ºC. A
solução de
xilana foi preparada a partir de 1 g de xilana ("Birchwood"-
Sigma) adicionada
em 80 ml de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5. A solução foi
aquecida
sob agitação e o volume completado para 100 ml com o mesmo
tampão.
Um volume de 900 µL de xilana 1 % foi colocado em tubos de
ensaio que
foram incubados em banho termostatizado, à temperatura de 50°C
por 5 min.
Em seguida, acrescentaram-se 100 µL das amostras contendo
enzima. Após
5 min, adicionou-se 1,5 ml de DNS para dosagem dos açúcares
liberados,
sendo a mistura aquecida em banho de água fervente por 5 min. A
reação foi
interrompida em banho de água à temperatura ambiente e as
leituras foram feitas a 540 nm em um espectrofotômetro Shimadzu
modelo UV-150-02. As
leituras de cada amostra foram feitas utilizando-se tampão
acetato de sódio
50 mM a pH 5,5 e DNS como referência.
Para detectar as unidades redutoras provenientes da
hidrólise
enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O
primeiro, denominado
controle do substrato, continha a xilana sem a ação da enzima. O
segundo,
denominado controle da enzima, foi constituído de tampão
acetato, meio
fermentado contendo a enzima e o DNS, para detectar a presença
de açúcares
redutores do próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com
as amostras,
foram descontadas as absorbâncias verificadas nos controles (
enzima e
substrato). A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose
(Merck) nas
concentrações entre 2 e 1 O µmol/ml.
3.6 Diálise: 20 ml do extrato provenientes da fermentação em
bolsas por 30 dias foram dialisados utilizando membrana celulósica
de corte 12 kDa, com
diâmetro de 21 mm e capacidade de 11 O ml contra solução tampão
de
acetato de sódio de concentração 50 mM pH= 5,5 durante 12 h a
4ºC.
27
-
Dos extratos dialisados foram medidas as atividades enzimáticas
pelos
métodos descritos no item 3.5.
3. 7 Análise química da composição do bagaço: A fração principal
de lignina
foi determinada por gravimetria pelo método Klason (ASTM, 1956)
após
hidrólise com H2S04 72%. O bagaço foi seco a 60ºC por 40 min e
moído a
40 mesh (0,42 mm). Amostras de 1 g de bagaço foram secas,
pesadas com
precisão de O, 1 mg e transferidas para béqueres de 100 ml e
tratadas com
5 ml de H2S04 72 %, sobre vigorosa agitação, em banho
termostatizado a
45 ± 0,5ºC por 7 min. As reações foram interrompidas com adição
de 25 ml de água destilada. As amostras foram transferidas para
frascos Erlenmeyer de
250 ml, elevando-se o volume de água a 137,5 ml.
Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, os
frascos
Erlenmeyer foram fechados com papel alumínio e autoclavados por
30 min a
1,05 bar. Após a descompressão da autoclave, os frascos foram
retirados e
resfriados à temperatura ambiente, sendo a mistura reacional
filtrada e os hidrolisados transferidos e avolumados com água
destilada em balões
volumétricos de 250 ml.
Os materiais retidos no papel de filtro previamente tarado
(lignina
Klason) foram lavados com aproximadamente 900 ml de água
destilada e
secos em estufa a 105±3ºC até massas constantes.
As quantidades de lignina solubilizadas em meio ácido foram
determinadas segundo a metodologia desenvolvida por Rocha et a~.
(1993). Alíquotas de 5 ml de hidrolisado foram diluídas com água
destilada em
balões de 100 ml, após alcalinização com NaOH 6,5 mo1L·1 até pH
12,5.
As frações de ligninas solúveis foram determinadas pela
absorbância a
280 nm em um equipamento UN visível GBS-Cintra 20, usando
como
referência NaOH 6,5 mo1L·1. A determinação da lignina solúvel
foi calculada
pela equação 1 .
28
-
C u9= [(0,04187 X A1ig2so - Apol 200) - 0,32790] X 10-3 (equação
1)
onde:
Cli9 ... concentração de lignina em g/L
Ali92so absorbância da solução de lignina, em 280 nm.
Apd2so c1s1 + c2s2 = absorbância, em 280 nm dos produtos de
decomposição dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural)
cujas concentrações
(e, e c2) e absortividade (s1 e s2) foram determinadas
previamente por
cromatografia líquida de alta eficiência e por UV (Rocha et ai.,
1993)
As cinzas foram determinadas utilizando cerca de 1 g das
amostras de
bagaço de cana ou 1 g de lignina. As amostras com umidade
conhecida foram
pesadas com precisão de O, 1 mg em um cadinho de porcelana
previamente
calcinado e tarado. Em seguida, o material foi calcinado
inicialmente a 300ºC e
depois por mais de 2 h a 800ºC. Após a calcinação, o cadinho foi
resfriado em
dessecador e o teor de cinzas calculado pela equação 2.
%czy= (M2 -M1) I M3x 100 (equação 2)
onde:
%czy ... porcentagem em massa de cinzas
M1 massa do cadinho calcinado vazio, em g
M2 massa do cadinho com cinzas, em g
M3 massa de bagaço ou lignina seca, em g
Para os experimentos do sistema sob agitação ( série 1 ) não
foram
calculadas as porcentagens de cinzas do bagaço e somente para os
sistemas
sob agitação (série 2), estacionária e em bolsas.
A celulose e as hemiceluloses foram determinadas por
cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia de Rocha
et ai. (1997).
Foi realizada a quantificação dos açúcares produzidos presentes
nos
hidrolisados ácidos, que foram filtrados em Sep-Pak C18
(Waters), para a
remoção de partículas em suspensão e de compostos aromáticos e
então,
injetados diretamente (alça de injeção de 20 µL) em uma coluna
Aminex
HPX-87H (300 X 7,8 mm) de troca iônica, utilizando H2S04 0,005 M
como fase
móvel com fluxo de 0,6 mtrnin", a 45 ºC e detector de índice de
refração. A
quantificação dos açúcares foi realizada por comparação com
padrões.
29
-
O furfural e hidroximetilfurfural foram determinados por CLAE em
coluna
(RP-18 1 O µL) utilizando-se acetonitrila I água 1 :8 (v/v) com
1 % de ácido
acético como fase móvel, com fluxo de 0,8 rnl.min' a 25ºC. O
hidrolisado foi
filtrado em membrana RC 25 de 45 µm e injetado diretamente na
coluna
através de uma alça de injeção de 20 µI. Os compostos. foram
detectados a
276 nm e as concentrações de furfural e hidroximetilfurfural
foram
determinadas a partir de curvas de calibração obtidas de
compostos puros.
A perda de massa do bagaço de cana-de-açúcar durante o período
de
biodegradação foi calculada como sendo:
Pm(%) = ( mi ~imf )x100% (equação 3)
onde:
Pm ... perda de massa
mi. .. massa inicial de bagaço (base seca)
mf ... massa final de bagaço (base seca)
O bagaço biodegradado foi caracterizado quimicamente
conforme
metodologia descrita acima. Após a caracterização química foi
possível
determinar a perda de cada componente do bagaço durante os
períodos de
biodegradação estudados da seguinte forma:
Pc(%) = (mci - ~cf )x100% mci
(equação 4)
onde:
Pc perda do componente
mci %componente inicial X massa inicial de bagaço
mcf %componente final X massa final de bagaço
3.8 Análise do bagaço autoclavado: Foram utilizados 6 g do
bagaço in natura, colocados em frasco Erlenmeyer de 250 ml e
adicionados 100 ml
de água destilada. O frasco foi fechado com papel alumínio e
autoclavado.por
30 min a 1, 05 bar. Após a descompressão da autoclave, o frasco
foi retirado e
resfriado à temperatura ambiente. Depois da autoclavagem o
líquido foi separado do bagaço filtrado em Sep-Pak C18 (Waters) e
analisado por CLAE
30
-
como descrito no item 3. 7. Com as áreas obtidas foram
calculadas as
porcentagens de xilana e glucana perdidas em função da
autoclavagem.
3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV): Amostras do
bagaço
inoculado com P. tigrinus e do controle ( série 1) foram
separadas e secas a
50ºC durante 40 min. Um conjunto de feixes de cada amostra foi
preso no
suporte com uma fita de carbono e o conjunto foi mantido em
dessecador até o
momento da análise morfológica em MEV, utilizando um microscópio
modelo
JSMT-300 para a observação das fibras do bagaço antes e após o
tratamento
fúngico.
3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR) e
análise por componentes principais (PCA): Amostras do bagaço
original e
inoculado com P. tigrinus bem como das polpas obtidas (itens
3.11 e 3.12),
foram secas a 50ºC durante 40 min para análise por FTIR. Os
espectros de
FTIR foram obtidos diretamente das amostras de bagaço utilizando
a técnica
de reflexão difusa (DRIFT) em um equipamento Nicolet 520. Depois
da
correção da linha base pelo método poligonal (Faix et ai.,
1992), os espectros
foram normalizados pela absorção a 151 O cm", correspondente à
vibração do esqueleto aromático da lignina, que não sofre
influência de outros grupos. Para
as polpas obtidas dos processos kraft e Acetosov, os espectros
foram
normalizados pela absorção em 900 cm", que corresponde ao
carbono-1
anomérico do grupo 0-C-O em polissacarídeos (Gonçalves e Ruzene,
1999).
Os espectros de FTIR foram digitalizados e convertidos para
arquivos texto
usando o programa OMNIC (Nicolet, lnc.). As absorbâncias
normalizadas
foram analisadas por PCA como um conjunto de dados formados por
uma
coluna correspondente aos números de onda e outra coluna com
os
respectivos valores de absorbância. A matriz consistia de 557
valores de
intensidade de absorção medidos a cada 2 cm" entre 792 e 1865
cm",
fornecidos pelo espectrofotômetro FTIR. Os espectros
normalizados foram
analisados pelos softwares de análise multivariada BIOTEC e
FAEN
compilados em FORTRAN e desenvolvidos por Bruns (1994).
31
-
3.11 Determinação da composição do licor de polpação kraft pelo
teste
ABC: A composição escolhida do licor utilizado para as polpações
kraft foi de
15% de álcali ativo e 20% de sulfidez, valores próximos aos
sugeridos na
literatura (Paturau, 1969). Para verificar se a composição do
licor kraft utilizado
para as polpações correspondia aos valores de álcali ativo e
sulfidez
desejados, foi feita a análise de uma alíquota do licor através
do teste ABC
(TAPPI, 1985) que permite determinar as concentrações de
hidróxido de sódio,
sulfeto de sódio e carbonato de sódio (quando presentes)
dissolvidos no licor.
Estes testes foram realizados em triplicatas segundo a
metodologia descrita
por Mimms et ai. 1993 .
Teste A
Em um Erlenmeyer de 250 ml foram colocados 5 ml do licor e
adicionados
50 ml de água destilada e 25 ml de BaCb 10%. Foram adicionadas
algumas
gotas de fenolftaleína e titulada a solução com HCI 0,5 N até
o
desaparecimento da cor rósea (pH 8,3). O volume indicado na
bureta (A) foi
anotado. A bureta não foi completada.
Teste B
Foram adicionado 5 ml de formaldeído 40% à solução após a
viragem da fenolftaleína no teste A A solução volta a ter coloração
rósea e após 30 s continuou-se a titulação até a cor rósea
desaparecer. Foi anotado o volume
indicado na bureta (B). A bureta não foi completada.
Teste C
Foram adicionadas algumas gotas de alaranjado de metila à
solução após a segunda viragem da fenolftaleína no teste B. A
titulação foi continuada até o primeiro traço da cor vermelha
aparecer (pH 4,0). Foi anotado o volume
indicado na bureta (C).
Através das relações abaixo é possível obter o volume de HCI 0,5
N necessário
para neutralizar a quantidade de cada componente adicionado ao
licor de
polpação (expresso em base de NaOH ou Na20 equivalente) e,
através de
32
-
cálculos estequiométricos, calculou-se a quantidade do
componente realmente
dissolvido no licor:
NaOH = 2A-B Na2S = 2(8-A) Na2C03 = C-B
3.11.1 Polpação kraft: As reações de polpação kraft do bagaço in
natura desmedulado, do controle dos processos de biodegradação e do
bagaço
biodegradado, foram realizadas em reatores de aço inox 316 com
capacidade
total de 85 ml (3 cm de diâmetro por 12 cm de altura). Foram
feitas reações
com nível de álcali ativo de 15% e sulfidez de 20% (sendo todos
os valores
expressos em base de Na20). As reações foram realizadas à
temperatura de
170ºC utilizando-se 8 ml de licor para 2 g de bagaço (relação
licor/ bagaço de
4: 1 ). O bagaço ficou embebido no licor durante um período de
24 h para
garantir que não haveria a limitação da reação por penetração ou
difusão do
licor na matriz lignocelulósica. O reator foi carregado e
fechado e a reação foi
conduzida por imersão do reator em banho de silicone
pré-aquecido a 170ºC e
a temperatura foi mantida constante durante toda a reação. Após
o tempo
pré-determinado de reação, o reator foi imerso em água fria para
rápido
resfriamento até temperatura ambiente. O reator foi aberto e o
material residual
obtido foi filtrado a vácuo sobre papel de filtro em funil de
Büchner. A polpa ou
bagaço não desfribado foi lavada abundantemente com água
destilada para a
máxima remoção do licor residual (8 a 1 O lavagens com 2 L de
água cada).
Durante o processo de lavagem, a polpa era desfibrada
manualmente com o
auxílio de um bastão de vidro. Para o bagaço in natura as
palpações kraft foram realizadas com 5, 1 O, 15, 20, 40 e 60 min de
reação; para o bagaço das
bolsas foram realizadas com 20, 40 e 60 min de reação e para os
frascos com
e sem agitação foram realizadas as palpações com 20 min de
reação.
3.12 Polpação Acetosolv do bagaço: A polpação Acetosolv do
bagaço· de cana-de-açúcar desmedulado foi realizada com ácido
acético 93%, na
presença de HCI como catalisador, conforme metodologia otimizada
para
bagaço por Benar (1992).
33
-
Os experimentos foram realizados em bateladas, utilizando-se 2 g
de
bagaço de cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e
colocados em um
balão de fundo redondo de 100 ml juntamente com 25 ml de ácido
acético
glacial [relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 70 µL de HCI 37%
e 2 ml de
água destilada. Este procedimento foi realizado para o bagaço in
natura bem
como para as amostras biodegradadas e de controle obtidos dos
três sistemas
(agitação, estacionário e em bolsas). A polpação em escala
ampliada para o
· bagaço in natura foi realizada em batelada, utilizando-se 30 g
de bagaço de
cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um
balão de
fundo redondo de 1000 ml juntamente com 372,5 ml de ácido
acético glacial
[relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,05 ml de HCI 37% e 24,5
ml de água
destilada. Para as amostras de controle e bagaço biodegradado
pelas três
cepas nas bolsas, as· palpações foram também realizadas em
escala
ampliada em batelada, utilizando-se 44 g de bagaço de cana que
foram
pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um balão de fundo
redondo de
2000 ml juntamente com 500 ml de ácido acético glacial
[relação
bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,4 ml de HCI 37% e 35 ml de água
destilada.
Foi utilizado um condensador para evitar a evaporação do
ácido.
O balão foi aquecido em banho de óleo de silicone à temperatura
de
refluxo do solvente (ácido acético) (110 ± 5ºC) por 120 min. O
banho levou em torno de 30 min para atingir essa temperatura.
Após a polpação, a polpa foi removida e filtrada em funil de
Büchner. O
licor de polpação contendo lignina foi separado e guardado. A
polpa obtida foi
lavada exaustivamente com água destilada a 70ºC até a água de
lavagem
atingir pH>3,5.
As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h e levadas
posteriormente a um dessecador por 30 min e foram calculados
os
rendimentos das palpações. As polpas foram guardadas para
análises
posteriores, como descrito nos itens 3.12 e 3.14.
34
-
3.13 Determinação do número kappa: O número kappa (medida da
lignina
residual na polpa) foi determinado pela oxidação por
permanganato de potássio
e titulação com tiossulfato de sódio, seguindo-se a metodologia
padrão (TAPPI,
1985).
As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h. As amostras
de
polpa de bagaço tratado e não tratado foram pesadas em béqueres
com
massas entre 0,30 e 0,35 g (com precisão de 0, 1 mg) e cada uma
delas foi
· suspensa em 1 O ml de água destilada. Cada suspensão de polpa
foi
transferida com 140 ml de água para um Erlenmeyer de 500 ml que
foi
mantido a 25ºC sob agitação magnética. Foram misturados 25 ml de
uma ·-·-·· .
solução padrão de KMn04 O, 1 N (recém preparada) com 25 ml de
H2S04 4 N
em um Erlenmeyer de 125 ml, que foi mantido a 25ºC sob agitação
magnética
(solução A).
A solução A foi adicionada quantitativamente a cada
Erlenmeyer
contendo a suspensão de polpa, utillzando-se 50 ml de água
destilada para
lavar as paredes do Erlenmeyer. Após exatos 1 O min (medidos com
um
cronômetro) foram adicionados 5,0 ml de uma solução de KI 0, 1
N. Essa·
mistura foi titulada com uma solução padronizada de Na2S203 O, 1
N até
próximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor castanha).
Foram