Elementos reguladores estágio/linhagem Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante a recombinação V-(D)-J do específicos durante a recombinação V-(D)-J do locus locus da imunoglobulina da imunoglobulina Fabrício Souto Fabrício Souto Giuliano Bonfá Giuliano Bonfá Juliana Ueda Juliana Ueda
Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante a recombinação V-(D)-J do locus da imunoglobulina. Fabrício Souto Giuliano Bonfá Juliana Ueda. Recombinação e expressão gênica da imunoglobulina. - PowerPoint PPT Presentation
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Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante
a recombinação V-(D)-J do a recombinação V-(D)-J do locuslocus da imunoglobulina da imunoglobulina
Cada clone de linfócitos B ou T produz um receptor com uma particular estrutura de ligação ao antígeno e a variabilidade de rearranjos possíveis ~107
Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig)
Célula pró-B precoce
Célula pró-B tardia
Célula pré-B grande
Célula pré-B pequena
Célula Bimatura
Célula Bmadura
Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig)
Os genes RAG possuem importantes propriedades
As proteínas RAG1 e RAG2 são específicas para determinado tipo celular, sendo produzidas
somente em linfócitos T e B;
Os genes RAG são expressos somente nos linfócitos B e T imaturos, mas não em células B e T
maduras;
Os genes RAG são expressos nas fases G0 e G1 do ciclo celular e são silenciados nas células em
proliferação.
Controle da recombinação por mecanismos epigenéticos
Histonas: H3K9ac; H3K4me2; H3K4me3 (marcadores de histonas ativas)
Os loci de Igh e Ig estão posicionados na região central do núcleo no estágio pro-B
Locus da cadeia pesada da imunoglobulina (Igh)
A interação RAG - RSS leva a clivagem do DNA permitindo a
recombinação entre V e DJ e exclusão dos genes V não relevantes
Retirada do circulo de
DNA
V2V2
V3V3
V4V4V8V8
V7V7V6V6
V9V9
V5V5
DDJJV1V1 CC
DDJJV2
V3
V4
V8
V7 V6
V5
V9
V1V1 RAG1/2RAG1/2
RAG1/2 RAG1/2CC
Cadeia Pesada IgCadeia Pesada Ig
Formação do loop,
retirada do DNA
Fatores envolvidos na contração e looping da cromatina
Fator de ligação CCCTC (CTCF)Atividade de insulator (impede a atividade dos enhancers ou impede a condensação da cromatina)
Giuliano Bonfá
CTCF e cohesina são necessários durante a recombinação dos genes da imunoglobulina??
Fator de transcrição envolvido no rearranjo da Ig
Conhecido como proteína ativadora de células B
(BASP, B-cell activator protein)
Fator de transcrição envolvido na contração do locus Igh
A contração do locus Igh é dependente de Pax5
Juliana Ueda
Objetivo:
Identificar fatores nucleares responsáveis por regular a contração cromossômica e formação dos “loops”, favorecendo a recombinação V(D)J em um determinado estágio de desenvolvimento das células B.
Animais e metodologia
RAG-/-
µ+RAG-/-
µ+RAG-/- com gene IgH rearranjado (pré-B)
B6 Timócitos
ChIP qPCR
B6 MEF
B6 MEF fibroblastos embrionários de camundongos B6
RAG-/-
µ+RAG-/-
medula ósseaCD19+
ChIP-chip (MAT software)
medula ósseaCD19+
ChIP-chip
Author: Thomas Hentrich
Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no cromossomo 12?
Cromossomo 12ChIP-chip Affymetrix mouse tiling array E
Sítios de CTCF estão espalhados em todo cromossomo, com maior frequência no locus Igh em células pró e pré-B.
Sítios de CTCF estão espalhados em todo cromossomo, com maior frequência no locus Igh em células pró e pré-B.
locus Igh
Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no locus Igh?
VH=53
ChIP-chip
Dois sítios posicionados na porção 5’ do gene DH e os demais espalhados no locus VH ,principalmente na porção
distal.
Dois sítios posicionados na porção 5’ do gene DH e os demais espalhados no locus VH ,principalmente na porção
distal.
8 CTCF 12 CTCF 33 CTCF
Qual a diferença de ligação de CTCF em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus Igh?
ChIP qPCR
B6 MEF fibroblastos embrionários de camundongos B6
A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares
A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares
Coesina (Rad21) participa do complexo, ligando-se à sítios de CTCF no locus Igh?
ChIP qPCR
Coesina co-localiza com CTCF em todo o locus Igh, preferencialmente em pro-B
Coesina co-localiza com CTCF em todo o locus Igh, preferencialmente em pro-B
Como estão distribuídos os sítios para CTCF no cromossomo 6?
Cromossomo 6
Os sítios para CTCF no cromossomo 6 são distribuídos igualmente nas células pro e pre-B
Os sítios para CTCF no cromossomo 6 são distribuídos igualmente nas células pro e pre-B
ChIP-chip Affymetrix mouse tiling array F
Como estão distribuídos os sítios para CTCF no locus Igκ?
locus IgκChIP-chipSis elemento regulador negativo do rearranjo
Poucos sítios CTCF em comparação com Igh, com 11 em pre-B e apenas 4 em pro-B na região Vκ
Poucos sítios CTCF em comparação com Igh, com 11 em pre-B e apenas 4 em pro-B na região Vκ
11 CTCF Vκ
4 CTCF Vκ
ChIP qPCR
Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus
Igκ?
Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ
Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ
Há sítios de CTCF presentes no locus Igλ?
locus IgλChIP-chip
Em pro e pre-B há poucos (3), mas fortes sítios para CTCFEm pro e pre-B há poucos (3), mas fortes sítios para CTCF
3 CTCF
Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina no locus Igλ?
ChIP qPCR
CTCF e coesina ligam-se mais em pre-B nos 2 sítios 5’CTCF e coesina ligam-se mais em pre-B nos 2 sítios 5’
“Modelo Roseta”
Conclusão CTCF está presente em todos loci da Ig;
CTCF é estágio-específico apenas nos loci κ e λ ;
Coesina co-localiza com CTCF e juntas são estágio-
especifica e linhagem-específica para todos os loci da Ig;
Juntas são importantes na formação dos “loops” e
contração do locus V.
Objetivo: Identificar elementos reguladores no locus da Igh
ImunoprecipitaçãoH3K4me2H3K9ac
H3K4me3Pax5
CTCF
Camundongo RAG-/-
Célula Pró-B Pax5 -/-
Camundongo RAG-/- Pax5-/-
Célula Pró-B Pax5+/+
Medula óssea CD220+ CD19+ C-Kit+ CD25- IgM-
Elementos reguladores geralmente estão presentes em regiões de cromatina ativa
Cultivadas 4-5dIL-7
Há regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh?
- Poucas regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh- Ausência da histona H3K4me3: promotor não ativo
Diferentes famíliasPreto: VHJ558Rosa: VH3609
Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?
Família VH3609: únicos genes da porção distal que possuem cromatina ativa
Genes VH3609+ H3K4me2+ H3K9ac
Identificação regiões com cromatina ativa upstreamgenes VH3609
+ H3K4me2+ H3K9ac+ H3K4me3 (promores ativos)
Pax5 -/-
Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?
Pax5 : sítios de ligação nos genes VH3609
Céls Pró-B Pax5 -/-Genes VH3609 continuam com cromatina ativa: Independente de Pax5
Pax5: sítios de ligação nas regiõesupstream
Céls Pró-B Pax5 -/-Regiões upstream deixam de apresentar cromatina ativaDependente de Pax5
CTCF: sítios de ligação nas regiõesupstream, independente de Pax5
Pax5 -/-
Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?
Presença de elementos associados aos genes VH3609Com sítios de ligação Pax5 e CTCFCromatina ativa é dependente de Pax5
Genes família VH3609
Estes dados indicam…Porção distal do locus Igh:
Esses elementos associados aos genes VH3609 são conservados?
Identificados 14 cópias de sequências repetidas conservadas na região distal do locus da Igh• Ausentes no restante do genoma murino
Elementos depentendes de Pax5 para indução de cromatina ativa nas céls pró-B: PAIRPAIR: Pax5-Activated Intergenic Repeats
11 PAIRs upstream VH3609 genes
CTCF: liga-se a todos PAIR85 sítios (distal e proximal)
PAX5: 14 Síitos de ligação 1/3 distal 7:central/proximal 4 região 3’ locus
Esses elementos associados a VH3609 são conservados?
PAIR: 470bp4 subfamílias
Associação subfamílias PAIRs com genes VH3609
Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?
CTCFForte footprint PAIR4Fraco footprint PAIR6 e 7
Ausente Macrófagos
In vivo footprint: Macrófago (MO), pró-B (Rag2-/- Pax5+/+ ou Pax5-/-) tratamento DMS + piperidina
DMS: dimethyl sulfate
E2APadrão footprint semelhante entre os PAIRs
In vivo footprint
Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?
Interação de CTCF, E2A e Pax5em diferentes PAIRs no início do desenvolvimento de céls B CTCF ---- E2A ----Pax5
In vivo footprint
Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?
Os sítios de ligação dos fatores de transcrição são conservados nos diferentes PAIRs?
10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do CTCF10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do EA29 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do Pax5
Oligonucleotídeos não marcados
Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões….
Extrato nuclear (pró-B)Sonda (PAIR7)*Competidores Ensaio de mobilidade
eletroforética
PAIR7 tem afinidade (alta) semelhante aos sítios presentes em uE5 ekE2 (1989)
Oligonucleotídeos não marcados
Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)*Competidores Ensaio de mobilidade
eletroforética
O sítio de ligação de Pax5 em PAIR7 possui a mesma afinidade que sítio “referência”(promotor Cd19)e que uma única substituição de nucleotídeos (PAIR10), inserção de um resíduo A (PAIR8) ou substituiçãode 3pb (PAIR7M) inibe ligação de PAx5
Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões….
Cél Pró-B Rag2-/-Isolamento RNA Poly A+
RT-PCR éxons 1 e 2 (antisense)Unspliced (u)Spliced (s)
Investigação da atividade transcricional antisense dos PAIRs
Investigação da atividade transcricional dos PAIR4
CTCF:Menor PAIR4= PAIR 6 e 7
Na célula pré-B:
E2A:Semelhante
Pax5Ausente
Pax5 se liga de forma eficiente em células pró-B, mas não nos estágios seguintes de desenvolvimento, fazendo com que esses elementos permaneçam inativos nas céls pré-B
Estes fatores de transcrição ligam-se aos PAIRs ns próximos estágios de desenvolvimento da célula B?
Rag-/-Céls Pró-B (MO), células B maduras (LN), cél T DP (T)ChiPAnticorpo anti-CTCF
Padrão e intensidade de ligação similar de CTCF e Rad21 na região regulatória 3’RRe na região proximal dos genes Vh nos 3 tipos celulares
Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B?
CTCF: interage com todos os PAIRs (cél pró-B), com eficiência diferenteRad21: mesmo padrão CTCFCTCF: redução/ausência de ligação nos estágio cél B madura e cél T DP (exc. PAIR4)CTCF e Rad21: interagem preferencialmente nos elementos PAIRs em células pró-B
Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B?
Região distal do locus da Igh:Elementos reguladores dependentes de Pax5Sítios de ligação para CTCF, E2A e Pax5Transcrição antisense dependente de PAx5 (pró-B)
Regulação da recombinação distal VhH- DJ no locus da Igh