Top Banner
(1) Phytophthora palmivora Lignifying Peroxidase and Scopoletin Peroxidase Induced in Leaves and Cell Suspension of Hevea brasiliensis by Phytophthora palmivora Jeerapa Chaiwong A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Biochemistry Prince of Songkla University 2551
138

F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

Mar 24, 2023

Download

Documents

Khang Minh
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(1)

����������������� ��������������� ������������ ��� ��������� � �������������������������!"��#��$���%&'��

Phytophthora palmivora Lignifying Peroxidase and Scopoletin Peroxidase Induced in Leaves and

Cell Suspension of Hevea brasiliensis by Phytophthora palmivora

@��A� %����B� Jeerapa Chaiwong

���������F���'��G� H��I�J������BJK����I�� "���LL�

�����B� ��I���MN�� �����%�%������ �I��������� ����������

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Biochemistry

Prince of Songkla University 2551

��� ��F�]����I��������� ����������

Page 2: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(2)

����������� �������� �������������������������� � �������������� ����

� �!���"��#�#������������������!� ����$%�� �"&��'���()*� �

Phytophthora palmivora

������� ������+� �,� (����-�

����� (��� �

���� ��������������� ���� � !���"����#

................... .................� �0��� �� ( ��-��" �+� �� � .����� �(���(���) ( ��-��" �+� �� � .� �,�! �&�� !��0&�)

......................� �� ���� ��������������� �$�" ( ��-��" �+� �� � .����� �(���(���)

................... ...................� �� ( ��-��" �+� �� � .���� �"(�'") ( ��-��" �+� �� � .���� �"(�'") ...................� �� (� .�0��� �" �� )

��12�"�������� 3��������������� ��� � ��&�"�#3�����������!�0�4�����*

��5��6��3�7������� -7�8� "�3����%" � �99������-��" 3���12�" ������(�(��� �

...................... ( ��-��" �+� �� � .�� ��(�� ���3�%) 1�����12�"��������

Page 3: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(3)

������ ����� ��������������������������������� � ��! ��"���!#�$!%��� �!���&�& $!%��!!�$��!��� �� � �����'(���%#)��������*�� Phytophthora

palmivora +(������ � �� ,��%- ����.� � � � ���"�� �/� �.0�1 2550

�������

� �� � (Hevea brasiliensis) ��5���������" ��6 "�7#8��.�19�,�����%��.��� ������ " �*6 � ������(��0*� �8�+!&:���� ��� ���*������ ��;�����8�"��!(�� �� � � �8�� ��� �.0�1 �������<� $!%,���� �#8 �= ��8� �� �����)�� � >�"$!%.�#�(� � � ��($!���1 ��� � �����&:����+!+!#&��%�%� � ��!(�� �� � #����, �; ����)�� �� � �����!��1;%�:� %���� �- �-(�� � .$!%-(���%��. $!%�!���� �����)����#� �� �#8����*�>�"�����&��- �$�!�������!(���*�= � �#� �� �>�"���������, �:! ��!�� ��8� � ���� hypersensitive cell death, � ���� � pathogenesis related-proteins (PR-proteins), �S>#��!T���$!%!��� ��5�#�� ���������������������5� PR-proteins ���:�0�� � &�����������:! ���>������6 :�� ���$#�#8 ���� ��8� � ��! ��"���!#� �0����5�� ��S>#��!T������:�0��$!%��8��U��� � ���� �!��� ������6 � ��������& � �� � ����)� BPM-24 &��%�% B, B1, B2-C $!% D � $������� native PAGE #�,� �����������������������%��� 4 ��>����� (��>�������� 1, 2, 3 $!% 4) � ��>�������� 1 �������>���������&�& � ��%�% B ��>�������� 3 $!% 4 #�,� &��%�% B1, B2-C $!% D �8���>�������� 2 � &��%�% D ��8 ��*� $' ������������������������ �_����,� �����& � ���" �$�8� ��0*� ��>�������� 1 ���� &��%�% D �"!�������&��� ��SS` �����T�8 &��%�%����= ,0���5���>��������&�� 8� ��" ��8��$�8���& � �� � ��� &��8�& � �#����*�&������ # � ��>�������� 2 �� �U����,� &��;%�����>����� 3 $!% 4 , �: ��� , �� ��6 & � ��%�% B2-C � �6 &:���� �$+! � ��������������>�������8������� & &��8�#����*�&������ # & � �� � ����)� BPM-24 (����)�#� �� �) '(���%#)��&:���� ���� ���>�������� 2 ���� �$!%��T�8 &�����)� RRIM600 (����)��8��$�) $!%��5���>���������"!����������#������� ��>������������� &���!!�$��!�� � ��!���&���� ��#��#8 �= ���$�8 guaiacol, syringaldazine, o-dianisidine $!%�"���!#� � � �' 8� ��:�� ���������������������������� �����* ��>�������� 1, 3 $!% 4 ��5���������������>������������(8$!�&�& � �� � � ,����������� � ���� �!��� >����>�������� 1 �6 :�� ������ ���*� syringyl $!% guaiacyl lignin ��>�������� 3

Page 4: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(4)

$!% 4 ����������� syringyl lignin �������8 ����� �8���>�������� 2 ��*������������ � �#� �� �>�"�6 :�� ����! ��"���!#�, H2O2 $!%��� � guaiacyl lignin - �:!��, �� ��6 ��!T��8������ �� � � ����6 &:������!!�$��!�� #�,� � ���� ���������������������%:8 �� ��,�7�# ># �0��� ,����������� � ���� �!���$!%�6 ,��� ��!)8� reactive oxygen species (ROS) ���'(��!8������ , ���% �� ���� �!�0�- �&���!!� �������!!�$��!��� �� � '(���%#)����� filtrate ��� P. palmivora " ��������"���5� 0.300 ��>"�����>��#��#8� 1 ������!!�$��!�� ��5��! 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 96 $!% 104 ���>�� # �!6 �� � � �'����6 � �����"� %:��"���!#� (�S>#��!T���&�� �� � ) ����*��������������������&:��(��0*� �����* ����6 � �����"� %:��"���!#��(��)���� 80 ���>�� #�,� �"���!#������������� (S-POD) �����0*�����! 56 $!% 80 ���>�� �8�����������������������,6 �� %�� o-dianisidine (O-POD) � &����>����� 32 $!% 56 # �!6 �� &��;%������������������������������������ � ���� �!���"�� guaiacol (G-POD) �� syringaldazine (Z-POD) ��� ������0*���� 32, 64 �� 48, 72 ���>�� � ��6 �����������������������%���&���!!�$��!��&:� ��)��o ��8� >��+8 �"�!���� ion exchange ��� DEAE-sepharose CL-6B #�,� 3 ��>����� (POD1, POD2 $!% POD3) �0����5���>�������������0*�:!��, �� ���%#)����� filtrate , � P. palmivora ����������� � ��̀�����>�"&�� �� � ��"8 Km ��� POD1, POD2 $!% POD3 ��8 �� 0.27, 0.71, 0.91 �!!>�! �� (o-dianisidine), 0.23, 0.26, 0.39 �!!>�! �� (�"���!#�), ����8���, 4.17, 3.92 �!!>�! �� (guaiacol) $!% 0.12, 0.02, 0.29 �!!>�! �� (syringaldazine) # �!6 �� �6 �U��� �:� %����� pH 6.0, 5.0 $!% 5.0 # �!6 �� ��" ���'�������8� pH 7.0-10.0 $!%� � �'"�" �8����������);:-(� 0-60 ��. ��!����� � ��"�� ���� ���$�8 NaN3, β-Me $!% DTT � � �'�� ��*�� �����U��� ��� POD1, POD2 $!% POD3 �����8 ��� (�;� &��;%��� NaCl, SDS $!% citric acid �8������,������� POD1 $#8,%�� ��*��,������� POD2 $!% POD3

Page 5: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(5)

Thesis Title Lignifying Peroxidase and Scopoletin Peroxidase in Leaves and Cell Suspension of Hevea brasiliensis induced by Phytophthora palmivora

Author Miss Jeerapa Chaiwong Major Program Biochemistry Academic Year 2007

Abstract

Hevea brasiliensis (rubber tree) is an important economic plant in Thailand. A higher cost of rubber latex causes expansion of land for growth. Researchers have studied and developed such as cultivar selection, disease and pest protection and look after for sustainable rubber plantation to obtain higher yield rubber latex. The growth of rubber depends on weather condition in each country and the resistant cultivar will be selected to propagate in the suitable area. Induced disease resistance in plant is based on multiple mechanisms such as hypersensitive cell death, biosynthesis of pathogenesis related-proteins (PR-proteins), phytoalexins and lignin. Peroxidase (POD) is one of the PR-proteins that found in most plants with several functions. Some peroxidases are involved in degradation of scopoletin (a phytoalexin) and some are related to the biosynthesis of lignin. To analyze the defense process of Hevea, four different stages of BPM-24 leaves (B, B1, B2-C, and D of ages) were used. Four POD isozymes (1, 2, 3 and 4) were found in leaf extract, however only isozyme 1 was found in stage B. The isozymes 3 and 4 increased in stage B1, B2-C and D, while the isozyme 2 was found only in stage D. Not only the intensity of POD isozymes increasing in correlation with the age of leaves, the isozyme 1 of stage D also moved in electric field slower than that of the other stages, therefore it may be used as marker of age in Hevea brasiliensis leaves. The isozyme 2 was increased in naturally infected leaves of Hevea, whereas the isozymes 3 and 4 were decreased. The same phenomenon was occurred in Hevea leaves after wounding and the rate including intensity of this induced POD isozyme in resistant cultivar was significantly higher than that in the susceptible cultivar. Only one band with similar mobility to isozyme 2 was observed in Hevea cell suspension. After scopoletin, o-dianisidine, guaiacol and syringaldazine were used to stain for POD activity; the results showed that isozymes 1, 3 and 4 localized in leaf were involved in lignin biosynthesis. The isozyme 1 was related to syringyl lignin and guaiacyl lignin

Page 6: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(6)

whereas isozyme 3, 4 were specific to syringyl lignin biosynthesis. The isozyme 2, a defense related one, should be involved in degradation of scopoletin, H2O2 and biosynthesis of guaiacyl lignin.

During growth of Hevea cell suspension, the defense system that can protect them against reactive oxygen species (ROS), which was correlated with the enhancement of POD production. Activation of Hevea cell suspension with the culture filtrate of P. palmivora at concentration equivalent to 0.300 µg protein/g cell suspension for 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 96 and 104 h, respectively induced the accumulation of scopoletin and POD. The scopoletin production reached the highest level at 80 h after exposure, which was correlate to an increase of scopoletin peroxidase (S-POD) at 56 and 80 h. The activity of o-dianisidine peroxidase (O-POD) involved in the oxidation of ROS also enhanced in Hevea cell suspension at 32 and 56 h after the filtrate treatment. The lignifying PODs, guaiacol peroxidase (G-POD) and syringaldazine peroxidase (Z-POD) responded to filtrate at 32 and 64 h for G-POD, 48 and 72 h for Z-POD, respectively.

Partial purification of acidic POD by DEAE sepharose CL-6B showed that the POD from Hevea cell suspension consisted of 3 isozymes, POD1, POD2 and POD3, which were purified to 15, 17 and 287-folds, respectively. The entire POD isozymes were increased after induced with filtrate from P. palmivora. Kinetics studies revealed that POD1, POD2 and POD3 had apparent Km values as follows, 0.27, 0.71, 0.91 mM for o-dianisidine, 0.23, 0.26, 0.39 mM for scopoletin, ND, 4.17, 3.92 mM for guaiacol and 0.12, 0.02, 0.29 mM for syringaldazine, respectively. The POD1, POD2 and POD3 have an optimum pH of 6.0, 5.0, and 5.0, respectively. The pH and temperature stabilities were 7.0-10.0 and 0-60 oC, respectively. The POD1, POD2 and POD3 were completely inhibited by NaN3, 2-mercaptoethanol (β-Me) and Dithiothreitol (DTT). NaCl, Sodium dodecyl sulfate (SDS) and citric acid could activate the POD1 activity but suppressed the activities of POD2 and POD3.

Page 7: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(7)

���������������

� �,���6 �� �����&�"��*���*�6 ��T,!)!8����������8��� : �� � )""!����6 "�7����)� "�� ���. �#� , ��� ��. ���� ����� � � , ��������0�1 �� ����� �����); '8 ����" ��(� � ��������� �����!%�! &:�"6 ��0�1 $!%$�%�6 $�� �&�� �$������7: #!��,�#�,�� $!%$������� ���8��#8 �= $�8.1�������

���� �� ��%"); ���. �#� , ��� ��. ����� �#�%># � , ��������0�1 �8� ���. �#� , ��� ��.��%- �� �)� �����)� $!% ��. ����� ��#�� � ���&:�" ���); &�� �#�,�� �� ����� $!%�����); ����$�% $���� �����#� �6 &:��� �������" �'(�#����� (�;�� ��0*�

���� ��%");"; , ��� - "� ���"���)��8 ���������%���o��%� �� " ��(�#8 �= $!%�������$�%�����5���%>����&�� ��6 ,��#!���

���� ��%"); �;�#�� !�� �: �� !�����! �"����� ��������); ��� ��)�����)� ��8�&�� �.0�1 $!%�)���� ��)�� �,��������� �����, �>"��� ���� �" � ���� ��� �$�T ��(8 " � ��5 � �! . ���- " � �� �"�� ";% �� . �#�� �: �� !�����! �"�����

�)��� �+(��6 �� ��������� ��%");�6 !��&,������&:78, �");�8� ");$�8 :!�!)� ���� � ���� $!%+(�����%");�)��8 � ����*��� ");���= ������= $!% ����= ���.0�1 ��77 ���$!%��77 >�&�- "� ���"���)�"������5��6 !��&,&�� �.0�1 � >��#!�� ,0��6 &:�+(��6 �� ������6 ��T,� �.0�1

,��%- ����.�

Page 8: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(8)

������ ���� �"���8� (3) Abstract (5) �##������%� . (7) � � �7 (8) � �� �# � � (9) � �� ��(� (11) #��8�$!%��7!��1;� (14) 1. ��6 1 ��6 #�������� 1 � �#�,���� � 5 �#')��%��"� 36 2. ���) �)���;�$!%��� ���!�� 37 ���) 37 �)���;� 39 ��� ���!�� 40 3. +!� ���!��$!%, �;� 55 4. ��)�+!� ���!�� 103 ���� ��� ��� 106 - "+�� 119 ��%�#+(������ 123

Page 9: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(9)

����������� ������ ! ���� 1.1 " ����������%:8 ����#8����������$!%���*�� 13 2.1 ����� ��"�� �*6 :���>��!�)! $!% �1��+(�+!# 37 2.2 �8���%�� ����,!��!T">#�>S����$ ��8$�!��- � (native PAGE) 42 2.3 ��"���%�� ���� : ��(#� MS �0�����$�!������&���� %�!�*����!T��8�� 44 � �� � 2.4 ��"���%�� ���� : ��(#����$�!���� MS ���&������6 ��!!�$��!�� 46 2.5 �8���%�� ����,!��!T">#�>S����$ $�!��- � 49

(Tricine-SDS-PAGE) 3.1 $���"8 ��!����$�!����>��#��$!%�������������������&��%�% 68 � ��,�7�# >#�����!!�$��!��� �� � ��5��! 14 �� 3.2 $���� �����"� %:��"���!#� (nmole/ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 72

$��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate ���" ��������#8 �= "�� 0.033, 0.075, 0.150 $!% 0.300 ��>"�����#8� 1 ������!!�$��!��

3.3 $���� �����"� %:��"���!#� (nmole/ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 75$��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

3.4 $���� �����"� %:� S-POD (∆OD./ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 77 $��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

3.5 $���� �����"� %:� O-POD (∆OD./ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 79 $��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

3.6 $���� �����"� %:� G-POD (∆OD./ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 81 $��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

3.7 $���� �����"� %:� O-POD (∆OD./ g fresh wt) ����! #8 �= &���!!� 83 $��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

Page 10: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(10)

����������� (��) ������ ! ���� 3.8 $������ ;>��#�� (�!!����#8� 1 ������!!�$��!��) ����! #8 �= &���!!� 85

$��!��� �� � �����'(���%#)����� filtrate " �������� 0.300 ��>"����� #8� 1 ������!!�$��!��

3.9 $���+!$�"##�*����������������������$!%>��#����������, � 91 $#8!%��*�#������ ��6 ��)��o 3.10 $���"8 Km, Vmax $!% Vmax/Km ��������������������������6 &:� 92 ��)��o ��8����"�!���� DEAE-sepharose 3.11 $���"8 " ������������$�"##�*�����������������������6 �U��� 95 ����:� %������8� pH 2.0-10.0 3.12 $���"8 " ������������$�"##�*������������������������'��� 97 &��8� pH 2.0-10.0 ��5��! 1 ���>������);:-(�:��� 3.13 $���"8 " ������������$�"##�*������������������������'��� 99 &��8��);:-(� 0-80 ��. ��!����� ��5��! 1 ���>�� 3.14 $���+!���� ��"��#8�$�"##�*����������������������:!��, � 101 8�����);:-(�:�����5��! 5 � ��

Page 11: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(11)

�������$� �$�� ! ���� 1.1 $����8���%�� ���� �� � 5 1.2 �,���#������*�� Phytophthora spp. 8 1.3 !��1;%� �#� ����#8� Phytophthora ramorum &�������#8 �= 10 1.4 !��1;%������*�� Phytophthora palmivora 12 1.5 $���� ���� hypersensitive &����#� ����#8�� ��̀�����#���� 14 , ����*�>�"�8�>�" 1.6 $���>"����� �����S>#��!T������#8 �= 15 1.7 '�� �����"� %:�� ���%�� �S>#��!T���&�� �#%�� 16 1.8 $���>"����� ����!��� 18 1.9 $���� �#�*�#�����!��� 19 1.10 �U��� � �����"� %:�!���>�������� 19 1.11 $���>"����� ����������������������������:�(8 heme ��5� prosthetic 24 1.12 $����� ��#�����#8 �= ���������������������� 25 2.1 $+8�- ��(�$ � �)& � �� � #�*�$#8��*�� �) A, B, B1, B2, C $!% D 40 2.2 $���#6 $:�8�� �#��& � �� � ������>��#8 �= 41 2.3 $���� �#��& � �� � �� � 1X1 # � ��* 41 2.4 $���+!�8��� �� � � �)��%� ; 4-6 ���� :� - �:!��� �+������ 44 2.5 $�����*�#��� ��� %�!�*�����*������, ���!���:)����!T��8��� �� � 44 2.6 $�����*�#��� ��� ��!�*�� 46 2.7 P. palmivora �,�7&�� : ��(#� Henninger 48 3.1 $���& � �� � &��%�% B, B1, B2-C $!% D &��%�%�����8#����*� 56 3.2 $���$' �������������������&�& � �� � ����)� BPM-24 56

�������������"���!#� 3.3 $���$' �������������������&�& � �� � ����)� BPM-24 57 ������������ guaiacol 3.4 $��� native PAGE ���������������������� , �& � �� � 59 ����)� BPM-24 $!% RRIM600 �������������"���!#� 3.5 $��� native PAGE ����������������������, �& � �� � ����)� BPM-24 61

�������������� ��#��#8 �=

Page 12: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(12)

�������$� (��) �$�� ! ���� 3.6 $��� native PAGE ����������������������, �& � �$!%��!!�$��!�� 62 � �� � ����)� BPM-24 ��������"���!#� 3.7 $���$"!!��, ���!���:)����!T��8��� �� � 63 3.8 $�����!!�$��!��� �� � 64 3.9 $����(�$ � ��,�7�# >#�����!!�$��!��, �$"!!������)� BPM-24 65 3.10 $���"8 ��!����$�!����>��#��&��%�%� ��,�7�# >#�����!!�$��!�� 67 � �� � ��5��! 14 �� 3.11 $���"8 ��!����$�!����������������������� &��%�%� ��,�7�# ># 67 �����!!�$��!��� �� � ��5��! 14 �� 3.12 $ $+����$' >��#��>�!��%"�! �����,!��!T�>��S�����$ 69 Tricine-SDS-PAGE ��� filtrate , �� ������,!����!�������#�# 3.13 $���� �����"� %:��"���!#������!!�$��!��� �� � 72

:!��, �'(���%#)����� filtrate 3.14 $���� ������$������"���!#�- �&#�$���)!#�� �>��!T# 73 3.15 $�����!!�$��!��� �� � ���������� Evans blue 74 3.16 $���� �����"� %:��"���!#�����! #8 �= �����!!�$��!�� 76

� �� � :!��, �'(���%#)����� filtrate 3.17 $���� �����"� %:������������������������! #8 �= �����!!�$��!�� 78

� �� � :!��, �'(���%#)����� filtrate �����&���"���!#���5��� ��#�� :!��, �'(���%#)����� filtrate

3.18 $���� �����"� %:������������������������! #8 �= �����!!�$��!�� 80 � �� � :!��, �'(���%#)����� filtrate �����&�� o-dianisidine ��5��� ��#��

:!��, �'(���%#)����� filtrate 3.19 $���� �����"� %:������������������������! #8 �= �����!!�$��!�� 82

� �� � :!��, �'(���%#)����� filtrate �����&�� guaiacol ��5��� ��#�� :!��, �'(���%#)����� filtrate

3.20 $���� �����"� %:�������������������� ����! #8 �= �����!!�$��!�� 84 � �� � :!��, �'(���%#)����� filtrate �����&�� syringaldazine ��5��� ��#�� :!��, �'(���%#)����� filtrate

Page 13: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(13)

�������$� (��) �$�� ! ���� 3.21 $������ ;>��#������! #8 �= �����!!�$��!��� �� � 86

:!��, �'(���%#)����� filtrate 3.22 $������ ;>��#��&���!!�$��!��� �� � :!��, � 8���� filtrate 87 :!��, �+8 �"�!���� DEAE sepharose CL 6B 3.23 $������ ;�������������������&���!!�$��!��� �� � :!��, � 88 8���� filtrate :!��, �+8 �"�!���� DEAE sepharose CL 6B 3.24 $������ ;>��#��$!%�������������������&���!!�$��!��� �� � 89 :!��, � 8���� filtrate :!��, �+8 �"�!���� DEAE sepharose CL 6B 3.25 $��� native PAGE ���������������������� , ���!!�$��!�� 90 '(���%#)����� filtrate ������� o-dianisidine 3.26 $���� �������� S$ Michaelis-Menten 93 3.27 $���� �������� S$ Lineweaver-Burk plot 93 3.28 $���" ���������" �8������ POD1, POD2 $!% POD3 96 ����6 �U��� ����:� %������8� pH 2.0-10.0 3.29 $���" ���������" �8������ POD1, POD2 $!% POD3 99 �����'���&��8� pH 2.0-10.0 3.30 $���" ���������" �8������ POD1, POD2 $!% POD3 100 ��'���&��8��);:-(� 0-80 ��. ��!����� 3.31 $���+!���� ��"��#8�" ���������" �8������ POD1, POD2 $!% POD3 103

Page 14: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(14)

���%��&'(�)���*%���+�� BSA = Bovine serum albumin °C = Degree celsius DEAE = Diethylaminoethyl EDTA = Ethylenediaminetetra acetic acid fresh wt = Fresh weight g = Gram G-POD = Guaiacol peroxidase kDa = Kilodalton mA = Milliampere mg = Milligram ml = Milliliter nmole/g = Nanomole per gram µg = Microgram µl = Microliter µm = Micron µM = Micromolar OD. = Optical density O-POD = o-dianisidine-Peroxidase pH = -log hydrogen ion concentration PDA = Potato dextrose agar PDB = Potato dextrose broth Scp = Scopoletin SDS = Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE = Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis S-POD = scopoletin-Peroxidase sp/ml = Spore per milliliter TEMED = N,N,N,N,-tetramethylenediamine

Page 15: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

(15)

���%��&'(�)���*%���+�� (��)

Tris-HCl = Tris (hydroxymethylaminomethane) hydrochloride

Z-POD = syrigaldazine-Peroxidase UV = Ultraviolet w/v = Weight per volume α = Alpha β = Beta λ = Lamda % = Percent

Page 16: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

����� 1

����

������� ����

������� (Hevea brasiliensis) ��� ���������������������� ������������ ���������!��"�#�����$��%�� &��' �(��"�(��� !�%��)�������&����"&�� �(* �.�. 2442 ��%�����.��/�%����0�)���1���� (2(3��4�5 6 �%�(�) �#� �����������������(#�1(��� �� ���)"�� ��� ��2��5�!�� &(������#�����������7"������������85� 9��/4���%�������� 5������������5��%���%��6 12 ������& !�%��2"��7�$���������������85� (����5�� �(��2��5#������������7���85� �#�$)����������� 5�����4��"6�����&2��������������&(� ������8���� �(��;��!�%�&�$)� �������������� �4< �=" ���������������2"��7#�2�> &(�����;���%�� �#��������%��6 1 !7�����4�� !�%����"�����42"����(��&�(��� �����"7"������������"&� 6 ����2� $�(��2 ���@�� ��������%�����!�&��������/�!�������85� 26%����� �����(�/�� �$)���<2����������� 1 ������& $�* 2547-2549 �#�$)��� ������"�%������������ 5�����������������(�&����� �����������"��(���4(/ 7�)����)������� �����;��(/ 7�)������������(��%��������>�/�)���� �(������#�$)��%��������%�����@�� !�%7&�((�����������������7/�$�<�� � �(2"�����")���$�(/ 7�)�����8���������"�������� &��' �&� �������E/0������� <�2!�%�� ��������� �����!������7"�������� ����#����"��� � ������� �2�/� ������� �!3�� �(�������������$)�!�&��"7"�������� !�%�������;���������<����������;��7"�������������=� �&� ����������)���7�� ���$�����&��5#���� ���7&�7��������%!��!�%�������E/0��� � �($)����@�@�� $��%�%��" ������������� �(������6����E/0����������������6%)��%7���471��1���(����!�%1����%�� !�%� (�7�����E/0��� ������ &(� 5(<�2�����$�71��!"���(���������5�' Phytophthora spp. ����#�$)����<�2��4���������)������� ���!�& P. palmivora P. botryosa P. heveae P. Meadii !�% P. parasitica $��%������47�����E/0����#�$)����<�2$�������� 3 ���� 2 ( P. palmivora P. botryosa !�% P. nicotianae <��� 5(�� P. palmivora �����!��&��%�������"<�� ��� �(�������7����I�#�����������"&� 138 ���� (Chee, 1968) ��� 5(��7�) /�(�<�2���7����I����"� (��&���4���� �5#�!�%(���� �#����� ������5�7&"���� �#� �� ���� $4!�%@��(�<�<�� ���"���� �/���� ������� ������� ���7#�%)��� �%� (��!�%��7�4 �� �� <��� 5(����5�%(����(��&

1

Page 17: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

2

����O�����4���3��� ����2���<�2 ��(������"� I/$����)� (4�� �(����4������ ���IE��� (2547) �#�3�<(7(�0�(� P. palmivora 2"�������� 5x107 3�<(7(�0 &(������� � 38����� 5(����#�$)����<�2$4�&"�!�%7���#�$�������� �#�$)�)������7�� ��4&�$4����������E/0 ������ (BPM-24) !�%���E/0(&(�!( (RRIM600) 7��� 2"��! � &���(������(��)�� �4"&�$����E/0(&(�!(����(��)��!@&�"����"&����E/0 ������ <�����E/0 ������7����I���4��"6����/�����(��(��)������������ 5(���

��� ��� 5(��$�� ���5�� �(������2"��7�����E0�%)"&����� &(��� � ����������#�)��2"�� ������!�%2"��(&(�!( $��6%���� 5(���=���������#�)��2"����&�/�!�� !�%�������#�)��2"���/�!�� 2"��7�����E0�(�����%)"&��� ���4� 5($�����6%�����&�#�$)�� ����<�2 ��(��&��6����"2 ( � � �(������ ������!�%� 5(���������#�)��2"����&�/�!�� �����5�I8�!��"&�� 5(�%��������!7��2"����&�/�!��! &I��� ������(&(�!( � 5(��5��=�#�$)�� �!7��(�����(�<�2��� � ���&���%441���2/����� ! &7����I��4 �"� �( &( ������4/��/��(�� 5(<�2��"�"�E� &��' ��������5 �#�$)�3��0����#���� ��� 5(!�%3��0���(��&����2��� ������"&� hypersensitive cell death <��7��� )=����(��)��7��5#� ��, 7����7��a���"�%38��7����I��4��5�������> �4< �(�� 5(<�2��� ����"&� �b< (�=�3�� (phytoalexin) 7����<� ���85����#����� 5(<�2����"&� pathogenesis related-proteins (PR-proteins) ���!�& (��3�04 ��-1,3-���2��7, �2 ��7 !�%(�0((�3��7 �����%4"���� lignification � �(���4��"6� 5(<�2��&$)��/���� &(����3��0����2���

(��3�0(�0((�3��7��(��&$�� ����"� ��)����(<3�3�0 �#�)������! � &����� $�� �! &�%������(�0((�3��7�(<3�3�0�����2"���#���% &(���!7��((�$�! &�%� 5(� �( 2"42/�!�% (47�(� &(7���!"���(��������% /�� Edwards !�%26% (1997) �"��4��������(�(��3�0(�0((�3��7 $���%4"�������4(��38��(�72(�(�� �� $���� %"�� <���&�72(�(�� ���������7���%�(4�����7�!�%��&�%����5#� ����(��3�0(�0((�3��7������5"&�72(�(�� ��(�0((�3��7 (S-POD) �� �"�<���/� 46,000 ��<���� �� $�$4�(���� %"���4��������(� S-POD ���$�4��"6�(4' 4��!@�)��������% /����"� CuCl2 )� ( salicylic acid �(������5����4 S-POD $�$4���l����, ��7�4!�%I��" (Clarke, 1973; Goy et al., 1993) (��3�0(�0((�3��7�������"��(���4����&"�3&(�!3�@���3��0 <���%�&���%4"����7��2��%)0(�20�%�(4�(�@���3��0 �&� ������ 3�4(��� � �(7����2"��!�=�!��$)���4� 5(��� (Van Huystee and Zheng, 1993) $����l�������7����������7����I��4��5�������> �4< �(�� 5(�� P. infestans ��� (Friend et al., 1973) $�$4�������)��� ��� 5(�� P. botryosa $4������E/0 �������% (47�(� &(� 5(��������5 <��������a����������7����

Page 18: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

3

�������85�4��"6@���3��0 � �(����2"��!�=�!��$)���43��0!�%���4��"6� 5(<�2��&$)��/���� 7&"�$4������E/0(&(�!()=�a����������7������������&����� �����5�a����������7����������7����I4(��%��42"�� ��� ���<�2��� (���/4�, 2545)

����#�(��3�0(�0((�3��7$)�4��7/�E�t�#����)���"�E� Gabaldón !�%26% (2006) �8�����%4"�������������$���5� (�7/���������&�a�������<��(��3�0(�0((�3��7 $�3��0!�"��(��(� ��4��� �� (Zinnia elegans) )������ ����(��3�0(�0((�3��7 $)�4��7/�E�t��"� 4 2(����0 ���!�& Phenyl-Sepharose, Superdex 75, SP Sepharose Fast Flow !�% Concanavalin A-Sepharose 4B ���#���4 !��"�#����8���2/67�4� ��(�(��3�0(�0((�3��7 <��$�� cinnamyl alcohol 3 ���� (coniferyl alcohol, sinapyl alcohol !�% p-coumaryl alcohol) �4"&� sinapyl alcohol ��7�47 ����������7/� Martínez !�%26% (2008) �8���(��3�0(�0((�3��7$�����!�� (Capsican annum) <������#�$)�4��7/�E�t4��7&"� ��"�"�E����7���<� ��!��((����7������( �� !����"� Triton X-114 �&"���4"�E���� � %�(���"� (NH4)2SO4 1��)������ �"�7(4��"�"�E� SDS-PAGE !�%��(���"� 4-metoxi-α-naftol �4(��3�0(�0((�3��7����!I4���" !��"�#�(��3�0(�0((�3��7!I4�����&�"���8��� Vmax !�% Km (� �($�� ABTS ��7�47 ��) ��2&��&���4 0.495 !�% 1.32 �����<����0 ���#���4 (��3�0(�0((�3��7���!������������)"��I����4��5���"� ascorbic acid

�����%��5��� 5(� �(� � 2 ( ����#�(�7&"�$�7&"�)�8���(�� � �&� $4 ��(� ����� � 5(� �( )� (3��0 ����%��5��$�(�)��7��2��%)038���%�(4��"� !�&E� / �#5� �� "� ���� !�%7��2"42/�������> �4< <�����%<���0)���(�&���&� ����������E/0� �, ���@�� �����E/0���������<�2, ���@�� 7��7#�2�>, ���(�/����0���E/���� ���!����������E/0� �!�%�����4�/����E/0� � �� �� 9��/4������#�!2���7)� (3��0!�"��(���������%��5��� 5(� �(���8�����%4"���� &��' �������"��(���4� � �����#���$����7(4�������85� Daayf !�%26% (2003) �#�!2���7(���@������8������7%7��b< (�=�3����������% /����"��5#���5��� 5(�� Fusarium oxysporum f. sp. albedimis (Foa) 7����I��% /��$)�!2���7��������������%��5��� 5(� �((���@������E/0 ������ (BSTN) �����7%7��b< (�=�3��$�����67���"&�!2���7(���@������E/0(&(�!( (JHL) ��� �=>��� (2548) �#�(���3� ������5#���5���(�� 5(�� P. palmivola ����% /��!2���7���������� (�)/����=�(&(�������� �4"&�(���3� �� 1 ��<2����� &(!2���7 1 ���� 7����I����#�$)�!2���7��5����E/0 ������ (BPM-24) !�%���E/0(&(�!( (RRIM600) 7��2��%)072(�(�� �� (�b< (�=�3���(��������) <�������7%7��(� 72(�(�� ��$�3��0!�%�&(�((����(�3��0 Egea !�%26% (2001) �#�

Page 19: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

4

3��0!�"��(��(�����������E/0 ������!�%(&(�!( �4����8������7%7��(� (��3�0(�0((�3��7 !�%������ �&����"��4 Wang !�%26% (2008) �#� oligochitosan ����% /��3��0!�"��(��(���7�4 � �(�8�������(���� �"(��(�� �

$�����8���2��5���5@��"���� 7�$��#�3��0!�"��(����������� (�)/����=�(&(��(�������� ���8���(��3�0(�0((�3��7�������"��(���4����(���� �"(� ���!�&���7����������!�%���7��2��%)0(��3�0(�0((�3��7 <���������#���� filtrate (�5#���5��) �(� P. palmivora 38����� 5(����#�$)����$)����<�2$�������� �#�(��3�0(�0((�3��7���7���������3��0!�"��(� ���#�$)�4��7/�E�t4��7&"� !��"�8���2/67�4� � &��' �(�(��3�0(�0((�3��7

Page 20: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

5

� ������

1.1 ���

���������� ���������������������� (����� 1.1) $��6%��5�����2"��7�$���������������85�� �(��2��5#��������7���85����%"� ����60 <������������ 5�����4��"6�����&2��������������&(� ������8���� �(��;��!�%�&�$)� �������������� �4< �=" ������������������2"��7#�2�> &(�����;���%�� �#��������%��6 1 !7�����4�� !�%����"���E0��42"����(��&�(��� �����"7"��������"&� 6 ����2� $�(��2 ���@�� ��������%�����!�&��������/�!�������85� 26%����� �����(�/�� �$)���<2����������� 1 ������& $�* 2547-2549 �#�$)��� ������"�%������������ 5�������������(�&�����

����� 1.1 !7��7&"��%�(4�(�������� ���!�& ��������� (a) �(�������� (b) @�������� (c)

��������������� � ������/&�����$)>&�����(��/� ���� ����������5#����$��/�7&"��(� �� � (��(��#� ���%��4��"6���$)��5#����������7/� $�4���� �����$�7�/� Hevea �4"&� Hevea brasiliensis 38����� �(7���>"&� rubber tree )� ( ��������� ���������$)��5#����������7/�!�%� 5(�����2/67�4� ����"������7 �0���"&��������( ��' $�����O����7 �0������(�/���"�E���(� ��������� �����5

a b c

Page 21: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

6

Kingdom: Plantae Subkingdom: Tracheobionta

Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Rosidae Order : Euphorbiales Family : Euphorbiaceae Genus : Hevea Species : Hevea brasiliensis (����� : http://www.kanchanapisek.or.th/kpc/BOOK/chapter4/t3-4-l1.htm#sect1)

���1�2$ � 1�2 %"��((�!�%4��7&"��(�1�2 %"��((�����)� (�(��%�����)��%����%���������� � �(������ ����������(4����&"����������%4���5#�$ �@�"����� ��2"������� (pH) $��&"� 4.0-5.5 l� �7��#�7�( �(�*��2"��� 5�7��!�%�4"&���&2"����$����7���"&��%��4�5#��%� 1,000 b/ ���%����(� ����������!��"2&(����� 5� �8��������&��� 1.5-2.0 � � �����!@&$�@�"����8��������&��� �(<����!�� �����7����I����$)��5#�������� �((��/�%��6 5-6 * I��������"�2"���%����%"���=7����I����(��5#�����������"&� 30 * �����5�$���������������8� �(������6����E/0����������������6%)��%7���471��1���(����!�%1����%�� <��$�* �.�.2546 7I�4��"������� ���"�������� ����$)�2#�!�%�#�!�&�� ���I8�9������� �(������6�$����$�����E/0��� � �($)��� ��������4@� (4!�����7�����@�@�� ���7���85� 38���%�#��7�&�����;���%�� &(�

7I�4��"����������"�������� � ���((�2#�!�%�#����E/0��� * 2536 7#�)��4�� ������"��"������5

- ���E/0�����5� 1 ���!�& ������E/0�� !�%�#�$)��� ������<����&�#����� 5�������

- ���E/0�����5� 2 ���!�& ������E/0�� !�%�#�$)��� ������<���#����� 5������� ��������&�����(��% 30 �(�� 5�������������I (2�(� ! &�%���E/02"������&��(��"&� 7 ��&

- ���E/0�����5� 3 ���!�& ������E/0�� !�%�#�$)��� ������<���#����� 5������� ��������&�����(��% 20 �(�� 5�������������I (2�(� ! &�%���E/02"������&��(��"&� 7 ��&

Page 22: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

7

���E/0������!�%�#�$)����$�!)�&���������� (1�2$ �!�%1�2 %"��((�) - ���E/0�����5� 1 BPM 24, 7���� 362, RRIM 600, GT 1, PR 255, PR 261 - ���E/0�����5� 2 PB 217, RRIC 110, RRIC 100, PB 260, PB 255, PB 235 - ���E/0�����5� 3 KRS 251, PR 305, PR 302, RRIC 101, BPM 1, RRIM 712,

KRS 250

���E/0������!�%�#�$)����$�!)�&�������$)�& (1�2 %"��((�!�%1�2 %"��((�����)� ()

- ���E/0�����5� 1 RRIM 600, GT1, 7���� 36, BPM 24, PR 255 - ���E/0�����5� 2 PB 235, PB 255

1.2 Phytophthora spp.

1.2.1 ������ �� Phytophthora spp. !��� �� "#�"�$

������8��� Phytophthora 2��5�!��$�* 2.�.1876 <�� Anton De Bary � 5(������5��7�) /�(�<�2$4�)�� (late blight) $����l���� &(��$�* 2.�.1995 Hawksworth !�%26% ����#�!��(�/���"�E���(�� 5(�� Phytophthora �����5

Kingdom: Chromista Class: Oomycetes Order: Pythiales

Family: Pythiaceae Genus: Phytophthora

Phytophthora $�1������� !�"&� @���#����� � �������8���!�%"���� �4"&� Phytophthora ��I8� 63 7*��70 (Erwin and Ribeiro, 1996) ����5����(����(��&$��5#�!�%��� ��7��$������&��@�����5� ���"�� @���3��0�%�(4��"� cellulose-β-glucans �8����(��&$�(�6�����<2���7 � (Chromista) ���"����������6%���&��!�%���>2������ (true fungi) (��&$���/&�<(<(��3�7 (Oomycetes) <��7��$�����"' (hypha) �%! �������������/&�7��$� (mycelium) 7���"����<2<��� (����� 1.2) �����7����7(�0!������ (sporangium) 4�7(�0!����<(b(�0 (sporangiophore) 1��)���������>��7(�0!������!��"7(�0!����<(b(�0�%���>$)�7(�0!����<(b(�0$)�&������(����� !�%���7(�0!����������������(�7(�0!����<(b(�0 <��7&"������7(�0!����<(b(�0��5��%������6%�(��"&�7��$�� � 7(�0!������

Page 23: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

8

�����&��2������&��& ��4��"6�����2"���"����"&�7&"�4� �������/��38����7&"�������&(�$)�3�<(7(�0((�7�&1���(�����������������6%��/�� (papilla) 7����I$)��#����3�<(7(�0���(/6)1����%)"&�� 12-15 (���3�3��7 !�%�(�����6%���&( (germ tube) ����#����� ����<�� �����(/6)1���7���"&� 15 (���3�3��7 7#�)��4<2��7�����(�3�<(7(�0 ���������!4&� �"�(�<�< ���738� (protoplasm) 1��$�7(�0!������ � �(71��!"���(�)��%7� 3�<(7(�0�� 2 )�� )��)�8��������6% tinsel 38������(&(����#��"���� ����#�)������<4�$)�2� �(���������)��� (��)��)�8����!7�)� ( whiplash �#�)������<4�I(�)��� (Desjardin et al., 1969) � �(3�<(7(�0I���&(�((����7(�0!������!�%"&���5#�����%�%)�8���=�%)�/����2� �(��)" ��)��!��"�8�������% (encystment) 38������85�<�������% /����"�2��04(���((��3�0!�%���7���7%� (� )��������5�=�%�(��� germ tube <�����7����7��$����>!�%7����3�<(7(�0�85����(�� ����(��(�3�<(7(�0 7����I��% /����"��������((�3���$)�����85�

����� 1.2 "�����"� �(�� 5(�� Phytophthora spp. (����� : http://www.gebhardt.com.au/durian/phytophthora.html)

Phytophthora 7����I(��&����O��<��(��&$����(�<(<(7(�0��4$����(�7��$����(��&$�� ������<�2 � �(71��2"��� 5�)��%7��=�%���7(�0!������!��"�&(�3�<(7(�0���2� �(����$��5#�)� (��%�=����4l�!��"��(�����#����� � (�%7����, 2534) �&� P. cinnamomi 38��(����$���������2"��� 5�!��"�8��&(�3�<(7(�0�����#�������� ��#�$)����<�2����&� ����6%�(� Phytophthora !��&��%���<��(�����5#������3�<(7(�0� $�

Page 24: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

9

��6��������#����� 5(� �(7&"� &��' �(� �����$�71��E����� � ������<�2�%4����������� Phytophthora �%����#�������7&"�l9� �(� ���� $4 !�%!@&�$4�����&������&(����(�$4�&���5� 7&"�����%4��$�l9��%I��� 5(����#�����&(�!��"!��&���E/0���#��"����(�&���"��=" �����5�� 5(�%����#����7&"�����$4�#�$)�$4�&"� $���6���� �����(&(������&��l9� 4��"6�(�(&(��%I�� Phytophthora ����#�����&(��#�$)��(��&� &(��� 5(�%�/��������#��������$4!�%!@&�$4$����7/� 71��(�������)��%7� &(������<�2�%4��(�&���/�!����5� �85�(��&��4����6�5#�l�!�%�#��"�"��l� ���9����7#�2�> <��� �<�2�%����85�(�&���"����"��!�%�/�!��$��%�%�����l� �)��� �� &(�����"��)���' "��$�4��"6����� Phytophthora �%4��(��&38������%����85�$��%)"&��� (���I/����I8��O��������(��/�' *

Phytophthora spp. ��7�) /�#�$)����<�2��4����� �)������� (����� 1.3) �&� @�� ����(� ����%��4 � �����/� &��' �"���5����� � �� 7&"�$)>&�#�$)����(�����&���� ��� �#� ��!�%)�" �&� P. palmivora 7�) /<�2����&� <2��&��(��/ ���� P. parasitica 7�) /<�2����&��(�7��!�%�(��&��(�7�4%�� P. botryosa 7�) /<�2$4�&"��(�������� P. infestans 7�) /<�2$4�)���(����l����!�%�%� (�� P. fragariae 7�) /<�2���!�%<2��&��(�7 �(4(���

Page 25: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

10

����� 1.3 ����6%��� (47�(� &( Phytophthora ramorum $�� ����� &��' (�����: http://ceris.purdue.edu/napis/gif/sod-np.jpg)

(/�� !�%26% (2546) 7#��"�<�2�(������������4$�!)�&����������!�%!)�&�������$)�& � �($������(���$����7����!44�#��(�����%4���(�<�2 !�%�����60����%4���(�<�2 <�����7#��"�!)�&��%4��!�%2"���/�!���(�<�2��5�$�7"�������"� !�%$�7I������(����$�� 5����������1�2$ � (�4� 1�2$ � (��&�� 1�2 %"��((� !�%1�2 %"��((�����)� ( �4"&�$����)"������/� 7���� �%�� 9 ��� !�%���E�"�7 ������%4���(�<�2���$��&"�� (�����2� 2546 2"���/�!��7&"�$)>&(��&$��%��4�=���(�-������ ��"��4��� 5�����(����)"������/� 4��� 5�����(����)"��7���� 2"���/�!���(�<�2(��&$�

Page 26: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

11

�%��4 4-5 !�%�&"�� (��������-E��"�2� 2546 �4����%4���(�<�2$4�&"�!�%l9��&����������� 5( Phytophthora spp. $�4��� 5�����(����)"��7 �� ��� �%�� !�%���E�"�7 2"���/�!���(�<�27&"�$)>&(��&$��%��4�=���(� (�%��4 1-3) ��"��4��� 5�����(����)"���%�� !�%���E�"�7 �&"�� (�E��"�2� 2546 ��<�22&(������/�!�� (�%��4 4-5)

Phytophthora 7�����E/0����#�$)����<�2$����������(��&)������� ���!�& P. palmivora P. botryosa P. heveae P. meadii !�% P. parasitica $��%������47�����E/0����#�$)����<�2$�������� 3 ���� 2 ( P. palmivora P. botryosa !�% P. nicotianae <�� P. palmivora (����� 1.4) �����!��&��%�������"<�� ��� �(�������7����I�#�����������"&� 138 ���� (Chee, 1968) ��� 5(��7�) /�(�<�2���7����I����"� (��&���4���� �5#�!�%(���� �#����� ������5�7&"���� �#� �� ���� $4!�%@��(�<�<�� ���"���� �/���� ������� ������� ���7#�%)��� �%� (��!�%��7�4 �� �� <��� 5(����5�%(����(��&����O�����4���3��� ����2���<�2 ��(������"� I/$����)� (4�� �(����4������

�=>��� (2549) ��7(4<��$��!2���7�����������=�(&(����������43�<(7(�0�(� P. palmivora �4"&� 1.5 x 107 3�<(7(�0 &(������� � ��2"�����������7����I����#�$)�!2���7��5����E/0 ������ (BPM-24) !�%���E/0(&(�!( (RRIM600) 7��2��%)072(�(�� �����7��7/� 3�<(7(�07����I)����"�#�$)������7��2��%)072(�(�� ��!�%(��3�0(�0((�3��7$�3��0 !�%�&(�((����(�3��0$�����6���!�@�� ���%��42"�� �������(�������� P. palmivora @�� �=(�3��$�(�)��)�"!�%7����I ����$)�4��7/�E�t���4��7&"�<����� � %�(���"��� (!(�<�����3��b !�%@&��2(����0 PD-10 ���#���4 � �( �"�7(4��"�"�E� Tricine-SDS-PAGE !�%��(���"� Coomassie Brilliant Blue G-250 )� (3��"(�0�� � �4"&��=(�3����<� ��)���$�(�)��)�"���5#�)���<���/��%��6 10 ��<���� �� !�%�����<� ��$���/&�(���3� �� � �(�#�(���3� ������% /����=�(&(�����������2"�������� 1, 2, 4 !�% 8 ��<2����� &(��=�(&(� 1 ���� !�%����% /��!2���7���������� (�)/����=�(&(�����������2"�������� 0.5, 1 !�% 2 ��<2����� &(!2���7 1 ���� �4"&�(���3� �� 2"�������� 2 ��<2����� &(��=�(&(� 1 ���� !�% 1 ��<2����� &(!2���7 1 ���� ��2"�����������7����I����#�$)���=�(&(�!�%!2���7��5����E/0 ������ (BPM-24) !�%���E/0(&(�!( (RRIM600) 7��2��%)072(�(�� �� (�b< (�=�3���(��������) ���7��7/�

Page 27: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

12

����� 1.4 ����6%�(�� 5(�� Phytophthora palmivora ����6%�(�3�<(7(�0!�������&(����&(�3�<(7(�0 (a) 7(�0!�������(�� 5(�� P. palmivora ������&(�3�<(7(�0((������ papilla (b) 3�<(7(�0!�������(�� 5(�� P. palmivora 2 3�<(7(�0����#����"&��(��&4��"6����4� (c) (�����: www.botany.hawaii.edu/�/Bot201/Oomyceta/Phytophthora.jpg)

1.2.2 %�&��&���'( �)�*���+����+�,�

������<�2�(�� � �(�(����9���� &��' ���!�& 71��!"���(����)��%7� 2"��(&(�!(�(�� �!�%� 5(�������2"���/�!�� &(� �������5� ������� 5(��7����I����#����� �����85�(��&��49����1��$��(�� �!�%�����(�� 5(�������2"��7�����E0��� 38��2"��7�����E0��5����85������5��#���%!�%��&�#���% &(� � 2"��7�����E0�%)"&��� �!�%� 5(��7����I����85����)�����!44���!�&

1.2.2.1 %�&��&���'( �)�*����*���� (Gene for Gene Theory)

� ����������#�)��2"�� ������ (resistant) ������&� (dominant) !�%�������#�)��2"��(&(�!( (susceptible) �������(� (recessive) $��6%���� 5(���������#�)��2"����&�/�!�� (avirulent) ������&� !�%�������#�)��2"���/�!�� (virulent) �������(� 2"��7�����E0�(�����%)"&��� ���4� 5($�����6%�����&�#�$)�� ����<�2 ��(��&��6����"2 ( � � �(������ ������!�%� 5(���������#�)��2"����&�/�!��!7��((� ( ������� 1.1) �����5�I8�!��"&�� 5(�%��������!7��2"����&�/�!��! &I��� ������(&(�!( � 5(��5��=�#�$)�� �!7��(�����(�<�2���

a b c

Page 28: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

13

������� 1.1 2"��7�����E0�%)"&����� &(����(�� �!�%� 5(��

1.2.2.2 %�&��&���'( �)�*���� ����+!���+�,�

a��������(�<� �� (Protein Reaction) 4��"6@�"�(�� �!�%� 5(�%��<� ��38�����������!7��((��(���� <� ��)�&���5�%��@� &(2"��7�����E0$���� ��� 5(�(�� � ��&�"2 ( <� ���(�@�"� ��%��4��"6����� Recognition site )� (4��"6���#��(�� 5( I��<� ���(�� �!�%� 5(7����I��������� � ��%��&!7��a������� &( ����#�$)�� ���5������� ��� 5( ! &I��$���6����<� ���(�� �!�%� 5(��&7����I��������� � ��%!7��a������� &( ���$���!44 &��' �����5

�) � ��"; Hypersensitive cell death

Hypersensitive cell death ��a���������� (47�(�$�����(����<�2�(�� ����7#�2�> (����� 1.5) !7��I8�2"�� ������<�2�(�� � $��%)"&��4/��/��(�� 5(<�2)� (I��4/��/�<��7����� &��' ���4��"6@�"3��0 � �(� � ��� 5(!��"� �38�������E/0 �������%����(��)��7��5#� �� 38��������6%������������ ��(�&���"��=")������� 5(����#���� �#�$)�� 5(<�2��&�����47��(�)�����3��0����������"� (��& � 5(�8��%���������> �4< !�% ��$����7/� (�����(��)���4���<�����"� ��4��"67&"��(�� ������<�2 ���!�& $4 �� <2� �� ��� )�" l9� @� �� �� �����(�<�2�85�(��&��47&"��(�� � �����(�� � � 5(���4/��/� 71��(����!�%7���!"���(� &��'

Gene in Plant Gene in Pathogen

R (resistant) dominant r (susceptible) recessive

A (avirulent) dominant AR

No infection Ar

Infection

a (virulent) recessive aR

Infection ar

Infection

Page 29: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

14

����� 1.5 !7�������� hypersensitive cell death $�� � (47�(� &(����(���� �"(����� 5(<�2�&(<�2 (�����: www.padil.gov.au/viewPestLargeImage.aspx?id=3...)

) � � ��� GH$���I�J"� (Phytoalexin)

� �4����������%4"���������!��1��$�3��0� � � �( &( ����������#�����(�� 5( <�����@�� 7���%1��b< (�=�3��38����7��a���"�%���� �7�����85�)������� 5(����#����!��" !�%����� &(� 5(<�2 �8�7����I��4��5�������>�(�� 5(��� ���"�<���/� �#� ��E� /2��04(� ��<����!�%((�3�����(�20�%�(4 �4$�� ���������4�����% /������ 5(<�2)� (I����% /�����(���3� (�0 &��' ��5� biotic !�% abiotic �b< (�=�3����7�������2/67�4� ����% �85�(��&��4�����(�� � ! &��&��%����4� 5(<�2����$�����)�8��a���������5���$�� 5(� �(���I��4/��/�<��� 5(<�2 !�%� 5(� �(�(�3��0����2��� (� ���������b< (�=�3���85�(��&��4���E/�����(�� � !�%���$�3��0� ��������"� �&���5� (��<���0, 2525) "�I����7��2��%)0�b< (�=�3�� (biosynthesis pathway) $�� ��/�����(����"�I��(� shikimate, acetate-malonate !�% acetate-mevalonate 38����"�I��!�4(��38�!44�/ ��1��� �b< (�=� 3��4������7��2��%)0<��$������"�I����" 4������ �(�$��"�I�$����7��2��%)0�&"����7(�I8�7��"�I� (Kuc�, 1995)

�b< (�=�3����)������� (����� 1.6) 4������(����@��#�$)�� ����a������� hypersensitive !�%4��������@� &(������> �4< �(�� 5(7�) /<�2� � 7��)�&���5<��� ��%������6�����=���(�$�3��0� � ! &� �(� 5(����#����� ��%�����@�� 7��)�&���5��������85�

Page 30: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

15

����� 1.6 !7��<2��7�����(��b< (�=�3������ &��'

Gutierrez !�%26% (1994) �#�$4�(���� %"�� (Helianthus annuus) ���8��� ��%4"����7%7��(�7���%�(4 hydroxyl coumarin 2 ���� 2 ( 72(�(�� ��!�%(%����� (ayapin) )����"�#���������(�(��3�0(�0((�3��7���((�3���3072(�(�� ��$)���7���%�(4�����7�!�%��&�%����5#� (����� 1.7) )��������% /��$4��� %"����"� CuCl2 )� (�5#� ��3�<2�7 )=����� (�!7�1��1��$ �!7� UV �(������5�����% /����"� Triton-X100 ������@��&����"��� $��6%�����% /����"� salicylic acid, dichloroisonicotinic acid )� ( glutathione ��&�#�$)�������� (�!7�1��$ �!7� UV ���7����7���%�(4 hydroxyl coumarin $�� ���5��%�85�(��&��4�����(�(���3� (�0����#�����% /��!�%(��/�(�� 5(� �(� � ���7����(%����� $�$4�(���� %"�� ��������% /��

Page 31: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

16

��"��5#� ��3�<2�7!�% CuCl2 �4"&������7����$�����6����&���� 7&"����7����72(�( �� �� �4"&������% /����"� CuCl2 �������% /��������"&��#� ��3�<2�7

����� 1.7 "�I����7��2��%)07���%�(4�b< (�=�3��$���� %"�� (�����: Gutirrez et al., 1994)

$��������������8���������� (47�(� &(� 5(<�2��2��5�!��<�� Tan !�% Low (1975) �4"&�)������$4��� ��� 5( Colletotrichum gloeosporioides �%�����7%7�7��� (�!7�7��5#���� (7�������&��7�) &(�����������8������� �� <���#�$4���������4&���"�� 5(�� Microcyclus ulei �4"&�7��� (�!7������&�"2 ( hydroxyl coumarin !�%$)�� �("&� 72(�(�� �� (Giesemann et al., 1986) 38�����7%7�72(�(�� ���%����85�(�&���"��="!�%7����I��4��5�������> �4< �(�� 5( (Garcia et al., 1995b) ! &$4������ ��� 5(�� Corynespora cassiicola �4"&�2"���������(�72(�(�� ��$�$4������E/0(&(�!(������67���"&�$����E/0 ������ (Breton et al., 1997) $��6%���� 5(�&(<�2$�������� �"( ��' �&� � 5(�� P. palmivora ���)����"�#�$)�@�� 72(�(�� ��$�$4������� 4 ���E/0 !��"7����I4(��%��4

Page 32: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

17

2"�� ������<�2��� ����2 ( ���E/0 BPM-24 (���E/0 ������) !�%���E/0 PB235 (���E/02&(����� ������) @�� 72(�(�� �����7���"&����E/0 RRIT251 (���E/02&(�����(&(�!() !�%���E/0 RRIM600 (���E/0(&(�!() (Churngchow and Rattarasarn., 2001) ���E0"��� (2547) 4&�!2���7���E/0 GT1 (2&(����� ������) !�%���E/0 RRIM600 ((&(�!() ��"�3�<(7(�0!�%(���3� ����� P. palmivora �4"&�3�<(7(�07����I��% /��!2���7$)������7��2��%)072(�(�� ��$����E/0 GT1 ����"&����E/0 RRIM600 <������6!�%(� ���="$����7��2��%)072(�(�� ��!�@�� ����4�%��42"�� ������<�2�(�������� �(������5)���I����% /����"�(���3� ���4"&� !2���7��(� ���="$����7����72(�(�� ��7���"&������% /����"�3�<(7(�0 �"���5��#�$)������� ���(�3��0 ����="�"&������% /����"�3�<(7(�0 $�� �( ��' �&� ����7�4 � �(4&�3�<(7(�0�(�� 5(�� P. nicotianae $�3��0!�"��(��(���7�4 (Nicotiana tabacum) ��5����E/0 ������!�%(&(�!( �4"&�3�<(7(�07����I)����"�#�$)�3��0!�"��(�7�����b< (�=�3�������5�7(����E/0 <��������E/0 �������%������6���7�����b< (�=�3��7���"&����E/0(&(�!((�&�������7#�2�> !�%� �(��7(4<��$��3�<(7(�0�(�� 5(�� P. palmivora 38����7�4��&$�&� �(�����(�� 5(�������&�" �4"&�@�������(�$)�@����$����������"��� (Perrone et al., 2003) �(������5� �(4&� ��(&(��(�I��"��7� (Arachis) ��"� Bradyrhizobium spp. �4"&������)����"�#�$)�� �7�����b< (�=�3������&����"��� (Azpilicueta et al., 2004)

%) � ����% �)( Pathogenesis L related proteins (PR-proteins) PR�proteins ��<� ������ �7�����85�� �(�(����(�� ���$)���4 �(�

�������/�����(�� 5(<�2)� (�������������"�7��2��!�%�(�0<��� �4������ �"�I8����I����������������4��!@� (wounding) !�%(���3� (�0 &��' <�����"�$�� ���5�7�������7%7� PR� proteins � �(�#�)������ &( ���!�%��4��5�������> �4< �(�� 5(<�2)� (�"��7 (Kitajima and Sato, 1999)

PR�proteins ���� �7�����85���2/67�4� � ��(��3�0 <�����7����(��3�07#�)��4�#�)�������� PR�proteins ��5���!44��&�#���%��%�� ! &�%����85�� �(����� ��� 5()� (I��������&���5���&$�&��������2"42/�� ��(�������E/���� 7&"�$)>&�(����� 5(�����O�E�t������I8� �#�!�%�����&�#���%��%�� &(� 5(<�2$� (Kauffmann et al., 1987)

�) � ����% �)(�"��"� (Lignifications)

��������7���%�(4���3�(�b*�(������(�0<��(���(�0���� �(���"����E%<2"����0��%���(��&1��$�<���!322����0 (����� 1.8) !�%��(�20�%�(4�(��2 �����@���3��0�(�� � ��������<2��7�������!�=�!�����2(�25#��/�$)���4�&(�#������5#��(�� �

Page 33: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

18

�"���5��&"�25#��/�� 5(� �(( ��' ��<2��7�������� �)�����6%�#������5#������ 5(� �( &��' ��������������%4"����((�3����4<����(�0���03����(�<�<�����(� (cinnamyl alcohol) 3 ���� ���!�& p-coumaryl, coniferyl !�% sinapyl (!7��$������ 1.9) �&�a�������<�� xylem oxidase ��5������(��3�0(�0((�3��7 !�%�����&$�&(��3�0(�0((�3��7 �&(�7��((���2 ( ���(�0<��(���(�0 (!7��$������ 1.10) (Ros-Barcelo et al., 2002) $����l�������7����������7����I��4��5�������> �4< �(�7���� P. infestans ��� (Friend et al., 1973) !�%$��������������4��"6��&$)�� 5( Microcyclus ulei �/��������3��0����2���<��������������7#�2�>(��)�8��$���� ���� 5(����5 (Garcia et al., 1995) �(������5$�E����� �� ��=�����7����(��3�0(�0((�3��7� �($��$����<����(�0��30������

����� 1.8 !7��<2��7�����(������� (�����: http://genomics.energy.gov/gallery/b2b/gallery-02.html)

Page 34: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

19

����� 1.9 !7��7�� �5� ���(������� ���!�& coniferyl alcohol, sinapyl alcohol !�% p-coumaryl alcohol. (�����: Kishimoto et al., 2005)

����� 1.10 a����������7��2��%)0������<��7��� (�����: ���!����� Ros-Barcelo et al., 2002)

4CL, 4-(hydroxy)cinnamoyl CoA ligase; C3H, p-coumarate 3-hydroxylase; C4H, cinnamate 4-hydroxylase; CAD, cinnamyl alcohol dehydrogenase; CCoAOMT, caffeoyl CoA O-methyltransferase; CCR, cinnamoyl CoA reductase; COMT, caffeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase; CQT, hydroxycinnamoyl CoA:quinate hydroxycinnamoyltransferase; CST, hydroxycinnamoyl CoA:shikimate hydroxycinnamoyltransferase; F5H, ferulate 5-hydroxylase; PAL, phenylalanine ammonia-lyase; pCCoA3H, p-coumaryl CoA 3-hydroxylase; SAD, sinapyl alcohol dehydrogenase.

Non-peroxidase

Page 35: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

20

� ��% (47�(� &(� 5(<�2<��������a����������7����������� �(����2"��!�=�!��$)���43��0� �!�%���� 5(<�2��&$)��/����)� (!��&��%���((�� ���IE��� (2546) 4&�$4����������E/0 BPM-24 ( ������), RRIT251 ( ������������) !�% RRIM600 ((&(�!() ��"�3�<(7(�0�(� P. palmivora �4"&� $4������E/0 BPM-24 ���a����������7������������������7/�$����"<����� 24 )������4&���"�� 5(�� <���������������85��%�#�a���������4�����<��2�(�����������7�!�� ��4��"67������$4�(�$4������� � �(7��� 1��$ ����(��/������0 7&"�$4����������E/0 RRIT251 !�% RRIM600 �4���7�����������=���(�!�%��&�4���7������������

Gabaldón !�%26% (2006) �8�����%4"�������������$���5� (�7/���������&�a�������<��(��3�0(�0((�3��7 $�3��0!�"��(��(� ��4��� �� (Zinnia elegans) )������ ����(��3�0(�0((�3��7$)�4��7/�E�t��"� 4 2(����0 2 ( Phenyl-Sepharose, Superdex 75, SP Sepharose Fast Flow !�% Concanavalin A-Sepharose 4B ���#���4 !��"�#����8���2/67�4� ��(�(��3�0(�0((�3��7<��$��<�<�����(� 3 ���� (coniferyl alcohol, sinapyl alcohol !�% p-coumaryl alcohol) �4"&� sinapyl alcohol ��7�47 ����������7/� !��"�#� sinapyl alcohol ���#�a���������4 H2O2 (2"42/�(� ����� �� H2O2) !��"�8�����%4"�������((�3�<��������� @�������(��4"&�������7����@���3��0��"�7���%�(4���3�(�������$�3��0!�"��(�4��� �� ���� �(� &(�(�<�<�����(���"����E% β-O-4 cross-coupling 7���%�(4���3�(�������$�������(���5 �4"&���2"��(��� �" 38�� �����������4���������E%�����&�"$��6%���� ���������> �4< 2 (������ �(� &(��7���%�(4���������������$)>&!�%��&�����7�5�7/�

Mandal !�% Mitra (2008) �8�����������!���(�����6�(�������$�����(� ���%� (��)�����������% /����"�(���3� (�0 4 ���� 2 ( 7��7������7��$� (micelium) �(�� 5(�� Fusarium (FME), �2< 3�� (CHT), �5#���5��� 5(�� Fusarium (FCF) !�%7��7������7��$��(�� 5(�� Trichoderma (TME) �4"&�)������ 24 ���"<�� (���3� (�0��5� 4 ����7����I��% /�����7���� ferulic acid 38�������7������"��(���4������������ <����� FME !�% CHT 7����I��% /��$)���� ferulic acid ���7��7/� 3.71 !�% 3.30 �&� ���#���4 ���7�������������@���3��0�(���� ���%� (�� �"��4"&������% /����"� FME ���"&������% /����"� CHT ����6�(������������85� 3.6, 5.4 !�% 7.1 �&� ��� 12, 24 !�% 36 ���"<�� ���#���4 $��6%�������6�(���������������% /����"� CHT �����85� 2.8, 5.1 !�% 6.8 ��� 12, 24 !�% 36 ���"<�� ���#���4 ����6�(�(��3�0(�0((�3��738����(��3�0�������"��(���4���7���������� 7��7/���� 24 ���"<�� ������@���3��0�(� ���%� (�������7����

Page 36: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

21

��������������85��#�$)�3��0��2"��!�=�!�������85��&�����8���2"��7#�2�> &(����(���� �"(��(�� ����� 5( &��'

1.2.3 � � ��P*��+ ���+�,�

<��7&"�$)>&� ��% ��� 5(�= &(� �(� 5(7����I���7�&� ���� )��������5��8���������6!�%�#�2"��7��)��$)�!�&� � "�E�������7�&� ��(�� 5(�����)�����!442 (

1.2.3.1 ������7�&� �<�� �� � 5(��4������7����I!��@&��@���3��0�(�� ����<�� ����"�!���� �&� 7(�0�(� Oidium )� ( Pythium � �(�(�7����I!��7��$�@&��@���3��0����#����� ����<�� ��

1.2.3.2 ������7�&� �<��@&������&(���E����� � 7(�0�(�� 5(��4������� �( ���4�@�"� �!��"�%�(�7��$�����#����� �<��@&������&(���E����� ��&� ��$4, &(�2���5#� 38���%��)���5#���b��0�4��' �#�$)�)��%7� &(����(��(�7(�0!�% lenticels (�&(����#�)������!����������3)

1.2.3.3 ������7�&� �<��@&�����4��!@� 4��!@���������4� ���(���&(����)�8������ 5(<�27����I����#������� 38��4��!@�(��������)���7�) /���!�&

- 71��E����� � �&� ���������/)� (��!���#�$)�� �������7���7���������4��!@� ���������/���)=4 )� (71��(�������)��"����#�$)�3��0� �! � �� ��

- 7�������"� ���� &��' �&� ����������(�7� "0!�%!��� ��� ��! &�����)� (����=4@�@�� �(���/��0 �������#�����(��7�� (�l(��#�$)����� ����!@� �� ��

- ���������!����#�$)�������������4��"6��� - � 5(<�2�&(�7��2��4�������&� toxin )� ( enzyme ((���

�&(�@���3��0�#�$)�� ����4��!@��&(�����#����� � � 5(��! &�%����7����I���7�&� ����! � &����� 4������(�����7�&� ����

���4��!@�)� (�&(���E����� ��&���5���&7����I!��7��$����7�&3��0� �<�� ����� ! &� 5(��4������(��$����5� 3 ��!44$�������7�&� �

1.2.4 ��G�� ������+ ���+�,�

� �(� 5(�����7�&� ����!��" &(������%4"�������� 5(�#�$)�� �!7��(�����(�<�2 38��<��7&"�����%������#����� 5(� �(� �$)� ��)� (7��)�� ��������#����� ��(�� 5(�����!�&

Page 37: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

22

1.2.4.1 � R�"���GJ&(

�) (��3�0�&(�@���3��0� � @���3��0�(�� �!4&�((������ 3 ��5� 2 ( middle lamella, primary cell wall !�% secondary cell wall 38��! &�%��5���(�20�%�(4���2�����! � &����� 7���%�(4�(�@���3��0��(��& 3 �%1�2 ( pectin, cellulose !�% hemi cellulose �(������5@���3��0���I��2� (4��"� cutin $�� 5(��4������7����I@�� (��3�0((����&(�7���7���%�(4�(�@���3��0)�&���5���

�) (��3�0�&(�7���%�(41��$�3��0 � 5(��)�������7����I7����(��3�0((����&(�7���%�(4���(��&$�3��0� ��&� proteases, proteinases, peptidases �&(��"�<� �� amylase �&(�!�� !�% lipase, phospholipase �&(������

1.2.4.2 � R�"� �"�

"�E����)�8������ 5(���#�2"��7��)��$)�!�&� �2 (���7����7����������@� &(� 5(� �(� � 7��������� 5(7����7����I!4&�((������ 2 �������!�&

�) 7����������%�� &(� �(���� � 5(��7�) /<�2� �)���������2"���#���% &(� �(����<��7����I�#����� ����4�������&���5� ��5���5(��� �(������7��������� 5(@�� �85���@����% &(� 5(� �(� �������5�! &��&��@� &(� �����( �� 7����������%�� &(� �(�����&� Victorin or HV toxin @�� <��� 5( Cochilobulus vitoriae 7�) /<�2$4�)���(� ��<(� AM-toxin @�� <�� Alternaria mali 7�) /<�2$4�/��(� apple !�% Alternaria alternata 7�) /<�2$4�/��(��%� (�� @�� 7����� AL-toxin �� ��

�) 7����������&��%�� &(� �(���� 7�����������5��2"������� &(��5�� �(����!�%� �����( �� ! &��&�#�$)�� �!7��(�������<�2 4�4���(�7�����������5$�� 5(4�������%�� �"7���2"���/�!���(�<�2��&�"2 (�#�$)�� ����2"��7��)����������85� 7�����$���/&���5�&� oxalic acid @�� ���� 5( Sclerotium and Sclerotina spp. 7����� alternaric acid !�% alternariol @�� ���� 5( Alternaria spp., fusaric acid !�% lycomarasmin @�� ��� Fusarium oxysporum !�% cercosporin @�� ��� Cercospora spp. �� ��

1.2.4.3 � R�"S� ($&�) ��� %��%T&� �� "#�"�$

� 5(��7�) /<�2� �4�����������@�� 7���&�������> �4< �(�� � �#�$)�� ������&�� 7���% ���@��� �������� 7��2"42/�������> �4< ���� 5(��@�� �85��&�

Page 38: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

23

�) auxins @�� ���� 5( Plasmodiophora brassicae , Plasmodiophora brassicae !�% Ustilago maydis

�) gibberellins @�� ���� 5( Gibberella fujikoroi 2) ethylene @�� ���� 5( Fusarium oxysporum

1.3 ���GJ&(�U� (���J"�;�

1.3.1 %�&)&� �����GJ&(�U� (���J"�;�

(��3�0(�0((�3��7 : Peroxidase (EC : 1.11.1.7 donor H2O2 oxidoreductase) ����<�<� �� (hemoprotein) ����������% ��(��&)� (��)��&��(7 �� (prosthetic group) ��4��4(��3�0(�&��)��!�&���"����E%<2"��� 0 ������6%��"�!)"� �%���(� (tetrapyrole) �����<�< �(�0�b��� IX (protoporphyrin IX) �����&��!4���4 (planar) 1��$�<2��7�����(�"�!)"��%�%�(4��"��(((��(�)�=�)�8��(% (� (����� 1.9) <�����"�)�=��%�� #�!)�&����7����I������E%��� 6 #�!)�&���"���� <�� 4 #�!)�&��(�)�=��%7�������E%��4(% (��(���< ����(�"�!)"��(�0�b��� ���E%��� 5 !�% 6 �5������4�%��4�(���� 38�� #�!)�&���� 5 �%7�������E%��4(% (���< ����(����(%��<���7 ���� �(�<� �� !�%(��3�0(�0((�3��77����I!7��������� &��' ��� <�����!�������)��& &��' ��� #�!)�&���� 6 �(�)�=��#�$)�(�0((�3��7 7����I$����<����(�0((��3�0 (H2O2) �� �"��4(��=� �(�!�%((�3���307���%�(4���$)�(��=� �(�������@�@�� ���$)�7�((������ ���7����

2HA + H2O2 2H2O + 2A (A$)�7�) ����������a��������(�(��3�0(�0((�3��7 �������5

E + H2O2 compound Ι + H2O 7������� 1 compound Ι +AH2 compound ΙΙ + AH 7������� 2 compound ΙΙ + AH2 E + AH + H2O 7������� 3

<����� E 2 ( ferric enzyme �������!44$��%�%��� (resting) AH2 2 ( 7�47 ��$�71�"%���I������"30

AH 2 ( 7�47 �����I��((�3���30

peroxidase

Page 39: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

24

����� 1.11 !7��<2��7�����(�(��3�0(�0((�3��7�����)��& heme �� prosthetic (�����: www.tifr.res.in/~shyamal/research.html)

(��3�0(�0((�3��7�%((�3���307�47 �����$�71�"%����� H2O2 !�%7����I$��7�47 ��)������� �&� 7���%�(4b*�(��� 7���%�(4$���/&�(%<��� ��(���!�% 7���%�(4(�������0 (����� 1.12) 7&"��������� �((��3�0(�0((�3��7�%���� ��7�47 �����$�� �&� I��$�� guaiacol 38��(��&$���/&�7���%�(4b*�(�����7�47 �� �=�%����"&� guaiacol peroxidase (Vianello et al., 1997) (��3�0(�0((�3��7�4���$�7�������"� ��5� �#� �&� � 5(�� <�< 3�" 7�)�&��3��0���"��I8�� ���5�7��!�%7� "0��5�������"��� 7����I!4&���/&�(��3�0(�0((�3��7 �������������#���4���(%��<�!�%2"��7����I$������4��4�(((��(�<�)%��� 3 ��/&� ���!�& ��/&���� 1 2 ( intracellular peroxidase ��/&���� 2 2 ( extracellular fungal peroxidase !�%��/&���� 3 2 ( secretory plant peroxidase ���� ���5�7�� (Sakharov and Sakharova, 2002)

Page 40: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

25

o-dianisidine

Pyrogallol

����� 1.12 !7��7�47 ������ &��' �(�(��3�0(�0((�3��7

�������8���(��3�0(�0((�3��7�����)�=���(�20�%�(4 (heme peroxidase) !4&���� 3 ��/&� 2 (

��T*&��� 1 Intracellular peroxidase �&� cytochrome C peroxidase (CCP) $���7 0 ��<� �����7����I�%����5#���� �4��� electron transport chain $���<�2(�����!�%(��3�0(�0((�3��7�#�)�������(����(�� ������2"��������(�(�0((��3�0 �&�

2,2�-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)

3,3�-Diaminobenzidine (DAB)

3, 3�,5 ,5�-Tetramethylbenzidine (TMB)

Guaiacol

Syringaldazine 72(�(�� ��

Page 41: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

26

ascorbate peroxidase (AP) (Perez et al., 2002) $�� ���5�7��(��3�0(�0((�3��7�#�)������������<����(�0((��3�0((����2�(<����7!�%�3< 3(� 7&"�$�!42�����(��3�0 (�0((�3��7�%�#�����&"���4(��3�02% ��7 (catalase) <���(����3��0���71�"% oxidative stress

��T*&��� 2 Extracellular fungal peroxidase �&� lignin peroxidase (LiP) !�% manganese-peroxidase (MnP) 38����<�<��(�0�(����<2<� �� <� ����/&���5�%�(4��"� disulphide bridges 4 #�!)�&� !�% �� Ca2+ 2 <���/� MnP �4$�� 5(������&(�7��������� <�� MnP �%$�� H2O2 �� �"��4(��=� �(�!�%((�3���30 Mn

2+ 38����7�47 �������(��&$�� 5(��� (Young et al., 2000 !�% Kapich et al., 2005) ���a������� &(���5

MnP + H2O2 MnPΙ + H2O a���������� 1 MnPΙ + Mn2+ MnPΙΙ + Mn3+ a���������� 2 MnPΙΙ + Mn2+ MnP + Mn3+ + H2O a���������� 3

<����� MnP 2 ( Manganese peroxidase Mn2+ 2 ( Mn $�71�"%���I������"30 Mn3+ 2 ( Mn $�71�"%���I��((�3���30

7����I�4(��3�0��5�7(�������5$�� 5(������&(<�2�����" (white-root disease) �&� � 5(�� Phanerochaete chrysosporium $�b�����"7��� (Arora et al., 2002)

��T*&��� 3 2 ( secretory plant peroxidase ��)�������#���%��4� 5(� �(! &�%���� �&� 2� �(����� H2O2 ((����2�(<����7 0!�%�3< 3(� ((�3���307���%�(4�������� 7����@���3��0 (47�(�$�����(����<�2���4��!@� ��%4"����7��� indole-3-acetic acid (IAA) ��%4"����7��2��%)0(�E����!�%( ��' <� ����/&���5��<�<��(�0�(����<2<� ���&����"��4��/&���� 2 ! & &�������� #�!)�&��(� disulphide bridges (http://InterProHeam peoxidase,plant-fungal-bacterial.html)

1.3.2 �U� (���J"�;�G�$JGJ&(

�(<3�3�0 ��(��3�0�����<2��7���� &�����! &�&�a����������"��� (��3�04�� �"(�����(<3�3�0 &�����$�((�0!����0 (organelle) &��������� �&� $��3< 3(� (cytosol) !�%$���<�2(����� �(<3�3�0! &�%����(����2/67�4� �)��%7���471�"%

Page 42: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

27

!"���(� &����� �����5�����8���(��3�0���"����=7����I$���(<3�3�0 �"�7(42"��! � &���%)"&�����E/0� �!�% �"�7(42"��! � &���(�� �� ���4� ������<�2���

$�����8���(��3�0(�0((�3��7(�����(<3�3�0 &�����$�� 5(� �( &��' �(�� � ����8���(��3�0������5����������8���2��5�!��$� radish )� ( horseradish &(�� Shannon !�%26% (1966) ���$���2��2 ion exchange chromatography !��(��3�0(�0((�3��7�����5�)�� 7 �(<3�3�0 � �($�� CM-cellulose chromatography 7����I!����� 5 �(<3�3�0 ���!�& A, B, C, D !�% E !��"� ����@���"��2��2 DEAE-cellulose chromatography 7����I!���(<3�3�0 A ((��� 3 �(<3�3�0�&(� 38������"&� A1, A2 !�% A3 Aibara !�%26% (1982) �%74@�7#��=�$����!���(<3�3�0 B !�% C ��� 5 �(<3�3�0�&(� ���!�& B1, B2, B3, C1 !�% C2 ��"� CM-cellulose chromatography 38�����������(������&�"�=�����!4&��%1��(�(��3�0(�0((�3��7 ���%�/�����(�20�%�(4��� 3 �%1� 2 ( �%1���� 1 ��(%3����(�0((�3��7 ���!�& �(<3�3�0 A �%1���� 2 ����" �(� (�0((�3��7 ���!�& �(<3�3�0 B, C !�%�%1���� 3 ��47��(�0((�3��7 ���!�& D, E

"�E����!44��&!��71�� (native PAGE) ��&�#�$)�<� ��7��71�� ��E����� � 7����I�8����5#�)���<���/��(�<� ��$�71������� oligomer ��&$�&��)�&"��&(� �&� $�3��0!�"��(��(���=��%)/&� 7����I!��(��3�0(�0((�3��7���� extracelllular ��� 6 �(<3�3�0 38��!���&(���� 2 ��/&� 2 ( ��/&� anionic �� 2 �(<3�3�0 ���!�& A1!�% A2 7&"���/&� cationic !����� 4 �(<3�3�0 ���!�& C2, C3, C4 !�% C7 � �(�#�3��0�����&�"��4&���"�(���3� (�0 �4"&�7����I)����"�#�$)������7����(��3�0(�0((�3��7�����85� !�%����4�(<3�3�0$)�&(�� 3 �(<3�3�0 ���!�& C1, C5 !�% C6 (Bruce and West, 1989)

� ��%�����7����(��3�0(�0((�3��7�85���)����(<3�3�0 � �(�%<���0���! � &����� ���!�& �&"�3&(�!3�@���3��0 <���%�&���%4"����7��2��%)0(�20�%�(4�(�@���3��0 �&� ������ (lignin) 3�4(��� (suberin) � �(7����2"��!�=�!��$)���4� 5(��� (Van Huystee and Zheng, 1993) $����l�������7����������7����I��4��5�������> �4< �(�7���� P. infestans ��� (Friend et al., 1973) $�$4�������)��� ��� 5(�� P. botryosa $4������E/0 �������% (47�(� &(� 5(��������5 <��������a����������7�����������85�4��"6@���3��0 � �(����2"��!�=�!��$)���43��0!�%���4��"6� 5(<�2��&$)��/���� 7&"�$4������E/0(&(�!()=�a����������7������������&����� �����5�a����������7����������7����I4(��%��42"�� ������<�2��� (���/4�, 2545) �&����"��4$4���������� ��� 5(�� Microcyclus ulei ���$������6���7����������4(��%��42"�� ������<�2 (Garcia et al., 1995a) �"���5�$4

Page 43: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

28

����������I��4&���"�� 5(�� P. palmivora )������ 24 ��I8� 72 ���"<�� 7����I �"�"����� ��� ��7��$4)���!�%7��$4�&(��(�$4������E/0 BPM-24 (���E/0 ������) ! &$����E/0 RRIM600 (���E/0(&(�!() �4���7����������$�7��$4�&(��&���5� (Rattarasarn, 2003) �(����� �I����% /����"�� 5(��!��" �����% /����"�7��2�� ������4��!@� �=�#�$)�� �7����(��3�0(�0((�3��7�����85� $� �� Ebenus cretia ���I�� ��!��"4&���"���� indolic-3-butyric 7����I����#�$)�����(��="�85� 38��7(�2��(���4���7��2��%)0������ (Syros et al., 2004) Chen !�%26% (2002) ������"&��(�!�� (Copper : Cu) ��E� /(�)������#����(� �� radish ! &I�������4��������=�%��4��5�������> �4< ��� 7&�@�$)����(�/���(�7�%�"� reactive oxygen species (ROS) 38��7����I������� H2O2 �������� &(3��0 �����5�� ��8� (47�(���"����7����(��3�0(�0((�3��7��5� cationic !�% anionic � �($���#���� H2O2 !�%7���������� 4���(<3�3�0�(�(��3�0(�0((�3��7����"��(���4�%��42"�� �������(�� ���"� <�� Mohammadi !�% Kazemi (2002) �4"&� $���=����"7������I����% /����"�� 5(�� Fusarium graminearum �����7����(��3�0(�0((�3��7 (guaiacol-peroxidase) 7��7/�$��&"��5#�������"&��&"�((��"� �&"�7����!�� !�%�&"��"�!�& ���#���4 2&�2"��"&(��"�(�(��3�0(�0((�3��7�=7����I4(��%��42"�� �������(����"7��������"� 2 ( ���"7������E/0 ������ (Sumai # 3 !�% Wang shui-bai) �����7����(��3�0(�0((�3��7����"&����E/0(&(�!( (Falat !�% Golestan)

(��3�0(�0((�3��7�������"��(���4��������7��(�@����!�%@�� jicama (Pachyrizus ersus L. Urban) ��� ����)�"���7)"�� !�%��� ���������(��%���=�3�<�!�%(��������� 38�� �(�(����2"���%����%"�����$�����=4����"!�%��7&� ���%4��!@�7��5#� �� ��4��"6��5"���� !�%�(��)��7��5#� ����������%�4��%!����� �#�$)���2� � �#� <���4"&�(��3�0(�0((�3��7!�%<���b*�(�((�3��7 ��4��"6�����&�"7�����E0��4���7���������� (Aquino-Bolanos !�% Marcado-Silva, 2004) $���5���� (Litchi chinensis Sonn.) 38���4(��3�0��5�7(�$�7&"��(�� (�)/�������&���< =������5� 3 ��5� 2 ( epicarp mesocarp !�% endocarp !7��"&�(��3�0�����&�"��5��2"��7#�2�>$���������7�@�" �#�$)�@������7��5#� �� (Underhill and Critchley, 1995)

�/�(����� (2547) �8���2"��! � &���(��(<3�3�0(�0((�3��7$�$4������E/0 BPM-24, PB235, RRIT 251 !�% RRIM600 ���I����% /����"���� ��$4 �4!I4(�0((�3��7�(<3�3�0���!4&�((��� 2 ��/&� 2 ( ��/&����E/0 ������ ���!�& ���E/0 BPM-24 ��4 PB235 "��2"��"&(��"�(�(��3�0(�0((�3��7���$�����67���"&���/&����7(� 38������/&����E/0(&(�!( ���!�& ���E/0 RRIT251 ��4 RRIM600 �%��6 2-3 �&� � �(�#��� �"�2"��

Page 44: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

29

! � &���(��(<3�3�0(�0((�3��7��"�"�E�(��=�< �<b��3�7!44��&!��71�� (native PAGE) !��"��(�2"��"&(��"�(�(��3�0(�0((�3��7��"� o-dianisidine !�% guaiacol �4 2 �(<3�3�0 (�(<3�3�0 X !�% Y) $��/�2"42/� !�% 3 �(<3�3�0 (�(<3�3�0 X, Y !�% Z) $��/����(� ���(<3�3�0 X �&���5� ���! � &���%)"&�� 2 ��/&� ��&�"2 (�(<3�3�0 X $���/&����E/0 �������%���a!I42"��"&(��"$� #�!)�&����7���"&���/&����E/0(&(�!( � �(!��2"��! � &���(��(<3�3�0��5�8������(<3�3�0 X �(����E/0 ������"&� �(<3�3�0 X1 !�%���E/0(&(�!( ����"&� �(<3�3�0 X2 7&"��(<3�3�0 Z ��5����(<3�3�0�����(��&!��"$��������

1.3.3 � � ��&���GJ&(V)�� "�T�'"W

��� ����(��3�0$)�4��7/�E�t7����I�#����<��(����)������!�� ��2/6����6%������1��!�%��"1���(�(��3�0��� �(����!�� ��)���"�E������5

1.3.3.1 ���!��!�%�#�(��3�0$)�4��7/�E�t <��(����2/67�4� ���������%��� �) ��������!��2&� pH (isoeletric precipitation)

�) ��������!��2&�2"��!��(�((� (change in ionic strength) 2) �����2&�2������(��� ��2 (decrease in dielectric constant)

1.3.3.2 ���!��!�%�#�(��3�0$)�4��7/�E�t <��(����2/67�4� ���������)� (�"�

�) ��b�� ���� (gel filtration) �) (/� ��b�� ���� (ultrafiltration) 2) ��(%��3�7 (dialysis)

1.3.3.3 ���!��!�%�#�(��3�0$)�4��7/�E�t <��(����2/67�4� ������%�/ �) <2���< ����b*!��������%�/ (ion-exchange

chromatography) �) �(<3(��2 ��2<b��73�� (isoelectric focusing)

1.3.3.4 ���!��!�%�#�(��3�0$)�4��7/�E0 <��(����2/67�4� �����2"���#���%

�) <2���< ���b*�#���% (afinity chromatography)

Martínez !�%26% (2008) �8���(��3�0(�0((�3��7$�����!�� <������#�$)�4��7/�E�t4��7&"� ��"�"�E����7���<� ��!��((����7������( �� ��"� Triton X-114 �&"���4"�E���� � %�(���"� (NH4)2SO4 ���2"���������%)"&�� 30-80 (�03=� 0 ���!��<� ����"� Triton X-114 ��� 20 (���3�3��7 7����I!��7�����((��� 2 7&"� !��

Page 45: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

30

<� ������(4�5#�((����<� �������&�(4�5#� (Brodier, 1981), 7���%�(4b*�(��� (Núñez-Delicado et al., 1996; Núñez-Delicado et al., 2003) !�%7���%�(42�(<�b���0 (Sánchez-Ferrer et al., 1989) 1��)������ �"�7(4��"�"�E� SDS-PAGE !��"��(���"� 4-metoxi-α-naftol �4(��3�0(�0((�3��7����!I4���" �#�(��3�0(�0((�3��7!I4�����&�"���8��� Vmax !�% Km (� �($�� ABTS ��7�47 ��) ��2&��&���4 0.495 !�% 1.32 �����<����0 ���#���4 (��3�0(�0((�3��7���!������������!��I����4��5���"� ascorbic acid

Belcerz !�%26% (2007) !��(��3�0(�0((�3��7 ����%)��#��� (spring cabbage) ��"�2(����0 DEAE sepharose CL-6B �"��4(��3�0(�0((�3��7���� cationic !�% anionic �����2"��4��7/�E�t�&���4 143.5 !�% 5.49 �&� ���#���4 ��2&� pH ���)��%7��&���4 7.0 !�% 3.0 ���#���4 pH ���)��%7��(�(��3�0(�0((�3��7�&(�����#�4��7/�E�t �&���4 6.0 �8���2"���� &((/6)1���$��&"� 20-70 (���3�3��7��"�� 20 ���� �4"&�(��3�0(�0((�3��7��5� 2 �(<3�3�0��2"��"&(��"���(/6)1��� 40 (���3�3��7 �(������57����I2�2"��7����I$�����&�a����������I8� 4 7���)0 � �(�=4�"����(/6)1��� 4 (���3�3��7 � �(�#�(��3�0(�0((�3��7���� cationic !�% anionic ���8���2&� Km <��$�� ABTS, o-dianisidine !�% guaiacol �4"&���2&� Km �&���4 0.038, 0.357, 6.41 �����<����0 ��������� cationic !�% 0.0625, 0.286, 13.89 �����<����0 7#�)��4���� anionic ���#���4 7�47 �������2"��)��%7���4(��3�0(�0((�3��7���� cationic ������7/�2 ( pyrogallol 7&"�7�47 �������2"��)��%7�(��3�0(�0((�3��7���� anionic 2 ( o-dianisidine

1.5 � ������,�����,������

�����%��5��� 5(� �(� � 2 ( ����#� (�7&"�$�7&"�)�8���(�� � �&� $4 ��(� ����� � 5(� �( )� (3��0 ����%��5��$�(�)��7��2��%)038���%�(4��"� !�&E� / �5#� �� "� ���� !�%7��2"42/�������> �4< �(������5��� �(��#������%��5��$�71������������ 5(�/�������0!�%$�71�"%���2"42/�7���!"���(����!�& (/6)1��� !7� !�%2"��� 5� 38����5�7&"��(�� ������&�"�%��������> �4< !�%��;���$���!44 &��' �&� ������(� �������� �����(=�4��<( )� (�������/&�3��0�������"&� �!2���7� ���7����I����#�$)������� � ��$)�&���7�4��60�#��"�������

)������7#�2�>�(������%��5��� 5(� �(� �2 ( �(��#�$�71������������ 5(�/�������0��&�"2 (�/���5� (� �(�������������(��(��/�������0 <����5� (�$�����#� ����%����������b(��&�� 5(�����5�7&"�� �!��" ��(����%7&"���� �(�����#� ��"����%��5��$�)�(����(�)� (�"�!��"���4���/(�)��7��2��%)038�����@&������&�� 5(��!��"�&���� �"���%��5��

Page 46: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

31

��5�%I���#� ��"����5��$�)�(���������2"42/�71�"% &��' �&� !7� (/6)1��� $)���� ����� ��� � �(���� ��5�7&"��(�� ��%�����4!�&E� /!�%7��(�)�����(�)��7��2��%)0!�%���> �4< &(� 38��������> �4< �(���5�7&"�� ���57����I2"42/����<������ (�$��7� �(�)��!�%7��2"42/�������> �4< ���)��%7� �&� �(�0<��� � ��5���5�85�(��&��4"� I/�%7�20�(������%��5��"&� �(����$)���5�7&"���5����>���7&"�$� �&� I�� �(����$)����>���7&"��#� ���=7����I�#� �������#�<��$���(�0<��� ���/&��3< �2��� (cytokinin) )�� �(����$)�������(��$���(�0<����/&�((�3�� (auxin) )� ((���%$���(�0<��)���' �����"����

1.5.1 UY�������&�R�V�� ������,�����,��������+

9����7#�2�>�����@� &(2"��7#��=��(������%��5��� 5(� �(� � 2 ( (�)����%��5�� ��5�7&"��(�� �����#�����%��5�� !�%71�"%���$��$������%��5�� <��(�)����%��5����5���9�������7#�2�>(�&������ &(2"��7#��=�$������%��5�� (�)����%��5����������)���7� �$)�� (�$�� �&� 7� � Murashige and Skoog (MS) ��7� �� 5�����������$����4� ����"' � 7� � Vacin and Went (VW) )��%7#�)��4�����%��5�����"����7�/� &��' 7� � Woody Plant Medium (WPM) )��%7#�)��4�����%��5��� ��"����� 5(!�=�<�����"�7� �(�)��)�&���5�%�%�(4���"� E� /(�)��)������� � �(����$�����6��� ���!�&��< ��� (N) b(7b(��7 (P) <�! 73��� (K) E� /(�)���(����� � �(����$�����6�����=���(��&� <4�(� (B) <���4����� (Mo) !������7 (Mn) <24(� 0 (Co) 7���%7� (Zn) �(�!�� (Cu) �(<(��� (I) !�%E� /(�)��( ��' �&� "� ���� ���(%��<�!�%�#5� �� �(������5(���%��7&"��%�(4( ��' �&� 7��2"42/�������> �4< �(�� � )� (�������"&��(�0<��� � )� (7�����E����� �( ��' �&� �#5��%����" ���l���� ���"�)(� 7��7��������7 0 38���%��7���&"��&�������> �4< �(�� ��"�(��&��"�

1.5.2 U �$�+�( ��� ������,�����,��������+

1.5.2.1 ����������E/0� � �����%��5��� 5(� �(7����I�������E/0� �����������E/0��"�"�E�( �������� )� (���������� �2��2�����%��5��� 5(� �(� �7����I�����#��"� ������#��"����(�&���"��=" 7����I@�� �����E/0��� �(�* 38�� �����E/0�������%������6%)� (�����/��%���!�%$)�@�@�� 2/61���� � �)������������9>)�$�����������E/0!44� �! &9��/4���%742"��7#��=�$�����������E/0<��"�E������%��5��� 5(� �(� � �&� ���"���� )���"�" !�%)�&(���l����

Page 47: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

32

1.5.2.2 ���@�� �����E/0���������<�2 � �)��������%��� 5(�"��7!l� �"(��&$��&(�#����� �8��������� &(���@�� ���E/0� ����������<�2 �����5������%��5��7&"��(�����(���������&���&(�#������%7����I����������(��(��"��7)�&���5���� ��� �)����������$���2��2��5���7#��=� �&� ���l���� 7 �(4(��� !�% ���  � 

1.5.2.3 ���@�� 7��7#�2�> � �)�������7����I@�� 7��7#�2�>��� 38��7��7#�2�>)�&���5 �&� 7�� �"�������<�2 7����$��$�(/ 7�)���� 38������#�� �)�&���5����%��5��$�71�"%���2"42/�����%7����I����#�$)�3��0�(�� �@�� 7��$�����6�����������85�

1.5.2.4 ���(�/����0���E/����!�%���!����������E/0� � ������=4�"4�"����E/0� �<�������%��5���"�$��"�!�%4��2�4$)� �4< (�&�����' 38���#�$)�7����I�=4��������E/0� ��"������� �%)���� 5����!�%!����� �(������5���7%�"� &(���!����������E/0� ���4 &���%�����%(��&$��"�!�%������� 5(<�2

1.5.2.5 �����4�/����E/0� � ������#��2��2�����%��5��� 5(� �(� ����%�/� 0$�� �&� ���7����� �<2�<�<3��/����" �������#�$)��������������E/0 ����"�3��0� � (protoplast fusion) !�%���E/"��"�����(�� �

1.5.3 � ������,��!%����

!2���7 )���I8� 3��0���(��&�"��������/&� <����������&����������!�����("��"%)� (� 5(� �(���� &��' !2���7�%�(4��"� 3��0����2�������(�&�����" ������ &��' ��� �����&����&!�&�(� 1��$�3��0��(�03=� 0�(�!"22�"<(�7�� !2���7���3��0��% �"���!�&� ������"&� compact callus I��3��0��%���)�"�' ����"&� friable callus 1��$�3��0�(�!2���77&"�$)>&�%��&����2"� I/����7&"���(�����4"&���7����" ���%��2�(<�b���0 7�)� (����%��!2<����(��0!�%b��<"�(��0 7��&"����%��!(�<��3����� 38��������6!�%�����(���2"� I/�����&�"�85�(��&��4�����(�� � E� /(�)�����$����%��5�� !�%9�������7���!"���(��(������%��5�� <�����%9�����(�!7�

��5�7&"��(�� ��/�7&"�����������"� (��& 7����I����%����#�$)����!2���7��� ����������4"&�7&"����$)�(�03=� 02"��7#��=�7��7/�$�� �$4��5��2�& 2 ( 7&"��(�(�4��<( $4��5�� �#� �� 7&"�$ �$4��5�� !�%��� 7&"�$�� ��"�$4��5������" 2 ( 7&"��(�(�4��<( $4(&(� �(�(&(� !�%��=�������������(������7/�

Page 48: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

33

� 5(� �(( ��' �(�� ����7����I����#�$)����!2���7����=2 ( !2�4��� 2(�0�2 �7� �&(�#�����(�)�� !�%�3�������2��

1.5.3.1 UY�������&�����*�� ���,��!%����

�) 7��2"42/�������> �4< <�����%�(�0<��� � �&� ((�3�� !�%�3< �2��� 38�������;���(�� ��85�(��&��47��7&"��(��(�0<��7(���/&���5 2 ( I��7��7&"��(�((�3�� &(�3< �2���7�� � ��%��;�������� I��7��7&"��(�((�3�� &(�3< �2��� �#��%��;���� �� !�%)��(��&$�7��7&"����������)� (7��/� �=�%��;�����!2���7 �������8���$�)���' � � �4"&� ((�3�����(��&$��&"� 0.01-10.0 ��������� &(�� � !�% �2� �� (�3< �2�������)�8��) 0.1-10.0 ��������� &(�� � ���&"�2"�����������)��%7� &(�����;��!2���7

�) E� /(�)�� �(����E� /(�)�������7&"��%�(4���"' ��(�7� �(�)��!��"�4"&� (�)��7����#��"����(%��<� (��� ���� !(7������ (��0����� ���"��� !�%���������) 23����<����3� �(� 07��� 7��7��������7 0!�%�5#��%����" ��7&"�7#�2�>$������% /��$)����!2���7

2) !)�&��(�2��04(� !)�&�2��04(����7#�2�> 2 ( �5#� �����<27 !�%�5#� ��!322�<�7 2"�������� 2-4 (�03=� 0

�) 9�������7���!"���(� �&� !7� �����%��5��!2���7 �(����2"�����!7� �#�)� (��&$��!7��� (/6)1������)��%7��%��6 25 (���3�3��7 �(������5��� �(�������3((�3���� �(���)��$��(�3��0��"�

1.5.3.2 U �$�+�( ��� ������,��!%����

�) � �(����������E/0� � ��7����I����%����#�$)���� ��� ����������� 5(� �(�(�!2���7

�) � �($��$����@�� <�< ���7 0 !2���7)��%!�&����#��@�� ��<�< ���7 0 ���%�&�� &(����&(�@���3��0 !�%��71���(�� 5((��&!��"

2) � �(���@�� 7��2������ �$�)�(����(� � �4������7����I@�� 7����"2�� 4���������7����I7����#�(��$��$�������!���0)� (���(/ 7�)�������

�) � �(���@�� � ������ �&� �� &(71�����2=� �����5�" �� &((������(�!�%)��" �� ��

Page 49: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

34

�) � �(���@�� � ����E/0 ������ &(71��!"���(����)��%7� �&� ���E/0 ������ &(���&�!��� ����4"��� � !�%���E/0 ������ &(<�2���������� 5(�� !42����� !�%�"��7 �� ��

�) � �(@�� � ������<2�<�<3�)����/� <�����$��7��2��<2���3�� ����#�$)������������/��(�<2�<�<3�

�) � �(�=4��������E/0� �

�=>��� (2549) �#�(���3� ����� P. palmivora ����% /��!2���7���������� (�)/����=�(&(�����������2"�������� 0.5, 1 !�% 2 ��<2����� &(!2���7 1 ���� �4"&�(���3� ��2"�������� 1 ��<2����� &(!2���7 1 ���� 7����I����#�$)�!2���7���E/0 ������ (BPM-24) !�%���E/0(&(�!( (RRIM600) �����)����"�#�$)������7��2��%)072(�(�� ��$�3��07��7/����"�� 18 ���"<��!�%�&(�((����(�3��0����� ����"&� 40 (�03=� 0 ��� 6 ���"<�� &(�� !�%�����7����(��3�0(�0((�3��7$�3��07��7/����"�� 24 !�%�&(�((����(�3��0�����=���(� � �($�� o-dianisidine ��7�47 �� $��6%���� �($�� guaiacol ��7�47 �� (��3�0(�0((�3��7�%�85�7��7/�����"&� o-dianisidine ��7�47 �� �%��6 6 ���"<�� !2���7�����7��2��%)072(�(�� ��!�%(��3�0(�0((�3��7$�����6���!�@�� ���%��42"�� �������(�������� <��!2���7���E/0 ������@�� 72(�(�� ��!�%(��3�0(�0((�3��7$�3��0���7���"&����E/0(&(�!(�%��6 3 �&�!�% 2 �&� ���#���4 !2���77����I (47�(� &(� 5(<�2����&����"��4��=�(&(�!�%$4�(��������

Daayf !�%26% (2003) �4"&��5#���5��� 5(�� Fusarium oxysporum f. sp. albedimis (Foa) 7����I��% /��$)�!2���7��������������%��5��� 5(� �((��@������E/0 ������ (BSTN) �����7%7��b< (�=�3��$�����67���"&�!2���7��0����E/0(&(�!( (JHL) ��� � ��%�����7����(��3�0(�0((�3��7�85���)����(<3�3�0 � �(�%<���0���! � &����� ���!�& �&"�3&(�!3�@���3��0 <���%�&���%4"����7��2��%)0(�20�%�(4�(�@���3��0 �&� ������ 3�4(��� � �(7����2"��!�=�!��$)���4� 5(��� (Van Huystee and Zheng, 1993) $����l�������7����������7����I��4��5�������> �4< �(�� 5(�� P. infestans ��� (Friend et al., 1973) $�$4�������)��� ��� 5(�� P. botryosa $4������E/0 �������% (47�(� &(� 5(��������5 <��������a����������7�����������85�4��"6@���3��0 � �(����2"��!�=�!��$)���43��0!�%���4��"6� 5(<�2��&$)��/���� 7&"�$4������E/0(&(�!()=�a����������7������������&����� �����5�a����������7����������7����I4(��%��42"�� ��� ���<�2��� (���/4�, 2545)

Page 50: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

35

1.5.4 � ���,���J��(! �����

�����5��3��0!�"��(� )���I8� ����#�!2���7$����(� fiable !2���7 ���#������%��5��$�(�)��)�" � 5(� �(���)��%!�&����#�����5��3��0!�"��(� 2 ( !2���7 (friable callus) 38��3��0��% �"���(�&��)�"�' �&�� &(���!��)� (��%���3��0((������� �(������5(��$��7&"��(�$4�=��� ! & �(��#�����&(�� 5(� �(7���&(� <��$��(��3�0�2 ��7 0.25 (�03=� 0 )� ($��7���%���<�!�73�����! ��3��b (potassium dextran sulfate) 2"�������� 1 (�03=� 0

�%<���0�(������5��3��0!�"��(�

1) � �(����8�����%4"����� �4(��38��(�3��0 2) � �(�8�������#�����(�(��3�0 3) � �(�8������!7��((��(���� 4) � �(���@�� 7����"2��4������$�)�(����(� 5) � �(���@�� (=�4��((��0 6) � �(���@�� ���E/0 ������

Egea !�%26% (2001) �#�3��0!�"��(��(�����������E/0 ������!�%(&(�!( ���8������ (47�(� &((���3� (�0 2 ���� 2 ( lyophilized mycelium !�% filtrate �(� P. capsici )������I����% /���4"&�3��0!�"��(�7���� PR-proteins ����)�8�� 2 ((��3�0(�0((�3��7 !�%�����7%7��(������� $����E/0 �������4"&���@���3��0)���85� � �(���������7%7��(�������� �(�(�������4/��/��(�� 5(<�2 ��������85��(�������7�����E0��4��������85��(�(��3�0(�0((�3��7 38���4���%$�7�����E/0 ������ �(������5$�7�����E/0(&(�!(����4 necrosis ��(��"&�7�����E/0 ������ � �(�������E/0 ����������� (47�(�!44 hypersensitive cell death !�%���� �("&� necrosis �������85������&�"���������7%7��(�������

Wang !�%26% (2008) �#� oligochitosan ����% /��3��0!�"��(��(���7�4 � �(�8�������(���� �"(��(�� � @�������(��4"&� � �(��% /����"� oligochitosan ���������67��' �#�$)�3��0!�"��(��(���7�4 �� oligochitosan ���2"�������� 500 ��<2����� &(������� � 7����I��% /��$)�3��0!�"��(� ��$����"<����� 72 I8� 40.6 (�03=� 0 �(�3��0!�"��(� ����6%��� ���(�3��0!�"��(�$�� ��%2������4������ apoptosis $�3��07� "038���#��7�&���)� �"�(��3< ���738�!�%�������"� �"���!�&��(�<2��� ��

Page 51: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

36

oligochitosan ��% /��$)�3��0!�"��(�7���� H2O2 ��7�>>�6�7�&��� ���(�3��0 � �( �(������4��5���� ���(�3��0!�"��(������@�� �(������ H2O2 �8��#������% /��3��0!�"��(�<��$�� �"��% /�� 2 �����&"����2 ( oligochitosan !�% �"��4��5����7%7��(� H2O2 �4"&�3��0!�"��(����I��)����"�#�$)������� ���&���� �8�7�����������"&���� ���(�3��0!�"��(���������������% /����"� oligochitosan ��&����"��(���4���7&�7��>�6�(� H2O2

��ZTU ���%(

1. �8���(�0((�3��7�(<3�3�0$�$4������� 2. �8��� substrate specificity �(�(�0((�3��7�(<3�3�0 � �($�� guaiacol,

syringaldazine, o-dianisidine !�%72(�(�� �� ��7�47 �� 3. ����3��0!�"��(������=�(&(�������� ��7(43��0!�"��(���������"� filtrate

���� 5(�� P. palmivora 4. �8�����������(���� �"(��(�������� ��������% /����"� filtrate ���

P. palmivora

5. ����(�0((�3��7�(<3�3�0���3��0!�"��(�����������I����% /����� filtrate $)�4��7/�E�t4��7&"�

6. �8���2/67�4� ��(�(�0((�3��7�(<3�3�0��� �������

Page 52: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

����� 2

��� �� ������������������

���

�������� 2.1 � ��������� ��������������� ������ ��!"#!���

���������� �� �!���"������ ���#��$%&$��' Acetic acid 60.05 Merck Acetic anhydride 102.09 Merck Acrylamide 71.1 Merck Agar - :��;�<�� Ammonium sulfate 132.14 Merck Ammonium persulfate 228.7 Merck 6-Benzyladenine (BA) 225.3 Sigma Bovine serum albumin 67,000 Sigma Bromophenol blue - Sigma Calcium carbonate 100.09 Fluka Citric acid 210.14 Carlo erba Commassie brilliant blue G250 854.0 Sigma Commassie brilliant blue R250 826.0 Sigma Cupric sulphate-5-hydrate 249.68 Baker 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 221.04 Sigma 3,5-dinitrosalicylic acid 228.19 Fluka chemical 3,3S-Dimetoxybenzidine dichloride (o-dianisidine) 317.2 Sigma Dithiothreitol (DTT) 98.15 Merck Ethanol 46.07 Merck Evans blue 960.82 Sigma Ethylenediaminetetracetic (EDTA) 249.68 Baker Glycine 960.9 Sigma

37

Page 53: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

38

���������� �� �!���"������ ���#��$%&$��'

Hydrogen peroxide (H2O2) 34.02 Sigma

MES hydrate 195.2 Sigma

Methanol 32.04 Carlo Erba

Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) - Sigma

Myo-inositol 180.16 Sigma

Nicotinic acid 123.11 Sigma N,N-methylene bisacrylamide 154.2 Merck N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED) 116.2 Merck O-dianisidine 317.2 Sigma Potatsium acetate 98.15 Merck Potato dextrose agar - Difco Phosphoric acid 98.0 Baker Analyzed Phytagel - Sigma Scopoletin 192.2 Sigma Sephadex G-50 - Sigma Syringaldazine 360.37 Sigma Sodium acetate 136.08 Carlo erba Sodium chloride (NaCl) 58.44 BDH Sodium dodecyl sulfate (SDS) 288.4 Merck Sodium dihudrogen phosphate 157.90 Carlo erba Sodium hydroxide (NaOH) 40.0 BDH Sucrose 342.30 Carlo erba Thidiazuron (TDZ) 220.3 Sigma Tricine 179.18 Fluka Tris (hydroxymethyl) aminomethane 121.1 Merck Thiamine hydrochloride 337.27 Sigma Urae (NH2.CO.NH2) 60.06 Unilab V8 - Campbell Soup

Page 54: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

39

�� ����

1. ��#��]�����<�̂ Olympus CH 40 (Japan) 2. ��#��`a�;�"b Sony cybershot 7.1 �#��c���d� digital (Japan) 3. e:f Duran e��f 0.1, 0.25, 0.5, ��� 1 ���� 4. e:f�c������;�e��f 6 ���d̂ 5. ������̂ PD-10 (Pharmacia) 6. ��� ����������������a� Diethelm model 12909657 (Japan) 7. ��� ����������������a� 8. �#����������#��c������������������� 9. ]������;��� �� (Petri dish) e��f��#�!a�<"�;̂���� 9 ��� 11 �d������� 10. f#����f!a���f 11. �"#b��f�� �� Ehret (Germany) 12. g���f!a���f ����̂ 23 13. b�����b��;�����:��;�: 120 -150 ��������� 14. �������̂ e��f 0.1, 0.25, 1 ��� 2 ���� 15. bh�b���#: e��f 2, 5 ��� 10 ��������� 16. bh�b���#:��fb��; e��f 10 ��������� 17. i��������bh�b� c�#����b e��f 50, 100, 200 ��� 1,000 i�������� 18. ��#��j��ka��� ��f#:;�:��f��i����� (Autoclave SS-320 Tomy Japan) 19. Orbital shaker incubator, Paton scientific model 013422 (South Australia) 20. Centrifuge J2-21 operation, Beckamn (USA) 21. Microcentrifuge 5804 R Eppendorf (Germany) 22. pH meter Cyberscan 1000 (Singapore) 23. Power supply model 1000/500, Biorad (USA) 24. Electoporesis appartatus, ATTA Cooperation (Japan) 25. Shimazu UV-Vis recording spectrophotometer model UV160A (Japan) 26. Spectroofluorophotometer RF-1501 Shimadzu (Japan) 27. Freeze dryer ��� Deep-freeze refrigerator, Sanyo (Japan) 28. UV box, Vilber Lourmat (France)

Page 55: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

40

�����������

2.1 ���*+�#��,�-�����./��� ������/��

2.1.1 ���*+�#����� ���0�� ��-���,����./��� ������/��1�1�0����0�'2��3 �����'������1�������'�

���g�;��c���c��o�^ BPM-24 (c��o�^�#�����) g���;� B, B1, B2-C ��� D f���"b��� 2.1 g��a:����g���f���i�a��f�� ��g�o������� ���fg�i�����]����: ��#:���ff#:;������fg�������a:� 2 �����������a�g�;��c��� 1 ���� ������fb�����f#:; phosphate ��p�p��̂ 20 ����������̂ ��� pH 7.0 b�����f#:; Triton X-100 0.25 �b��̂�dr��^ ��� PVPP 3 �b��̂�dr��^ ��������sc������ ]���������������ff����a�:���d����ph:]̂f#:;�:����r: 12,000 ����a����� ��� 4 ��<��d��d�;� �bt��:�� 15 ���� ���������f�a:�g�ib;#���:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�g�#���c�������bt���������

�"b��� 2.1 �!a�u�c�"b�����;�g�;��c���������ae�����;� A, B, B1, B2, C ��� D (�����: Breton et al., 1997)

2.1.2 ���*+�#��,�-�����./��� ������/�����,%����'�&�&�0���$�-��0��4��� 2 �04��������������'&�����"��'2�����

g�����f�����������]�g�#g�;��c���c��o�^ BPM-24 (c��o�^�#�����) ���c��o� ̂RRIM600 (c��o�^�a����) �f;]���f�� ��g�;���������;��;"a���:a��e��� B2-C stage (Breton et

Page 56: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

41

al., 1997) ��fg�#��e��f 1x1 ��������: ]���:� 50 ���� (�"b��� 2.2) :�������f� ����� �� ��r���:�;a��������� 10 ���� �� ���:��!a��ib 0, 24, 48, 72 ��� 96 ���:��� (�"b��� 2.3) ���������fg�;��c������e#� 2.1.1 ��#:���������f�a:�g�ib;#���:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�

�"b��� 2.2 ��f�������a������fg�;��c���������:����a��x

�"b�� 2.3 ��f������fg�;��c��� e��f 1X1 ��������: �����:�������f� ����� ����#:��r�����:�� 24, 48, 72 ��� 96 ���:��� ������f��

Page 57: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

42

2.1.3 ���*+�#�����6 ��4��'2����'��-��� ������/��.�"/./�� �����1�& guaiacol, syringaldazine, o-dianisidine �����4���'��

�����:]���`�e�����id�̂�b��̂���d��f����if#]����a��e������g��c���������i�f^�]�����r�����p��d�� ���if#�f;f�f�b��:�o�e�� Davis (1964) dj��g�#�]��:���e#�e#� 3 �b��̂�d�� ̂g� Tris-HCI 0.5 �����̂ ��� pH 6.8 �bt��]������� g�#�c���������i�f^�:���e#�e#� 7 �b��̂�d��^ g� Tris-HCI 1.5 �����̂ ��� pH 8.8 �bt��]������a�� ����;��������;�b�������if#]��������f�f;!�������:�;a�� 3 �a:������p�p��̂��:�;a��������� native PAGE 1 �a:� ��p�p��̂��:�;a��b�����f#:; Tris-HCl 0.2 �����̂ pH 6.8, glycerol 40 �b��̂�d��^ ��� bromophenol blue 0.4 �b��̂�dr��^ ����]������g�a�������;��:�;a��g�#��b����y�b����b����y 15 i�������� �a� 1 �a���]� ���������p�p��^���g�#g�����������r�����p��d�� � � Tris-HCl 0.025 �����̂ ����� glycine 0.2 �����̂, pH 8.3 �����ippz� 60 �:��^�a��]� 1 �!a� ��]��� bromophenol blue ��� ������ib]�`j�e���a��e���!a��]� g�#�:�� 3 ���:��� bhf�����ippz� ;#�����b����g��!a��]�f#:; Coomassie brillient blue R-250 , ������� 50 �b��̂�dr��^ ��� ��f��d���� 7.5 �b��̂�d��^ ��� 12 ���:��� ��#:����]�ib�#�������i�a�#��������f#:;�������;!��e�� ������� : ��f��d���� : ���� g�������a:� 5 : 7 : 88 ]���r��`��b������f�]�

�������� 2.2 �a:�b�����e���]�����r�����p��d�����i�a�b���u�c (native PAGE) f�f�b��]��:�o�e�� Laemmli (1970)

2�� ����� Stacking gel (3%) Separating gel (7%)

30% Acrylamide-0.8% bisacrylamide 0.50 ml 3.00 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml - 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 - 3.25 ml 10% Ammonium persulfate 50 µl 200 µl TEMED 10 µl 13 µl Distilled water 3 ml 6 ml Total volume 5 ml 13 ml

Page 58: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

43

2.1.4 ���0&�������2��.�-�����./��� ������/��1��6�P�0!�������0�" �'��"0����Q�"'�"R��/�

����!a��]�����ag��������;���b�����f#:; 1 �b��̂�dr��^ (���������f;b������) e�� guaiacol, H2O2 0.4 �����̂ g� phosphate ��p�p��̂ 10 ����������̂, pH 6.5 b���|���f���}e�����id�̂�b��̂���d��f� g�ey���� o-dianisidine ]���r����f��#� �� ��;#��f#:; o-dianisidine 40 ����������̂, H2O2 0.4 �����̂ g� sodium acetate ��p�p��̂ , pH 5.4 �a:����c��������f�����������e#� ��:]���g�b|�����;����b�����f#:; phosphate ��p�p��̂ 0.05 �����̂, pH 6.5 ����� H2O2 3 ����������̂ ����� ��;#��f#:; syringaldazine b���|����c" g�b|�����;����b�����f#:; syringaldazine 40 ����������̂ ��� H2O2 3 ����������̂ �b��;����;��`�e���b��̂���d��f�i��did�̂���b���| �����:]��i��did�̂�������;:e#������������bz�������:e��;��c���

2.2 ������� ��/����-����06�����Q�2��0��4���

2.2.1 ����������$�������� ������6��� ����!�&����Q�2��0��4���

g�#���rf�a��e��;��c���c��o�^ BPM-24 (�#������a� P. palmivora ) ��;�b����y 6-8 ��bf��^ ����]��!������ (f����f�g��"b��� 2.4) ���!����#������:������ff#:;����b��b��������e#��"#b��f�� �� p��ka��� ������:y!�:���f#:;���]�a�g������~��^ 95 �b��̂�d��^ ��#:��ip �����a���� 1�2 �����]���ag]:a�!�:u�;�������fb��<]���� �� ]���������fc"e��!�����bt���;e������ 2 ��:g���:f��� ��#:���f�����:f#����dj��e:�������;��f�f�� �bhf�b� ��!����]���r����rf�a���"b�a�����e��f��r���f�;"a����� g�#��f!a���f���ka��� ����#:��f�;����rf���]��!� !a���j�����rf�a�����;�:�c ����a����rf����bt� 2 �a:���a� x ��� ��#:!a����rf�����������e:���c ����a����rf����bt� 3 �a:� f������ 1 ���rf�����`��a����if#�bt� 6 �a:� ������rf�����f��a��bt��a:� x ib����;�g������������������ MS-1 (�������� 2.3) :������;�g����� f �����y�u"�� 25 + 2 ��<��d��d�;� (e����������c������;���f�g��"b��� 2.5) �b� ����#����rf]�g�#�:��c�����bt�������u�;g� 3-4 ��bf��^ �� ��if#��������#:]j�������;#�;����;�g����������c���b����y������ MS-2 (�������� 2.3) ��� 4 ��bf��^

Page 59: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

44

�"b��� 2.4 ��f�!��a��;��c�����;�b����y 6-8 ��bf�� ̂u�;�������!������

�"b��� 2.5 ��f�e����������c������;��� ���; ��]���b� ����#����rf�a��;��c��� ���;�������f��e������ ���fc"e��!���� (a), ��a����rf�a������bt� 6 �a:� (b) ��� :������;���������"�� MS-1 (c)

�������� 2.3 ���^b�����e��������"�� MS dj��f�f�b���c ��g�#�c������;����rf�a��;��c���

����� (mg/l) ���� �����

���� ������ (MS-1) �4��� ����� (MS-2) KNO3 1900 1900 NH4NO3 1650 1650 CaCl2.2H2O 322.2 322.2 MgSO4.7H2O 180.7 180.7 KH2PO4 170 170 MnSO4.H2O 16.9 16.9 ZnSO4.7H2O 8.6 8.6 H3BO3 6.2 6.2

a b c

Page 60: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

45

����� (mg/l) ���� �����

���� ������ (MS-1) �4��� ����� (MS-2) KI 0.83 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 Na2EDTA 37.25 37.25 FeSO4.7H2O 27.85 27.85 Thiamine.HCl 0.02 0.02 Pyridoxine.HCl 0.10 0.10 Nicotinic acid 0.10 0.10 Glycine 0.4 0.4 Myo-inositol 100 100 BA 1.0 1.0 2,4-D 1.0 1.0 Sucrose (%) 5 3 Phytagel agar (%) 0.23 0.23 pH 5.7 5.7 (�����: f�f�b��]��b��<����̂, 2538)

2.2.2 ������� ��/����-����06�������

����]��������;#�;����;��bt�]���:� 3 ����� ;#�;�������������� y��a:�ib����;�g���������:�"���������d��^�e:���; :������;������ ����e;a���������bt�:��������:����r: 100 ����a����� �����y�u"�� 26 ± 4 ��<��d��d�;� �bt��:��b����y 2 ��bf��^ ������;#�;ib����;�g������g��a�"���f����� 14 :�� g����;#�;����;��d��^�e:���;g�#�d��^������#���������b����y 0.3 ���� ����;�g������b������ 30 ��������� dj�����]��;"ag�p����^e��f 125 ��������� (�"b��� 2.6) ������:�fb������������d��^ (packed cell volume: PCV)�������;#�;����;�]���� 14 :�� �������:�o����:�f���if#�f;���b�a�;g�#�d��^�������g����f�d����ph:]̂�bt��:�� 2 ���� �� ���d��^���������f��#: �a���a�b������������d��^]������:�fe#�����f ����j�!�����]��������������� y��d��^�e:���; ����a����if#ib�e�;����p�"b�������]���������

Page 61: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

46

�"b��� 2.6 ��f�e���������;#�;����;� �� ��������������������:�x (a) ;#�;��g�������"���������d��^�e:���; (b) �d��^�e:���;����]���]����������bt��:�� 14 :�� (c)

�������� 2.4 ���^b�����e��������"��f�f�b��e�� MS ���g�#�������d��^�e:���;

����� (mg/l) ���� �����

���� ��/����-����0 KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 322.2 MgSO4.7H2O 180.7 KH2PO4 170 MnSO4.H2O 16.9 ZnSO4.7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2EDTA 37.25 FeSO4.7H2O 27.85 Thiamine.HCl 0.02 Pyridoxine.HCl 0.10 Nicotinic acid 0.10 Glycine 0.4 Myo-inositol 100

a b c

Page 62: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

47

����� (mg/l) ���� �����

���� ��/����-����0

2,4-D 1.0 TDZ 0.1 Sucrose (%) 3 pH 5.7 (����� : f�f�b��]����k������b��, 2536)

2.2.3 ���*+�#���6����-�����./��� ������/�� �����1�& o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine �����4���'��� W����'��

����d��^�e:���;g��a:����:a������]��������������������f���e#� 2.1.1��#:���������f�a:�g���<j� ���]��������b���;��b��e�����id�̂�b��̂���d��f� �f;���a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�g�b|�����;����b�����f#:; o-dianisidine 7.88 ����������̂, H2O2 3.3 ����������̂ g� sodium acetate ��p�p��̂ pH 5.4 f"f�� ��������:��;�:�� �� 460 �������� ���:�o�e�� Shannon ����y� (1966) ��#:�b��;����;����b|�����;������ guaiacol 0.67 ����������̂, H2O2 3.3 ����������̂ g� potassium phosphate ��p�p��̂ pH 7.0 dj��f"f�� ��������:��;�:�� �� 470 �������� (Perez et al., 2002) �a:�g�b|�����;����g�# syringaldazine b�����f#:; syringaldazine 0.1 ����������̂, H2O2 1 ����������̂ g���p�p��̂ sodium phosphate ��p�p��̂ 0.05 �����̂, pH 7.4 dj��f"f�� ��������:��;�:�� �� 530 �������� (Quiroga et al., 2000) ��� g�b|�����;����g�#���c������ b�����f#:; ���c������ 0.1 ����������̂, H2O2 1 ����������̂ g� potassium phosphate ��p�p��̂ 0.1 �����̂, pH 6.5 dj��f"f�� ��������:��;�:�� �� 595 �������� ����:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ���� (•OD./min) ��#:����a����if#���e�;����p��f��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�

2.3 ����'��0��� �����0� (filtrate) -�� P. palmivora

2.3.1 ����'��0� P. palmivora 1!&�������Y

P. palmivora if#����:�����������^]��<"�;̂:�]�;;����e�� ���<"�;̂:�]�;;����e��if#�������;�g�#������o�� �f;�����r���:�;a��]���#��g�;��c�������bt����g��a:� ]������!"#:�]�;if#��������:�;a�����������;� P. palmivora g�#������o�� (isolate) �������� �f;��������#������#��d"���b��̂����� �c ��g�#if#�b��̂�f��;: (monospore) ��#:���������;���

Page 63: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

48

����� Potato Dextrose Agar, PDA ;#�;�������f��;:���if#��������� PDA �������� ����]����������;��a�ib��� 1 ��bf�� ̂�����y�u"�� 25 ± 2 ��<��d��d�;� ]j�]������`���ibg�#���if#

2.3.2 ����'��0� filtrate 6�� P. palmivora

��f�������������� P. palmivora (Ø = 0.6 �d�������) ]���:� 1 ��rf�a� 10 ��������� ��g�������"�� Henninger dj��b�����ibf#:; KH2PO4 0.05 �b��̂�d��^, MgSO4.7H2O 0.025 �b��̂�d��^, Asparagine 0.1 �b��̂�d��^, Thiamine 0.0001 �b��̂�d��^, Yeast extract 0.05 �b��̂�d��^ ��� D-Glucose 2.5 �b��̂�d��^ ]���������ib�e;a�g����� f��� 100 ����a����� ��y�u"�� 25 ��<��d��d�;� �bt��:�� 15 :�� P. palmivora ]��a�;x !�������d��������b�����a�� x �����g� filtrate (�"b��� 2.7) �� ����������f�����������#�g;���f#:; vacuum ��� filtrate ib��b����y�b����f#:;:�o����fp��̂f (Bradford, 1976) ��#:��r���������;��� ��i:#�����y�u"�� -20 ��<��d��d�;� �c ��g�#g����<j� ��a�ib

�"b��� 2.7 ��f� P. palmivora �]���g�������"�� Henninger �����y�u"�� 25 ��<��d��d�;� �bt��:�� 15 :��

2.3.3 ���'��6�� �����" �'��1� filtrate

��� filtrate b������ 100 i�������� ���b|�����;�����������;!�����fp��̂f 1 ��������� �e;a�g�#�e#������������i:#�����y�u"���#����� 10 ���� :�f�a����f"f�� ��������:��;�:�� �� 595 �������� ����a����f"f�� ����e�������:�;a��ib�b��;����;�������p����}�� Bovine serum albumin (BSA)

Page 64: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

49

2.3.4 ���'��6��-��-��" �'��'2��3 1� filtrate &�0���� Tricine-SDS-PAGE

�c���������i��^�]����g�#g����<j� ��bt��]�����!a� (slab gel) e��f 7x8 �d������� ��� 0.75 ��������� b�����f#:;�]� 2 �a:� � � �]��a:��� (stacking gel) ���:���"�b����y 2 �d������� ����]��a:��a�� (separating gel) ���:���"�b����y 6 �d������� dj�����a:�b�����e���]�f���������� 2.5

�������� 2.5 �a:�b�����e���]�����r�����p��d������b���u�c (Tricine-SDS-PAGE)

2�� ����� Stacking gel (4%%%%) Separating gel (16.5%%%%) 49.5% Acrylamide-bisacrylamide 0.40 ml 4.33 ml 3.0 M Tris-HCl,pH 8.45+0.3% SDS 1.2 ml 4.33 ml 10% Ammonium persulfate 50 µl 200 µl TEMED 10 µl 13 µl Deionized water 3.34 ml 4.00 ml Total volume 5.0 ml 13.0 ml (�����: f�f�b��]��:�o�e�� Laemmli, 1970)

����������;��:�;a�� (f"u��!�:�) ����������;�b��������}��������:������������ (b�����f#:; Phosphorylase b 97.4 ����f�����, BSA 66.2 ����f�����, Ovalbumin 45.0 ����f�����, Carbonic anhydrase 31.0 ����f�����, Soybean trypsin inhibitor 21.5 ����f�����) g�ag���a���a���]� �������r����p���d��g���p�p��̂ Tris-HCl 0.1 �����̂, Tricine 0.1 �����̂ ��� SDS 0.1 �b��̂�dr��^, pH 8.25 �bhf�����ip����� 30 ���������b�̂ g�#��;��:��b����y 4 ���:��� ��e�� bromophrnol blue ]���� ������ib]��� ��`j�e���a��e���!a��]� (�a��]��e���a��b����y 0.5 �d�������) bhf�����ip�������]���;#��f#:;d���:��̂i�����

Page 65: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

50

2.4 ���*+�#� b���4������!�2�� filtrate -�� P. palmivora ����/����-����00��4���

2.4.1 ����2��/����-����0&�0 filtrate �4���*+�#������-&�-&�-�� filtrate ����!�����4���1�&1��������'2�.

����d��^�e:���;��;� 14 :�� ���a�f#:; filtrate g�#�d��^ 0.5 ���� g� 5 ���������e�� MES hydrate ��b�p��̂ (MES) ���b�����f#:; MES ��p�p��̂ 10 ����������̂, MS 5 �b��̂�d��^ ��� �������d"���� 3 �b��̂�dr��^ �a��d��^�e:���;f#:; filtrate �����f�bt��b�����:� 0.033, 0.075, 0.150 ��� 0.300 i���������a� 1 �����d��^�e:���; �bt��:�� 96 ���:��� ������!������ �����e�����c������f#:;���b�a���� 12 ���:��� �f;���������a��f"u�;g�#��������#�i:����� (�:��;�:�� �� 366 ��������) �� ������:����� 0, 24, 48, 72 ��� 96 ���:��� �;��d��^�e:���;���]�� MES ��p�p��̂ �f;�������!a�����f� ��������̂ 4 ��� MES ��p�p��̂ib��:]:�f������������^���c������ �c �����:���e#�e#�e�� filtrate ����������� ������`������g�#�d��^�e:���;��������������^���c��������������f �������g�#g�����f����a�ib

2.4.2 ����2��/����-����0&�0 filtrate �4���*+�#���.���� c�����'�����-��4��

:�o�����f�����a��f�;:���e#� 2.4.1 ��a�a��d��^�e:���;f#:; filtrate ����:���e#�e#����f������f]��e#� 2.4.1 � � 0.300 i���������a� 1 �����d��^�e:���; (�:���e#�e#����g�#�a����c�������"���f) �� ��`j��:����������f � � 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 ��� 104 ���:��� ����d��^�e:���;������!a�����f� ��������̂ 4 �c ���;��d��^�e:���;���]�� MES ��p�p��̂ �c �����ib<j� �������������^���c���������b�a�;��g� MES ��p�p��̂������id�̂�b��̂���d��f�g��d��^�e:���;�a�ib

2.4.3 �����������0����/����-����0

����d��^�e:���;���!a������a�g�e#� 2.4.2 �����fg� Sodium Phosphate ��p�p��̂ 0.1 �����̂ pH 7.0 ����� PVP 3 �b��̂�dr��^ ��� Triton-X100 0.25 �b��̂�dr��^ g�������a:� 1 : 1 ]���������ib�d����ph:]̂f#:;�:����r: 12,000 ����a����� ��� 4 ��<��d��d�;� ��� 20 ���� ���������f�a:�g�ib��b����y�b����f#:;:�o����fp��̂f ��r�������fi:#�����y�u"�� -20 ��<��d��d�;� �c ��g�#g����<j� ��a�ib

Page 66: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

51

2.4.4 ���*+�#�����������!���4���'��

��� MES ��p�p��̂ ]������f����d��^�e:���;���d����ph:]̂f#:;�:����r: 8,000 ����a����� �bt��:�� 5 ���� ��#:������f����a�:��:�f�a������ �����f#:;��� ��� spectrofluorometer ����:��;�:�� �������#� (λ excitation) 340 �������� ����:��;�:�� ��b�fb�a�; (λ emission) 440 �������� �b��;����;�b����y����:��g�������������^���c������

2.4.5 ���*+�#�����������!� PR-proteins (���./��� ������/��) �����1�& o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine �����4���'��� W����'��

���������f]���d��^�e:���;���!a������a�f#:; filtrate ��<j� ���i����bz�������:���e��c � �f������a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f����e#� 2.2.3 �f;g�# o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine ������c�������bt��������� ]����������:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ���� (•OD./min) ��#:����a����if#���e�;����p��f��:��:a��i:e�����id�^�b��̂���d��f�

2.5 ���� ����./��� ������/��1!&�������Y���2��

2.5.1 ����2��/����-����0�4����'��0�� ����./��� ������/�� �������Y���2��

g�#�:���e#�e#�e�� filtrate ���g�#�a���������#����c�������"���f]�� 2.4.1 ]j�g�#�:���e#�e#�f����a�:g���������#��d��^�e:���;b����y 43 ���� ��r��d��^�e:���;��� 80 ���:��� ��#:��������f���e#� 2.1.1 g�������a:�������f 1 ����������a��d��^�e:���;;��c��� 1 ���� ��#:���ib���g�#������o���a�ib

2.5.2 ���� ����./��� ������/��1!&�������Y���2��"0$2��������� ion exchange ��� anionic

���������f]���d��^�e:���;]��e#� 2.5.1 ��b������ 100 ��������� ib��������b����f#:; (NH4)2 SO4 �:��������: 80 �b��̂�dr��^ ����;����f#:; phosphate ��p�p��̂ 0.02 �����̂ pH 7.0 b������ 6 ��������� ���������f���if#ib!a��������̂ PD-10 (���]�f��� ����) ����!a�� PD-10 b������]��c���ej���bt� 12 ��������� ����������;���if#ib��

Page 67: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

52

������̂ DEAE-sepharose CL-6B (ion exchange) b������������̂ 20 ��������� ��������̂�f;g�#�:���e#�e#�e�� NaCl 0.05 - 0.1 �����̂ g� phosphate ��p�p��̂ 20 ����������̂ pH 7.0 ��������i�� 0.5 ����������a����� ��r����f�� 3 ���������

2.5.3 ���'��6!�" �'��!���$2��������� DEAE-sephrose

����]��!a��������̂ DEAE-sepharose ����������;���if#���x 2 ���f��:�fb����y�b���� �f;����������; 100 i�������� ���b|�����;�����������;���fp��̂f 1 ��������� �e;a�g�#�e#������������i:#�����y�u"���#����� 10 ���� :�f�a����f"f�� ��������:��;�:�� �� 595 �������� ����a����f"f�� ����e�������:�;a��ib�b��;����;�������p����}�� BSA

2.5.4 ����������2��.�-�����./��� ������/��!���6��$2��������� ion exchange ��� anionic

����������;���if#����]��!a��������̂ DEAE-sepharose ���x 2 ���f��:�f���id�̂�b��̂���d��f�g�b|�����;����b�����f#:; o-dianisidine 7.88 ����������̂, H2O2 3.3 ����������̂ g� sodium acetate, pH 5.4 f"f�� ��������:��;�:�� �� 460 �������� ]����������:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ���� (•OD./min) ����a����if#���e�;����p�b��;����;��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f� dj��`"������������:���e#�e#��a��x e����� �

2.5.5 ���'��6!�� ������/��.�"/./��&�0������Q�"'�"R��/����.�2� ��P�4 (native PAGE) &�0������� Ion exchange ��� anionic

�����:]�����id�̂�b��̂���d��f�i��di��̂ ���if#�f;������;�fc�����if#]�����:�f���if#]��e#� 2.5.4 dj��c�:a���;�fc��]����������#�f#:; filtrate ����:���e#�e#� NaCl 0.07, 0.08 ��� 0.09 M ���;��b����f#:;:�o� native PAGE ������;#���:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f� �f;g�# o-dianisidine �bt��������� g�b|�����;����b�����f#:; sodium acetate ��b�p��̂ 0.05 �����̂, pH 5.4, o-dianisidine 40 ����������̂ ��� H2O2 0.4 �����̂ ��a�!a��]�g��������;��� 10 ���� b�����`��b����e�����id�^�b��̂���d��f��bt����f�-�#� �b��;����;��`�e�����id�̂�b��̂���d��f����b����

Page 68: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

53

2.6 ���*+�#�������'�-�����./��� ������/��

2.6.1 Km, Vmax -���'2�����'��

���;�fc��e�����id�̂�b��̂���d��f�g���f�f��������a� Km ��� Vmax e�����id�̂�b��̂���d��f���:]:�fg��a:��:���e#�e#� 0-1 ����������̂ e�� o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine ������c������ g�b|�����;������ H2O2 (3.3, 3.3, 1.0 ��� 1.0 ����������̂) :�f�a����f"f�� ��������:��;�:�� �� 460, 470, 530 ��� 595 �������� ������f�� ����a� Vmax ��� Km ���if#���e�;����p Lineweaver-Burk ����"��

2.6.2 ���*+�#��2� pH ����!�������������'����� pH '2��3 -�����./��� ������/��

]��e#� 2.6.1 c�:a���������������a� catalytic power (Vmax/Km) ���������������f� � o-dianisidine <j� ��a� pH �������������if#�f;������id�̂�b��̂���d��f�ib:�f�:��:a��i:g�b|�����;����b�����f#:; o-dianisidine 7.88 ����������̂, H2O2 3.3 ����������̂ g� pH ����}�� ��� pH 2-10 :�ff"f�� ��������:��;�:�� �� 460 ��������

������id�̂�b��̂���d��f�ib�a���� pH 2-10 �����y�u"���#�� �bt��:�� 1 ���:��� ����]������b��� pH e�����id�̂�b��̂���d��f��bt� 5.4 ��#:������id�̂�b��̂���d��f���:�f�:��:a��i:�f;g�# o-dianisidine �bt��������� g�b|�����;����b�����f#:; o-dianisidine 7.88 ����������̂, H2O2 3.3 ����������̂ g� sodium acetate, pH 5.4 f"f�� ��������:��;�:�� �� 460 ��������

����:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ���� (•OD./min) ����a����if#���e�;����p��f��:�����c��o^�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f���� pH �a��x

2.6.3 ���*+�#�������'��������!P%��'2��3 -�����./��� ������/��

��:]:�f�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�����]���a������y�u"���a��x �f;g�# o-dianisidine �bt��������� ������id�̂�b��̂���d��f�ib�a������y�u"�� 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ��� 80 ��<��d��d�;� ��� pH 7.0 �bt��:�� 30 ���� ��#:�����b�����y�u"���f;�����ag�����������er��a�����ib:�f�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f� ����:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ����

Page 69: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

54

(•OD./min) ����a����if#���e�;����p��f��:�����c��o^�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f������y�u"���a��x

2.6.4 ���*+�#�$�-��������'2����'���'��-�����./��� ������/��

������id�̂�b��̂���d��f�ib�a�g� 1 ����������̂ e����:;��;����a����� if#��a EDTA, CuSO4, NaN3, ascorbic acid, NaCl, citric acid, β-Me, salicylic acid, SDS ��� dithiothreitol (DTT) �����y�u"���#�� �bt��:�� 5 ���� ��#:���ib:�f�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f� �f;g�# o-dianisidine �bt��������� ����:y�b��̂�dr���̂��;��;����f;g�#�"��

% Inhibition = 100 (Ac-Ai) Ac Ac = �:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f����i�a����:;��;��� Ai = �:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��������:;��;���

����:y�a��:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f��bt��a����f"f�� ��������b���;��b��ib�a� 1 ���� (•OD./min) ����a����if#���e�;����p��f��:�����c��o^�:��:a��i:e�����id�̂�b��̂���d��f�

Page 70: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

����� 3

������ ����������

3.1 ���������� �� �� !��" �� ���#$�$�%�&�

3.1.1 ���������� �� �� !��" �� ���#$�$�%���%�'(�) �!*� !��'���+*, $�-��!+'�

������������������� �� BPM-24 (��� ���������) ��� B, B1, B2-C !� D ��#$%�&'���() !�*+$�(),#-./�� ��+#��( (�01�&' 3.1) +�4��))�% phosphate ��<,</��20 +(!!(>+!���, pH 7.0 �&'+& Triton X-100 0.25 ,1/��,GH��� !� PVPP 3 ,1/��,GH��� !�%���4��4��)���*1 � J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 )�%%( & native PAGE !��/+P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)�#�4P/�/!(�(� !� guaiacol ,1U�4��4,��� ��%$�+& J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4#�()/�G()(� �����#$%�&'*+$�(),#-./ 1��+�V 4 J� (�01�&' 3.2 !� �01�&' 3.3 ��+!��)��) �������� B ��,WH� J��&' 1 J�,)&% >)��,WH� J��&' 3 !� 4 ,�('+KX.������ B1, B2-C !� D �$���� J��&' 2 ����� D ,�$���.� >1��&���. 4 J��&'���� �$!������,WH�#�),��,+-'/���+&P%�+ �$+��KX.���+!��)�� �/�����&. J��&' 1 �&'������� D ,P!-'/��&'*)�,�H%�%$����/-'� !�/���#� J��&.�/�P%�+/$/� �$K/�������*)�

J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�����������#$%�&'�(),#-./�� ��+#��(��.�,WH�#�),��,�& 2 J� P-/ J��&' 1 !� 2 !�,WH�#�),����+P%�+ �$K/��� ,+-'/�/+)�% guaiacol GX',1U�4��4,����&',�&'%K�/������4���!(��(���,WH� J��&' 1 #�)�%$� J��&' 2 (�01�&' 3.3) ��KV��&'�/+)�%4P/�/!(�(���,WH� J��&' 2 #�),���%$� (�01�&' 3.2) >)��%$� J��&' 3 !� 4 ������(),#-./����W�*1,+-'/,�&�������������&'*+$�(),#-./ ,�-'/�����KV��&'��������(),#-./��W�)���4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4 J��&' 3 !� 4 !�/W�-//��,1!&'�>P�4������ J��&' 3 !� 4 *1,1U� J��&' 2 �&',P!-'/��&'*)�#��! 4��4��)������������&'�(),#-./+& J��&' 2 #�),��KX.� GX'�$�/�%$� J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 J��&' 2 +&P%�+,�&'%K�/,�&'%K�/������1Z/���>�PK/����� �/�����&.��W%$����,��([,�(�>�K/��������� J��&' 1 #�)KX.� !��/+�() guaiacol /��,1U�*1*)�%$� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4)��!$�%,�&'%K�/������4���!(��(�,�-'/4���P%�+ KH ��W�����������

55

Page 71: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

56

�01�&' 3.1 4)������������ B, B1, B2-C !� D ������&'*+$�(),#-./

�01�&' 3.2 4) J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4������������ �� BPM-24 ,+-'/�/+)�%4P/�/!(�(� #$%��*+$�(),#-./ (a) !� #$%���(),#-./ (b) ������,��([,�(�>� B, B1, B2-C !� D

1

2

3 4

B B1 B2-C D B B1 B2-C D

a b

Page 72: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

57

�01�&' 3.3 4) J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4������������ �� BPM-24 ,+-'/�/+)�% guaiacol #$%��*+$�(),#-./ (a) !� #$%���(),#-./ (b) ������,��([,�(�>� B, B1, B2-C !� D

3.1.2 ���������� �� �� !��" �� ���#����6��'78�9�%��:$;8��������$�$�%�&� 2 #%&<�-7����!�=�!'8���9�='(�<�

,+-'/������������� �� BPM-24 (��� ���������) !���� �� RRIM600 (��� ��/$/� /) +�����W�,�()��) `! >)��)�W�+&K��) 1 x 1 �����(.% !�%%������)�b��/#-.�,1U�,%!� 0 (#�)P%�P�+), 24, 48, 72 !� 96 #�'%>+ ��+!��)�� �����.���%�4/� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 )�%%( & native PAGE >)�#�4P/�/!(�(�,1U�4��4,��� ��%$���#�)�)!/�&'����������4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4)�%�������W�,�()��) `! 1���e J�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4#�()/�G()(� 4 J� ,+-'/,�&����#�)P%�P�+GX'1���e,�& 3 J� (1, 3 !� 4) ,+-'/,%!�`$��*1 J��&' 3 !� 4 ��P$/f ��W�*1 J�P%�+%$/*%�&'J0�4���KX.��W+$ ( J��&' 2) �$���J0������������������W�,�()��) `! P%�+,K�+K/ J��&' 2 ��4���� �� BPM-24 �/+�()*)�#�),����. �$#�'%>+�&' 24 ��KV��&'��� �� RRIM600 ,WH�#�),���&' 72 #�'%>+ �/�����&. J��&' 2 ����� �� BPM-24 �()4&,K�+�%$������ �� RRIM600 4)%$���� �� BPM-24 �/�4�/�$/���,�()��) `!*)��%),�H% !�+&1�(+�V40�%$� !���%$� J��&' 1 K/���������� �� BPM-24 ,P!-'/��&'*)�#���%$�K/��� �� RRIM600 (�01�&' 3.4) �X/���#�*/>G*G+��&.�$�/�4���� ��K/�����*)�

1

2

3 4

B B1 B2-C D B B1 B2-C D

Page 73: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

58

!��bV� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'J0�4���KX.��W+$ ( J��&' 2) !� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'W�*1 ( J��&' 3 !� 4) ������J0��������>)�������W�,�()��) `!,1U�*1��!��bV�,)&%�������#$%�&'�(),#-./�� ��+#��( 4)%$� J��&' 2 �&',�()����������W�,�()��) `!���������,�&'%K�/�������������>�P

�/����,/�*G+�,1/��//�G(,)4 4�+��J ���)��P%�+�������>�P�������*)� !�% ���-##�()/-'�*)�+&����*%�)�%,#$���� ,#$� ,+!H)K��%4�!&��� ��������� (Suma # 3 !� Wang shui-bai) �&'J0��������)�%,#-./�� Fusarium graminearum +&���4���,/�*G+�,1/��//�G(,)440KX.� ������&'+&���4����.���+ ���//��% ���4��� 1Z !����,�H�,�&'% ��+!��)�� !�+&P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)440�%$���� ��/$/� / (Falat !� Golestan) (Mohamammadi and Kazemi, 2002)

Jung !�PV� (2002) �#�,#-./�� Phytophthora capsici ��������W�4���*/>G*G+��W+$ f ������(�*� ,+-'/�/+P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��1���e*/>G*G+� 3 J�>)+& 1 J�W!�� K��)>+,!��! 53 �(>!)�!)�� !� 2 J��/ K��)>+,!��! 45 !� 114 �(>!)�!)�� ,+-'/�������(�*�+��$+)�%,#-./ P. capsici �$%+���,#-./1e(1p�b� P-/ Paenibacillus illinoinensis 1���e,�& 2 J� �&'+&K��)>+,!��! 53 !� 114 �(>!)�!)�� �X4��1*)�%$�*/>G*G+�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4K��)>+,!��! 45 �(>!)�!)�� J0�,W�&'%����W�4���KX.�/$��%),�H%,+-'/��(�*��(),#-./ 4)%$� J�P%�+%$/*%�&.,�&'%K�/������1Z/���>�P

�������)!/K/��� �%q�& (2547) *)�qX�b�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�� P!!�4K/����� ,+-'/�������)�%/(!(G(�(� !�G0>/41/��K/,#-./�� P. palmivora ��%$� /(!(G(�(� ����������4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4*)�,�H%�%$�G0>/41/�� ,�-'/���/(!(G(�(�,1U�4���&'+����,#-./��+&>+,!��!K��),!H� �X ���,K��40$,G!!� P!!�4*)�$��%$����,���K/G0>/41/�� >)��%$� P!!�4�������� �� GT1 (��� ���������) 4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4 *)�+���%$���� �� RRIM600 (��� ��/$/� /) 1��+�V 6 ,�$� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�� P!!�4 !����1���e J�P%�+%$/*%�&',W+-/���� �/�����&.���4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4,�-'/�������������������,#-./>�P�H,1U��!*�W�X'�����1Z/���>�P �X4�+��J�#�1�(+�V,/�*G+�,1/��//�G(,)4�/���)��P%�+�������>�P*)�)�%

���/�+�!& (2547) qX�b�P%�+ ���$�K/*/>G*G+�,1/��//�G(,)4�������� �� BPM-24, PB235, RRIT251 !� RRIM600 �&'J0��������)�%�����)�� �$,1/��//�G(,)4*/>G*G+�*)�,1U� 2 �!�$+ P-/ �!�$+��� ��������� *)� �$ ��� �� BPM-24 ��� PB235 %�)P%�+

Page 74: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

59

%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4*)���1�(+�V40�%$��!�$+�&'4/ GX',1U��!�$+��� ��/$/� / *)� �$ ��� �� RRIT251 ��� RRIM600 1��+�V 2-3 ,�$�,+-'/���+���%�P%�+ ���$�K/*/>G*G+�,1/��//�G(,)4 )�%%( &/(,!H�>��><�(G&4 ��*+$ 1!4r�� (native PAGE) !�%�/+P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4)�% o-dianisidine !� guaiacol �� 2 */>G*G+� (*/>G*G+� X !� Y) ��#�)P%�P�+ !� 3 */>G*G+� (*/>G*G+� X, Y !� Z) ��#�)�)!/ +&*/>G*G+� X ,�$���.� �&' ���$���W%$� 2 �!�$+ �!$�%P-/*/>G*G+� X ���!�$+��� �����������1���e J�P%�+%$/*%����� W�$�&'40�%$��!�$+��� ��/$/� / ,�-'/ �P%�+ ���$�K/*/>G*G+��&.�X,�&�*/>G*G+� X K/��� ���������%$� */>G*G+� X1 !�K/��� ��/$/� / ,�&�%$� */>G*G+� X2

�01�&' 3.4 4) native PAGE K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ������������� �� BPM-24 (a) !� RRIM600 (b) �/+)�%4P/�/!(�(� #$/�&' 1 : #�)P%�P�+ #$/�&' 2, 3, 4 !� 5 : 4��4��)������&'����W�,�()��) `! !�%������)�b��/#-.�,1U�,%!� 24, 48, 72 !� 96 #�'%>+ ��+!��)��

3.1.2 ������=�!�:�&�'( #<�#�'��� ��" �� ���#� 9 � !� �!*� $+8 guaiacol, syringaldazine, o-dianisidine ���#= & ��'�� �"L�#<�#�'��

��������4���� �� BPM-24 GX'�/�4�/*)�)&�%$���� �� RRIM600 +�qX�b�P%�+���,����$/4��4,���>)������+�����W�,�()��) `! !�%%������)�b��/#-.�,1U�,%!� 0 (#�)P%�P�+) !� 24 #�'%>+ �����.���%�4/� /P�(%(�&.)�%%( & native PAGE

Page 75: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

60

>)�#� guaiacol, syringaldazine, o-dianisidine !�4P/�/!(�(�,1U�4��4,��� GX' �$!���%���$�/�����%����1Z/���>�P�&',�&'%K�/ �!$�%P-/ guaiacol !� syringaldazine �#���%�4/�*/>G*G+��&'���W����&',�&'%�������%����4�,P���W�!(��(�,�-'/4���P%�+ KH � �$`��,G!!� ,���� guaiacol !� syringaldazine +&>P�4���P!����� coniferyl alcohol !� sinapyl alcohol GX',1U�4����.��������4��� guaiacyl lignin !� syringyl lignin ��+!��)�� ����#� 4P/�/!(�(�,1U�4��4,��� ,�-'/qX�b�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'���W����&'//�G(*)G� 4P/�/!(�(��W��!�,1U�4��1���/�+&4&�&'*+$!�!��.�� (Gutierrez et al., 1994) ,�-'/��������4���4P/�/!(�(�KX.�+������),#-./�&',K��+�!��!�+ ��KV�,)&%����-#�H+&%( &��������)4��#�()�&. ,�-'/1Z/���P%�+,4&W�r���,G!!�)�% )���.�4P/�/!(�(��#�,1U�4��4,���,�-'/��%�4/�*/>G*G+��&'���W����&'�����)��.4P/�/!(�(� !� H2O2 r���,G!!� 4$%� o-dianisidine ���W����&'//�G(*)G� H2O2 ,1U�W!�� ����01�&' 3.5 J��&' 1 4�+��J�/+�()*)����4��4,��� GX',1U�*/>G*G+��&'+&/0$ !�%��������� !��$���,�&'%K�/���!(��(� ,�-'/����/+�()*)�/$����,������ guaiacol !� syringaldazine �$���� J��&' 2 GX'J0��������������,�()��) `!����������/+�() o-dianisidine !�4P/�/!(�(� ,1U�W!�� !��/+�() guaiacol ,!H���/ J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 J��&.,�&'%K�/������4!� 4P/�/!(�(� !�4���!(��(�#�() guaiacyl lignin !�,1U� J��&',�&'%K�/������1Z/���>�P 4$%� J��&' 3 !� 4 4�+��J�/+�()*)���. syringaldazine, o-dianisidine !�4P/�/!(�(� �$4�,��*)�%$�+&P%�+���,������ syringaldazine ,�-'/����/+�()4&*)�/$����,������ syringaldazine +���&'4�) GX',1U�*/>G*G+��&'+&/0$ !�%��������� !��$���,�&'%K�/���!(��(��!�$+ syringyl lignin ,�&/$�,)&%

���/�+�!& (2547) ��%�4/�,1/��//�G(,)4*/>G*G+��&',�&'%K�/�������������>�PK/����� W!����J0��������)�%G0>/41/�� ��%���P%�+%$/*%*)� 3 */>G*G+� (X, Y !� Z) GX'+&*/>G*G+� Y ,�$���.� �&',�&'%K�/�������������>�P >)�����W����&'>�!(,+/��*�G�>+>�!(��/!�W�,1U�!(��(�#�()�$�f ��� !�*/>G*G+� Y 4�+��J�/+�()P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4)�%4��4,���W!�#�() *)� �$ o-dianisidine, guaiacol, 4P/�/!(�(�, coniferyl alcohol !� syringaldazine

Page 76: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

61

�01�&' 3.5 4) native PAGE K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4������������� �� BPM-24 ,+-'/�/+)�%4��4,����$�f #$/�&' 1, 3 5 !� 7: #�)P%�P�+ #$/�&' 2, 4, 6 !� 8: 4��4��)������&'����W�,�()��) `! !�%������)�b��/#-.�,1U�,%!� 24 #�'%>+ �/+)�% guaiacol (#$/ 1 !� 2) syringaldazine (#$/ 3 !� 4) o-dianisidine (#$/ 5 !� 6) !�4P/�/!(�(� (#$/ 7 !� 8) ��+!��)��

3.1.3 �������" �� ���#� 9 � !�$�$����� �������� %%�&�

,+-'/������������� �� BPM-24 +�����W�,�()��) `! !�%%������)�b��/#-.�,1U�,%!� 0 (#�)P%�P�+) !� 24 #�'%>+ ,1�&�,�&����4��4��)���,G!!� K%�!/ �&'�$+)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ �&' 0 !� 80 #�'%>+ GX',1U�P%�+,K�+K���&',W+��4+ ��+����)!/K�/ 3.4.1 !�%��%�4/�*/>G*G+����4��4��)������� 1���e%$�+& 4 J� (1, 2, 3 !� 4) >)�� J�P%�+%$/*%�&'J0�4���KX.��W+$,1U� J��&' 2 4)%$�J0��������������,�()��) `! ��KV��&'��,G!!� K%�!/1���e,�& J�,)&% GX',P!-'/��&'*)���!�,P&��� J��&' 2 ��������� !�,+-'/�������$+,G!!� K%�!/)�% filtrate ,1U�,%!� 80 #�'%>+ 1�(+�V,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ( J��&' 2) ��,G!!� K%�!/+&1�(+�V40KX.� !��$���,�&'%K�/�������������>�P,����J0��������)�% filtrate

Page 77: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

62

���,#-./�� ����&'�� J�*/>G*G+��&' 2 ��,G!!� K%�!/��. �$ ����.�/��,�-'/+�������J0��������>)���,K$�,G!!���/�W���!/),%!�

�01�&' 3.6 4) native PAGE K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4������ !�,G!!� K%�!/�������� �� BPM-24 �/+)�%4P/�/!(�(�

#$/�&' 1 : #�)P%�P�+��������� #$/�&' 2 : 4��4��)������&'����W�,�()��) `! !�%������)�b��/#-.�,1U�

,%!� 24 #�'%>+ #$/�&' 3 : #�)P%�P�+��,G!!� K%�!/ #$/�&' 4 : ,G!!� K%�!/�&'�$+)�% filtrate ,1U�,%!� 80 #�'%>+

3.2 �+<�:� �������� %��"�* ;78!�!�M� ( �%�&�

3.2.1 ���+<�:$;8����=��<#��"�* ;78!�!�M�

,+!H)/$/��������� �� BPM-24 �&'+&/��1��+�V 6y8 4�1)�W� 4�+��J#������W�,�() P!!�4*)�>)������+�%�,!&.��/�W�� MS �$%+��� 2,4-D !� BA �&'P%�+,K�+K��,�$����P-/ 1 +(!!(���+�$/!(�� r�������%�,!&.�&'/�VWr0+( 26±2 /q�,G!,G&4 ���&'+-),1U�,%!� 4 4�1)�W� P!!�4�&'*)�+&!��bV�<0 4&,W!-//$/� !�,������W!%+f (friable callus) ,!-/��#� P!!�4��#$%/��1��+�V 3 4�1)�W�W!������,!&. 3 P��. 4��W���,��&+,G!!� K%�!/ !��#�,1U�%��J�)(������qX�b�1e(�(�(�����/�4�/�$�f �������

Page 78: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

63

>)��'%*1���#����� P!!�4 !����,���,!&.,�-./,-'/1��4�P%�+4��,�H��H�$/,+-'/���#(.�4$%��-#�&'+&�(����+,�-./,-'/,��([+�������,���,!&. `!������&'��{��+����W�X' �$�*+$JX���4���� �$1���/�)�%,�-./,-'/,��([�&'+&�(����+��� �$,G!!�40 /$�*��H��+4$%��&'+&q��r��40 !�1��4�`!4��,�H������,���,!&. P-/ ,1!-/�W��+,+!H) (4+1/, 2539)

�01�&' 3.7 4) P!!�4���,1!-/�W��+,+!H)/$/������/��1��+�V 4 4�1)�W� W!������,!&. P��.�&' 3

3.2.2 ���+<�:� �������� %��=��<#

���#�����,G!!� K%�!/���>)����� P!!�4�&'+&!��bV� friable *1,!&.��/�W��,W!% !�%,K$�,!&.��4r�%��&',W+��4+ P!!�4�����+&4/1��,r� ,#$�,)&%��� P!!�4�-#/-'�f P-/ P!!�4�&'+&!��bV�,������ �$� ,+-'/��*1,!&.��/�W��,W!% !�%,K$�,!&.*+$4�+��J#�����,G!!� K%�!/*)� P!!�4��,1!&'�,1U�4&�.����! !������&'4�) 4$%� P!!�4/&�1��,r�W�X'P-/ P!!�4�&',������W!%+f ,+-'/�� P!!�41��,r��&.*1,!&.��/�W��,W!% !�%,K$�,!&.4�+��J#�����,G!!� K%�!/*)� (4+1/, 2539) ,G!!� K%�!/�����4�+��J#�����*)���� P!!�4�&',���,!&.���#(.�4$%��$�f K/�-# ,#$� P!!�4���/��!�//,�4� (��+�!� !� 4+1/, 2542) !����,1!-/�W��+,+!H)/$/� (Te-chato and Chartikul, 1993b; Sushamakumari et al., 2000) ,1U����

�������K/ ,�H[+�q (2549) #�����,G!!� K%�!/������*+$4�+��J,�('+1�(+�V*)�+����� !�,G!!� K%�!/�&'*)�+&!��bV�,����!�$+���,1U��!�$+��/� ��.�&.

Page 79: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

64

/��,�-'/+����,!&.,G!!���/�W�� MS �&',�(+~/��>+�#�() 2,4-D ��� BA `0�%(���X��� P!!�4*1,!&.��/�W��40��#�����,G!!� K%�!/�&',1!&'�#�()K/~/��>+���� BA ,1U� TDZ ~/��>+�#�() TDZ +&`!��������(����+K/*G>�*P�(�>)���W����&',1U�4��P%�P�+���,��([,�(�>�K/�-#�&'4$,4�(+���,��([,�(�>� ���������� �$,G!!� ��� ����K�� !�#�!/���,4-'/+ TDZ +&`!,�('+���4�4+*///�K/ ���/�W����/$� !�4��,+���/*!��GX'1���/�)�%>��!&� !���) /�*G4(� ��*�>�>G+ !�>�!&>G+����%�+����*G>��!�4GX+ ����W����4�,P���W�>1��&� !��(����+r���,G!!�,�()KX.�+�� (Chvojka et al., 1992 !� Huetteman and Preece, 1993; /��>) r�V��q� !�4+1/, 2546)

`0�%(��,!&.,G!!� K%�!/������������ MS ��� � 2,4-D P%�+,K�+K�� 1 +(!!(���+�$/!(�� TDZ P%�+,K�+K�� 0.1 +(!!(���+�$/!(�� !�G0>P�4 3 ,1/��,GH��� %�,!&.��,P�-'/,K$� ��W+��,1U�%�!+�&'P%�+,�H% 100 �/��$/���& �&'/�VWr0+( 26±2 /q�,G!,G&4 ���&'+-),1U�,%!� 4 4�1)�W� ��������,!&.>)�#�,G!!��.��W��� 0.3 ���+ *)�,G!!�4&,W!-//$/� �������% !� �//�,1U�,G!!�,)&'%f (�01�&' 3.8) ,G!!� K%�!/+&���,��([,�(�>�,1U� 3 ��� P-/ ��� lag phase, log phase !� stationary phase ����#����/�,G!!�,�('+�����/�%$��&./��4$`!�W����,��([K/,G!!� K%�!/*+$)& ����#�1�(+������/�,G!!�,�('+���,�('+KX.�4$`!�$/���,��([*)�)& �$W���#�1�(+������/�,G!!�,�('+���+��,�(�*1/��+&`!����W�,�()���4�4+4��#&%,P+& !�/����� �K/�.�������W�/�W��,���,!&.K�$� (#%��(q, 2544)

����#�~/��>+������,!&.�&',W+��4+������W�,G!!��-#+&��� �$,G!!�*)�)& �����%(��K/ Santos-Gomes !� PV� (2002) ��%$�,+-'/,!&.,G!!� K%�!/��/�W��,�(+ BA ����W�*)�,G!!�+&!��bV�,����!�$+��� ��KV��&',+-'/,!&.,G!!� K%�!/��/�W��,�(+*P,��(���*)�,G!!�4$%��W[$�&'+&!��bV� �,1U�,G!!�,)&'%f (majority single cell suspension)

Page 80: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

65

�01�&' 3.8 4),G!!� K%�!/����� W!������,!&.P��.�&' 3 ,1U�,%!� 14 %����/�W��40�� MS ,�(+ 2,4-D 1 +(!!(���+�$/!(�� !� TDZ 0.1 +(!!(���+�$/!(��

,+-'/qX�b����,��([,�(�>�K/,G!!� K%�!/>)���%�)1�(+������/�,G!!� (PCV) >)�#�1�(+������/�,G!!�,�('+���1��+�V 0.5 +(!!(!(�� ��%$�,G!!�+&���,��([,�(�>�,1U� 3 ��� P-/����&' 1 lag phase /0$��#$% 1-2 %�� W!������,!&. ����&' 2 log phase /0$��#$% 2-10 %�� !�����&' 3 stationary phase /0$��#$%%���&' 10-14 W!������,!&. (�01�&' 3.9)

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 2 4 6 8 10 12 14 16Day

CPV

�01�&' 3.9 �01 �����,��([,�(�>�K/,G!!� K%�!/��� P!!�4��� �� BPM-24 ��������,!&.���%��,1U�,%!� 14 %�� ( 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

PCV (m

l)

���;�<��%8%���,%�

Page 81: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

66

3.2.3 ��������"���%��"��"��!�9"�'������ �� !��" �� ���#$���;�(������S�'��9'� �� �������� %

W!����,�('+1�(+�V,G!!� K%�!/>)P�),!-/�,G!!�,)&'%+�,!&.��/�W�� MS 40��#��������,�(),G!!� K%�!/ %�)1�(+�V,G!!��&',�('+KX.�,1U�,%!� 14 %�� !�%4��),G!!� K%�!/,�-'/qX�b����,1!&'� 1!K/>1��&� !��(����+K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (�����&' 3.1) >)���,1!&'� 1!K/>1��&���.�,�('+KX.���#$% 2 %�� �� +&P$�404�),1U� 15,307 +(!!(���+�$/ PCV )� 4)���01�&' 3.10

������qX�b����,1!&'� 1!�(����+K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ,+-'/�#� o-dianisidine (O-POD), guaiacol (G-POD), syringaldazine (Z-POD) !�4P/�/!(�(� (S-POD) ,1U�4��4,��� (�01�&' 3.11) ��%$�����W%$����,��([,�(�>� 1�(+�V,/�*G+�,1/��//�G(,)4��. 4 */>G*G+�,�('+KX.���#$% 0-8 %�� W!������.���P�&' >) Z-POD ��,�('+40��. �$%���&' 2 !�%!)! !�,�('+KX.�/&�P��.��%���&' 8 1�(+�V 15.8 !� 15.1 ∆OD./ PCV ��+!��)�� ��KV��&' S-POD !� O-POD ,�('+404�)�&'%���&' 4 !�%���&' 6 ,�$���� 11.0 !� 9,530 ∆OD./ PCV ��+!��)�� >) O-POD ��.�+&��1�(+�V+����. �$��� �$ G-POD ��+&1�(+�V�&'P$/�K��P�&' +&���,1!&'� 1!�&',�('+KX.�,!H���/��%���&' 6 ,�$���� 6.06 ∆OD./ PCV

����W%$�����%����,+���/!(GX+r���,G!!� >)1��( !�%,G!!���1!$/4������%� reactive oxygen species (ROS) ,#$� O2

-, H2O2, OH- !�,+-'/,G!!�*)����

P%�+,P�&)���4(' %)!�/+,�('+KX.�����W�,G!!�4���4��)��!$�%,�('++��KX.�)�% /��+&`!����W�,G!!�,�()>�P !���*)� )���.�,G!!��X+&%( &��������)4���!�$+ ROS ,�-'/1Z/���P%�+,4&W� (Asada and Takahashi, 1987; Asada, 1999; Dat, 2000) ROS ����W�,�()����%����//�G(,)�&1�$�f *)� �$ *!1�),1/��//�G(,)#��, ���W�)�����K/,/�*G+� !�,�() DNA degradation ,1U���� �/���� ROS ��+&4$%�,�&'%K�/�������%����,�()>�P !���K/,G!!� !�% �+&4$%�,�&'%K�/������1Z/���>�P/&�)�% (Mittler, 2002) ,/�*G+��&',�&'%K�/�������%���� /��&.//�G( )���4��%�,!&.!0�)�%�+��.�+&W!�#�() >)+&W����&'���.4���!�$+ ROS (Adachi et al., 2000; Ookawara et al., 2003; Comhair et al., 2001) ����W�`0�%(��4������,1!&'� 1!K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4��,G!!� K%�!/�������#$%��W%$����,��([,�(�>�

Kim !�PV� (2004) ��%�%�)���,1!&'� 1!K/,/�*G+��&',�&'%K�/�������%���� /��&.//�G( )� *)� �$ SOD, GPX !� G-POD ��,G!!� K%�!/K/+��,�q����W%$����,��([,�(�>�r����P%�+,P�&)�������%����//�G(,)�&1��%$� SOD, GPX !�

Page 82: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

67

G-POD r���,G!!� K%�!/,�('+KX.�W!������������,!&.,1U�,%!� 30 %�� ��%���,/�*G+�)��!$�%���.��,!&.,G!!� (�/�,G!!�) +���%$�r���,G!!�

0

4000

8000

12000

16000

20000

0 2 4 6 8 10 12 14Day

mg/CPV

�01�&' 3.10 4)P$�,1!&'� 1!K/>1��&� ��������,��([,�(�>�K/,G!!� K%�!/

�����,1U�,%!� 14 %��

0

400

800

1200

1600

2000

0 2 4 6 8 10 12 14

day

OD./CPV

Z-POD/10

S-POD/10

O-POD*10

G-POD/100

�01�&' 3.11 4)P$�,1!&'� 1!K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��������,��([,�(�>�K/,G!!�

K%�!/�����,1U�,%!� 14 %��

mg/PCV

OD./PCV

Page 83: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

68

�����&' 3.1 4)P$�,1!&'� 1!K/>1��&� (mg/PCV) !�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (∆OD. /PCV) ��������,��([,�(�>�K/,G!!� K%�!/�����,1U�,%!� 14 %��

"��!�� �� !��" �� ���# (∆OD./ PCV) ���

(�<�)

PCV

(ml)

"��!�9"�'��mg/PCV Z-POD S-POD O-POD G-POD

0 0.50 9,658 115 82 2,070 37 2 0.50 15,307 158 111 7,440 38 4 0.60 12,200 129 110 9,530 48 6 0.70 10,590 142 131 3,200 61 8 0.88 10,246 151 91 2,330 41 10 1.20 9,333 133 85 2,30o 39 12 1.25 9,376 116 83 2,140 38 14 1.30 9,658 115 82 2,070 37

�������)!/,G!!� K%�!/��%$�+&���,1!&'� 1!K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��#$%���,��([,�(�>���/�&'4�)P-/W!���� 10 %�� GX'`0�%(����/���qX�b��(����+���,1!&'� 1!K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'+&`!+�������J0��������)�%/(!(G(,�/���$�f ,�&/$�,)&% )���.��X,!-/��#�,G!!� K%�!/��#$%/�� 14 %��W!������,!&. �����qX�b�1e(�(�(�����/�4�/K/,G!!� K%�!/

3.3 ���'���# �=�!���#7�-�Y� � filtrate

��),4��� P. palmivora (Ø = 0.5 ,G��(,+��) ������/�W�� PDA ����%� 1 #(.��$/ 10 +(!!(!(�� !��/�W��,!&.40�� Henninger !�%,K$�,!&.,1U�,%!� 15 %�� ,+-'/P�����W�)���+���/,4���K/ P. palmivora //�)�% vacuum ��� filtrate *1��%�4/�P%�+��(4�� (�>)������/(,!H�>��</�&G(4 �� Tricine-SDS-PAGE !��/+,�!)�%G(!,%/��*�,��� ��%$�+& J�>1��&�W!�� 1 J�+&4&,K�+ !�W���X�/$�#�),�� GX',+-'/W��.��W���>+,!��!K/ J�)��!$�%,�&���� J�>1��&�+��������%$�,1U� J��&'+&�.��W���>+,!��!1��+�V 10 �(>!)�!��� (�01�&' 3.12)

����)!/K/ Rattarasarn (2003) ��%$�4�+��J�#�/(!(G(�(� (>1��&�K��) 10 �(>!)�!)��) �&'��(4�� (� GX'+&#-'/,����%$� palmivorein (Churngchow and Rattarasarn, 2000) ,�-'/����/���)��P%�+�������K/>�P*)� ,����/(!(G(�(�)��!$�%����W�,�()���4���4P/�/!(

Page 84: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

69

�(������������� �� BPM-24 (�������) *)�+���%$��&'������� �� RRIM600 (/$/� /) �������)!/K/���J ()� (2546) ������,!&. P. palmivora ��/�W��40�� PDB ,1U�,%!� 21 %�� !�%����W���(4�� (���4$%�>)���`$��P/!�+�� PD-10 qX�b�`!,1�&�,�&����/(!(G(�(��&'����W���(4�� (� ��%$�/(!(G(�(���(4�� (� !�/(G(�(��&'����W���(4�� (�,�&��4$%��W�`!����)!/*1���(q��,)&%��� )���.�,�H[+�q (2549) ���/(!(G(�(��&'����W���(4�� (�,�&��4$%�+��)4/���� P!!�4��� �� BPM-24 !� RRIM600 4�+��J��������W�,�()���4�,P���W�4P/�/!(�(������ �� BPM-24 *)�+���%$���� �� RRIM600

Filtrate �&'+���� P. palmivora ��/�W��,!&.40�� Henninger GX',1U�40��/�W���&'�#�,%!������,!&.4�.��%$�P-/ 15 %�� !��+&��P�J0��%$�/�W��40�� PDB ��%$�+&>1��&�W!���&'`!(�//�+����.��,!&.,1U�/(!(G(�(� !�+&P%�+��(4�� (�,�&�,�$����/(!(G(�(��&',!&.��/�W��40�� PDB �&'̀ $���������W���(4�� (�,�&��4$%� )���.�������)!/P��.�&.`0�%(���X,!-/��#� filtrate �&',!&.��/�W��40�� Henninger +��)4/����,G!!� K%�!/�����,�-'/qX�b�1e(�(�(�����/�4�/�$/*1

�01�&' 3.12 �� `�K/ J�>1��&� �� Tricine-SDS-PAGE K/ filtrate �������/+,�!

)�%G(!,%/��*�,��� J%�&' 1 J�>1��&�+������GX'1���/�)�% Phosphorylase b 97.4 �(>!)�!)��BSA 66.2 �(>!)�!)��, Ovalbumin 45.0 �(>!)�!)��, Carbonic anhydrase 31.0 �(>!)�!)�� !� Soybean trypsin inhibitor 21.5 �(>!)�!)�� J%�&' 2 J�>1��&���� filtrate

1 2

97

66

45

31

21

10

Page 85: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

70

Polkowska-Kowalczyk !�PV� (2003) *)���� filtrate K/ P. infestans �&',!&.��/�W��40�� Henninger +����������+�,K-/ 3 4���� �� (S. nigrum, cv Bzura !� Clone H-8105) ,�-'/qX�b�����%����//�G(,)�&1 *)� �$���,�() ROS, *!1�),1/��//�G(,)#�� !�,/�*G+�*!�/�G(,�4 (LOX) ��%$� ROS J0��������,�('+KX.���+P%�+,K�+K��K/ filtrate >)��K/+�,K-/��� ��/$/� / (Clone H-8105) 4��� ROS *)�+���%$���� ��������� (cv Bzura !� S. nigrum) ��)�����4��� ROS �&' ���$���� ,�-'/+����P%�+ ���$�K/&�������� �����,�()����%����*!1�),1/��//�G(,)#��,������4���� ��������� (S. nigrum) !�,�()W!��������%���� oxidative burst (Polkowska-Kowalczyk and Maciejewska, 2001) ���4���,/�*G+� LOX J0��������+���� H2O2 ������� ���������+���%$���� ��/$/� / ,/�*G+� LOX 4$`!�W�,�()����%����,++,���,1/��//�G(,)#������W�,G!!��� (Maccarrone et al., (2002) �/�����&. Macri !�PV� (1994) ����%$� H2O2 �&'P%�+,K�+K����/f 4�+��J����������,�(),/�*G+� LOX ��KV��&' H2O2 �&'P%�+,K�+K��40f !)��)�����4���,/�*G+� LOX �W���/!

3.4 ������"\�#<!&<�-���;�(� filtrate � ��+*, � P. palmivora <�� �������� %%�&�

3.4.1 ����(!� �������� %�8�% filtrate �&*� ���=�!��8!�8�� � filtrate ����;!�#!

W!�����$+,G!!� K%�!/)�% filtrate �&'P%�+,K�+K���$�f P-/ 0.033, 0.075, 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 24, 48, 72 !� 96 #�'%>+ %(,P���W�`!���4���4P/�/!(�(��&'1!$///��/�,G!!� K%�!/ (extracellular) ��%$���./����,�H% !�1�(+�V�����4�,P���W�4P/�/!(�(�K/,G!!� K%�!/ ,+-'/J0��������)�% filtrate �&'P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ +&P$�404�)P-/ 9.13 ��>�>+!�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ �&' 72 #�'%>+ !�+& �%>��+!)!�&' 96 #�'%>+ ��KV��&' filtrate P%�+,K�+K�� 0.150 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ����������4���4P/�/!(�(�*)�404�),�$���� 8.55 ��>�>+!�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ��#�'%>+�&' 96 (�����&' 3.2 !��01�&' 3.12)

�������K/ Li !�PV� (1997) *)�����%$�*<>�/,!H�G(�J0�`!(� !�,�H�4�4+�� vascuolar parenchyma cell �&'���/+��J0�1!$/,+-'/J0��������)�%/(!(G(,�/���$�f )���.�,+-'/�-#J0��������)�%/(!(G(�(�W�-/,#-./>�P�$�f �X+&���,W�&'%����W�4����.��� P-/ coumarin ���%(J&<��(!>�����/)� (phenylpropanoid pathway) ,1!&'�,1U�4P/�/!(�(� !�%1!$///�+��/�,G!!� )�%,W��`!�&.,/�&'/������W�4�+��J��%�4/����4�4+K/4P/�/!(

Page 86: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

71

�(�*)�,�H%�%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ����/,)&%�����%(��K/ Gomez Vasquez !�PV� (2004) ,+-'/�)4/��� !�,G!!� K%�!/K/+��4��1�W!�)�%`��,G!!�K/&4�� (cell wall glucan elicitor) ��%$�+&���4�,P���W�4P/�/!(�(� !�,/�*G+�,1/��//�G(,)4,�('+KX.���.�� !��/�,G!!� ����W�`0�%(��,!-/�%(,P���W����4�,P���W�4P/�/!(�(�K/,G!!� K%�!/,�-'/��%�4/�P%�+,K�+K���&',W+��4+K/ filtrate ������������,G!!� K%�!/ !�,!-/��#� filtrate �&'P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ������)!/�$/*1 ,�-'/���,1U�P%�+,K�+K���&'4�+��J����������,�()4P/�/!(�(�*)�40�%$� !�,�H%�%$��&'P%�+,K�+K�� 0.150 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

�����&' 3.2 4)���4�,P���W�4P/�/!(�(� (nmole/ g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate �&'P%�+,K�+K���$�f P-/ 0.033, 0.075, 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

+7���� ���'78��8�% filtrate (ug/g) ���

+7�=��=7! 0.033 0.075 0.150 0.300

0 3.06±0.21 3.06±0.21 3.06±0.21 3.06±0.21 3.06±0.21 24 3.79±0.27 4.10±0.08 3.92±0.11 4.01±0.12 3.87±0.01 48 4.69±0.28 4.12±0.18 4.11±0.00 4.06±0.39 4.30±0.14 72 4.46±0.05 4.24±0.16 4.63±0.26 5.12±0.84 9.13±0.73 96 4.57±0.15 6.17±0.32 5.26±0.28 8.55±0.38 7.99±0.55 (��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 87: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

72

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96

time (h)

Scopoletin

(nmol/g fresh wt) control

F 0.033 ug/gF 0.075 ug/gF 0.150 ug/gF 0.300 ug/g

�01�&' 3.13 4)���4�,P���W�4P/�/!(�(�K/,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate �&'P%�+,K�+K���$�f P-/ 0.033, 0.075, 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 24, 48, 72 !� 96 #�'%>+

,+-'/�(���V�P%�+,K�+K��K/ filtrate �$/���4�,P���W�4P/�/!(�(���,G!!� K%�!/����� ��%$���.1�(+�V !�/����,�H%�����4�,P���W�4P/�/!(�(�KX.�/0$���P%�+,K�+K��K/ filtrate �&'�)4/� >)P%�+,K�+K��K/ filtrate �&'40KX.� ��+&���4�,P���W�4P/�/!(�(�,�('+KX.� ��KV��&'P%�+,K�+K��K/ filtrate �&'40,�(� *1�W����4�,P���W�4P/�/!(�(�!)!/$��%),�H% (K�/+0!*+$*)� 4)) ����������,G!!�K/�-#)�%/(!(G(,�/���&'P%�+,K�+K��40+����.� 4$`!�W�,G!!���*+$+&����/�4�/�$/���1Z/�����%,/K/�-# ,#$����4���4��*<>�/,!H�G(�, 4���!�$+ ROS !� PR-proteins ,1U���� 4/)P!�/��� ���/�+�!& (2547) GX'����%$�,+-'/�$+�������)�%G0>/41/��K/ P. palmivora �&'P%�+,K�+K��K/G0>/41/��40,�(�*1������W�,WH����!��!�+#�),������W��������*+$4�+��J4�,P���W�4P/�/!(�(�+����. P. palmivora *)� �$W���#�P%�+,K�+K��K/G0>/41/���&',W+��4+4�+��J,W�&'%����W�+&���4���4P/�/!(�(���1�(+�V40 �/�����&. ,�H[+�q (2549) ���/(!(G( ,�/�����,#-./�� P. palmivola `$���������W���(4�� (���4$%� +��)4/��� P!!�4����� ��%$�,+-'/�#�/(!(G(�(��&'P%�+,K�+K��40,�(�*1+&`!�W����4�,P���W�4P/�/!(�(�!)!/$��%),�H% Gutirrez !�PV� (1994) ����������%��+��������)�% CuCl2 ,�-'/qX�b�4P/�/!(�(� ��%$�W!������������������%��)�% CuCl2 4�+��J,W�&'%������4���4P/�/!(�(�*)� !���%����(����+K/

Page 88: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

73

,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',�$4P/�/!(�(��W�,1U�4��1���/��&'*+$!�!��.�� 4P/�/!(�(�4�+��JJ0�//�G(*)4�*)�)�%,/�*G+�,1/��//�G(,)4 !�,�&�,/�*G+�#�()�&.%$�4P/�/!(�(�,1/��//�G(,)4 (S-POD) 4P/�/!(�(��&'+&���4�,P���W�KX.���1�(+�V40,�(�*1�H��,1U��(b�$/,G!!��-# (Cooper and William, 2004) 4$`!�W�,G!!�K/�-#��+&`!�W�,G!!�4���4P/�/!(�(�*)�!)!

��� MES ��<,</��*14$/)0r���� 4/�!����*%>/,!� (P%�+�%P!-'� 366 ��>�,+��) 4�+��J4�,��,WH�)�%��,1!$� %(,P���W�4P/�/!(�(��&'1!$///�+��/�,G!!� �������������,G!!� K%�!/)�% filtrate �&'P%�+,K�+K�� 0.033, 0.075, 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/,+-'/,%!�`$��*1 96 #�'%>+ ��%$��&' filtrate �&'P%�+,K�+K�� 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ +&���,�-/ 4K/4P/�/!(�(�40�&'4�) !�,�-/ 4�� MES ��<,</�� ��+P%�+,K�+K��K/ filtrate �&'�#��������,G!!� K%�!/ (�01�&' 3.14) ���4�,�����,�-/ 4K/4P/�/!(�(�r���� 4/�!����*%>/,!H���.�,1U�%( &���W�X'�&'$� !��%),�H%

�01�&' 3.14 4)���,�-/ 4K/4P/�/!(�(�r���� 4/�!����*%>/,!H� 1!$///�+��� MES ��<,</�� (�/�,G!!�) W!��������$+ K%�!/�����)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.033, 0.075, 0.150 !� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,+-'/,%!�`$��*1 96 #�'%>+

����#�1�(+�V filtrate ������������40,�(�*1��,W�&'%��������K/,G!!� K%�!/ ,+-'/���,G!!� K%�!/+��/+)�% Evans blue 4�,��,WH�%$�,G!!��&',�()��������/+�()4&�.��,(� (�01�&' 3.15) ,�-'/���,G!!��&'�� !�%*+$4�+��J`!��4(' 1!�1!/+�&'/0$��,G!!�//�+�*)�����W�,WH�4&�.��,(�K/ Evans blue

���qX�b������K/,G!!� K%�!/+���(+�#� Evans blue ������/+,�-'/���+&P%�+,1U��(b�'�� )���%/$���%(��K/ Song !�PV� (1999) *)�qX�b������K/,G!!� K%�!/��J�'%,W!-/�&'J0��)4/�)�% phosphoinositide-specific phospholipase C inhibitor U-73122 (100 *+>P�>+!���) �����,W�&'%����W�,�()�����K/,G!!� ������qX�b�

Control F 0.033 ug/g F 0.075 ug/g F 0.150 ug/g F 0.300 ug/g

Page 89: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

74

��%$�,G!!��&'+&#&%(���*+$�()4& ��KV��&',G!!������()4&�.��,(�#�),��,+-'/4$/)�%�!�/��!���q�� ��+)� !�,+-'/4$/)�%�!�/��!���q��<!0//,�4,G��� ,G!!��&'+&#&%(���,WH����,�-/ 4,1U�4&,K&%��KV��&',G!!�����1���e,1U�4& ) !��W�`!,#$�,)&%���,+-'/�#�,G!!� K%�!/K/�40�

�01�&' 3.15 4),G!!� K%�!/������&'�/+)�% Evans blue ,+-'/4$/)�%�!�/��!���q�� ��+)� (x400) �!�$+,G!!���K/,G!!� K%�!/�&'�/+�()4&�.��,(� (a), �!�$+,G!!��&'+&#&%(�*+$�()4&K/ Evans Blue (b)

3.4.2 ��(!� �������� %�8�% filtrate �&*� ������"d �<�'<�� �� �&*+

3.4.2.1 ���#�8�#= & ��'�����"�( % !� � �������� %

�������)!/�$+,G!!� K%�!/)�% filtrate �&'P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ (P%�+,K�+K���&'�W�P$�4P/�/!(�(�404�)���K�/ 3.4.1) ,+-'/JX,%!��&'���W�) 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+ ��� MES ��<,</�� �������)4/�,G!!� K%�!/GX',1U�#�)�)!/ !�#�)P%�P�+ �&' �,G!!� K%�!///� !�% +�,G���(<�%��)�%P%�+,�H% 8,000 �/��$/���& ,1U�,%!� 5 ���& !�%���4����%/$�+�%�)P$����,�-/ 4)�%,P�-'/ spectrofluorometer ��%$�+&���4���4P/�/!(�(���#�)�)!/40�%$���#�)P%�P�+W!���� 60 #�'%>+ !�+&P$�404�)�&' 80 #�'%>+ (�����&' 3.3 !��01�&' 3.16) W!������.�4P/�/!(�(���#�)�)!/��P$/f !)!

a b

Page 90: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

75

Valle !�PV� (1997) �������)4/�,G!!� K%�!/K/ Ulmus pumila !� U. campestris GX'������� !�/$/� /�$/ Dutch elm disease (DED) ��+!��)�� >)����$+)�%41/��K/ Ophiostoma ulmi ��%$�+&���4�4+K/4P/�/!(�(���,G!!�/$��%),�H% !�%1!$/4P/�/!(�(�!��/�W�� !�,1U�*1������/,)&%��� ,�H[+�q (2548) GX'����%$�������/(!(G(�(�����.��,!&. P. palmivora �&'����W���(4�� (�,�&��4$%� +��)4/����,+!H)/$/� !� P!!�4����� ��%$�+&���,W�&'%����W�+&���4�,P���W�4P/�/!(�(���,G!!� !�1!$/4P/�/!(�(�//�+��/�,G!!���1�(+�V�&'��!�,P&���

�����&' 3.3 4)���4�,P���W�4P/�/!(�(� (nmole/ g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 0.91±0.01 0.85±0.02 8 0.92±0.11 0.88±0.01 16 0.75±0.07 0.87±0.01 24 1.20±0.19 1.01±0.09 32 1.37±0.32 0.98±0.06 40 1.31±0.24 1.14±0.11 48 1.29±0.08 2.16±1.10 56 1.81±0.19 1.94±0.12 64 1.62±0.11 2.06±0.71 72 2.24±0.27 5.82±1.80 80 2.34±0.32 10.41±1.07 88 2.88±0.45 6.69±0.31 96 2.95±0.29 4.81±0.31 104 3.10±0.21 5.40±0.75

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 91: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

76

0

2

4

6

8

10

12

14

0 16 32 48 64 80 96 112

time

Scp (nmol/ g fresh wt)

controlfiltrate

�01�&' 3.16 4)`!���4�,P���W�4P/�/!(�(��&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/�����

W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

3.4.2.2 �������#<��=��;�� �� !��" �� ���# ����������'78�� �������� %�8�% filtrate

W!�����$+,G!!� K%�!/��� �� BPM-24 )�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+K/,G!!� K%�!/ �&',%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+��+!��)�� ,+-'/���4��4��)+�qX�b����4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)�#�4P/�/!(�(�,1U�4��4,��� ��%$� filtrate 4�+��J,W�&'%������4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4*)�40��#$% 56 !� 80 #�'%>+��+!��)�� +&P$�,�$���� 530 !� 633 �OD./g fresh wt (�����&' 3.4 !� �01�&' 3.17) ��#$%,%!� 56 #�'%>+ �&' S-POD 40KX.� /��4���KX.�+�,�-'/!)P%�+��� �K/ H2O2 �&',�()�������%���� oxidative burst 4$%���#$%,%!��&' S-POD 40KX.� 80 #�'%>+,1U�#$%,%!��&'4/)P!�/������1!$/4P/�/!(�(� //�+��/�,G!!� K%�!/�&' 80 #�'%>+ �X,1U�*1*)��&',G!!� K%�!/�����4�,P���W� S-POD //�+�,�-'/�#������4!�4P/�/!(�(� Edwards !�PV� (1997) ��%���,/�*G+�,1/��//�G(,)4������%����,+���/!(GX+K/4P/�/!(�(� �������%�� ��%�%�)4P/�/!(�(�,�('+KX.��� 24 #�'%>+ ��W!������.�4P/�/!(�(���W�*1/$��%),�H%��*+$4�+��J%�)1�(+�V*)� ��%$�1�(+�VK/4P/�/!(�(�!)!4�+��� ����P%�+%$/*%�&',�('+KX.�K/,/�*G+�

Page 92: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

77

,1/��//�G(,)4>),�$�W�,�()4��1���/��&'+&4& !�*+$!�!��.�� 4P/�/!(�(�,1/��//�G(,)4 (S-POD) +&+%!>+,!��! 46,000 �(>!)�!)�� ����K/�����%�����(����+K/ S-POD +������(,%V�/�f ��) `!W!�����������)�% CuCl2 W�-/ salicylic acid �/�����&.��� S-POD ����+�����', �40� !�J�'% (Clarke, 1973; Goy et al., 1993) �-#`!(�4��*<>�/,!H�G(�KX.�+�,�-'/���.���,��([,�(�>�K/,#-./�� �$�H,1U�/������$/,G!!��-#)�% �/�����&. H2O2 �&',�()�������%���� oxidative burst �H+&�(b�$/,G!!��-#�XJ0������)//�>)������1e(�(�(���W%$�4P/�/!(�(� !� H2O2 )���.��X/���!$�%*)�%$�4P/�/!(�(��&'`!(�KX.�+�+&W����&' 2 1�����P-/ ,1U�*<>�/,!H�G(� !�,1U� detoxifying agent GX'���W����&'�����) H2O2 //����,G!!�

�����&' 3.4 4)���4�,P���W� S-POD (∆OD./ g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 253.05±0.02 275.25±0.02

8 274.05±0.03 271.50±0.03

16 274.05±0.04 316.65±0.01

24 284.55±0.03 331.20±0.01

32 303.90±0.02 362.25±0.01

40 288.75±0.07 386.70±0.04

48 279.30±0.25 396.90±0.04

56 290.85±0.09 530.25±0.04

64 255.15±0.44 462.75±0.05

72 271.95±0.09 454.50±0.02

80 348.00±0.16 633.00±0.06

88 300.00±0.06 454.50±0.04

96 324.00±0.04 467.25±0.06

104 285.00±0.11 486.00±0.08

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 93: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

78

0

200

400

600

800

1000

0 16 32 48 64 80 96 112

time

S-PO

D (OD./min/g fresh wt)

control

filtrate

�01�&' 3.17 4)���4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/����� ,+-'/�#�4P/�/!(�(�,1U�4��4,��� W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

4��W���P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �&'�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� ��P$�P%�+%$/*%K/ O-POD P$/f ,�('+KX.� !�40�&',%!� 32 !� 56 #�'%>+ >)+&P$�,�$���� 8,963 !� 10,755 ∆OD./g fresh wt ��+!��)�� GX'��%$�#�)�)!/+&P$�P%�+%$/*%K/ O-POD 40�%$�#�)P%�P�+ (�����&' 3.5 !� �01�&' 3.18)

Papadakis !�PV� (2001) ��%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ���4��4��)��/�$�4�+��J�#� ascorbate ,1U�4��4,�������������) H2O2 //����,G!!�*)� ,���������4�,P���W� 4K/�-#��,�()���4�4+ ROS GX'�%+JX H2O2 �&',1U��(b�$/,G!!��-# )���.��X�����) H2O2 //� >),/�*G+�,1/��//�G(,)4�����W����&'//�G(*)G�4��1���/�<��/! ,�-'/,1!&'� H2O2 ,1U��.�� !�,�()/��+0!/(4��K/4��1���/�<��/! �&'���/+�����1e(�(�(���� ascorbate ,�(),1U�/��+0!/(4��K/ monodehydroascorbate !�%,�()���>�!(,+/��*�G���� ��*)� dehydroascorbic acid !� ascorbate GX'���/+��,�()1e(�(�(������) H2O2 �$/*1 (Perez et al., 2002)

Page 94: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

79

�����&' 3.5 4)���4�,P���W� O-POD (∆OD./ g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 3375±191 3420±64 8 4298±159 4050±64 16 4680±127 4950±212 24 4905±64 6360±85 32 4500±1273 8963±583 40 3668±95 6263±53 48 4500±318 8100±212 56 3803±32 10755±700 64 3803±159 8325±318 72 3780±64 7695±64 80 2993±95 6563±265 88 4478±95 6788±477 96 3758±95 6900±849 104 3600±955 5138±159

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 95: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

80

0

4000

8000

12000

16000

0 16 32 48 64 80 96 112

time

O-PO

D activity (O

D./min/g fresh wt)

controlfiltrate

�01�&' 3.18 4)���4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/����� ,+-'/�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

,+-'/���4��4��)+�qX�b����4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)�#� guaiacol ,1U�4��4,��� �������$+,G!!� K%�!/)�% filtrate ��%$�P%�+%$/*%K/ G-POD ��#�)�)!/+&/�������,�('+KX.�#�),���%$���#�)P%�P�+ ��#�)�)!/+& �%>��+40KX.� !�40�&'4�)�&',%!� 64 #�'%>+ +&P$�,�$���� 81.0 ∆OD./g fresh wt 40�%$�#�)P%�P�+1��+�V 2.5 ,�$��&',%!�,)&%��� (�01�&' 3.19) ,+-'/,%!�`$��*1�&' 104 #�'%>+ G-POD ���#�)�)!/+&P$�!)!,1U� 50.1 ∆OD./g fresh wt GX'��/�%$�#�)P%�P�+�&'+&P$�,�$���� 59.7 ∆OD./g fresh wt ,+-'/,1�&�,�&�/�������,�('+KX.�K/ O-POD !� G-POD �������&',G!!� K%�!/4�,P���W�KX.�+�K/#�)�)!/ ��%$� O-POD (32 !� 48 #�'%>+) J0�4�,P���W�KX.�+��$/� G-POD (64 #�'%>+) 4/)P!�/��� ,�H[+�q (2549) GX'����%$�����$+ P!!�4)�%/(!(G(�(��&'P%�+,K�+K�� 1 *+>P����+�$/ P!!�4 1 ���+ ��P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �)4/�>)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,���+&P$�404�)�&',%!� 24 #�'%>+��,G!!� !�+&���1!$///�+��/�,G!!�,!H���/404�)�&',%!� 30 #�'%>+ ��KV��&'�#� guaiacol ,1U�4��4,��� +&P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4404�)�&',%!� 30 #�'%>+��,G!!� !�%1!$///�+��/�,G!!�,!H���/ !�404�)�&' 36 #�'%>+ ����&' O-POD !� G-POD �� P!!�4,�()KX.��$/���,G!!� K%�!//��,�-'/+��������#�P%�+,K�+K��K/>1��&�40JX 1 *+>P����+�$/ P!!�4 1 ���+

Page 96: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

81

GX',1U�P%�+,K�+K���&'40�%$�P%�+,K�+K��K/>1��&��&'�#�������������,G!!� K%�!/ (0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/)

�����&' 3.6 4)���4�,P���W� G-POD (∆OD./g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 22.8±0.00 28.1±0.01

8 27.5±0.01 29.9±0.01

16 33.0±0.01 36.5±0.01

24 42.0±0.02 46.5±0.04

32 30.9±0.00 50.4±0.00

40 34.4±0.02 42.2±0.00

48 41.7±0.07 52.2±0.00

56 32.3±0.03 66.6±0.01

64 33.2±0.00 81.0±0.04

72 32.9±0.01 54.0±0.09

80 34.1±0.00 55.2±0.02

88 38.1±0.03 45.3±0.03

96 48.9±0.01 46.5±0.02

104 59.7±0.01 50.1±0.00

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 97: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

82

0

20

40

60

80

100

0 16 32 48 64 80 96 112

time

G-PO

D (OD./min/g fresh wt)

control

filtrate

�01�&' 3.19 4)���4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/����� ,+-'/�#� guaiacol ,1U�4��4,��� W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

W!�������4��4��)+�qX�b����4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �#� syringaldazine ,1U�4��4,��� >)�$+,G!!� K%�!/)�% filtrate ��%$�P$�P%�+%$/*%K/ Z-POD ��#�)�)!/+& �%>��+40KX.� !�40�&'4�)�&',%!� 48 #�'%>+ +&P$�,�$���� 182.3 ∆OD./g fresh wt 40�%$�#�)P%�P�+1��+�V 2.8 ,�$��&',%!�,)&%��� (�����&' 3.7 !� �01�&' 3.20) +& �%>��+!)!�&',%!� 56 !� 64 #�'%>+ !�,�('+KX.�/&�P��.�&' 72 #�'%>+ +&P$�,�$���� 159.5 ∆OD/g fresh wt

Egea !�PV� (2001) ���,G!!� K%�!/K/��(�*���� ��������� !�/$/� / +�qX�b�����/�4�/�$//(!(G(,�/�� 2 #�() P-/ lyophilized mycelium !� filtrate K/ P. capsici W!����J0�������� ��%$�,G!!� K%�!/4��� PR-proteins #�()W�X' P-/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 !�+&���4�4+K/!(��(� ����� �����������%$�+&`��,G!!�W��KX.� ,�-'/���+&���4�4+K/!(��(�,�-'/1Z/������������K/,#-./>�P ���,�('+KX.�K/!(��(�4�+��� ����P%�+%$/*%�&',�('+KX.�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 GX'��,������4���� ��������� �/�����&.��4���� ��/$/� /��� necrosis ��/�%$�4���� ��������� ,�-'/���

Page 98: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

83

��� ���������+&����/�4�/ �� hypersensitive cell death !��,#-'/%$� necrosis �&',�()KX.�)��!$�%,�()������4�4+K/!(��(�

�����&' 3.7 4)���4�,P���W� Z-POD (∆OD./ g fresh wt) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 103.5±5.1 93.6±1.5 8 90.0±6.8 106.7±5.7 16 93.5±10.0 94.2±9.5 24 89.1±14.0 110.7±8.7 32 70.7±0.2 90.8±1.1 40 81.6±11.9 88.8±2.7 48 69.8±2.3 182.3±6.2 56 86.9±4.5 134.6±0.7 64 84.2±1.0 90.6±5.5 72 77.7±2.3 159.5±8.7 80 83.4±9.3 96.5±9.1 88 77.3±5.3 89.9±12.0 96 76.5±11.0 93.6±1.7 104 88.2±1.0 76.8±10.2

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 99: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

84

0

40

80

120

160

200

0 16 32 48 64 80 96 112

time

Z-P

OD

(O

D./

min

/g f

res

h w

t)

control

filtrate

�01�&' 3.20 4)���4�,P���W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/����� ,+-'/�#� syringaldazine ,1U�4��4,��� W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

,+-'/�(���V�JX1�(+�V>1��&�K/����)!/�&. (�01�&' 3.21) ��%$�1�(+�V>1��&���#�)�)!/W!����#�'%>+�&' 56 !)!,�-'/f P-/ �&' 0 #�'%>+ +&1�(+�V>1��&�1��+�V 2.76 +(!!(���+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,+-'/,%!�`$��*1 56 #�'%>+ !)!,W!-/1��+�V 2.44 +(!!(���+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ �&' 104 #�'%>+ +&>1��&�,�$���� 1.82 +(!!(���+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ (�����&' 3.8) ��KV��&'1�(+�V>1��&���#�)P%�P�++&P$��&'P$/�K��P�&' ������)!/�&.�$��������)!/K/���/�+��& (2547) �&'��������)����W�+&K��) 1x1 �����(.% !�%�$+)�%G0>/41/���&'P%�+,K�+K�� 1 x 107 %(,P���W�P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'���,%!�����$+�$���� P-/ 24, 48, 72, 96, 120 !� 144 #�'%>+ ��%$�1�(+�V>1��&���.��#�)P%�P�+ !�#�)�)!/!)!,�-'/f ��+,%!��&'�������)!/ P-/ �&' 0 #�'%>+ +&1�(+�V>1��&�1��+�V 5.15 +(!!(���+�$/ 1 ���+��� ,+-'/,%!�`$��*1�&' 144 #�'%>+ 1�(+�V>1��&�!)!,W!-/P�X'W�X'���P$�,�('+��� !���%$�W!��$+)�%G0>/41/��P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �� 1�`�`�����1�(+�V>1��&��%+ ����&'1�(+�V>1��&�!)!��.��#�)P%�P�+ !���#�)�)!/��.�/��,�-'/+���������)��� >)�������W����,�()��) `!����W�,G!!�����/��W�)���4���>1��&������,��([,�(�>�W�-/>1��&��&',�&'%K�/������)���#&%(� ,�-'/1�1Z/��%,G!!�,/�X4���>1��&��!�$+ PR-proteins /$�,)&%

Page 100: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

85

����W���1�(+�V>1��&���.��#�)P%�P�+ !���#�)�)!/!)! ����)!/��,G!!� K%�!/>)�������)�% filtrate �&'+��,�(�*1 4$`!�W�,G!!� K%�!/��/$��%),�H% !�%1!$/>1��&��&'/0$r���,G!!�//�+�+��/�,G!!� ,+-'/������%�)1�(+�V>1��&�r���,G!!��X+&1�(+�V!)!/$�,WH�*)�#�) (*+$*)� 4)K�/+0!)

,/�*G+�,1/��//�G(,)4��),1U� PR-proteins #�()W�X' 4+1/ !�PV� (2538) *)���� �� P!!�4���,1!-/�W��+,+!H)/$/�K/������&'��������$/4�����,#-./ Phytophthora spp. >)��� P!!�4�&'#��������,1!-/�W��+,+!H)+��$+)�%,#-./ P. botryosa !� P. palmivora ,1U�,%!� 24 #�'%>+ !�%��*1,!&.�$/��/�W��,1U�,%!� 3 4�1)�W� �����.����*14��) !�qX�b�>1��&����,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ,�-'/��%�4/��!*������������$/4�����,#-./K����� ��%$� P!!�4#�)P%�P�+�&'*+$�$+)�%,#-./��1���e J�P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 2 J� 4$%���#�)�)!/�&'�$+)�%,#-./��1���e 4-6 J� �$,+-'/�/+>1��&�)�%4& Coomassie blue ��%$���.�$/� !�W!��$+)�%,#-./��,WH�,�& J�,)&%GX'+&�.��W���>+,!��!1��+�V 38,000 )�!��� )���.�1�(+�V>1��&��%+*+$4�+��J�$�/�P%�+ ���$���W%$� P!!�4�&'������� !�*+$������� ��KV��&'*/>G*G+�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4+&P%�+,W+��4+�$/������ ��)��!$�% ��� �%q�& (2547) ��%$� P!!�4,+!H)/$/�K/�����4/��� �� +&����%�*/>G*G+�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ���$���� >) P!!�4��� �� GT1 �&'J0��������)�%G0>/41/��+&����%� 1 */>G*G+� 4$%� P!!�4��� �� RRIM600 +& 2 */>G*G+� !�*+$�����4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4��#�)P%�P�+

�������)!/P��.�&.P�)%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �$���,1U���%�$#&.JX/����K/>�P*)� P-/ ,+-'/�-#�(),#-./������W�,�()>�P/$�#��f !�,W�&'%���P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4,�('+KX.� ��JXK�.��&',�()>�P��� � !�%,G!!��� 4$`!�W����4���,/�*G+�,1/��//�G(,)4P�&'W�-/!)!

�����&' 3.8 4)1�(+�V>1��&� (+(!!(���+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/) �&',%!��$�f ��,G!!� K%�!/����� ,+-'/J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 0 2.68±0.07 2.76±0.04 8 2.79±0.15 3.07±0.13 16 3.27±0.18 2.81±0.02 24 3.08±0.20 2.79±0.09

Page 101: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

86

��� (+!.) +7�=��=7! +7���� � 32 3.30±0.11 3.17±0.01 40 2.75±0.23 2.76±0.06 48 3.12±0.18 2.82±0.02 56 3.15±0.09 2.44±0.01 64 3.02±0.09 2.37±0.02 72 3.04±0.06 2.55±0.02 80 3.02±0.04 2.38±0.08 88 2.85±0.05 2.12±0.09 96 2.88±0.01 1.86±0.01 104 2.60±0.12 1.82±0.02

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

0

1

2

3

4

0 24 48 72 96 120

time

protein (mg/g fresh wt)

control

filtrate

�01�&' 3.21 4)1�(+�V>1��&��&',%!��$�f K/,G!!� K%�!/����� W!����J0��������)�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300 *+>P����+�$/ 1 ���+,G!!� K%�!/ ,1U�,%!� 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96 !� 104 #�'%>+

Page 102: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

87

3.5 ����:� �� !��" �� ���#$;8���#7�-�Y��#(��9�%�(�= �<!�� ion exchange ��� anionic

3.5.1 ������=�!�''(�� �� �� !��" �� ���#����������'78��8�% filtrate 9�%�(�= �<!�� ion exchange ��� anionic

W!�����$+,G!!� K%�!/��� �� BPM-24 )�% filtrate P%�+,K�+K�� 0.300*+>P����+�$/ 1 ���+K/,G!!� K%�!/ ,�H�,G!!� K%�!/�&' 80 #�'%>+ ���4��4��)*1�����/�>1��&�)�% (NH4)2SO4 �&'P%�+/('+��% 80 ,1/��,G��� W!������.����*1`$��P/!�+�� PD-10 (GX'�������),�!-///�*1) ���4��!�!��&'*)�*1!P/!�+�� DEAE-sepharose CL-6B (ion exchange) +&P�V4+���(����� �*)���+1����K/>1��&� 1�(+���P/!�+�� 12 +(!!(!(�� #�P/!�+��>)�#�P%�+,K�+K��K/,�!-/ 0.05 - 0.10 >+!��� NaCl �� phosphate ��<,</�� 20 +(!!(>+!��� pH 7.0 ,�H� fraction !� 3 +(!!(!(�� ��1�(+�V>1��&��&'J0�#�//�+��� �$!� fraction K/#�)P%�P�+40�%$���#�)�)!/ >1��&��&'/0$��,G!!� K%�!/��#�)P%�P�+J0�#�//�+� 3 #$% *)� �$ #$%*+$������,�!-/ (unbound), #$% 0.05 >+!��� NaCl !� #$% 0.09 >+!��� NaCl 1�(+�V>1��&���#�)P%�P�+��+&+���%$���#�)�)!/4�+��� ��������)!/K�/ 3.4.2.2 GX',+-'/�������,G!!� K%�!/)�% filtrate ,1U�,%!����KX.���.�P$�>1��&���!)! >)>1��&��&',W!-//0$��,G!!�4$%��W[$,1U�>1��&��!�$+ PR-proteins

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

unbound:1 5 9 13172125

0.05 M:1 5 9 13172125

0.06 M:1 5 9 13172125

0.07 M:1 5 9 13172125

0.08 M:1 5 9 13172125

0.09 M:1 5 9 13172125

fractions NO.

proteins (mg/ml)

control

filtrate

�01�&' 3.22 4)1�(+�V>1��&���,G!!� K%�!/������&'�$+)�% filtrate W!����`$�� P/!�+�� DEAE sepharose CL 6B

Page 103: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

88

W!�����������,G!!� K%�!/)�% filtrate !�%���+�`$��P/!�+�� DEAE-sepharose CL-6B %�)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�� �$!�W!/) >)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� ,�-'/���,1U�4��4,����&'+&P%�+*%�$/,/�*G+�,1/��//�G(,)4+���&'4�) >)P()P$�P%�+%$/*%,1U� ∆OD./ml ��P%�+%$/*%��#�)P%�P�+ 3 #$%K/,�!-/ NaCl P-/ 0.05, 0.07 !� 0.09 >+!��� (�01�&' 3.23) +&P$�P%�+%$/*%,�$���� 3.8, 11 !� 2 ∆OD./ml ��+!��)�� 4$%���#�)�)!/��.���%���P%�+%$/*%#$%,�!-/P%�+,K�+K�� 0.07, 0.08 !� 0.09 >+!��� ��P$�P%�+%$/*%�&'J0��������,�('+KX.���#$%,�!-/)��!$�%,�$���� 390, 1,000 !� 3,800 ∆OD./ml ��+!��)�� (�01�&' 3.24) +&P%�+%$/*%+���&'4�)��#$%,�!-/ 0.09 >+!��� !���%$�P%�+%$/*%�&'//���#$%,�!-/ 0.05 >+!��� K/ NaCl �&'����#�)P%�P�+��.�W�*1

0

4

8

12

16

20

unbound:1 5 9 13172125

0.05 M:1 5 9 13172125

0.06 M:1 5 9 13172125

0.07 M:1 5 9 13172125

0.08 M:1 5 9 13172125

0.09 M:1 5 9 13172125

fractions NO.

control

(OD. 460/ml)

0

400

800

1200

1600

2000

filtrate

(OD.460 /ml)

�01�&' 3.23 4)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4��,G!!� K%�!/����� W!�����$+)�% filtrate W!����`$��P/!�+�� DEAE sepharose CL-6B

Page 104: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

89

0

0.04

0.08

0.12

0.16

0.2

unbound:1 5 9 13172125

0.05 M:1 5 9 13172125

0.06 M:1 5 9 13172125

0.07 M:1 5 9 13172125

0.08 M:1 5 9 13172125

0.09 M:1 5 9 13172125

fractions NO.

proteins

(mg/ml)

0

400

800

1200

1600

2000

activity

(OD.460 /ml)

�01�&' 3.24 4)1�(+�V>1��&� !�,/�*G+�,1/��//�G(,)4��,G!!� K%�!/����� W!�����$+)�% filtrate W!����`$��P/!�+�� DEAE sepharose CL-6B

,+-'/���/)K/�&P�&'*)������� �,G!!� K%�!/��#�)�)!/P-//)�&P�&'//�+��&'P%�+,K�+K�� 0.07, 0.08 !� 0.09 >+!��� NaCl +� �>1��&�)�%%( & native PAGE !�%�������/+P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� ,WH� J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4���#�)�)!/ 3 J� P-/ J����,�!-/ 0.07, 0.08 !� 0.09 >+!��� NaCl GX'+&P%�+,K�+ !�W��4�+��� ����P$�P%�+%$/*%�&'%�)*)���� �$!�W!/) >)��,�&� J�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �$!� J�%$� POD1, POD2 !� POD3 ��+!��)�� (�01�&' 3.25) J� POD3 ��.�,P!-'/��&'*)�,�H%�&'4�) 4$%� J� POD1 ,P!-'/��&'*)�#��4�) ���`!����)!/#&.�W�,WH�%$� POD1, POD2 !� POD3 ,1U�,/�*G+�,1/��//�G(,)4��,G!!� K%�!/�����W!�������J0��������)�% filtrate

Page 105: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

90

�01�&' 3.25 4) native PAGE K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ���,G!!� K%�!/W!����J0�

�������)�% filtrate �/+)�% o-dianisidine #$/�&' 1 : 4��4��),G!!� K%�!/W!����`$�� PD-10 #$/�&' 2, 3 !� 4: /)�&PW!����`$��P/!�+�� DEAE-sepharose �&'P%�+,K�+K��K/,�!-/ 0.07 (POD1), 0.08 (POD2) !� 0.09 (POD3) M ��+!��)��

������)!/P��.�&.`0�%(��4��� qX�b�P�V4+���(K/ PR-proteins (,/�*G+�,1/��//�G(,)4) �&'+��������������)�% filtrate �X������,!-/� POD1, POD2 !� POD3 +�������qX�b�P%�+���,����� �$!�4��4,��� *)� �$ o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine !�4P/�/!(�(� !�%,!-/�4��4,����&',W+��4+�&'4�)+�qX�b�P�V4+���(�$�f *)� �$ pH �&',W+��4+ P%�+���$/ pH P%�+���$//�VWr0+( !�4��,P+&�&'+&`!�$/P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4

��������&' 3.9 �$!�K�.��/� 4)P$�P%�+��(4�� (�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ������`$������%���������(4�� (�>)%( &�$�f >)��4�,��*)�%$�P$�P%�+��(4�� (���40�&'4�),+-'/`$����� �)�%P/!�+�� DEAE-sepharose CL 6B !��4�+��J �*/>G*G+�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4*)�/&�)�%

,/�*G+�,1/��//�G(,)4 3 */>G*G+� P-/ POD1, POD2 !� POD3 �&'������ �>)%( & !�,1!&'�1����)�%P/!�+�� DEAE-sepharose CL 6B +&P%�+��(4�� (�,�$���� 15, 17 !� 287 ,�$���+!��)�� >) J� POD3 +&P%�+��(4�� (�40+���&'4�) P$�P%�+��(4�� (�K/ POD1 !� POD2 1�`����+���1�(+�V>1��&��%+ 4$%�P$�P%�+��(4�� (�K/ POD3

1 2 3 4

POD1 POD2 POD3

Page 106: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

91

1�`�`�����1�(+�V>1��&��%+ 1�(+�V>1��&��%+�&'*)���.�+&1�(+�V��/P(),1U� 0.0016, 0.044 !� 0.022 ,1/��,GH��� 4��W��� POD1, POD2 !� POD3 ��+!��)��

�����&' 3.9 4)`!P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 !�>1��&��%+�&'*)���� �$!�K�.��/�K/��������(4�� (�

Purification

step

Total protein (mg)

Protein yield (%)

Total activity (u)

Activity recovery (%)

Specific activity (u/mg)

Fold

purification

Crude 82 100 340,000 100 4,146 1 80%

(NH4)2SO4 34 42 182,400 54 5,333 1.29

PD-10 39 48 178,800 53 4,533 1.09

DEAE-Sepharose CL-6B POD1 0.0013 0.0016 214 0.063 64,769 15 POD2 0.036 0.044 2,484 0.73 69,000 17

POD3 0.018 0.022 21,420 6.30 1,190,000 287

3.5.2 =( Km, Vmax � � POD1, POD2 ��� POD3

P$� Km !� Vmax K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (POD1, POD2 !� POD3) ��%�%�)��#$%P%�+,K�+K�� 0.0-1.0 +(!!(>+!��� K/ o-dianisidine, guaiacol, syringaldazine !�4P/�/!(�(� ��1e(�(�(��&'+& H2O2 %�)P$����)0)�!-� 4�&'P%�+�%P!-'� 460, 470, 530 !� 595 ��>+,+�� ��+!��)�� !�%���P$��&'*)�+�,K&����< Lineweaver-Burk (�01�&' 3.27) ���`!�&' 4)�������&' 3.10 P$�K/ Km �&'+��������)4/�)�%4��4,���W!�#�() ��%$�P$� Km K/ POD1, POD2 !� POD3 ,�$���� 0.27, 0.71, 0.91 +(!!(>+!��� (o-dianisidine); %�)*+$*)�, 4.17, 3.92 +(!!(>+!��� (guaiacol); 0.12, 0.02, 0.29 +(!!(>+!��� (syringaldazine) !� 0.23, 0.26, 0.39 +(!!(>+!��� (4P/�!!(�(�) ��+!��)�� W�� �,/�*G+�,1/��//�G(,)4//�,1U� 2 W����&'P-/ ,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',�&'%K�/������4���!(��(� !�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',�&'%K�/��� ROS !�*<>�/,!H�G(� >)�#�P$� Km ,1U���% �$W����&' ��%$ �,/�*G+� ,1/��//�,1/��//�G( ,)4�&' ,�&' %K�/������4�� �!(��(� syringaldazine ,1U�4��4,����&'+&P%�+*%�%$� guaiacol >) POD2 +&P%�+���,���������4���!(��(�+���&'4�) !�,1�&�,�&�4��4,���K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',�&'%K�/��� ROS !�

Page 107: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

92

*<>�/,!H�G(� ��%$� 4P/�/!(�(�+&P%�+*%����������� POD2 !� POD3 +���%$� o-dianisidine 4$%� POD1 ��.�+&P%�+*%����������!�,P&���

�����&' 3.10 4)P$� Km, Vmax !� Vmax/Km K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'����W���(4�� (���4$%�)�%P/!�+�� DEAE-sepharose

Substrate Km (mM) Vmax

(U/mg protein)

Vmax/Km

(U/mg protein/mM) O-dianisidine POD1 0.27 71.43 267.86 POD2 0.71 333.30 466.81

POD3 0.91 3333.30 3662.97

Scopoletin 0.23 1.54 6.77 0.26 3.70 14.06 0.39 71.43 183.15

Guaiacol ND* ND* ND* 4.17 2.22 0.53 3.92 17.24 4.40

Syringaldazine 0.12 4.00 33.60 0.02 1.66 75.45

0.29 100.00 344.83

W+�,W�� ND* ,1U�P$��&'*+$4�+��J%�)*)�

P$� Km K/ POD1 (0.27 +(!!(>+!���, o-dianisidine) �������)!/�&.+&P$���!�,P&��� Km K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (anionic form) �����W!'��1!&�&'`$����� �>)��������/�)�%,�!-/ (NH4)2SO4 40-75 ,1/��,GH��� !�%`$��P/!�+�� DEAE-sepharose CL-6B +& Km ,�$���� 0.286 (Belcarz et al., 2007) �$����P$� Km (1.310 +(!!(>+!���, o-dianisidine) �����G�!,%& (Salvia virgata Jacq) (Dogan et al., 2007) �/�����&. Kim !� Lee (2005) qX�b�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ���!�$+ cationic �&' �*)����`����)W�% >),�&� ,/�*G+�,1/��//�G(,)4#�()�&.%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 Cs !�%%�)P$� Km (o-dianisidine) *)�,�$���� 1.18 +(!!(>+!���

Page 108: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

93

�01�&' 3.26 4)���,K&����< �� Michaelis-Menten

�01�&' 3.27 4)���,K&����< �� Lineweaver-Burk plot

Lee !�PV� (2002) ���,/�*G+�,1/��//�G(,)4�W���(4�� (� !�qX�b�P�V4+���(K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&' �*)����,�/,�,�&+ ��,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'+&K��)>+,!��!,�$���� 58 �(>!)�!��� ����������W���(4�� (�)�%P/!�+�� DEAE sephacel, CM-cellurose !� Sephacryl S-200 ��+!��)�� !�qX�b�P$� Km )�%4��4,���W!�#�() ,#$� o-

Page 109: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

94

dianisidine (0.31 +(!!(>+!���), 4P/�/!(�(� ( 0.01 +(!!(>+!���) !� guaiacol (7.3 +(!!(>+!���) ��%$�+&P$� Km P!����� POD1 (0.27 +(!!(>+!���, o-dianisidine) �&' �*)����,G!!� K%�!/����� �$�$����P$� Km K/4P/�/!(�(� (0.23-0.39 +(!!(>+!���) !� guaiacol (3.92-4.17 +(!!(>+!���) ��,G!!� K%�!/�����

�/�����&.P$� Km K/ POD2 !� POD3 ,+-'/�#� guaiacol ,1U�4��4,��� �&'����,G!!� K%�!/�������!�,P&���P$� Km ��%�(!� 3.8 +(!!(>+!��� �&'`$����������(4�� (�)�%P/!�+�� gel filtration !� sephacryl S-200 (Marquez et al., 2007) ,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'������1�!�+�.��+�� 3.96 +(!!(>+!��� (Deepa and Arumughan, 2002) !������K/,�/���(< 3.7 +(!!(>+!��� (Duarte-Vazquez et al., 2001) �$P$� Km K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4��,G!!� K%�!/������$��������#� 1.66 +(!!(>+!��� (Chen and Asada, 1989) !��$������#��&'+&P$� Km ,�$���� 0.08 +(!!(>+!��� (Mamuka et al., 1997)

Chen !�PV� (2002) qX�b�`!K/ Cu2+ ����W%$����,��([,�(�>�K/`����)W�% >)��������%�%�)���,1!&'� 1!K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (syringaldazine) �� �$!�*/>G*G+� !�1�(+�V!(��(� ������ �,/�*G+�,1/��//�G(,)4)�%P/!�+�� DEAE-sepharose CL-6B qX�b� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4)�%%( & isoelectric focusing �� J�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 4 J��&'P$� pI ,�$���� 3.5, 5.1, 8.3 !� 8.6 >)+&P$� Km ,�$���� 0.255, 0.435, 0.15 !� 0.058 +(!!(>+!��� ��+!��)�� GX'P$� Km ��� ,/�*G+�,1/��//�G(,)4��`����)W�%�&'+&P$� pI ,�$���� 3.5 (0.255 +(!!(>+!���) !� 8.3 (0.15 +(!!(>+!���) P!�����P$� Km K/ POD3 ��,G!!� K%�!/����� (0.29 +(!!(>+!���) !� POD1 (0.12 +(!!(>+!���) ,+-'/�#� syringaldazine ,1U�4��4,���

,+-'/,�&!��)��P%�+,W+��4+K/4��4,������P$� Vmax/Km (catalytic power) GX',1U���% 1��&')&+�������W�4��4,����&',W+��4+ (Dogan et al., 2002) ��%$�P$� catalytic power �� POD1, POD2 !� POD3 K/ o-dianisidine > syringaldazine > 4P/�/!(�(� > guaiacol ������,1�&�,�&�)��!$�% o-dianisidine ,1U�4��4,����&'+&P$� catalytic power �&')&�&'4�) (�����&' 3.10) POD3 ��+&1��4(� (r����������40�%$� POD2, POD1 ��+!��)��

3.5.3 ����=( pH ����;!�#!���=(=�'<�$��'(�� pH

������W� pH �&',W+��4+)�%���%�) POD1, POD2 !� POD3 >)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� GX'1���/�)�% o-dianisidine 7.88 +(!!(>+!��� H2O2 3.3 +(!!(>+!��� �� pH +������#$% 2.0-10.0 !�%%�)P$����,1!&'� 1!K/���)0)�!-� 4�&'P%�+�%

Page 110: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

95

P!-'� 460 ��>�,+�� ���P$�P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �&'*)�+���� �$!� pH ���+�P(),1U�P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*% (relative activity) >)P(),�&����P$�P%�+%$/*%�&'*)�404�)K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 �$!�*/>G*G+���%$� POD1 �����1e(�(�(�,W+��4+�&' pH 6.0 4$%� POD2 !� POD3 �����1e(�(�(��&',W+��4+�&' pH 5.0 GX',1U�P$� pH �&'���1e(�(�(�*)�)&*+$�$����,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'�*+$`$���������W���(4�� (��&'+&P$� pH ,�$���� 5.4 (�����&' 3.11 !� �01�&' 3.28)

���qX�b� pH �&',W+��4+��%�(!� (Marquez et al., 2007) ��P$� pH �����*)�)&�&' 3.8 ,�&'%,�-'/���,/�*G+��&'����.�/0$��4r���&',1U���)�X/�������*)�)&��#$% pH ��.� (Deepa and Arumughan, 2002) Thongsook !� Barrett (2005) qX�b� pH �&',W+��4+�����������(4�� (�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��W!�,�-./,-'/�-# �� pH �&'/0$��#$% 4.5-6.5 4/)P!�/��� pH �&',W+��4+K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4��1�!�+�.��+���&' pH 5.0 (Deepa and Arumughan, 2002) ,W+-/����,/�*G+�,1/��//�G(,)4����!H/�>P!&�&'����P$� pH �&',W+��4+�&' pH 6.0 4��W���,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',1U��!� !�,W+��4+�&' pH 4.0 4��W���,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&',1U���) (Thongsook and Barrett, 2005)

�����&' 3.11 4)P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 �&'���1e(�(�(�*)�,W+��4+�&'#$% pH 2.0-10.0

Relative activity (%) pH

POD1 POD2 POD3 2.0 0.4±2.8 0.7±5.4 0.6±5.9 3.0 0.7±3.3 1.2±5.5 2.8±4.2 4.0 2.8±3.7 5.1±4.6 25.3±2.9 5.0 93.6±3.2 100.0±4.7 100.0±6.5 6.0 100.0±5.5 86.7±5.1 87.8±3.8 7.0 22.8±4.3 26.5±5.4 10.2±9.6 8.0 9.6±5.2 15.7±6.5 10.2±1.5 9.0 6.0±6.7 13.3±9.6 6.5±3.2 10.0 2.2±8.2 1.0±9.6 4.1±9.5

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 111: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

96

0

25

50

75

100

125

0 2 4 6 8 10 12

pH

Relative

activity (%

)

POD1POD2POD3

�01�&' 3.28 4)P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 �&'���1e(�(�(�*)�,W+��4+�&'#$% pH 2.0-10.0

W!�����$+,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'/�VWr0+(W�/ �� pH +������#$% pH 2.0-10.0 ,1U�,%!� 1 #�'%>+ !�%1��� pH K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4,1U� 5.4 !�%%�)P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 >)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� GX'1���/�)�% o-dianisidine 7.88 +(!!(>+!��� H2O2 3.3 +(!!(>+!��� �� sodium acetate ��<,</�� pH 5.4 `!���qX�b���%$��&' 50 ,1/��,GH��� K/P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*% POD1 +&P%�+,4J&� !����1e(�(�(�*)�)&�&'4�)�&' pH 7 (��#$% pH 5.0 y 9.0) ��KV��&' POD2 ,4J&� !����1e(�(�(�*)�)&�&'4�)�&' pH 10.0 (��#$% pH 8.0 - ≥10) 4$%� POD3 +&P%�+,4J&� !����1e(�(�(�*)�)&�&'4�)�&' pH 9 (#$% pH 5.0 - ≥10) (�����&' 3.12) >)��%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4��. 3 */>G+�*G+��&'������ �+����,G!!� K%�!/K/�������.�+&P$�P%�+,4J&��&' pH ���$���� POD2 ,1U�*/>G+�</��+�&',4J&�+���&'4�)�� pH �&',1U�)$� (pH 10.0) 4$%� POD3 ,1U�*/>G+�*G+��&',4J&�+���&'4�)�� pH �&',1U���) (pH 3.0)

POD1 ,�()1e(�(�(��&',W+��4+�&'4�)�&' pH 6.0 !�+&P%�+,4J&��&' pH 7.0 (�01�&' 3.29) ����W�����%$� POD1 ����� !�+&P%�+P��%��4r���&',1U��!� >)��40[,4&P%�+%$/*%,+-'/���1e(�(�(�W�-//0$��4r���&',1U���)W�-/)$�+��f GX'�$���� POD2 !� POD3 ��%$�,�()1e(�(�(�*)�)&��#$% pH �&',1U�)$� (pH 7.9) >) POD2 !� POD3 ��+&P%�+,4J&�P$/�K����/�&' pH 5.0 +&P%�+,4J&�,�('+KX.���+P$�K/ pH �&',�('+KX.� ��%$�+&P%�+,4J&��&'4�)�&' pH 9.0 !� 10.0 ��+!��)�� �������)!/4�,��*)�%$� POD2 !� POD3 +&#$% pH �&' ���$����/$�+����W%$� pH �&',W+��4+ (pH 5.0) ���P%�+,4J&��$/ pH (pH 9.0-10.0)

Page 112: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

97

>)P%�+,4J&�!)!,+-'/ pH !)! GX',1U�*1*)�%$�W!��������$+�&' �$!�#$% pH ,1U�,%!� 1 #�'%>+ /����,�()��� �K/ prosthetics group �&',1U��!�$+ heme ��� active site K/,/�*G+� (Deepa and Arumughan, 2002) �/�����&.+&�������%$�+&���1!$/W+0$ heme �W�,1U�/(4��/$��%),�H%��#$% pH �&'�'���%$� 4 ����W�,/�*G+�,1/��//�G(,)440[,4&P%�+%$/*% (Thongsook and Barrett, 2005) �������)!/�&.4�+��� ��������)!/K/ Marquez !�PV� (2007) GX'��%$�W!�������,/�*G+�,1/��//�G(,)4��%�(!��W���(4�� (�)�%P/!�+�� Sephacryl S 200 !�%qX�b� pH �&',W+��4+ !�P%�+,4J&��$/ pH +&P$�,�$���� 4.0 !� 12.0 ��+!��)��

�����&' 3.12 4)P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 �&',4J&���#$% pH 2.0-10.0 ,1U�,%!� 1 #�'%>+�&'/�VWr0+(W�/

Relative activity (%) pH

POD1 POD2 POD3 2.0 1.4±5.3 0.9±2.7 3.8±2.8 3.0 2.1±0.1 2.2±8.4 15.9±1.9 4.0 3.3±6.3 4.4±4.0 25.8±6.2 5.0 41.4±4.3 25.0±5.8 43.9±6.6 6.0 60.7±6.9 30.6±2.4 56.1±3.5 7.0 100.0±0.4 37.5±3.5 75.8±1.0 8.0 74.5±2.0 47.2±2.6 83.3±2.8 9.0 40.0±4.1 62.5±4.2 100.0±2.7 10.0 1.9±6.2 100.0±4.4 80.3±3.2

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 113: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

98

0

25

50

75

100

125

0 2 4 6 8 10 12

pH

Relative activity (%

)

POD1POD2POD3

�01�&' 3.29 4)P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 �&',4J&���#$% pH 2.0-10.0

3.5.4 ������=(=�'<���� 7�;r6!�'(�<�

��������%�%�)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'/�VWr0+(�$�f >)���,/�*G+�,1/��//�G(,)4*1�$+�&'/�VWr0+( 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 !� 80 /q�,G!,G&4 �&' pH 7.0 ,1U�,%!� 30 ���& !�%���+�1���/�VWr0+(>)��� #$��������.�� KH�$/����*1%�)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)�#� o-dianisidine ,1U�4��4,��� GX'1���/�)�% o-dianisidine 7.88 +(!!(>+!��� H2O2 3.3 +(!!(>+!��� �� sodium acetate ��<,</�� pH 5.4 ��%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'*)����,G!!� K%�!/�����,4J&��&'/�VWr0+( 0-60 /q�,G!,G&4 (�����&' 3.13 !� �01�&' 3.30) ,+-'//�VWr0+(40KX.� (70-80 /q�,G!,G&4) ,/�*G+�,1/��//�G(,)4���*/>G*G+���40[,4&P%�+%$/*% >) POD1 ��PP%�+,4J&�*)�)&�&'/�VWr0+( 60 /q�,G!,G&4 4$%� POD2 ,4J&��&'4�)�&' 40 /q�,G!,G&4 ��KV��&' POD3 ��,4J&��&'4�)�&'/�VWr0+( 50 /q�,G!,G&4

Page 114: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

99

�����&' 3.13 4)P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 �&',4J&���#$%/�VWr0+( 0-80 /q�,G!,G&4 ,1U�,%!� 1 #�'%>+

Relative activity (%) Thermal

POD1 POD2 POD3 0 100.0±3.0 100.0±5.1 100.0±4.5 10 99.0±12.6 95.1±1.2 98.1±1.8 20 100.5±3.9 95.1±3.3 95.4±1.5 30 127.1±2.4 106.9±4.8 132.4±1.8 40 141.0±8.7 122.5±2.7 162.0±13.2 50 143.8±8.4 112.7±13.5 177.8±7.2 60 141.0±11.7 104.9±20.1 102.8±4.8 70 57.6±8.1 91.2±0.3 93.1±5.7 80 13.8±8.4 79.4±10.8 85.6±15.6

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

oC

Relative activity (%

)

POD1

POD2

POD3

�01�&' 3.30 4)P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 ,4J&���#$%/�VWr0+( 0-80 /q�,G!,G&4

+&��������$/�W����&.%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4,1U�,/�*G+�/&�#�()W�X'���-#�&'���$//�VWr0+(40 >) Vamos-Vigyazo, (1980) �������$+,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'

Page 115: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

100

/�VWr0+( 121 /q�,G!,G&4 ,1U�,%!� 6 ���& ,�-'/������W�)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'����J�'%,K&% /$�*��H��+P%�+���$//�VWr0+(K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4��.���KX.�/0$��� W!$�&'��,/�*G+� !�4r�%��&'������qX�b�,/�*G+� >),����/$�(' pH !�4��4,����&'���+��#��)!/ �/�����&.,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'���$//�VWr0+(40 ��%�����)/�+(>�#�() cysteine ,1U�����%�+����4�>�!&,11*�)� (Deepa and Arumughan, 2002)

�������K/ Belcarz !�PV� (2007) �,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��� spring cabbage )�%P/!�+�� DEAE sepharose CL-6B *)�,/�*G+�,1/��//�G(,)4 2 */>G*G+� (cationic !� anionic) qX�b�P%�+���$//�VWr0+(��#$% 20-70 /q�,G!,G&4,1U�,%!� 20 ���& ��%$�,/�*G+�,1/��//�G(,)4��. 2 */>G*G+������*)�)&��#$%/�VWr0+( 20-40 /q�,G!,G&4 ��KV��&',/�*G+�,1/��//�G(,)4�&' �*)����%�(!� ,+-'/qX�b�P%�+��K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'/�VWr0+( 0-80 /q�,G!,G&4 >)�$+,1U�,%!� 1 #�'%>+�&' pH 7, 9 !� 11 ��P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)440�&'4�)�&' 70 /q�,G!,G&4�&' pH 7 4$%��&' pH 11 �&'/�VWr0+()��!$�%40[,4&P%�+%$/*% (Marquez et al., 2007)

3.5.5 ������#��=!����!���'( =�!�( ���� �� �� !��" �� ���#

���������,/�*G+�,1/��//�G(,)4*1�$+�� 1 +(!!(>+!��� K/4��,P+&#�()�$���� *)� �$ EDTA, CuSO4, NaN3, ascorbic acid, NaCl, citric acid, β-Me, salicylic acid, SDS !� DTT �&'/�VWr0+(W�/ ,1U�,%!� 5 ���& !�%���*1%�)P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 ��%$� NaN3, β-Me !� DTT 1 +(!!(>+!��� 4�+��J���.���,�()1e(�(�(�K/ POD1, POD2 !� POD3 *)�/$�4+�0�V� (0 ,1/��,GH��� K/ P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*%) ������.K/ NaN3 ��.�*1 $������ Fe

2+ �&'4������ �/0$���/��/+*�>��,��K/% W%��/��*<�&�W�-//��/+*�>��,��K/��)/�+(>�~(4�()&��&',1U�4$%�1���/�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 +&�������%$� NaN3 (1 +(!!(>+!���) 4�+��J���.���,�()1e(�(�(�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4���`����)W�%*)�/$�4+�0�V� (0.1-0.5 *+>P�>+!����$/+(!!(!(�� 4�+��J���.*)� 50 ,1/��,GH���) (Kay et al., 1967) !������1�!�+�.��+���� NaN3 1 *+>P�>+!��� 4�+��J���.*)�,�& 25 ,1/��,GH��� ,+-'/,�('+P%�+,K�+K��,1U� 20 *+>P�>+!���4�+��J���.*)�/$�4+�0�V� (Deepa !� Arumughan, 2002) NaN3 1 +(!!(>+!��� ����.,/�*G+�,1/��//�G(,)4���%�(!�*)�/$�4+�0�V� (Marquez et al., 2007) ��KV��&' β-Me 4�+��J���.P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 >)������!���� �*)G�!*<)���>P�4���K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 4$%� DTT ���.���,�()1e(�(�(�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4>)������

Page 116: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

101

1e(�(�(���� Fe2+ �&'��(,%V active centre ��W+0$ heme �&',1U� prosthetics group K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (Debowska !� Podstolski, 2001)

Ascorbic acid 4�+��J���.P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4*)�,#$���� +&P�V4+���(,1U� reducing agent >)��� �$>~>)�,��/��/+�W����4���!�$+ ROS (H2O2) �&',1U�4���&',�&'%K�/���1e(�(�(�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 (Weber et al.,1996)

EDTA 1 +(!!(>+!��� �������)!/�&. 4�+��J,�('+ !�!)���,�()1e(�(�(�K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�&'*)����,G!!� K%�!/����� >) EDTA +&P�V4+���(,1U� chelating agent ��� Fe2+ /��/+�&',1U� prosthetics group K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4 +&`!����W�,/�*G+�,1/��//�G(,)4,1!&'��01�$� !�%+&���,1!&'� 1!`!K/P%�+%$/*% �/�����&.P�V4+���(K/4��,P+&1��,r�>!W�W��� Cu2+ 4�+��J,�('+P%�+%$/*%K/,/�*G+�,1/��//�G(,)4�������)!/�&.*)����*/>G*G+� >)/��,1U�`!,�-'/+����+&P�V4+���(,1U�>P <�,�/����KV��&',/�*G+�,1/��//�G(,)4�����4$`!�W�P%�+%$/*%��,G!!� K%�!/�����,�('+KX.����*/>G*G+�

�����&' 3.14 4)`!K/4��,P+&�$/P$�P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3 W!�����������$+�&'/�VWr0+(W�/,1U�,%!� 5 ���&

Relative activity (%) Compound (1 mM)

POD1 POD2 POD3 EDTA 218.5±4.4 87.0±3.7 127.4±13.1 Cu2SO4 254.6±3.3 127.3±6.2 133.9±1.3 NaN3 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 Ascorbic acid 9.2±0.3 0.0±12.5 10.1±0.4 NaCl 197.5±5.6 80.7±1.6 89.9±3.1 Citric acid 238.7±8.7 78.9±1.6 91.1±1.2 β-ME 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 Salicylic acid 75.6±2.7 40.4±22.5 47.6±3.7 SDS 122.7±0.1 58.4±7.5 48.8±2.8 DTT 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

(��%,!K�&' 4),1U�P$�,�!&'��� 3 ����)!/ ± SD)

Page 117: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

102

0

50

100

150

200

250

300

EDTACu2SO4

NaN3

Ascorbic acid Na

Cl

Citric acid

B-ME

Salicylic acid

SDS

DTT Compound (1 mM)

Relative activity (%

)

POD1

POD2

POD3

�01�&' 3.31 4)`!K/4��,P+&�$/P%�+4�+��� �P%�+%$/*%K/ POD1, POD2 !� POD3

Page 118: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

����� 4

���� �������

1. ������������������� ���������� ��� (H. brasiliensis)

- ��������� ���������������������� ����������� BPM-24 ���� B, B1, B2-C �&� D (��� �) 4 ��� ���������� B �����*(+ 1 ����(�, -��./���*(+ 3 �&� 4 ��+ �12����� B1, B2-C �&� D �����*(+ 2 ����� D *3��2 ������ ������������*�2� 4 ���*(+����43&�����5�./���5 6+������ (7,� ��3 ���124� &8���� ��5��(2���*(+ 1 *(+������� D 7&6+�*(+��9�/,�12 �:���*(+�3����7,� �3���3������������ ��)�*(+�����4���62����� ��4���,3����*(+ 3 �&� 4 5��.�����&�./���*(+ 2 ���5�12 ��� ���������������*(+ 2 �(+�,�9���������;����-�7���� ��4� �&����*(+ 1 �(+�,�9����������9��&����6+���+ 7,� ��/�����.9������������ ��5��(2���*(+ 1 �&� 2 *(+������� B2-C �&� D 7&6+�*(+��9�/,�,3������6+�&���5��9���*(+ 1 ���7,� �3���3��������������9

- ��������� ������������*(+�<����4�9-�����*8��.9�������=&���������� 2 ��������*(+ (7,� 49�*�-�743������9��3 BPM-24 (�����49�*�) �&� RRIM600 (������3���) �������9����� ������������ 4 ��� 6+�*(��������7,�7� �1+�����D�(�� 3 ��� (1, 3 �&� 4) 6+�,&�=3������*(+ 3 �&� 4 5�73��E 5��.���� ���7,� ,3���,*(+�<���9���12�. 3 (���*(+ 2) �<����4�95�����*8��.9�������=& �:���&��F)��(�,�������3,�*(+4���62����� ��4� *8��.9*���,3����*(+ 2 �(+�,�9��������49�*�-�7 -��7,� �9 ������*(+ 2 ��������� BPM-24 ./����,3������ RRIM600

- ����4�*������ ������������ 4 ��� ��9��3 guaiacol, syringaldazine, o-dianisidine �&��7���&�4� �� ����3��������,����;����-�7*(+�(+�,�9�� �&3�,76� guaiacol �&� syringaldazine ��94�,5�����-��� �*(+*8�.9�*(+�(+�,�������,������7���.�&����6+���9��7,� ��/������3=���&&� ���� guaiacol �&� syringaldazine (-7����9��7&9����� coniferyl alcohol �&� sinapyl alcohol �1+��:���4�2�49������9�� guaiacyl lignin �&� syringyl lignin 4� &8���� �7���&�4���9�:����4�*�6+�4�,5�����-��� �*(+*8�.9�*(+�8�5��*�2��7���&�4��&� H2O2 Z����&&� �3, o-dianisidine �(+�,�9�������� ������������ -��*8�.9�*(+������������������[\�& �6+��&(+� H2O2 ���:28� ���*(+ 1 �:��������� ������������*(+ (��<3�&9,�����������(+�,�9����������9��&���*�2���� syringyl �&� guaiacol lignin ���*(+ 3 �&� 4 �(+�,�9����� syringyl lignin �(����3���(�, �3,���*(+ 2 �2

103

Page 119: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

104

�(+�,�9��������49�*�-�7*8�.9�*(+�&���7���&�4�, H2O2 �&���9��&������ guaiacyl lignin

- =&���]1�F��������������-��� �����&��&&���,&��������� ��-��� �5��������������������� ( 4 ��� (1, 2, 3 �&� 4) ��)�*(+��&&���,&������D�(������(�, 7&6+�*(+��9��&97(��������*(+ 2 ���������� ���*(+ 2 ������ ��������������&&���,&���<����4�95�������3��&� (��� �)��+ �12 6+��<����4�9�9,� filtrate 5�� P. palmivora (7,� �(+�,�9��������49�*�-�7

2. ��$% �&��������'����(� ��)� *+����,��-����� ���

- .&��5���9���7&&��������� �) 3 �����.� ��&(2�����.���<4����8��&&���,&��*(+�&(+�������_���- -��*8����&(2�����.�� MS *(+4� 2,4-D 7,� �9 �9 1 �&&���� 43�&�4� TDZ 7,� �9 �9 0.1 �&&���� 43�&�4� �&��<-7�� 3 �����/4� ��9�&&��(.&6���3� ���5��4�,�&��������:�&&��(+�,E �&&���,&�� (���5��d4��-4�: 3 ���� 76� ���� lag phase (1-2 ,�), log phase (2-10 ,�) �&� stationary phase (10-14 ,�)

- ���.,3�����5��d4��-4����&&���,&�� (��� �)������ ��������������+ �<��12�&���&���4�������+ ������ ������������ .&������9��&(2���,�*(+ 10 ����� ���������������.,3������,���5��d4��-4

3. ��/�'(���0'�������1�2��� filtrate

- filtrate 5�� P. palmivora *(+&(2�����.���<4� Henninger (-��4(.&����� 10 ��-&��&�� *(+ (7�)� ��4��:��&���4� (�6+�e���,3� palmivorein (7,� �����*��h*(��*3���� filtrate ��95�� P. palmivora *(+&(2�����.���<4� PDB �&9,=3����*8��.9�����*��h����3,

4. ��:; <�=��%� %�1��>*'-�� filtrate ����$)?��� P. palmivora %��������'������� ���

- �&&���,&���������*(+�3 �9,� filtrate *(+7,� �9 �9 0.300 ��� 43� 1 ��� �&&���,&�� �� ������8�������7���.��7���&�4��<����*(+ 80 ��+,- � ��� ��������������� S-POD ��+ �12*(+,&� 56 �&� 80 ��+,- � *8�.9�*(+��������� H2O2 ���:28� (*(+ 56 ��+,- �) �&��&���7���&�4� (*(+ 80 ��+,- �) O-POD *8�.9�*(+�(+�,�9��������������������������[\�& �&� H2O2 4�,5�����+,- �*(+ 32 �&� 56 4� &8���� ��)�*(+ G-POD ���

Page 120: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

105

Z-POD *(+*8�.9�*(+�(+�,�9����������9��&����6+���+ 7,� ��/�����.9����&&�5������<����4�9�&&���,&���9,� filtrate (�����+ �12*(+ 32, 64 �&� 48, 72 ��+,- � 4� &8����

5. ���&�������������� ������*+�����1�2����-'���>0A���%/�����������

- ��� ������������*(+=3�7�&� � ion exchange ��� DEAE-sepharose CL-6B ( 3 ��-��� � ��9��3 POD1, POD2 �&� POD3 (7,� �����*��h*3���� 15, 17 �&� 287 *3� 4� &8���� ��� ������������*�2� 3 ��-��� ���+ �12.&��5��������4�9�9,� filtrate 5�� P. palmivora �(+�,�9���������;����-�7�������� (73� Km ��� POD1, POD2 �&� POD3 *3���� 0.27, 0.71, 0.91 �&&�- &��� (o-dianisidine), 0.23, 0.26, 0.39 �&&�- &��� (�7��&&�4�), ,��� 3��9, 4.17, 3.92 �&&�- &��� (guaiacol) �&� 0.12, 0.02, 0.29 �&&�- &��� (syringaldazine) 4� &8���� 5��73� Km singaldazine �� ���5�������� ������������*�2� 3 ��-��� ���9�(*(+���

- 8� o-dianisidine *(+�:����4�*. ��� *(+��� (catalytic power) -�� POD1, POD2 �&� POD3 5�*8��D�������. ��� *(+ pH 6.0, 5.0 �&� 5.0 4� &8���� �:73� pH *(+*8��D���������9�(� 343��5����� ������������*(+���� 3=3����*8��.9�����*��h*(+ (73� pH *3���� 5.4 �&� (7,� ��(��*(+ pH 7.0, 9.0 �&� 10.0 4� &8���� ��� ����������������������*(+=3����*8��.9�����*��h����3,5���&&���,&��������� (7,� *��Z�,�*(+�:�&���1��3��

- POD1, POD2 �&� POD3 *(+��95���&&���,&�����������(���&�*8�����9�(*(+��).Z< � 0-60 ��]��&�(�� 6+���).Z< ��<��12*(+ 70-80 ��]��&�(�� ��� ������������*����-��� �5��<d�(�7,� ,3���,

- 1 �&&�- &��� ��� NaN3, β-Me �&� DTT �� ��������2��������D���������� POD1, POD2 �&� POD3 ��9��3��� �<�)� ��)�*(+ NaCl, SDS �&� citric acid �3,���+ 7,� ,3���,��� POD1 �435������2�7,� ,3���,��� POD2 �&� POD3

Page 121: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

106

������������

���� ��� �. 2544. ���� ������������������������ !����������� ����" #$�����.�%�����&��%������'(�)*+,� �� �����-������ '(��%���*��� �� �.��%��.

���#&/� �!/��&0%!�. 2546. ��.*/��-! ����*�&1��2��%���� ��-�!�*�&1� (germplasm) �/�=�2>"�!��!�����%?! >� !���-�!�� Phytophthora palmivora. �%�����&��%������'(�)*+,� �� ��������.'� '(��%���*��� ���.��%��.

��1)� )1@(�*��$��. 2545. A� !�!>�����>"�!��!�� !���-�!�� Phytophthora botryose �$!=)��������*�&1��2��%�� (BPM-24) ����*�&1�!$!��! (RRIM600). �%�����&��%������'(�)*+,� �� ��������.'� '(��%���*��� ���.��%��.

�1�!�'��� /���'!. 2547. I!�>I>'� !���!��!! >�/�%�J� �J�� 2!� *) ���2��%����. !��������. �%�����&��%������'(�)*+,� �� ��������.'� '(��%���*��� �� �.��%��.

�*�%� �������� , �'&�� �*����� �����1)� )1@(�*��$��. 2544. �L ����!)��!� !���������$!��!�����%?! >��� ��-�!�� Phytophthora spp. M�.�������.'� .+��%������� '(��%���*��� ���.��%��.

�������� � -�!'+�. 2538. �%.�. ��������������-�!��-J!�-�, 158 (�2�. �1��%�P : M�.�������%�� .+��%������� '(��%���*�� R�������.

��'���� �1������ ����'�!� ������. 2542. A� !�I>��I.���$! ���������>���>*�����*� ���� ��� ������������������� !��������. �. �� ���.��%�� �%%. 21, 169-177.

�*�&���� ����1���+. 2547. �L ����!)��!� !��.��*���������$!��-�!�� Phytophthora palmivora. �%�����&��%������'(�)*+,� �� ��������.'� '(��%���*��� �� �.��%��.

Page 122: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

107

��?@'� ��.!1/'. 2548. �L�*'�*�&���(�$���>���� ���!�������� *)>"�!��!�����!�>�� !���-�!�� Phytophthora palmivora. �%�����&��%������'(�)*+,� �� ��������.'� '(��%���*��� ���.��%��.

I������ �T������. 2525. (�* �����.�-�, 386 (�2�. �1��%�P : M�.�����.�-� .+�� R������� '(��%���*�� R�������.

M�+1��� (�"�1' ����'�!� ������. 2546. �U��*�%�J'�A��$! ����J'��'�+��� ���-/��� !��!/A* �(���� (Gnetum gnemon Linn.) �/��&� ��������������-�!��-J!. �.�� ���.��%�� �%%. 25, 565-575.

�'�!� ������. 2539. ��������������-�!��-J!�-� (�* ������-���R] �%�J�^�.*@, 126 (�2�. �� �� : M�.����-������ .+�%�*��� �&��'��� '(��%���*��� �� �.��%��.

�'�!� ������ ������� ��� �. 2543. A� !�!��1A�������.�).1' �����@��)���$! ����2���.��*�=��-�� 1� Garcinia ������� R�� 16, 31-45.

!1I� �*�%����%�, ���� �*�%����-!�, ������ �$'�-J��1 ��'��, !��'+� ������1���, !�1��+� ��'�� ��� � R�� ��)��%. 2546. ���^������.=����������)�%��)�*�&1�. )%.*/�$!�����*�����*_���������. �'��� ��� R�� �#�)*���*����.

Adachi, T., Wang, J. and Wang, X.L. 2000. Age-related change of plasma extracellular-superoxide dismutase. Clin. Chim. Acta. 290, 169k178.

Aibara, S., Yamashita, H., Mori, E., Kato, M. and Morita, Y. 1982. Isolation and characterization of five neutral isozymes of horseradish peroxidase. Biochem. 92, 531-539.

Arora, D.S., Chander, M. and Gill, P.K. 2002. Involvement of lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase in degradation and selective ligninolysis of wheat straw. Int. Biodet. Biodeg. 50, 115-120.

Page 123: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

108

Aquino-Bolanas, E.N. and Mercado-Silva, E. 2004. Effects of polyphenol oxidase and peroxidase activity, phenolics and lignin content on the browning of cut jicama. Post. Biol. Tech. 33, 275-283.

Asada, K. and Takahashi, M., 1987. Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. In: Kyle, D.J., et al. (Eds.), Photoinhibit. 227k287.

Asada, K. 1999. The waterkwater cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 601k639.

Azpilicueta, C.E., Zawoznik, M.S. and Tomaro, M.L. 2004. Phytoalexins synthesis is enhanced in ground nut plants inoculated with Bradyrhizobium sp. (Arachis). Crop. Prot. 23, 1069k1074.

Belcarz, A., Grazyna, G., Barbara, K. and Pawel, K. 2007. Spring cabbage peroxidases k Potential tool in biocatalysis and bioelectrocatalysis. Phytochem. 69, 627k636.

Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

Breton, F., Sanier, C. and Auzac, J. 1997. Scopoletin production degradation in relation to resistance of Hevea brasiliensis to Corynespora cassiicola. J. Plant Physiol. 151, 595-602.

Brodier, C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. Biol. Chem. 56, 1604k1607.

Bruce, R.J. and West, C.A. 1989. Elicitation of lignin biosynthesis and isoperoxidase activity by pectin fragments is suspension culture of castor beans. Plant Physiol. 91, 889-897.

Buffard, D. Bread, C. Huystee, R.B. Asemota, O. Pierre, M. Dang Ha D.B. and Esnault, R. 1990. Molecular cloning of complementary DNAs encoding two cationic

Page 124: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

109

peroxidases from cultured peanut cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8874k8878.

Chee, K.H. 1968. Phytophthora leaf disease in Malaysia. J. Rubb. Res. Inst. Malaya. 21, 79-87.

Chen, E., Chen, Y., Chen, L. and Liu, Z. 2002. Effect of copper on peroxidase activity and lignin content in Raphanus sativus. Plant Physiol. Biochem. 40,439-444.

Chen,G. and Asada, K. 1989. Ascorbate peroxidase in tea leaves: Occurrence of two isozymes and the differences in their enzymatic and molecular properties. Plan Cells Physiol. 30, 1987-1998.

Christophe, H., Mohamed, A., Ophélie, F., Lamine, B., Eric, D., François, M., Frédéric, L. and Eric, L. 2008. Molecular characterization of cell death induced by a compatible interaction between Fusarium oxysporum f. sp. linii and flax (Linum

usitatissimum) cells. Plant Physiol. Biochem. Article in Press, 1-11.

Churngchow, N. and Rattarasarn, M. 2000. The elicitin secreted by Phytophthora palmivora, a rubber tree pathogen. Phytochem. 54, 33-38.

Churngchow, N. and Rattarasarn, M. 2001. Biosynthesis of scopoletin in Hevea brasiliensis leaves inoculated with Phytophthora palmivora. J. Plant Physiol. 158, 875-882.

Clarke, D.D. 1973. The accumulation of scopolin in potato tissue in response to infection. Physiol. Plant Pathol. 3, 347k358.

Comhair, S.A., Bhathiena, P.R., Farver, C., Thunnissen, F.B. and Erzurum, S.C. 2001. Extracellular glutathione peroxidase induction in asthmatic lungs: evidence for redox regulation of expression in human airway epithelial cells. FASEB J. 15, 70k78.

Cooper, R.M. and Williams, J.S. 2004. Elemental sulphur as an induced antifungal substance in plant defence. J. Exp. Bot. 55, 1947-1953.

Page 125: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

110

Daayf, M., Bellaj, M., Hassni, F. and Hadrami, I. 2003. Elicitation of soluble phenolics in date palm (Phoenix dactylifera) callus by Fusarium oxysporum f. sp. albedinis culture medium. Envi. Exp. Bot. 49, 41-47.

Davis, B.J. 1964. Disc electrophoresis ΙΙ: method and application to human serum protein. Ann. NY. Acad. Sci. 121, 404-427.

Dat, J. 2000. Dual function of the active oxygen species during plant stress responses, Cell Mol. Life Sci. 57, 779k795.

Debowska, R. and Podstolski, A. 2001. Properties of diphenolase from Vanilla planifolia (Andr.). Shoot primordia cultured in vitro. J. Agri. Food Chem. 49, 3432k3437.

Deepa, S. and Arumughan, C. 2002. Purification and characterization of soluble peroxidase from oil palm (Elaeis guinensis Jacq.) leaf. Phytochem. 61, 503k511.

Desjardin, P.R., Zentmyer, G.A. and Reynolds, D.A. 1969. Electron microscope observations of the flagellar hairs of Phytophthora palmivora zoospores. Can. J. Bot. 47, 1077-1079.

Dogan, S., Turan, P., Dogan, M., Arslan O. and Alkan, M. 2007. Variations of peroxidase activity among Salvia species. J. Food Eng. 79, 375k382.

Dogan, M., Arslan, O., & Dogan, S. 2002. Substrate specificity, heat inactivation and inhibition of polyphenol oxidase from different aubergine cultivars. Int. J. Food Sci. Tech. 37, 415k423.

Duarte-Vazquez, M. A., Garcia-Almendarez, B. E., Regalado, C., Whitaker, J. R. 2001. Purification and properties of a neutral peroxidase isozyme from turnip (Brassica napus L. var. purple top white globe) roots. J. Agric. Food Chem. 49, 4450-4456.

Edwards, R., Stones, T. M., Gutihrrez-Melladot, M. C. and Jorrin, J. 1997. Characterization and inducibility of a scopoletin degrading enzyme from sunflower. Phytochem. 45, 1109-1114.

Page 126: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

111

Egea, C., Ahmad, A.S., Candela, M. and Candela, M.E. 2001. Elicitation of peroxidase activity and lignin biosynthesis in pepper suspension cells by Phytophthora capsici. J. Plant Physiol. 158, 151-158.

Erwin, D.C. and Riberio, O.K. 1996. Phytophthora palmivora. In Chee, K.H., Phytophthora Disease Worldwide. pp. 243-244. Minnessota : APS Press.

Friend, J., Reynolds, S.B. and Aveyard, M.A. 1973. Phenylalanine ammonia lyase, chlorogenic acid lignin in potato tuber inoculated with Phytophthora infestans. Physiol. Plant Pathol. 3, 495-507.

Jung, W.J., Jin, Y.L., Kim, Y.C., Kim, K.Y., Park, R.D. and Kim, T.H. 2004. Inoculation of Paenibacillus illinoisensis alleviates root mortality, activates of lignification-related enzymes, and induction of the isozymes in pepper plants infected by Phytophthora capsici. Biol. Control. 30, 645-652.

Gabaldón, C., López-Serrano, M., Pomar, F., Merino, F., Cuello, J., Pedreño, M.A. and Ros Barceló, A. 2006. Characterization of the last step of lignin biosynthesis in Zinnia elegans suspension cell cultures. FEBS Letters 580, 4311k4316.

Garcia, D., Cazaux, E., Rivano, F. and Auzac, J.D. 1995a. Chemical and structal barriers to Microcyclus ulei, the agent of South American leaf blight, in Hevea spp. Eur. J. For. Path. 25, 282-292.

Garcia, D., Sanier, C., Machiex, J.J. and Auzac, J. 1995b. Accumulation of scopoletin in Hevea brasiliensis infected by Microcyclus ulei (P. Henn.) V. ARX and evaluation of its fungi toxicity for three leaf pathogens of rubber tree. Physiol. Mol. Plant Pathol. 47, 213-223.

Gaspar, T., Penel, C., Thorpe, T. and Grcppin, H. 1982. A Survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants, p. 1. University of Geneva Press, Geneva, Switzerland.

Giesemann, A., Biehland, B. and Lieberei, R. 1986. Identification of scopoletin as a phytoalexin of the rubber tree Hevea brasiliensis. Phytopathol. 117, 373-376.

Page 127: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

112

Gómez-Vásquez, R., Day, R., Buschmann, H., Randles, S., Beeching, J.R. and Cooper, R.M. 2004. Phenylpropanoids, phenylalanine ammonia lyase and peroxidases in elicitor-challenged cassava (Manihot esculenta) suspension cells and leaves. Ann. Bot. 94, 87-97.

Goy, P. A., Signer, H., Reist, R., Aichholz, R., Blum, W., Schmidt, E. and Kessmann, H., 1993. Accumulation of scopoletin is associated with the high disease resistance of the hybrid Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi. Planta, 191-200.

Gutierrez, M.C., Parry, A.,Tena, M., Jorrin, J. and Edwards, R. 1994. Abiotic elicitation of coumarin phytoalexin in sunflower. Phytochem. 38, 1185-1191.

http://ceris.purdue.edu/napis/gif/sod-np.jpg. (�-).2��*�%�J 10/02/2551)

http://genomics.energy.gov/gallery/b2b/gallery-02.html. (�-).2��*�%�J 11/02/2551)

http://InterProHeam peoxidase,plant-fungal-bacterial.html. (�-).2��*�%�J 03/03/2551)

http://www.kanchanapisek.or.th/kpc/BOOK/chapter4/t3-4-l1.htm#sect1. (�-).2��*�%�J 26/02/2551)

http://www.gebhardt.com.au/durian/phytophthora.html. (�-).2��*�%�J 10/03/2551)

http://www.botany.hawaii.edu/�/Bot201/Oomyceta/Phytophthora.jpg. (�-).2��*�%�J 29/01/2551)

http://www.padil.gov.au/viewPestLargeImage.aspx?id=3... (�-).2��*�%�J 12/03/2551)

Kapich, A.N., Steffen, K.T., Hofrichter, M. and Hatakka, A. 2005. Involvement of lipid peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. Biochem. Biophy. Res. Commun. 330, 371-377.

Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C. and Pegler, D.N. 1995. Ainsworth and Bisby�s Dictionary of the Fungi. 8th ed. Willingford, UK : CAB International.

Page 128: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

113

Jung, W.J., Jin, Y.L., Kim, Y.C., Kim, K.Y., Park, R.D. and Kim, T.H. 2004. Inoculation of Paenibacillus illinoisensis alleviates root mortality, activates of lignification-related enzymes, and induction of the isozymes in pepper plants infected by Phytophthora capsici. Biol. Control 30, 645-652.

Kauffmann, S., Legrand, M., Geoffroy, P. and Fritig, B. 1987. Biological function of; pathogenesis-related' proteins: four PR proteins of tobacco have 1,3-beta-glucanase activity. EMBO 6, 3209-3212.

Kay, E., Leland, M., and Jow, Y. 1967. Peroxidase isoenzymes from horseradish roots. J. Biol. Chem. 242, 2470k2473.

Kim, Y. H., Kim, Y., Cho, E., Kwak, S., Kwon, S., Bae, J., Lee, B., Meen, B. and Huh, G. H. 2004. Alterations in intracellular and extracellular activities of antioxidant enzymes during suspension culture of sweetpotato. Phytochem. 65, 2471-2476.

Kim, S. and Lee, D. 2005. Purification and characterization of a cationic peroxidase Cs in Raphanus sativus. Plant Physiol. 162, 609-617.

Kishimoto, T., Uraki, Y. and Ubukata, M. (2005). Easy synthesis of β-O-4 type lignin related polymers. Org. Biomol. Chem. 3, 1067 k 1073.

Kitajima, S. and Sato, F. 1999. Plant Pathogenesis-Related Proteins: Molecular Mechanisms of Gene Expression and Protein Function. Biochem. 125, 1-8.

Kuc�, J. 1995. Phytoalexins, stress metabolism, and disease resistance in plants. Ann. Rev. Phytopathol. 33, 275-291.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Lee, S., Kim, E.,and Lee, M. 2002. Purification and characterization of a cationic isoperoxidase from scented-geranium. Phytochem. 58, 859k864.

Page 129: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

114

Li, Z.S., Alfenito, M., Rea, P.A., Walbot, V. and Dixon, R.A. 1997. Vacuolar uptake of the phytoalexin medicarpin by the glutathione conjugate pump. Phytochem. 45, 689-693.

Macri, F., Braidot, E., Petrussa, E. and Vianello, A. 1994. Lipoxygenase activity associated to isolated soybean plasma membranes. Biochem. Biophys. Acta. 1215, 109-14.

Mamuka, K., Winkel, C. and Thorneley, R. 1997. Purication and characterization of a novel class III peroxidase isoenzyme from tea leaves. Plant Physiol. 114, 1237-1245.

Mandal S. and Mitra A. 2008. Reinforcement of cell wall in roots of Lycopersicon esculentum through induction of phenolic compounds and lignin by elicitors. Physiol. Mol. Plant Pathol. Article in press.

Marco, A., Guzzardi, P. and Jamet, E. 1999. Isolation of tobacco isoperoxidase accumulated in cell-suspension culture medium and characterization of activities related to cell wall metabolism, Plant Physiol. 120, 371k381.

Marquez, O., Waliszewski, K. N., Oliart, R. M. and Pardio, V. T. 2007. Purification and characterization of cell wall-bound peroxidase from vanilla. Food Sci. Tech. article in press.

Martinez, A. S., Fortea, M.I., Amor F.M. and Nez-Delicado, E. 2008. Kinetic characterization and thermal inactivation study of partially purified red pepper (Capsicum annuum L.) peroxidase. Food Chem. 107, 193-199.

Mittler, R.O. 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance, Trend Plant Sci. 7, 405k410.

Mohammadi, M. and Kazemi, H. 2002. Change in peroxidase and phenol oxidase in susceptible and resistance. Plant Sci. 162, 491-498.

Page 130: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

115

Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15, 473k479.

Núñez-Delicado, E., Bru, R., Sánchez-Ferrer, A. and García-Carmona, F. 1996. Triton X-114-aided purification of latent tyrosinase, J. Chromatogr. 680, 105k112.

Núñez-Delicado, E., Sojo, M.M., García-Carmona, F. and Sánchez-Ferrer, A. 2003. Partial purification of latent persimmon fruit polyphenol oxidase, J. Agri. Food Chem. 51, 2058k2063.

Ookawara, H., Eguchi, M., Nishimura, T., Kizaki, E., Takayama, D., Saitoh, H. O. and. Suzuki, K. 2003. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation of extracellular superoxide dismutase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 914k919.

Papadakis, A.K., Siminis, C.I. and Roubelakis-Angelakis, K.A. 2001. Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts. Plant Physiol. 126, 434-441.

Perez, F.J., Villegas, D. and Mejia, N. 2002. Ascorbic acid and flavonoid-peroxidase reaction as a detoxifying system of H2O2 in grapevine leavea. Phytochem. 60, 573-580.

Perrone, S.T., McDonald, K.L., Sutherland, M.W. and Guest, D.I. 2003. Superoxide release is necessary for phytoalexin accumulation in Nicotiana tabacum cells during the expression of cultivar-race and non-host resistance towards Phytophthora spp. Physiol. Mol. Plant Pathol. 62, 127-135.

Polkowska-Kowalczyk, L., Wielgat, B. and Maciejewska, U. 2003. Changes in the antioxidant status in leaves of Solanum species in response to elicitor from Phytophthora infestans. J. Plant Physiol. 164, 1268-1277.

Polkowska-Kowalczyk, L. and Maciejewska, U. 2001. The oxidative processes induced in cell suspensions of Solanum species by culture filtrate of Phytophthora infestan. J. Plant Physiol. 56, 235-244.

Page 131: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

116

Quiroga, M., Guerrero, C., Botella, M.A., Barcelo, A., Amaya, I., Medina, M.I., Alonso, F.J., de Forchetti, S.M., Tigier, H. and Valpuesta, V. 2000. A tomato peroxidase involved in the synthesis of lignin and suberin. Plant Physiol. 122, 1119-1128.

Rattarasarn, M. 2003. Defense response of Hevea brasiliensis against zoospores and elicitin from Phytophthora palmivora. Ph. D. dissertation in Biochemistry Prince of Songkla University.

Ravindra, N., and Van-Huystee, R. 1984. Characterization of peroxidase in plant cells. Plant Physiology, 75, 956k958.

Ros-Barcelo, A., Pomar, F., Lopez-Serrano, M., Martinez, P. and Pedreno, M.A. 2002. Developmental regulation of the H2O2-producing system and of a basic peroxidase isoenzyme in the Zinnia elegans lignifying xylem. Plant Physiol Biochem 40, 325k332.

Sakharov, I.Y. and Sakharova, I.V. 2002. Extremely high stability of African oil palm tree peroxidase. Biochem. Biophys. Acta. 1598, 108-114.

Sánchez-Ferrer, A., Bru, R. and García-Carmona, F. 1989. Novel procedure for extraction of a latent grape polyphenol oxidase using temperature-induced phase separation in Triton X-114, Plant Physiol. 91, 1481k1487.

Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. and García-Carmona, F. 1993. Partial purification of soluble potato polyphenol oxidase by partitioning in an aqueous two-phase system, J. Agri. Food Chem. 41, 1583k1586.

Santos-Gomes, P.C., Seabra, R.M., Andrade, P.B. and Fernandes-Ferreira, M. 2002. Phenolicantioxidant compounds produced by in vitro shoots of sage (Salvia officinalis L.). Plant Sci. 162,981-987.

Shannon, M.L., Key, E. and Lew, Y.J. 1966. Peroxidase isozymes from horseradish root. J. Biochem. 9, 2166-2172.

Page 132: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

117

Song, J., I. Kanazawa, S.K., Murata, T. and Yokoyama, K.K. 1999. Color coding the cell death status of plant suspension cells. BioTech. 26, 1060-1062.

Sushamakumari, S., Asokan, M.P., Anthony, P., Lowe, J.B. and Davey, M.R. 2000. Plant regeneration from embryogenic cell suspension-derived protoplasts of rubber. Plant cell 2, 253-261.

Syros, T., Yupsanis, T., Zafidiadis, H. and Economou, A. 2004. Activity and isoforms of peroxidase, lignin and anatomy, during adventitious rooting in cuttings of Ebenus cretica L. J. Plant Physiol. 161, 69-77.

Takao, K.,Yasumitsu, U. and Makoto, U. 2005. Easy synthesis of b-O-4 type lignin related polymers. Org. Biomol. Chem. 3, 1067k1073.

Tan, A.M. and Low, F.C. 1975. Phytoalexin production by Hevea brasiliensis in response to infection by Colletotrichum gloeosporioides and its effect on the other fungi. Proceeding of Intercational Rubber Conference. RRIM600. Kuala Lumpur, Malaysia. 3, 217-227.

Te-chato, S. and Chartikul, M., 1993a. Certain factors affecting callus formation integument of immature seed. Songklanakarin J. Sci. Technol. 15, 227-233.

Te-chato, S. and Chartikul, M., 1993b. Tissue culture of rubber : somatic embryogenesis induction from integument subsequent to plantlet regeneration. Songklanakarin J. Sci. Technol. 15: 235-241.

Te-chato, S., Niyagij, C. and Suranilpong, P. 2002. Callus formation from protoplasts derived from cell suspension culture of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg.). Thai J. Agric. Sci. 35, 165-173.

Thongsook, T., and Barrett, M. 2005. Purification and partial characterization of broccoli (Brassica oleracea Var. Italica) peroxidasas. J. Agri. Food Chem. 53, 3206k3214.

Page 133: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

118

Underhill, S. and Critchley, C. 1995. Cellular localisation of polyphenol oxidase and peroxidase activity in Litchi chinensis Sonn. Pericarp. Aust. J. Plant Physiol. 22, 627 1 632.

Valle, T., Lopez, J.L., Hernandez, J.M. and Corchete, P. 1997. Antifungal activity of scopoletin and its differential accumulation in Ulmus pumila and Ulmus

campestris cell suspension cultures infected with Ophiostom ulmi spores. Plant Sci. 125, 97-101.

Vamos-Vigyazo, L., 1981. Polyphenol oxidase and peroxidase in fruits and vegetables. Crit. Rev. Food Sci. Nutrit. 15, 49k127.

Van Huystee, R.B. and Zheng, X. 1993. Cationic peanut peroxidase and the oxidation of ferulic acid. Phytochem. 34, 933-939.

Vianello, A., Zancani, M., Nagy, G. and Macri, F. 1997. Guaiacol peroxidase associated to soybean root plasma membrane oxidizes ascorbate. J. Plant Physiol. 150, 573-577.

Wang, W., Li, S., Zhao, X., Du, Y. and Lin, B. 2008. Oligochitosan induces cell death and hydrogen peroxide accumulation in tobacco suspension cells. Pest. Biochem. Physiol. 90, 106-113.

Youngs, H.L., Sundaramoorthy, M. and Gold, M.H. 2000. Effect of cadmium on manganese peroxidase competitive inhibition of Mn2+ oxidation and thermal stabilization of the enzyme. Eur. J. Biochem. 267, 1761-1769.

Zemek, J., Kosikova, B., Augustin, J. and Joniak, D. 1979. Antibiotic properties of Lignin components. Folia Microbiol. 24, 483k486.

Page 134: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

�������

Page 135: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

120

1. ���� ���������������������� Potato Dextrose Agar (PDA) ��� PDA �� ��� 39 ���� ������������������ ���� 1 � �� ���������

autoclave '(�)*�+,-� 121 )./�01�01(�2 0�3�0��� 15 ��'( ' �.����+�)*�+,-� �5�.������ 50-60 )./�01�01(�2 ���0'�289���������/9��0:;�)02��<8�/-��=���. 9 01�� 0��� 9���� 10 � �� � �� 2. ���� ����&'(�(��) '���*��+,���'& Tris-Tricine (Tris-Tricine sample buffer)

0��(��>�?0?)�=���)�8�.@5�����:� Tris-HCl 0.5 @����=, pH 6.8 <2� Glycerol 2.4 � �� � ��, SDS 10 0�)�=01O��= 1 � �� � ��, 2-mercaptoethanol 0.2 � �� � �� ��� Coomassie brilliant blue G-250 0.5 0�)�=01O��= �� ���� 0.4 � �� � �� 2*5'������>�� �����+��5� 10 � �� � �� @5�����:������������)5�)))� (deionized water) 4 � �� � �� 3. ���� ����+�� '���*�� Tricine-SDS-PAGE

@5�������2�����)�8�. 3 28��<2���>>�?0?)�=���)�8�. (sample buffer) 1 28��'(��5�9�����0��(����Z�) 2 9��5�2�������'(��([���0Z��Z��Z).@���(����'(���).��� �8)�'��) 0�O�@'�?)�(1 2��).���2�����)�8�.�����������05;)5��� 5 ��'(

4. ���� ����=>� ���� �?��@�A�����=����B� A,� (low molecular weight)

���@���(�����\��'(��(���@�0��*�������09;)9�.��> Tris-Tricine sample buffer ��)����28�� 1 : 20 �8)����������'(�)*�+,-� 95 )./�01�01(�2 0�3�0��� 5 ��'( ' �.����+�0�O� ���������:�[���.�� 10 ��@[�� ���8) 1 :8).09� 5. ���� ����+���F���G&�H(��)H ����� Coomassie brilliant blue G-250 9����� 100 � �� ���� �� 0)'��)� 95 0�)�=01O��= �� ���� 50 � �� � �� 9������0� � phosphoric acid 85 0�)�=01O��= �� ���� 100 � �� � �� [��+�0Z���������09;)9�.2�������5�������������+��(�� ���� 1 � �� ��).�8)�������:� 6. ���� ����=>� ���� �?�� ����� BSA 9����� 1 � �� ���� ������������� ���� 1 � �� � �� +��.9�����������09;)9�.5�������������+��([���0Z��Z�� 5, 10, 15, 20 ��� 25 ��@[������8) 100 ��@[�� ��

Page 136: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

121

7. �����>�K��L=>� ��=H��KM�G&�H(��)H +��� ���@���(�Z).2�����)�8�.���� _(Z). Bradford (1976) @5��:�2�����)�8�.�� ���� 100 ��@[�� �� '���a � � ����>2��������>�5?)�=5 �� ���� 3 � �� � �� <2��+�0Z��������.' �.���'(�)*�+,-� +�).��� 10 ��'( 9�������������5[8����5-5��;��2.'(�[������[�;�� 595 ��@�0��� [�����+�[���0Z��Z��Z).@���(���2�����)�8�. @5����[8����5-5��;��2.Z).2�����)�8�.��0��(�>0'(�>��>���?����\�� BSA

y = 0.0345x

R2 = 0.9921

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25 30

BSA (ug/ ul)

O.D

. 59

5 nm

���?����\��@���(� (BSA) @5��:��� ���Z).@���(� BSA 0�3� 5, 10, 15, 20 ��� 25 ��@[����� )8��[8����5-5��;��2.'(� 595 ��@�0��� 8. ���� ����+��O��K K��� �?��

�����2[)b)� � � 9����� 96.1 � �� ������ 0)'��)� 95 0�)�=01O��= 10 � �� � �� 9��5�2[)b)� � �'(��([���0Z��Z�� 50 � �� @����= 9������'�����09;)9�.2������� 2[)b)� � ��>> serial dilution �+��5�2�������'(��([���0Z��Z��Z).2[)b)� � �0'8���> 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 ��� 0.05 ��@[�@����= ������5�> ����9c.���2�����������5[8����0�;).�2.5���0[�;�). spectrofruorometer '(�[������[�;������*�� (λ excitation) 340 ��@�0������[������[�;����5��8)� (λ emission) 440 ��@�0��� 1c�.0�3�[������[�;��0eb�����Z). 2[)b)� � � ���?����\��2[)b)� � �@5��:�[���0Z��Z��Z).2[)b)� � �0�3� 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 ��� 0.05 ��@[�@����= )8��[8����0�;).�2.'(�[������[�;������*�� 340 ��@�0���

Page 137: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

122

(λ excitation) ���[��������5��8)� 440 ��@�0��� (λ emission) 1c�.0�3�[������[�;��0eb�����Z).2[)b)� � �

y = 121.32x

R2 = 0.9988

0

40

80

120

160

200

240

280

320

360

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

scopoletin (uM)

Inte

ns

ity

���?����\��2[)b)� � � @5��:�[���0Z��Z��Z).2[)b)� � �0�3� 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 ��� 2.5 ��@[�@����= )8��[8����0�;).�2.'(�[������[�;������*�� 340 ��@�0��� (λ excitation) ���[������[�;����5��8)� (λ emission) 1c�.0�3�[������[�;��0eb�����Z).2[)b)� � �

Page 138: F F F F F F Phytophthora palmivora Lignifying ... - CORE

123

>�F�' K�PQ�R���

:;�) ��.2��9(��,� :���./=

�+�2���9��������/c�f� 4822014

�*g ���/c�f�

�*g :;�)2h�>�� �i'(�2��0�O9���/c�f�

� '��/�2��>��j � �+�� '�����2.Z���[� �'�= 2548 (0[�(-:(�� '��)

'*����/c�f� ('(��5���>��+�8�.���/c�f�)

'*����/c�f���5�>>��j �/c�f� ���0,''*�)*5+�*�@[�.���2���.[���0Z���ZO.2-8[���0�3�0� /'�.� :���� 2�Z�� :�:(�0[�( �+�� '�����2.Z���[� �'�= ���9���i 2548

����� �OK�O)���GO�*S���K@���KO�M) 9(��,� :���./= ��� ���'� 0: .0:��=. 2550. 0)��1�=0�)�=))�1 052'(�0�(���Z�).��>���2���

scopoletin ���2���.� �� �����.b���. ������:*�.��� :����)����Z�b;:�+8.:�� [���.'(� 8. 20-22 05;)� bk/9 ���� b./ 2550, @�.���)��� �'�=���-� )��0,)0�;). 9�.+��5 b f�*@��.