CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO, 2013 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE Q U Í M I C O F A R M A C É U T I C O B I Ó L O G O P R E S E N T A : DANIEL LEY OROZCO Evaluación de la estabilidad de un producto a base de tres extractos naturales: Calendula officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa, el cual presenta actividad antibacteriana ASESOR: Q.F.B. VICTOR HUGO ABREGO REYES
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CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO, 2013
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
Q U Í M I C O F A R M A C É U T I C O B I Ó L O G O
P R E S E N T A :
DANIEL LEY OROZCO
Evaluación de la estabilidad de un producto a base de tres
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FACULTAD DE ESTUDIOS S{n'F.RIOKES CUAUTITLÁN UN HlAD DE ADMINISTRACiÓN ESCOLAR
I.lEl'ARTAl'I'lENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES U.N. /l..o<.·
ASUNTO:~~~"TORIO
DRA. SIJEl\11 ROI.lIÚG UEZ RO;"\IO J)lRECTORA DE LA FES CUAUTlTLÁN PRESENTE
ATN: L.A. ARACF.U
J,~r;.< ,:::¡?:;~~
Con base en el Art. 28 del Reglamento de Examenes Profesionales nos p'-·nnitim<J~ comunicar a usted que re visamos la: TESIS
F:'-aluadótl de la es tabilidad de un producto a base de tres fxlmctus naturales: Calendula omtinalis. Eehin~eea 11Ur¡lll r~a e lIi!lllOcra tea excelsa, el cual presenla Hcti.·idad antibacteriana.
Que presenla el p.1,amc: Con nÚmero de euellla: ,oc,,]T", "' , de: Oufmico f:umacélllico Riólot:o
Con~iderondo que dicho lrebajo reúne los requisitos necesario., paro ser disculido en el EXAMEN PROfESIONAL com:~pondi<:nle, otorgarnos n<J",~lro VOTO APROBATORIO.
ATENTAMENTF. " 1'OR MlltAZA HABLARA EL rspÍluTu" Cuautillán Izealli, Méx. a 14 de noviembre de 2012.
------------------~~,'~'~/~;-~,/ QFB. Brigida del Carmen Camacho Enrique~ ..02 ~ .. ~ 2do SUPLENTE QFH. Guadalupc Hemándcz; Torres
NOTA: lo , "ood3l~, 'upl~",,, ... ,jn obH/:,oo, 3 P""""''" ~ d .. Y he .. dol E ....... n Pm!e,l<)nal (.rt. 12 H~A,lpm
FACULTAD DE: ESTUDIOS SUPERIOKES CUAUTITLÁN UN HlAD DE AD1\uNLSTRACIÓN ESCOLAR
I)EI'ARTAiI'lENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES U.N. /l.,Ol.. ·
ASUNTO:~~_TORIO
DRA. SIlEMIKOllfÚG UEZ RO;"\IO I)IRECTORA DE LA FES CUAUTITLÁN PRESENTE
ATN: L.A. ARACr.U
J,~r;.< ,::: ¡?:~~~::
Con b3.'ie en el Art. 28 del Reglamento de Exámenes Profesionales nos p"nnilirnos romunicll' " uSlcd que r~"isamu~ la: TESIS
r., ·~lu~dón de la ~s l a l'¡lidad de un pruduclQ a bas~ de Irl"S u lr,¡clu! Dalural c~ : Calendul:¡ offitinalis. Echinacca )Iuqlllrfa e lIi!lllOcralea cnrlsa, el cual presenh¡ HCli"ida d anlibacleriana.
Que presentn el pn.<;nnlc:
Cono"'"'''''''d'' '''''''' ' ,oc,,]T" .. ,], .. de: O u fmico Farmacé"lico Bióloco
Considerando que dicho 1mbnjo rellOe los req\lisitos neeesario.<; para ser disculido en el EXAMEN PROFESIONAL <:um:~pondi<:nle . ,"Iorgarnus nUt;~lru VOTO APROBATORIO.
ATENTAMENTF. " 1'01{ MI ¡tAZA HABLARA EL ESl'Í1UTU" Cuaulillán lzcalli, Méx. a 14 de noviembre de 2012.
PI{O"'ESOI{~~S Q UEI NTEC,RAN EL .mRAI)O
NOMHRE FIRMA
l'RE SIDE NTE
VOCAL
Q. Mario MUro Morales Delgado '(/""''':«'3::',1. .a
cariofileno, cariofileno epóxido, echinolona, etc.
Mucopolisacáridos: Son moléculas de alto peso molecular.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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3.5 ACCIONES FARMACOLOGICAS.
Inmunomoduladora inmunoestimulante: Los mucopolisacáridos de alto peso
molecular situados en la raíz han demostrado poseer un efecto inmunoestimulante
inespecífico demostrado a varios niveles; aumento en la producción de leucocitos y
linfoquinas, aumento en la tasa de properdina, elevación de la producción de interferón,
inhibición de la hialuronidasa y aumento de la capacidad de fagocitosis por parte de los
macrófagos (Alonso, 2004).
Antiinflamatoria
La acción antiflamatoria de la Echinacea viene referida desde 1950, donde se ponen de
manifiesto sus excelentes resultados en la cura de pacientes afectados de artritis
crónica. En 1957 se demuestra que el extracto de Echinacea reduce aproximadamente
un 22% la inflamación articular, comparable al efecto de la cortisona (Jiménez, 2009).
Antimicrobiana: Aumenta la fagocitosis de virus y bacterias. Aumenta la liberación de
radicales de oxígeno por los macrófagos, los cuales están destinados a destruir
determinadas estructuras como ADN, ARN, proteínas, lípidos, etc., que son elementos
estructurales de los microorganismos. Ejerce una actividad virustática que puede
atribuirse a un efecto tipo interferón (Redondo, 2000).
3.6 CONTRAINDICACIONES E INTERACCIONES
Debido a su capacidad estimulante de los procesos autoinmunes, la Echinacea no
debe emplearse en las personas que padezcan enfermedades sistémicas graves
como tuberculosis, leucemia, enfermedades del colágeno, esclerosis en placas y otras
similares. Pueden presentarse reacciones alérgicas especialmente en las personas
sensibles a los alérgenos del girasol (familia Asteraceae). No se recomienda su uso en
un tiempo que exceda de ocho semanas (Jiménez, 2009).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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4.0 ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis es un método de separación basado en las diferencias en la velocidad
de migración de especies cargadas en un campo eléctrico aplicado. Esta técnica de
separación para muestras de gran tamaño fue desarrollada inicialmente por el Químico
sueco Arene Teselius en la década de 1930 para el estudio de las proteínas en suero;
obtuvo el premio Nobel de 1948 por su trabajo.
Una ventaja particular de la electroforesis es su capacidad única para separar,
macromoléculas cargadas que son de interés para bioquímicos, biólogos y químicos
clínicos. Durante muchos años ha sido el método más poderoso para la separación de
proteínas (enzimas, hormonas, anticuerpos) y ácidos nucleicos (ADN y ARN), para lo
cual ofrece una resolución sin igual (Skoog, 2005).
El mecanismo de separación de la electroforesis capilar (EC) es el mismo que el de la
electroforesis convencional. La EC consiste en introducir en un capilar una mezcla de
especies (cargadas o neutras), que se separan en función de su movilidad
electroforética bajo la influencia de un campo eléctrico (Castillo R. R., 2002).
4.1 FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
Muchas moléculas importantes poseen grupos ionizables y pueden tenerse en solución
en forma de especies con carga eléctrica, ya sea como cationes (+) o como aniones (-).
Además las moléculas que poseen cargas similares suelen tener distintas relaciones
carga/masa. En conjunto, estas diferencias constituyen base suficiente para una
migración diferencial, cuando los iones en disolución se someten a un campo eléctrico.
Los cationes se trasladan hacia el cátodo (-) y los aniones hacia el ánodo (+) a
velocidades que dependen del equilibrio entre la fuerza impulsora del campo eléctrico
sobre los iones cargados de la muestra y las fuerzas de retardo entre las moléculas que
migran y el medio circundante, que son principalmente fuerzas de fricción
electrostáticas (IMAGEN 5).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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IMAGEN 5: Proceso de separación electroforética(Castillo R. R., 2002).
La corriente se mantiene por todo el circuito ya que los electrodos, están sumergidos en
viales que contienen búfer. Durante la separación en los electrodos se producen iones
hidroxilo e hidrógeno en el cátodo, mientras que en el ánodo se forman iones oxígeno e
hidrógeno (Castillo R. R., 2002).
4.1.1 Movilidad electroforética
La separación electroforética está basada en las diferencias de velocidad de los
analitos en presencia de un campo eléctrico. La velocidad de un analito, cuando ningún
flujo electroosmótico está presente puede ser dada por la ecuación 1:
_______ (1)
Dónde: es la velocidad del analito, µ es la movilidad electroforética y E es el campo
eléctrico, que es una simple función de la aplicación del voltaje y la longitud del capilar
(voltios/cm). La movilidad electroforética depende de la especie iónica, del tamaño, de
la carga, de la temperatura, de la concentración y de la naturaleza del analito.
_______ (2)
FESC-UNAM GENERALIDADES
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De la ecuación 2 es evidente que especies o analitos cargados y pequeños tienen alta
movilidad, mientras que especies cargadas con gran peso molecular muestran baja
movilidad.
Dónde:
µ es la movilidad electroforética del analito, q es la carga del analito, η es la viscosidad
de la solución y r el radio molecular (Castillo R. M., 2010).
4.1.2 Flujo electroosmótico
Una característica única de la electroforesis capilar es el flujo electroosmótico. Cuando
se aplica alto voltaje a través de un tubo capilar de sílice fundida que contiene una
disolución tampón, se genera habitualmente un flujo electroosmótico en el que el
disolvente migra hacia el cátodo.
La velocidad de migración puede ser considerable. Como se muestra en la IMAGEN 6,
la causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se desarrolla en la
interface sílice/disolución. A valores de pH mayores de 3, la pared interna de un capilar
de sílice se carga negativamente a causa de la ionización de los grupos sílanol de la
superficie (Si-OH). Los cationes del tampón se congregan en una doble capa eléctrica
adyacente a la superficie negativa del capilar de sílice. Los cationes de la parte exterior
difusa de la doble capa son atraídos hacia el catado o electrodo negativo. Dado que
estos cationes están solvatados, arrastran consigo el grueso del disolvente.
IMAGEN 6: Grupos sílanol en la pared del capilar de sílice fundida en función al pH.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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La velocidad del flujo electroosmótico suele ser mayor que las velocidades de migración
electroforéticas de los iones individuales y aun cuando los analitos migran según sus
cargas dentro del capilar, la velocidad de flujo electroosmótico generalmente es
suficiente para arrastrar todas las especies positivas, neutras e incluso negativas, hacia
el mismo extremo del capilar, de manera que todas pueden ser detectadas a su paso
por un punto en común (Skoog, 2005).
IMAGEN 7: Migración de cationes, aniones y analitos neutros dentro de un capilar debido a sus
movilidades electroforéticas y el flujo electroosmótico (Galicia, 2006).
4.2 INSTRUMENTACIÓN PARA LA ELECTROFORESIS CAPILAR
Como muestra la IMAGEN 8, la instrumentación para la electroforesis capilar es
sencilla. En el caso más usual, se coloca un capilar de sílice fundida relleno de una
disolución tampón, con un diámetro interior de 10 a 100 µm y de 40 a 100 cm de largo,
uniendo dos depósitos de disolución búfer, que contienen también electrodos de platino
(Skoog, 2005).
Los capilares se sujetan normalmente de un cartucho de plástico que alinea los
extremos del capilar en los viales del búfer y los electrodos. Debido a la gran longitud
de los capilares estos se enrollan en círculos en un soporte en la parte superior del
cartucho (Chavez, 2009). La introducción de la muestra se realiza reemplazando uno de
los viales con buffer por un vial que contiene la muestra (disuelta en agua o en buffer) y
luego aplicando por unos segundos una presión externa con ayuda de una bomba
(inyección hidrodinámica), o bien un campo eléctrico (inyección electrocinética). Hecho
lo anterior, se aplica el campo eléctrico para llevar a cabo la separación (Abrego, 2006).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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En el extremo del capilar se encuentra un sistema que registra una propiedad física de
los analitos (detector) que llegan a él. La representación de la propiedad físico-química
medida generalmente en absorbancia en función del tiempo de migración es lo que se
le denomina electroferograma. La señal del detector es registrada por un ordenador
que, con un software apropiado, es capaz de representar dicha señal en función del
tiempo para generar el electroferograma (Chavez, 2009).
La detección se realiza con un detector UV-VIS, arreglo de diodos o fluorescencia, o
fuera del capilar con detectores como índice de refracción, conductimetría,
amperometría, e inclusive espectrometría de masas(Abrego, 2006).
4.2.1 Partes básicas en un sistema de EC. (IMAGEN 8)
Dos Electrodos (ánodo y cátodo).
Fuente de poder.
Depósito (viales) en donde se colocan los electrodos respectivamente.
Capilar (compartimiento donde se lleva a cabo la separación).
Sistema de enfriamiento del capilar (típicamente en la forma de
convección de aire forzado o de líquido).
Sistema de introducción de muestra.
Un detector.
IMAGEN 8: Sistema general de electroforesis capilar EC.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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4.2.2 El capilar
Puede ser de distinta naturaleza: vidrio, sílice fundida o teflón. Recientemente también
otros materiales tales como el polipropileno, y el nylon han sido utilizados. Comúnmente
se utilizan aquellos hechos de sílice fundida porque esta posee una excelente
transparencia a la radiación ultravioleta (UV) y visible (VIS). Además son químicamente
y eléctricamente inertes y baratos. Los capilares de sílice fundida están normalmente
recubiertos por un polímero, generalmente poliamida, la cual facilita su manipulación
dándoles flexibilidad.
Los tubos capilares de sílice fundida son usados principalmente por:
Flexibilidad
Alta conductividad (grupos silanol)
Transparencia espectral en el UV-VIS
Posibilidad de modificación de superficie externa
4.2.3 Sistema de detección
Existe una amplia variedad de detectores que se pueden utilizar en electroforesis
capilar (CE), los más comunes son:
TABLA No. 2: Detectores para electroforesis capilar (Skoog, 2005).
Tipo de detector Límite de detección* moles detectados
1.- Espectrofotometría
Absorción
Fluorescencia
Lentes térmicas
Raman
Quimioluminiscencia
1-1000 1-0.01
10 1000
1-0.0001
2.-Electroquímico
Conductividad 100
3.-Potenciometría 1 4.-Amperometría 0.1
FESC-UNAM GENERALIDADES
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Detectores de UV-Vis: se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar
en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco (IMAGEN 9). El
capilar intercepta el trayecto óptico procedente desde la fuente al fotomultiplicador. De
esta manera se evita todo tipo de volumen muerto(Rojas, 2008). La lectura de UV
puede ser directa (cuando los electrolitos son transparentes y los analitos absorben la
energía electromagnética) o indirecta (cuando los electrolitos absorben energía
electromagnética y los analitos presentan características transparentes)(Galicia, 2006).
IMAGEN 9: La celda o ventana de detección se obtiene en el capilar al eliminar una parte
pequeña de recubrimiento del capilar, cuya distancia es considerada para determinar la
longitud efectiva del capilar para la separación y medición de los componentes.
Detectores de arreglo de diodos DAD.
La utilización de un detector de diodos en línea (DAD) en lugar de la detección por
única o múltiple longitud de onda tiene muchas ventajas. La luz de la lámpara de
deuterio es enfocada en el capilar por medio de un sistema de lentes y al pasar por el
capilar es difractada hacia un detector de diodos en línea, cada uno mide un cierto
intervalo de longitudes de onda. Las ventajas son: la visualización del espectro UV-
Visible en todo momento del análisis, obtención del electroferograma a cualquier
longitud de onda en una sola inyección, determinación del máximo de absorbancia para
todos los analitos, e identificación de compuestos y pureza del pico (Perez, 2010).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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4.3 LA INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA
Los sistemas de inyección comúnmente empleados en los instrumentos comerciales de
EC para transportar las muestras desde el contenedor hacia el detector incluyen los
modos de inyección hidrodinámica y electrocinética (también conocida como
electromigración).
4.3.1 Inyección hidrodinámica
También llamada inyección neumática, se realiza mediante diferencia de presión, por
bombeo o bien por vacío, es decir, forzando la introducción de la muestra al capilar.
Este sistema es confiable y no selectivo. Con un control preciso de la presión y el
tiempo de inyección se pueden obtener inyecciones altamente reproducibles
4.3.2 Inyección Electrocinética o Electromigración.
Este tipo de inyección se realiza mediante un campo eléctrico aplicado entre el
contenedor de la muestra y el reservorio de salida del electrolito, el cual causa que los
componentes de la muestra migren dentro del capilar. Esta inyección es selectiva y muy
recomendable para bajar los límites de detección de algunos analitos, aunque es
importante citar que podría alterar la composición de la muestra, razón por la cual se
recomienda que para cada inyección se emplee un vial con muestra fresca (Galicia,
2006).
4.4 EL BÚFER
La sensibilidad del flujo electroosmótico (FEO), a pH requiere el uso de un búfer que
pueda mantener un pH constante. Los sistemas efectivos de búfer tienen un rango de
dos unidades de pH aproximadamente centradas alrededor del valor de pKa. Un búfer
para ser utilizado en EC debe poseer las siguientes características:
Buena capacidad de amortiguación en el rango seleccionado
Baja movilidad para minimizar la generación de corriente
Baja absorbancia a la longitud de onda de detección (cuando aplique)
FESC-UNAM GENERALIDADES
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TABLA No. 3: Clasificación de algunos de los sistemas búfer más utilizados en EC.
Químicos Biológicos:
Citrato (rango de pH 2.08-5.74)
Acetato (rango de pH 3.76-5.76)
Fosfato (rango de pH 8.14-10.14)
Borato (rango de pH 8.14-10.14)
ACES Ácido Etanosulfónico-2-[N-morfolino]
PIPES Ácido de Piperazina-N,N¨-bis-
[Etanosulfónico]
HEPES Ácido [N-2-hidroxietilpiperazina-N´-2-
Etanosulfónico]
TRIS Tris(hidroximetil)amino-metano
4.5 ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA (ECZ)
Es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su
simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los
analitos según la relación carga/tamaño(Abrego, 2006).
La ECZ es la forma más simple de EC principalmente porque el capilar es llenado sólo
con un electrolito soporte y la migración de los analitos se da en zonas discretas y a
diferentes velocidades.
La separación de mezclas con analitos, aniónicos y catiónicos es posible debido a la
influencia del flujo electroosmótico (FEO). Los analitos neutros no migran por sí solos,
pero coeluyen en presencia del FEO (Castillo R. M., 2010). La separación de
compuestos aniónicos son arrastrados hacia el detector colocado en el cátodo
(polaridad directa). En el caso contrario, por ejemplo aniones de dimensiones reducidas
y muy cargados es necesario cambiar la polaridad del vial de entrada y del vial de
salida (trabajar con voltajes “negativos”) de tal manera que estos aniones son
detectados en el ánodo (polaridad inversa) (Perez, 2010).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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IMAGEN 10: Representa la forma en que se lleva la separación en la Electroforesis Capilar de Zona.
a. El capilar se llena con el búfer y se introduce la muestra (analitos A y B) b. Los analitos A y B se separan con base en su distinta movilidad electroforética, al
aplicarse una diferencia de potencial eléctrico c. Los analitos A y B se han separado en zonas discretas d. Es el comienzo e. representan el perfil de concentración a lo largo del capilar: f. Durante el proceso de separación
FESC-UNAM GENERALIDADES
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5.0 ESPECTROFOTOMETRÍA La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben
las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende
de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que
pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
5.1 FUNDAMENTOS
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica
constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de
biomoléculas.
La espectroscopía de absorción, está relacionada con el hecho de que una sustancia
absorbe la luz, provocando que los electrones “salten” de un nivel de energía a otro
mayor(Arenas, 2004). Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una
molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un
estado de mayor energía (estado excitado), E2 y sólo se absorberá la energía que
permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados
(o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción
que a distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de
absorción- constituye una señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en
forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental
(Abril, 2012).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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IMAGEN11: Diagrama de niveles de energía luminosa hace que la molécula pase desde un
estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía
mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)
En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación
electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano,
de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
IMAGEN 12: Espectro electromagnético
Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos,
sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima
absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación
cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores como pH,
concentración de sal y el disolvente, alteran la carga de las moléculas, provocan
desplazamientos de los espectros UV.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución
coloreada.
Tabla No. 4: Comparación de la longitud de onda con el color observado y el que absorbe.
Longitud de onda λ Color que absorbe Color que se refleja o
ve
390-435 Violeta Amarillo verdoso
435-490 Azul Amarillo
490-580 Verde Rojo
580-595 Amarillo Azul
595-650 Naranja Azul verdoso
650-780 Rojo Verde azulado
5.1.1 Proceso de absorción
La ley de absorción, también llamada ley de Lambert Beer o simplemente ley Beer,
indica cuantitativamente la forma en que el grado de atenuación depende de la
concentración de las moléculas absorbentes y de la longitud del trayecto en la que
ocurre la absorción. Cuando la luz atraviesa un medio que contiene un analito
absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitación del analito.
Cuanto más largo sea el medio por el que pasa la luz (longitud del trayecto de la luz),
en el caso de una solución del analito de concentración dada, existirán más moléculas o
átomos absorbentes en el trayecto y, por tanto, mayor será la atenuación.
Además, para una longitud del trayecto dada de la luz, cuanto mayor sea la
concentración de los átomos o moléculas absorbentes, tanto mayor será la atenuación
(Skoog, 2005).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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5.1.2 Transmitancia
La Transmitancia T de la solución es la fracción de la radiación incidente que se
transmite en la solución.
T= P/P0
Po [=] Es la intensidad de la radiación del haz en fotones que incide sobre la celda.
P [=] Es la intensidad de la radiación del haz que abandona la celda (P ≤ P0)
Es frecuente que se exprese como porcentaje; denominado porcentaje de
transmitancia.
%T= (P/P0)*100
5.1.3 Absorbancia
La absorbancia A de una solución se relaciona con la transmitancia de manera
logarítmica.
A= -log T = log P0/P
Se reduce la transmitancia a medida que aumenta la absorbancia de la disolución.
5.1.4 Ley de Beer
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie
absorbente c y a la longitud de trayecto b del medio de absorción, como se expresa.
A= log P0/P = abc
Aquí, a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad. Dado que la
absorbancia es una cantidad sin unidades la absortividad debe tener unidades que
eliminen a las de b y c. Por ejemplo, si c tiene como unidades gL-1, y b tiene cm, la
absortividad posee las unidades Lg-1cm-1.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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Cuando se expresa la concentración con moles por litro, y b en centímetros, la
constante de proporcionalidad se llama absortividad molar y recibe el símbolo especial
ε, así;
A= εbc
A [=] Es la absorbancia; definida como la cantidad de radiación que absorbe una
solución y es una magnitud adimensional.
ε [=] Constante de proporcionalidad (absortividad)
b[=] Longitud interna de la celda 1cm.
c [=] Concentración de las especies absorbentes.
5.1.5 Medición
Ya que la solución que se estudia debe contenerse en algún tipo de recipiente (celda o
cubeta), en las paredes de la celda son posibles pérdidas por reflexión y dispersión,
como lo muestra la IMAGEN13 y pueden ser considerables. Por ejemplo, casi el 8.5%
de un haz de luz amarilla se pierde por reflexión a su paso por una celda de vidrio. La
luz también puede dispersarse en todas las direcciones desde la superficie de
moléculas o partículas grandes (como el polvo) en el disolvente y causar la atenuación
adicional del haz a su paso por la solución.
IMAGEN 13: Posibles pérdidas por reflexión
La compensación de estos efectos requiere comparar la energía de un haz que se
transmite por una celda que contiene la solución del analito con la energía de un haz
que cruce una celda idéntica que solo contiene el disolvente o blanco.
FESC-UNAM GENERALIDADES
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Así, se obtiene una absorbancia experimental, que se aproxima mucho a la absorbancia
verdadera de la solución es decir:
A= log P0/P = log P solvente/P solución
Los términos P yP0 se refieren a la energía de un haz que ha cruzado celdas que
contienen el blanco (solvente) y el analito, respectivamente (Skoog, 2005).
5.2 INSTRUMENTACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos
llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros
constan, según se indica en la IMAGEN 14 de:
Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada
longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o
tubos) que contenga la muestra pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico
transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice
fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.
Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas
IMAGEN 26: Reacción entre polifenoles y el reactivo de Folin Ciocalteu. En el cual el Mo (VI) es reducido a Mo (V) con un e- donado por un antioxidante (Cervantes, 2011).
FESC-UNAM GENERALIDADES
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Los fenoles sólo se oxidan rápidamente en un medio suficientemente alcalino. Pero, en
estas condiciones, el reactivo oxidante y el pigmento azul son inestables. Por ello, el
reactivo debe encontrarse en exceso, para que, aún a pH alcalino, se conserve
inalterada al menos una fracción el tiempo necesario para reaccionar con todos los
fenolatos (Conde, 1994).
Los flavonoides son compuestos fenólicos abundantes en la naturaleza, producto
del metabolismo de las plantas. Estos metabolitos secundarios se encuentran
principalmente en las partes aéreas de estas, ya que necesitan la luz del sol para
sintetizarse. Por lo que estos compuestos se concentran en frutos, vegetales, semillas y
flores(Julián, 2009). Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que
comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos
de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (heterocíclico).
Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2 al 8, y los del anillo B
desde el 2' al 6' (IMAGEN 16).
IMAGEN 16: Flavonoides Estructura básica y tipos.
FESC-UNAM GENERALIDADES
- 48 -
Dada su capacidad para capturar radicales libres y de crear complejos con iones
metálicos tienen una actividad antioxidante muy alta. La actividad de los flavonoides
como antioxidantes depende de las propiedades redox de sus grupos
hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura
química (Julián, 2009).
6.2 CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES.
Los flavonoides Totales se determinan de acuerdo al método descrito por Zhishen. Las
muestras son mezcladas con AlCl3 y NaNO2, formándose un complejo flavonoide-
aluminio de color rojo en medio alcalino (Julián, 2009), (Chuquimia, 2008) (Marinova,
2005).
FESC-UNAM GENERALIDADES
- 49 -
7.0 BACTERIAS. Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño entre 0,5 y 5
μm, por lo general y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y
hélices (espirilos). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las
células eucariotas (de animales, plantas, hongos, etc.), no tienen el núcleo definido ni
presentan, en general, orgánulos membranosos internos. Generalmente poseen una
pared celular compuesta de peptido glicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o
de otros sistemas de desplazamiento.
Las bacterias pueden diferenciarse por su capacidad para retener un colorante básico
(violeta cristal) después de su fijación con yodo y decoloración con alcohol (Tinción de
Gram), se dividen en Gram (+) y Gram (-). Las Gram (+) conservan el colorante, a
causa de los ácidos teicoicos que contienen en sus paredes celulares, en tanto que las
Gram (-) se decoloran con el alcohol y después se colorean de rojo con safranina,
debido a que tienen una membrana externa adicional que contiene lipopolisacárido
(endotoxina). La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez
de su pared celular.
7.1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS
ESTRUCTURA BÁSICA
La estructura básica de las bacterias Gram (+) está constituida principalmente por una
capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido
Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a
la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se
Para poder utilizar el promedio de las absorbancias de las diferentes curvas de
calibración, como una única curva de calibración estándar, se realizó la prueba de
ANOVA a los coeficientes de absortividad molar de las diferentes curvas de calibración
realizadas de manera individual para comparar los datos obtenidos y determinar si
existe variación entre ellas, en donde se observó que no existe variación significativa
con una probabilidad de P= 0.05. (TABLA No. 9)
TABLA No 9: Análisis de varianza ANOVA de un factor realizada a los coeficientes de absortividad molar de las curvas de calibración indirecta de polifenoles (Ver anexo2, tabla 5). Donde se muestra que al ser la F calculada menor que en el valor crítico para F, no existe diferencia significativa entre los coeficientes absortividad de las diferentes curvas.
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos 1880636,27
6 313439,3779 0,37939 0,8839 2,5727
Dentro de los grupos
17349692,6
21 826175,8396
Total 19230328,9
27
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 73 -
A la curva de calibración indirecta estándar se le realizó la regresión lineal y ajustó a la ecuación de la recta:
A = mx + b
Dónde:
A= absorbancia de la muestra
m= pendiente
x= concentración de analito expresada como [polifenoles expresados como mg/100m L de Pirogalol]
b= ordenada al origen
GRAFICO NO 2: Se puede observar la tendencia lineal de la curva de calibración indirecta de Pirogalol. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9996, el cual es muy cercano a 1, mostrando la relación que existe entre el aumento de la absorbancia y el incremento de la concentración de rutina, así mismo el coeficiente de determinación (r2) es cercano a 1, lo que indica el ajuste de los datos obtenidos al modelo lineal.
Los cálculos para determinar la ordenada al origen, concentraciones, desviación estándar y coeficiente de variación de la curva de calibración, se encuentran en el Anexo 2.
y = 1,2076x - 0,0246 R² = 0,9994
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
0,00 0,50 1,00 1,50
Ab
sorb
anci
a n
m
mg / 100 mL de Pirogalol
Polifenoles
Complejoazul
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 74 -
GRAFICO No. 3: Comparación entre las curvas de calibración realizadas con la curva de calibración estándar para polifenoles, en la cual se observa gráficamente que no hay diferencia significativa entre las curvas de calibración realizadas. (Ver prueba ANOVA).
Para realizar la cuantificación de los flavonoide se siguió la misma metodología que
para los polifenoles, se determinó la longitud de onda óptima mediante un espectro de
absorción desde la región UV (200 nm) hasta la región Visible (800 nm) GRAFICO 4.
Después se construyó una curva de calibración utilizando el promedio de las
absorbancias de las diferentes curvas de calibración realizadas, las cuales no
presentaron diferencia significativa con una probabilidad de P=0.05. (Ver anexo 3 para
análisis completo) al aplicar la prueba de ANOVA a los coeficientes de absortividad
molar de las diferentes curvas de calibración realizadas de manera individual (Anexo 2,
Tabla5). A la curva de calibración indirecta estándar se le realizó un análisis de
regresión lineal GRAFICO 5.
y = 1.2076x - 0,0246 R² = 0,9994
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
Ab
sorb
anci
a n
m
mg / 100 mL de Pirogalol
Polifenoles
Curva 1
Curva 2
Curva 3
Curva 4
Curva estandar
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 75 -
GRAFICO No. 4: Barrido espectrofotométrico del complejo Rutina – AlCl3. La longitud de onda
óptima fue a los 530nm que es donde se observa la máxima absorción.
TABLA NO. 10: Curva de calibración indirecta estándar para la cuantificación de flavonoides.
Sistema 1 2 3 4 5 6 7 8 mL rutina 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
TABLA No. 11: Análisis de varianza ANOVA de un factor realizada a los coeficientes de absortividad molar de las curvas de calibración indirecta de flavonoides (Ver anexo). Donde se muestra que al ser la F calculada menor que en el valor crítico para F no existe diferencia significativa entre los coeficientes absortividad de las diferentes curvas.
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos
96450,379 3 32150,1263 0,2958 0,82806438 2,9466
Dentro de los grupos
3042898,42
28 108674,944
Total 3139348,8 31
GRAFICO No. 5:curva de calibración indirecta de Rutina. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9995, el cual es muy cercano a 1, mostrando la relación que existe entre el aumento de la absorbancia y el incremento de la concentración de rutina, así mismo el coeficiente de determinación (r2) es cercano a 1, lo que indica el ajuste de los datos obtenidos al modelo lineal.
Los cálculos para determinar la ordenada al origen, concentraciones, desviación estándar y coeficiente de variación de la curva de calibración, se encuentran en el Anexo 2.
y = 0,1292x - 0,0275 R² = 0,9992
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1,4000
1,6000
0 2 4 6 8 10 12
Ab
s n
m
mg/100 mL de Rutina
Flavonoides
Complejo Rojo
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 77 -
GRAFICO No. 6: Comparación entre las curvas de calibración realizadas con la curva de calibración estándar para polifenoles, en la cual se observa gráficamente que no hay diferencia significativa entre las curvas de calibración realizadas. (Ver prueba ANOVA en ANEXO 3).
Antes de realizar la cuantificación de los polifenoles y flavonoides en el producto se
realizó la cuantificación de estos en los extractos de cada una de la plantas para saber
el aporte porcentual de polifenoles y flavonoides que presentan en el producto. Los
resultados se muestran en la siguiente tabla.
TABLA No. 12: Muestra la cuantificación de Polifenoles llevada a cabo a los extractos de
manera individual.
Cuantificación de polifenoles en los extractos de las plantas
Muestra Alícuota (ml) Aforo (mL)
Mg equivalentes a Pirogalol/100
ml extracto
PM g/mol
[M] eq a Pirogalol
Equinacea
1,0
10 1,843
126,11 0,000146
Calendula
1,0
10 6,073
126,11 0,000482
Cancerina
0,5
10 17,865
126,11 0,001417
y = 0,1292x - 0,0275 R² = 0,9992
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1,4000
1,6000
0 2 4 6 8 10 12
Ab
s n
m
mg/100 mL de Rutina
Flavonoides
Curva estandar
Curva 1
Curva 2
Curva 3
Curva 4
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 78 -
TABLA No. 13: Muestra la cuantificación de flavonoides llevada a cabo a los extractos de
manera individual.
Cuantificación de flavonoides en los extractos de las plantas
Muestra Alícuota (ml) Aforo (mL)
mg equivalentes a Rutina/100 ml
de extracto
PM g/mol
[M] eq a rutina
Equinacea
3,0
10
3,909
610,52 6,403E-05
Calendula
1,0
10
30,205
610,52 4,947E-04
Cancerina
0,5
10
70,309
610,52
0,0011516
Las tablas nos muestran la cuantificación de polifenoles y flavonoides llevada a cabo a
cada uno de los extractos utilizados, esto nos permitió hacer una estimación de la
proporción que aportan los extractos utilizados de dichos analitos, para ello se tomó en
cuenta que estos se mezclan en la misma proporción (5mL de cada extracto) es decir la
suma de sus concentraciones nos da el 100 % de aporte de los extractos. De esta
manera podemos observar que la Cancerina tiene la mayor concentración tanto de
polifenoles como de flavonoides y por tanto el mayor aporte (Gráfico 7).
Grafico No. 7: Aporte de polifenoles y flavonoides de los extractos en el producto.
7%
24%
69%
% Polifenoles aportado por los extractos al producto
Equinacea Calendula Cancerina
3,7438%
28,9253%
67,3309%
% Flavonoides aportado por los extractos al producto
Equinacea Calendula Cancerina
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 79 -
En las tablas No 12 y 13 podemos observar la concentración expresada como mg/100
mL de Pirogalol y mg/100mL de Rutina para polifenoles y flavonoides respectivamente
en cada uno de los extractos, pero poder hacer una comparación entre las
concentraciones de dichos analitos en cada extracto se calculó sus concentraciones
expresadas en Molaridad, de tal manera que esto nos permitió ver si dentro de estos
polifenoles cuantificados existían flavonoides en las plantas dado que los flavonoides
son polifenoles. De esta manera podemos observar que de los polifenoles que presenta
la equinacea el 43% son flavonoides, que la Calendula solo contiene flavonoides y que
la Cancerina presenta una gran cantidad de polifenoles de los cuales el 81 % de ellos
son flavonoides. Esto es importante debido a que la actividad antibacteriana que
presentan estos extractos, en los diferentes estudios se menciona es debido a la
presencia de flavonoides.
GRAFICO No. 8 Comparación de la concentración de polifenoles con respecto a la
concentración de flavonoides en cada extracto.
0,00000
0,00020
0,00040
0,00060
0,00080
0,00100
0,00120
0,00140
0,00160
Equinacea Calendula Cancerina
Mo
lari
dad
Comparacion de [M] Polifenoles y Flavonoides
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 80 -
IMAGEN 26: A la derecha se muestra la coloración verde-azul
característica para la cuantificación de polifenoles por el
método de Folín Ciocalteu, sistemas más concentrados dan
una coloración azul intenso casi negro. A la izquierda el color
rojo característica para la cuantificación de flavonoides
utilizando el método de Zhishen, Debe respetarse los tiempos
de incubación para que reaccionen todos los flavonoides, una
mala incubación da una coloración rojo pálido, precipitados o
nulo color.
Grafico No. 9 Cuantificación de polifenoles respecto al tiempo expresado como mg/100mL de
Pirogalol.
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 81 -
El grafico no. 9, muestra las concentraciones estimadas de polifenoles totales del
producto, y como se puede observar en la tabla no. 14 , no hay variacion significativa de
la cantidad de polifenoles con respecto a la media de las concentraciones, lo cual se
demuestra con el analisis de varianza ANOVA realizado a dichas concentraciones, lo
que indica que los polifenoles se mantienen estables, por un período de tiempo
prolongado, y con ello la actividad biológica que depende de los polifenoles se
mantendrá constante, al ser proporcional. El resultado que se reporta es el promedio
de las mediciones realizadas en cada analisis a lo largo de 8 meses, realizadas bajo
las mismas condiciones de análisis.
TABLA No.14: Análisis de varianza para las concentraciones de polifenoles.
Grafico No. 10: Cuantificación de flavonoides respecto al tiempo expresado como mg/100 mL
La TABLA 15 , muestra las concentraciones estimadas de flavonoides totales del
Producto, y como se puede observar en la Grafica 3, no hay variación significativa de la
cantidad de flavonoides con respecto a la media de las concentraciones, lo cual se
demuestra con el análisis de varianza ANOVA realizado a dichas concentraciones, lo
que indica que los polifenoles se mantienen estables, por un período de tiempo
prolongado, el resultado que se reporta es el promedio de tres mediciones por fecha
durante 8 meses, realizadas bajo las mismas condiciones de análisis.
TABLA No. 15: Análisis de varianza para las concentraciones de flavonoides respecto al tiempo
Grafico No. 11 Comparación de la concentración M entre polifenoles y flavonoides respecto al
tiempo.
Análisis de varianza flavonoides
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos
1,21918 15 0,08127903 1,0666 0,44808814 2,3522
Dentro de los grupos
1,21918 16 0,07619909
Total 2,4383 31
3E-05
4E-05
5E-05
6E-05
7E-05
8E-05
9E-05
0,0001
MO
LAR
IDA
D
[M] Polifenoles y Flavonoides vs Tiempo
Polifenoles[M]
Flavonoides [M]
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 83 -
En el grafico No. 11 Observamos la comparación respecto al tiempo de la
concentración de los polifenoles y flavonoides en él se observa que la concentración de
los polifenoles siempre fue mayor a la de los flavonoides es decir en los extractos
existen otros compuestos que pueden ser polifenoles diferentes de los flavonoides y
que también se conservan durante un tiempo prolongado. También se observa que la
variación de los flavonoides es menor en las mediciones realizadas que la de los
polifenoles.
Con las pruebas de ANOVA realizadas se demuestra estadísticamente que ambos son
estables y que la actividad biológica que depende de estos compuestos debe de
permanecer durante el lapso de tiempo en se realizó el estudio, para ello de forma
paralela se realizaron pruebas de la actividad antibacteriana los cuales respaldan estos
resultados. (Ver tabla No. 16)
Para realizar las pruebas de actividad antibacteriana se trabajó con 4 cepas a las que
se les realizó sus pruebas bioquímicas más características, que se muestran en las
tablas en el anexo No. 4.
En la tabla No.16 se muestra que los resultados obtenidos de las pruebas de actividad
antibacteriana que se realizaron respecto del tiempo en que duro el estudio coinciden
con la estabilidad mostrada en las concentraciones de polifenoles y flavonoide es decir,
el producto que se utilizó mostro actividad bactericida, la cual nunca desapareció en las
condiciones en que se almaceno el producto.
Cabe mencionar que no se probó si el producto o cada uno de los extractos
presentaban o no actividad antibacteriana esto ya había sido probado con anterioridad
en los estudios realizados en el laboratorio 10 de microbiología donde se comprobó su
efecto antibacteriano.
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 84 -
TABLA No. 16: Tabla General de resultados: se observa la concentración de polifenoles y
flavonoide en [M] y así como las pruebas de actividad antibacteriana y apariencia.
Fecha 7 de abril
13 de abril
20 de abril
27 de abril
2 de mayo
16 de mayo
2 de junio
29 de junio
Polifenoles [M]
9,36E-05 8,69E-05
8,87E-05 7,84E-05
6,61E-05
6,15E-05
6,95E-05
6,70E-05
Flavonoides [M] 6,32E-05
6,33E-05 6,33E-05
6,33E-05
6,27E-05
5,83E-05
5,81E-05 5,88E-05
*Actividad Antibacteriana
E coli (-) (-) (-) (-) (-) (-) bs (-)
S.fecalis (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
S .aureus (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) P. auroginosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
**Cambio en la
apariencia
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
***Cambio de olor
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Fecha 10 de agosto
1 de Sep.
6 de octubre
1 de Nov.
17 de Nov.
30 de Nov.
7 de Dic.
15 de Dic.
Polifenoles M
8,14E-05 6,52E-05
7,10E-05 7,2E-05 6,186E-05
6,27E-05
6,01E-05
7,63E-05
Flavonoides M 6,36E-05
5,36E-05 6,12E-05
5,60E-05
5,47E-05
4,92E-05
3,77E-05
4,63E-05
*Actividad Antibacteriana
E coli (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
S. faecalis (-) bs (-) (-) (-) (-) (-) (-)
S .aureus (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) P. aeruginosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Cambio de apariencia
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Cambio de olor
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
*Pruebas de antibacteriana (+) Crecimiento bacteriano, (-) Sin crecimiento, Bs Efecto bacteriostático. ** (+) Se observaron cambios en la apariencia del producto, (-) Sin cambio *** (+) El olor cambio, (-) Conservo su olor característico.
FESC-UNAM RESULTADOS Y ANÁLISIS
- 85 -
La apariencia del producto tampoco sufrió cambio alguno, el producto se mostró
siempre como un líquido amarillo claro ligeramente opaco de olor característico
agradable al olfato, siempre y cuando el frasco contenedor se encuentre protegido de la
luz, cerrado y a temperatura ambiente.
Este producto es de dosificación única por lo que una vez abierto se utiliza por
completo. Una vez expuestos al oxígeno y a la luz los extractos tienen una degradación
muy rápida, y presentan asentamientos y a lo largo de un tiempo pueden presentar
turbidez, que es signo de contaminación microbiana.
VII. CONCLUSIONES
FESC-UNAM CONCLUSIONES
Se determinaron los perfiles electroforéticos de los extractos etanólicos de Calendula
officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa, mediante la técnica de
electroforesis capilar, empleada como método de identificación de especies vegetales
en donde trabajando a las mismas condiciones los electroferogramas de extractos de
una misma planta de diferente procedencia, dan un trazo característico.
Se estimó el contenido de polifenoles totales presentes en un producto fitoquímico por
espectroscopia UV-Vis, mediante una curva de calibración indirecta utilizando el
Pirogalol como estándar, observando que la cantidad de polifenoles totales no difiere
significativamente con respecto al tiempo.
Se estimó el contenido de flavonoides totales presentes en un producto fitoquímico por
espectroscopia UV-Vis, mediante una curva de calibración indirecta utilizando el
flavonoide Rutina como estándar, observando que la cantidad de flavonoides totales no
varía significativamente con respecto al tiempo.
El producto conserva su actividad antibacteriana contra las cepas utilizadas con un
efecto bactericida en las condiciones en que se almacenó.
Dicho lo anterior y considerando que en las condiciones de almacenamiento No
presento cambios en su apariencia y olor, se concluye que el producto es estable y
conserva su actividad antibacteriana (in vitro), en un período de ocho meses tiempo que
duro esta evaluación.
- 88 -
ANEXO I FORMULAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN INDIRECTAS DE POLIFENOLES Y FLAVONOIDES
La media, de las medias viene dado por:
Desviación estándar, s, de n medias viene dada por:
Varianza: el cuadrado de la desviación estandar,
Coeficiente de variación:
Variacion dentro de muestras:
Variación entre muestras:
Donde Número total de medidas
Suma de las medidas en la ésima muestra
Suma de todas las medidas, gran total
Grados de libertad:
El estadístico del contraste es Cuadrado medio entre muestras/ Cuadrado medio
dentro de muestras y el valor crítico es: .
- 89 -
ANEXO 2 VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE POLIFENOLES CON ESTÁNDAR DE PIROGALOL
TABLA 1. CURVA DE CALIBRACIÓN INDIRECTA DE PIROGALOL 1
SISTEMA 1 2 3 4 5 6 7
mg /100 ml 0,294 0,441 0,588 0,735 0,882 1,029 1,176
Pirogalol: es una sustancia sólida, blancuzca, que se disuelve en agua dando
soluciones incoloras, tiene usos en la industria farmacéutica como patrón para
determinar el contenido de fenoles de diversos analitos mediante el reactivo de Folin
Ciocalteu; los resultados se anotan como equivalentes de ácido gálico.
Resina: es una secreción orgánica que producen muchas plantas, particularmente los
árboles del tipo conífera. Es muy valorada por sus propiedades químicas y sus usos
asociados, como por ejemplo la producción de barnices, adhesivos y aditivos
alimenticios. También es un constituyente habitual de perfumes o incienso.
Ruta graveolens: comúnmente llamada ruda es una especie de la familia Rutaceae,
nativa del sur de Europa. Se suele cultivar como planta ornamental de jardín, en
especial por sus hojas azuladas y por su tolerancia a suelos secos y al calor. También
se cultiva como hierba medicinal y condimento.
Rutina (flavonoide): también llamada rutósido, quercetin-3-rutinósido y soforina, es un
glucósido flavonoide encontrado en algunas plantas.2 Se ha encontrado este
compuesto en los pecíolos de las especies de los géneros Rheum y Asparagus, y
también en algunas frutas, en especial cítricos. Su nombre proviene de Ruta
graveolens, una planta que también contiene rutina.
Saponósidos o saponinas: son heterósidos muy extendidos en el reino vegetal.
Principalmente se caracterizan porque en contacto con el agua producen una espuma
persistente, propiedad que se ha utilizado ampliamente en muchas partes del mundo.
Además, las saponinas tienen la capacidad de aumentar la permeabilidad de las
paredes celulares y destruir los hematíes por hemolisis.
Terpenos o isoprenoides: son una vasta y diversa clase de compuestos orgánicos
derivados del isopreno (o 2-metil-1,3-butadieno), un hidrocarburo de 5 átomos de
carbono. El nombre deriva, de los primeros miembros de esta clase que fueron
derivados del aguarrás ("turpentine" en inglés, "terpentin" en alemán).
VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Abrego, R. V. (2006). "Aplicaciones de la electroforesis capilar para la determinacion de compuestos químicos a partir de diferentes matrices". Teis de Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo. México: UNAM.
2. Abril, D. N. (2012). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas. Obtenido de http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
3. Alonso, J. (2004). Tratado de fitofármacos y nutracéuticos. Rosario Argentina:
Corpus libros.
4. Álvarez de Luna, F. (2006). Sensibilidad a los antimicrobianos de Enterococcus faecalis aislados de pacientes en la provincia de Córdoba (España). Obtenido de http://www.seq.es/seq/0214-3429/19/2/m_causse.pdf
5. Arenas, S. I. (2004). Espectrofotometrìa de Absorciòn. Obtenido de
6. Barceló, J. G. (1990). Técnicas analiticas para vinos. Obtenido de http://shop.gabsystem.com/data/descargas/Taules%20I-XV.pdf
7. Brooks Geo, B. J. ( 2002). Microbiología médica de Jawets, Melnick y Adelberg.
México DF : Manual Moderno.
8. Castillo, R. M. (2010). "Desarrollo de métodos analíticos para el control de calidad de leches usando electroforesis capilar". Tesis para optar por el grado de Maestra en Ciencias. Cuautitlán Izcalli, Edo. México: UNAM.
9. Castillo, R. R. ( 2002). Fundamentos sobre electroforesis capilar. México:
Universidad Nacional Autónoma de México.
10. Centeno, M. L. (2004). "Plantas medicinales españolas. Calendula officinalis L. (Asteraceae)". Medicina Naturista, 2004; N.º 5, 257-261.
11. Cervantes, R. V. (2011). Perfil electroforético y cuantificación de polifenoles de extractos etanólicos de Calendula officinalis L. E Hippocratea excelsa K.. Tesis Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo. de Mex: UNAM.
12. Chaves, O. E. (2009). "Estudio preliminar de extractos de caléndula officinalis por
13. Chuquimia, F. A. (2008). Determinación de la capacidad antioxidante y la cuantificación de compuestos fenólicos y flavonóidicos de cuatro especies vegetales de la región andina de Bolivia. Obtenido de http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0250-54602008000100011&lng=pt&nrm=iso
- 109 -
14. Conde, A. C. (1994). Contribución al conocimiento de la composicion polifenolica de madera, corteza y hojas de eucalyptus camaldulensis, e. globulus y e. rudis TESIS DOCTORAL que, para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas. Obtenido de http://eprints.ucm.es/tesis/19911996/X/0/X0021401.pdf
15. Cordero, S. A. (2005). Reto Microbiologico de extractos de Calendula officinalis
con bacterias aisladas de metritis y mastitis bovina. Tesis Q.F.B. Cuautitlán Izcalli, Edo. Mex.: UNAM.
16. Díaz, F. J. (2009). Optimización de extracción y análisis de la capacidad
antioxidante de la piel de kiwi. Catalunya: Universitat Politècnica de Catalunya.
17. Frenk, M. J. (2001). Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. México DF: Secretaria de salud.
18. Galicia, A. K. (2006). "Caracterizacíon geoquímica de lantánidos y sus
implicaciones en sistemas geoenegéticos". Tesis Maestria en Ingeniería. Temixco, Mor: UNAM.
19. García, B. J. (1990). Técnicas analiticas para vinos . Vilafranca del Panedés:
Panedés Edicions S.A.
20. García, J. A. (2009). Manejo social de la Cancerina (Hippocratea), planta medicinal de la selva baja caducifolia en la cuenca del rio Papagayo, Guerrero, México.Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de Doctora en Ciencias. Montecillo, Texcoco, Edo. de México: Institución de Enseñanza e Investigación en Ciencias Agricolas.
21. Garrido, F. D. (2008). Propiedades antioxidantes y funcionales de cinco algas
chilenas sobre la calidad de pasta de salmón. Memoria para optar al titulo deIngeniero en Alimentos. Santiago, Chile: Universidad de Chile.
22. Jiménez, V. L. (2009). “Elaboración de una forma farmacéutica (óvulo) a base del
extracto de Caléndula officinalis, Echinacea purpurea e Hippocratea excelsa para el tratamiento de infecciones cervico vaginales humanas”. Tesis QFB. Cuautitlán Izcalli, edo México: UNAM.
23. Julián, L. A. (2009). Propiedades físicas y químicas de tres variedades de frutos
de Annona diversifolia. HuajapandeLeón, Oaxaca: Universidad Tecnológica de la Mixteca.
24. Koneman Elmer, S. A. (2001). Diagnostico microbiológico: Texto y atlas a color. 5a ed. Madrid España: Médica Panamericana.
25. Lara, O., & Márquez, A. (1996). Plantas medicinales de México: composición
usos y actividad biológica. México DF.: UNAM.
- 110 -
26. Laura, P. P. (2010). Determinación de las constantes de acidez de los compuestos LQM: 344, 345 Y 351 por electroforesis capilar y espectrofotometrúa UV-VIS. Tesis Licenciatura Q.F.B. . Cuautitlan Izcalli Edo. México: UNAM.
27. Marinova, D. (2005). Total Phenolics and total Flavonoids. Obtenido de
http://www.uctm.edu/journal/j2005-3/Marinova.pdf
28. Montalvo, P. L. (2005). Efecto inhibitorio de extracto de caléndula officinalis en bacterias aisladas de casos de mastitis bovina de la cuenca lechera de Tizayuca, Hidalgo”. Cuautitlan, Edo de México: UNAM.
29. Murillo, S. A. (2009.). Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de
Stirax benzoin Dryander (Benjuí) en 10 bacterias que comunmente se asocian en infecciones de heridas humanas. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan izcalli, Edo. México: UNAM.
30. Pérez, A. Y. (2008). “Determinación del efecto inhibitorio de tres extractos
naturales: caléndula officinalis, echinacea purpúrea e hippocratea excelsa, (solos y combinados) en bacterias aisladas de casos de mastitis bovina.” Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli, Edo de México: UNAM.
31. Perez, P. A. (2010). Determinación de las constantes de acidez de los
compuestos LQM: 344, 345 Y 351 por electroforesis capilar y espectrofotometrúa UV-VIS. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitlan Izcalli Edo. México: UNAM.
32. Ramírez, A. A. (2009). Estudio de las propiedades bioactivas de hongos
comestibles para el diseño de productos cárnicos funcionales.Tesis doctoral . Madrid, España: Universidad Autónoma de Madrid.
33. Redondo, M. L. (2000). "La equinácea purpúrea: Una alternativa real para
estimular el sistema inmunológico específico". Obtenido de http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/RDF1_1_EQUINACEA.pdf
34. Rojas, C. M. (2008). “Desarrollo de un método analítico por electroforesis capilar
para la determinación de bromhexina y ampicilina en cápsulas”. Tesis Licenciatura Q.F.B. Cuautitán Izcalli Edo. México: UNAM.
35. Skoog, D. W. (2005). Química analítica. México D.F.: Editorial Thomson. 8ª Ed.
36. Tovar, B. N. (1999). "Uso del extracto vegetal de péalos de Caléndula officinalis
en el tratamiento de metritis cróica purulenta en el ganado Holstein Friesian". Tesis para obtener el titulo de Medico Veterinario Zootecnista. Cuautitlán Izcalli, Edo. de Méx.: UNAM.