Extracción y caracterización de quitosano obtenido a partir de ...

Extracción y caracterización de quitosano obtenido a partir de residuos del procesamiento de camarón Penaeus monodon

Derley Preciado Romaña

Proyecto de Grado Ingeniería de Alimentos

Asesor: María Hernández Carrión

Co-asesora:

Andrea del Pilar Sánchez

Universidad de Los Andes Bogotá, Colombia

2022

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Tabla de contenido Resumen ................................................................................................................................ 4

1. Introducción ............................................................................................................... 5

2. Marco Teórico ............................................................................................................ 7

2.1. Conceptos generales ............................................................................................... 7 2.1.1. Extracción .................................................................................................................................. 7 2.1.2. Quitina ....................................................................................................................................... 8 2.1.3. Quitosano ................................................................................................................................... 8 2.1.4. Grado de Desacetilación ........................................................................................................... 9

2.2. Etapas del proceso de extracción .......................................................................... 9 2.2.1. Desproteinización ...................................................................................................................... 9 2.2.2. Desmineralización ................................................................................................................... 10 2.2.3. Desacetilación ......................................................................................................................... 10

2.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído .......................................... 11 2.3.1 Valoración potenciométrica ............................................................................................................. 11 2.3.2 Espectroscopía: Reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) .............................................................. 11 2.3.3 Análisis termogravimétrico .............................................................................................................. 12 2.3.4 Tamaño de partícula ........................................................................................................................ 12

3. Metodología .............................................................................................................. 12

3.1. Materiales y reactivos .......................................................................................... 12

3.2. Métodos ................................................................................................................. 13 3.2.1. Preparación de las materia primas ......................................................................................... 13 3.2.2. Proceso de extracción .............................................................................................................. 13 3.2.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído ................................................................ 18

4. Resultados y Discusión ............................................................................................ 20 4.1. Resultados de la etapa de desacetilación ..................................................................................... 20 4.2. Proceso de extracción y producto obtenido ................................................................................. 21 4.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído .................................................................... 23 4.4. Discusión general ........................................................................................................................ 35

5. Conclusiones ............................................................................................................. 36

6. Recomendaciones para futuros trabajos ............................................................... 37

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 38

ANEXOS .............................................................................................................................. 43

ANEXO I. Etapa de extracción ...................................................................................... 43

ANEXO II. Análisis estadístico de las caracterizaciones ............................................ 44

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Agradecimientos Principalmente, debo agradecer a dos mujeres que son ejemplo a seguir para cualquiera que quiera aprender y son mis estimadas profesoras, María y Andrea solo puedo darles las gracias por la compresión y la pasión por el proyecto. Por otro lado, mi familia, mi pilar en la vida por darme la oportunidad de estar haciendo esto, lo que me gusta, aprender, los amo. Hermanita te amo, gracias por el apoyo incondicional y la comprensión, te amo, tu hermanita ya volvió. A mis amigas del alma, mis Marías, Alejandra y Camila esto es para ustedes. A mi Changurito, le agradezco la paciencia y el apoyo. A las personas que me vieron entrar y salir del laboratorio todo el semestre Luis y Julián, gracias totales. Finalmente, pero no menos importante, Valentina Moreno y Daniela Castaño, sin ustedes no estaría aquí.

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Resumen En la actualidad, el aprovechamiento de desechos agroindustriales permite reducir el impacto ambiental. Los desechos orgánicos del beneficio de los mariscos en Colombia representan una oportunidad industrial debido a que el 75% de su composición son los exoesqueletos, comúnmente conocidos como las cáscaras. El exoesqueleto de camarón (Penaeus monodon) ha sido ampliamente utilizado para la extracción de quitina y quitosano, generando así el crecimiento del uso de estos en sectores como lo son: la agricultura, los alimentos y la medicina. Teniendo en cuenta que el quitosano es un compuesto que ha generado un impacto tecnológico en la actualidad surge la necesidad de aprovechar la oportunidad de producirlo en Colombia y comercializarlo en el exterior. El desarrollo de este estudio se basó en un diseño experimental 22 en el cual se variaron las etapas de extracción (desproteización o desmineralización) y la concentración de hidróxido de sodio (NaOH) en la solución utilizada en la etapa de desproteización (1% y 4% p/v). Este procedimiento incluyó una primera etapa de desmineralización con posterior extracción, seguido de la desproteinización con una concentración de 1% p/v de hidróxido de sodio. A partir de la caracterización del compuesto se determinó que los factores tuvieron incidencia estadísticamente significativa con respecto al tamaño de partícula y el grado de desacetilación obtenido. De igual manera, se determinaron las condiciones que permitieron el mayor grado de desacetilación. Los resultados indicaron que para la obtención de un mayor grado de desacetilación (GD: 85,46%) se debe iniciar el proceso por la desmineralización, seguido de la desproteinización con una concentración de 1% p/v de hidróxido de sodio. Los resultados de este estudio sugieren el potencial del aprovechamiento de residuos pesqueros para la obtención de compuestos de interés. Palabras clave: Aprovechamiento de desechos, camarón, exoesqueletos, extracción, hidrólisis, quitina, quitosano.

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1. Introducción En la actualidad los desechos tanto orgánicos como inorgánicos generan un impacto socio-ambiental en el mundo provocando así consecuencias graves para las comunidades como lo son: infecciones, enfermedades respiratorias y en casos extremos el desarrollo de cáncer [1]. Específicamente, en Colombia la producción masiva de estos genera daños tanto a nivel ambiental como en la salud pública. Lo anterior se debe a los gases que se emiten a partir de los desechos orgánicos en descomposición. Ahora bien, el problema principal de esto es que, tanto en Bogotá como a nivel nacional los rellenos sanitarios están al borde de su capacidad y no son capaces de atender a la alta demanda debido al nulo aprovechamiento de estos desechos [2]. Por lo tanto, es necesario hallar soluciones que permitan la mitigación del impacto negativo que estos desechos pueden generar en la salud de los seres vivos y reducir de manera significativa el impacto que se produce con respecto al cambio climático y generar nuevas oportunidades de mejoramiento en las tecnologías en la explotación en desechos. De manera que, teniendo en cuenta la actividad agrícola en Colombia es posible evidenciar que dentro de los sectores más activos se encuentra el pesquero y que al igual que los demás sectores se producen cantidades significativas de desechos orgánicos de las diferentes materias primas utilizadas para el procesamiento de estos alimentos. Y esto se evidencia debido a que solo para el 2020, Colombia generó 12 millones de toneladas de residuos sólidos que no fueron aprovechados [3]. Cabe destacar que los mariscos hacen parte de la dieta diaria y economía de las regiones costeras de Colombia, consumiéndose y comercializándose un promedio de 50 toneladas diarias, lo que se traduce en una media de 18,000 toneladas anuales [4]. En términos numéricos, la producción de este tipo de producto se estimó en 180,000 toneladas anuales, lo que quiere decir que el 90% de este fue exportado generando así residuos [5] de aproximadamente 135,000 toneladas, pues en el caso de muchos mariscos el 75% del peso se ve representado por el exoesqueleto [6]. Lo mencionando con anterioridad, expone la amplia oportunidad que genera este campo en el desarrollo de productos, pues a nivel internacional estos desechos son utilizados para la extracción y producción de quitina y quitosano. De tal manera, a partir de los diferentes conocimientos científicos como lo son la bioquímica y tecnología de alimentos es posible observar que estos desechos proporcionan una oportunidad de desarrollo de productos a partir de su aprovechamiento. En el caso particular de los desechos de mariscos, existe una oportunidad en el aprovechamiento de sus exoesqueletos remanentes, pues a partir de estos es posible transformar la quitina que, principalmente los compone, en quitosano, un biopolímero con mejores propiedades de solubilidad y reactividad [7]. Por consiguiente, es posible transformarlos en biopolímeros que pueden ser utilizados de manera segura en la industria alimentaria y biomédica. Este documento se centra en la extracción del quitosano

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debido al potencial que se ha descubierto pues permite un sinfín de aplicaciones en industrias como lo son: la alimentaria, agricultura, farmacéutica, medicina, cosmetología, textil y papelera [8]. Como bien se menciona, el quitosano se aplica actualmente en la industria alimentaria en sectores como lo son: aditivos como agentes controladores, mejoramiento de las propiedades nutricionales de algunos alimentos, preservación de alimentos al deterioro, encapsulación de nutrientes, entre otros usos [8]. Lo anterior se debe a que la particular estructura de la molécula le proporciona una considerable actividad antimicrobiana, biocompatibilidad, no toxicidad, biodegrabilidad, capacidad quelante, entre otros [9]. Además, es un compuesto seguro para la ingesta de los consumidores que permite preservar alimentos de su inevitable senescencia. Por lo tanto, la producción de este compuesto permite varios beneficios en la industria colombiana como lo son: el mejoramiento de los métodos de conservación por la adicción de este como agente activo, la transformación de desecho orgánicos en Colombia y la posibilidad de desarrollar nuevos alimentos. Con el fin de entender la relación entre los exoesqueletos y su posterior transformación a quitosano, es necesario entender el procedimiento en el cual se parte de la materia prima que en este caso es la quitina. En este orden de ideas, el primer reto es lograr la mayor proporción de transformación de la quitina en quitosano, con el fin de obtener un grado de desacetilación mayor. Grosso modo, el proceso de extracción se produce en 4 pasos principales: i) preparación de la materia prima, ii) desproteinización, iii) desmineralización y iv) desacetilación. Además, se ha evidenciado que el orden en el que se realizan las diferentes etapas de transformación incide en el grado de desacetilación obtenido al final de la extracción [10]. Como se mencionó anteriormente, para la elaboración de este proyecto y futura estandarización se deben tener claras las diferentes variables del proceso, tanto fijas como variables. En el caso de este procedimiento se estableció como variables constantes tanto la concentración de ácido clorhídrico (HCl) durante la desmineralización, así como la concentración de hidróxido de sodio (NaOH) durante la desacetilación. Por ende, durante el proceso de extracción se procedió a variar el orden entre las etapas de desproteinización y la desmineralización durante la extracción y la concentración de hidróxido de sodio (NaOH) durante la desproteinización. No obstante, existe una gran oportunidad pues la producción de quitosano actualmente es un mercado que está abarcado, principalmente, por China e India los mayores productores de este compuesto [11]. Lo anterior representa una oportunidad para Colombia debido a que los residuos que se generan permiten la generación de quitosano para exportar a nivel regional, Latinoamérica, y en un futuro una expansión a niveles internacionales. De manera, que se pretende la elaboración de un protocolo de transformación y producción que permita la

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obtención de quitosano con el mayor grado de desacetilación posible con una posibilidad de ser un procedimiento escalable. Por lo tanto, el presente proyecto se enfocó en el estudio de los diferentes factores de proceso que pueden afectar el procedimiento de extracción del quitosano con respecto al grado de desacetilación obtenido. De igual manera, al variar el orden en las etapas y la concentración de hidróxido de sodio durante la etapa de desproteinización, se procedió a evaluar características en el quitosano obtenido como tamaño de partícula, análisis termogravimétrico y la valoración potenciométrica

2. Marco Teórico El quitosano a pesar de ser un compuesto altamente estudiado sus aplicaciones se encuentran en fase exploratoria, generando así que su potencial tecnológico todavía no se haya desarrollado industrialmente. Por lo tanto, se considera importante realizar una introducción que permita la identificación de información relevante acerca de este. El presente se realiza a partir de la revisión bibliográfica de los diferentes aspectos necesarios para la realización de este estudio [12]. A continuación, se presenta conceptos referentes a la bioquímica de los compuestos y la extracción y a su vez la importancia de las diferentes etapas realizadas durante el proceso de extracción y finalmente los diferentes métodos de caracterización del compuesto.

2.1. Conceptos generales Con el fin de tener mayor entendimiento del estudio se considera que hay tres conceptos que se nombran a lo largo de este que requieren una introducción, con el fin de potenciar el afianzamiento de la información para el posterior análisis de los resultados obtenidos. Por lo tanto, se priorizaron los conceptos de: extracción, quitina y quitosano.

2.1.1. Extracción A nivel químico, las extracciones hacen parte del compendio de procesos de separación que se realizan con el fin de realizar el aislamiento de uno o varios componentes deseados a partir de una materia primaria [13]. En el caso de este estudio esta permite la separación de los productos deseados de los exoesqueletos a partir de un método químico en el cual se realiza haciendo uso de un protocolo comprendido por sus principales etapas de procesamiento conocidas como: desproteinización, desmineralización y desacetilación [14].

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2.1.2. Quitina La quitina es la materia prima para la extracción de quitosano debido a que los exosqueletos están compuestos principalmente a partir de esta y otras proteínas en menor cantidad [15]. Por lo tanto, este será el punto de partida para la producción del quitosano. De manera que, esta molécula es uno de los biopolímeros renovables más abundantes de la naturaleza, además, de que su obtención requiere de bajos costos de producción, pues es hallada en los desechos de los insectos y crustáceos. A nivel químico, la estructura molecular de las quitinas consiste en glucosamina N-acetilada (GlcNAc) y 2-amino-2-d-glucosa (d-glucosamina, GlcN). La quitina contiene una alta proporción de GlcNAc, como se puede observar en la figura 1. Sin embargo, su escasa solubilidad en agua limita el uso de este recurso natural [16]. Por lo tanto, es necesario hacer uso de un proceso de transformación que permita aumentar las aplicaciones de este compuesto aumentando la solubilidad con el fin de facilitar el uso de esta. Por ello se requiere del proceso de extracción para producir un derivado con propiedades mejoradas.

Figura 1. Estructura molecular de la Quitina [17].

2.1.3. Quitosano El quitosano presenta una solución para los problemas de solubilidad de la quitina pues, al realizar un método de desacetilación de la quitina en condiciones alcalinas. La estructura de este varía, generando así un cambio en las propiedades fisicoquímicas del compuesto. Esto se debe a que el quitosano es un polisacárido lineal que contiene varias proporciones de 2-amino-2-d-glucosa d-glucosamina (GlcN), como también en la quitina. Sin embargo, el proceso de desacetilación genera una sustitución en los grupos acetamido por grupos amino, como se observa en la figura 2 [18]. Lo anterior permite que la disolución del compuesto se facilite en medios ácidos orgánicos tales como: ácido fórmico, acético, cítrico y tartárico, y también en ácidos minerales diluidos a excepción del ácido sulfúrico [7]. Este compuesto cuenta con varias aplicaciones en: las áreas nutricionales, agrícola y especialmente biomédica. Sin embargo, su pobre solubilidad en soluciones acuosas y su alta viscosidad son problemáticas para esas aplicaciones [19]. Este problema genera que no se puede utilizar de manera correcta para diferentes aplicaciones generando así diversos problemas.

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Figura 2. Estructura molecular del Quitosano [17].

De igual manera, es importante resaltar que el quitosano presenta un tamaño de partícula variable. Lo anterior permite que se obtengan dos tipos principales de quitosano en la industria: de bajo y alto peso molecular. Con el fin de determinar el tipo de quitosano obtenido es posible hacer uso de la medición del tamaño de partícula pues cada uno de estos tiene un rango de tamaño establecido[20].

2.1.4. Grado de Desacetilación El grado de desacetilación hace referencia a la relación que se obtiene al realizar la extracción entre la cantidad de quitina inicial y la quitina final, de manera que se puede evidenciar la cantidad de quitosano extraído. El grado de desacetilación (GD) de una muestra de quito-oligosacáridos (COS) es uno de los factores más importantes para evaluar sus aplicaciones en los campos médico, nutricional, de tratamiento de aguas residuales y biotecnológico [21].

2.2. Etapas del proceso de extracción La extracción se compone de diferentes etapas que permiten la transformación de la quitina de los exoesqueletos en quitosano. A grandes rasgos este proceso consta del acondicionamiento de la materia prima en el cual se preparan los exoesqueletos de los camarones. Por otro lado, están las etapas de desmineralización y desproteinización que permitirán que los exoesqueletos se conviertan en una matriz pura de quitina. Finalmente se produce el paso más importante que en este caso es la desacetilación donde la quitina se transformará en el producto deseado, el quitosano. Cabe resaltar que en este caso la quitina está perdiendo su pureza de manera que aumenta la pureza del quitosano, por lo tanto, se ha determinado que en caso de no obtener un grado desacetilación del 100% se encuentren trazas de quitina en el compuesto extraído [22].

2.2.1. Desproteinización La desproteinización es un método utilizado en procesos químicos debido a la capacidad que tiene para eliminar las proteínas que no son requeridas para el producto deseado. Este proceso se realiza, generalmente, con la adición de hidróxido de sodio, ya que este permite que las proteínas contenidas en las cáscaras sean hidrolizadas de manera efectiva puesto que este tipo de bases tienen un pH lo suficientemente alto para realizar el procedimiento [23].

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2.2.2. Desmineralización De manera contigua, la desmineralización es una etapa en la cual se realiza la eliminación de los componentes minerales de los exoesqueletos, dado su alto contenido en estos. En el caso específico de este estudio, las cáscaras de los mariscos tienen una composición del 20 al 50% [24] de carbonato de calcio (CaCO3) el cual se debe aislar para la producción del quitosano, puesto que es el causante de la baja solubilidad de la quitina. Este proceso se realiza a partir de la inmersión de los exoesqueletos en un medio ácido con molaridades mayores a 10 M, generalmente, de ácido clorhídrico [25].

2.2.3. Desacetilación Finalmente, como se mencionó con anterioridad la etapa más importante del proceso de extracción es la desacetilación, pues como se observa en la figura 3, esta es la encargada de la sustitución del grupo acetilo en la quitina con un grupo amino que compondrá la nueva estructura del quitosano [26]. La importancia de este proceso radica en que este determinará el grado de desacetilación que hace referencia al contenido de grupos amino libres en la estructura obtenida. Este proceso se realiza a partir de un procedimiento de hidrólisis química en un medio alcalino. En el caso de la producción de quitosano las condiciones propicias para ejecutar este procedimiento son en condiciones relativamente severas de hidrólisis alcalina, en la cual se hace uso de solución acuosa concentrada de hidróxido de sodio (NaOH) a una temperatura de 110 a 140 ºC durante periodos de tiempo desde 4 hasta 24 horas en caso de realizarlo a temperatura ambiente. Es importante tener en cuenta, los factores de temperatura y tiempo pues al no ser controlados, estos pueden provocar la degradación de los biopolímeros generados [27].

Figura 3. Ramificación que cambia en la producción de quitosano [26].

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2.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído

2.3.1 Valoración potenciométrica En primer lugar, se presenta un método de la valoración en el cual se realiza la disolución del quitosano obtenido en un medio ácido y su posterior titulación con una solución alcalina. Este procedimiento permite realizar una curva de pH con respecto al volumen añadido de base. Como se puede observar en la figura 4 los tres momentos de la titulación, en primer lugar, el principal objetivo de esta práctica es realizar la titulación del exceso de ácido (a) dando inicio a la protonación de los grupos amino del quitosano. Una vez finalizado el proceso, el quitosano obtenido comenzará a precipitar en el medio neutro (b). El último segmento que se puede observar en la curva de titulación, se da cuando la solución presenta un exceso de la base (c), generando así una pendiente constante ilustrando el aumento de pH en la solución.

Figura 4. Curva de titulación potenciométrica de solución de quitosano puro en HCl [28].

De acuerdo con la gráfica obtenida, se obtienen dos puntos de inflexión. En primer lugar se obtiene uno que corresponde a la neutralización del exceso de ácido y el segundo a la neutralización de los iones del grupo amino del quitosano. De acuerdo con esto, la diferencia entre los dos puntos de inflexión presentará información consistente con el grado de desacetilación alcanzado por tratamiento [29].

2.3.2 Espectroscopía: Reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) La espectroscopía es un estudio que permite determinar, con buena precisión y sensibilidad, casi todos los elementos presentes en cantidades pequeñas y trazas en cualquier material [30]. Determinará picos característicos del compuesto obtenido que permitirán el contraste con lo encontrado en la literatura.

(a)

(b)

(c)

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El método más oportuno para el estudio de este compuesto es a partir de la reflectancia total atenuada (ATR) pues es un método de muestreo por contacto que involucra un elemento de reflexión interna (IRE) que cuenta con un alto índice de refracción y propiedades de transmisión de ATR. Siendo así una de las técnicas de muestreo más populares utilizadas por los analistas de FT-IR. Cabe resaltar que, esta técnica aprovecha la información espectral que se puede obtener de los fenómenos de reflexión [31].

2.3.3 Análisis termogravimétrico Este estudio se entiende como un método que permite el análisis de una muestra a partir del cambio de peso de una sustancia en función de la temperatura. Así, la muestra se somete a un programa de temperatura controlada por intervalos de aumento de temperatura en determinado tiempo en una atmósfera controlada [32]. En el caso del quitosano se ha podido determinar que hay una relación entre el grado de desacetilación y la estabilidad térmica, por lo tanto, se considera un prueba necesaria para el análisis posterior [25].

2.3.4 Tamaño de partícula Finalmente, el tamaño de partícula considerado uno de los parámetros más importante en el caso de materiales inorgánicos insolubles y orgánicos, permite la evaluación de dispersión, solubilidad, eficiencia de nucleación y propiedades ópticas y mecánicas de los materiales [33] lo cual genera la posibilidad de evaluar la solubilidad del material obtenido. De igual manera, su medición permite establecer si el quitosano es de bajo o alto peso molecular.

3. Metodología

3.1. Materiales y reactivos Para la realización de este estudio se utilizó como materia prima las cáscaras de marisco, específicamente, camarón tigre. Estas fueron obtenidas en la pesquera Alzate ubicada en la ciudad de Bogotá. Con referencia a su trazabilidad, estas fueron obtenidas de las costas de la región pacifica de Colombia en el municipio de Tumaco, Nariño. Los reactivos utilizados fueron proporcionados bajo la supervisión de los técnicos de los laboratorios del departamento de Ingeniería Química y de Alimentos de la Universidad de los Andes, debido a su condición de sustancia controlada. Se usó, hidróxido de sodio en lentejas (MERCK, Estados Unidos) y ácido clorhídrico al 37% (Panreac, Alemania). Por otro lado, con el fin de realizar comparaciones con respecto a quitosano comercial se hizo uso de quitosano de marca Sigma-Aldrich.

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3.2. Métodos El siguiente estudio se distribuyó en 2 etapas que permitieron el cumplimiento de los objetivos propuestos: proceso de extracción y caracterización del compuesto obtenido.

3.2.1. Preparación de las materias primas La primera etapa que se realizó fue el acondicionamiento de la materia prima debido a que esta se encontraba congelada. Cabe resaltar, que la materia prima de este procedimiento consta de las partes de la cabeza, cola y el segmento torácico correspondientes de los exoesqueletos de los camarones. A seguir, se realizó la etapa de limpieza con el fin de eliminar impurezas como tierra, materia orgánica o minerales del mar. Posteriormente, se realizó el secado con el fin de disminuir la humedad de éste. Para esto se extendieron los exoesqueletos en una bandeja y se ingresaron a un horno de convección forzada Isotherm® (Esco, Estados Unidos ) a 60ºC durante 24 horas [34]. Una vez obtenida la materia prima seca se realiza el proceso de reducción de tamaño de partícula en un molino de cuchillas y posteriormente tamizado. Para este proceso se realizó la molienda con el fin de tener un material homogéneo debido a los diferentes tamaños de cada parte del exoesqueleto. Para esto se hizo uso de un molino de cuchillas Pulverisette 19 (Fritsch, Estados Unidos) con el fin de reducir este tamaño y posteriormente se utilizó la tamizadora eléctrica (Pinzuar, Colombia) con un mallado de 10 (2 mm) [36].

3.2.2. Proceso de extracción En primer lugar, el proceso de extracción se dividió en 2 métodos de extracción diferentes, dando como resultado 4 tratamientos. Por lo tanto, se consolidó un protocolo que permitiera la repetición de este proceso. La figura 5 muestra el diagrama de flujo que se llevó cabo. Cabe resaltar, que para cada uno de los tratamientos se realizaron dos réplicas correspondientes a cada tratamiento. Simultáneamente, se empleó un diseño factorial 22 en los cuales se tienen dos factores y dos niveles de cada factor (tabla 1). En este caso se determinó a partir de literatura que el orden de extracción puede llegar a ser significativo en cuanto el grado de desacetilación debido a que las rutas de las reacciones generadas pueden provocar la degradación de algunos componentes en primera instancia [10] y por otro lado la concentración de hidróxido de sodio durante la desmineralización [35]. Se determinó que las variables de respuesta evaluadas fueran el grado de desacetilación, el tamaño de partícula y los valores de pH. Por otro lado, se realizó una comparación con los espectros y análisis termogravimétrico hallados en la literatura.

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A modo de aclaración, durante las etapas intermedias del proceso como lo son los secados de la materia prima, como las velocidades de agitación utilizadas en el montaje de extracción se mantuvieron constantes para cada uno de los tratamientos realizados en el estudio. Con respecto a las temperaturas y tiempo de secado se utilizaron temperatura de 80º C durante un tiempo de 6 horas. Por otro lado, para los montajes de extracción en los cuales la materia de estudio se encuentra inmersa en soluciones, como lo son la desproteinización, la desmineralización y la desacetilación, se estableció una velocidad de agitación de 400 rpm durante 30 minutos.

Figura 5. Diagrama de flujo del protocolo de extracción.

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De manera seguida, se presenta la tabla 1 donde se observa un resumen de las variables que se tuvieron en cuenta durante el proceso de extracción.

Tabla 1. Especificaciones de los cuatro tratamientos de extracción realizados.

Factores y variables fijas de las etapas de extracción

Tratamiento Orden de etapas*

Concentración NaOH

Concentración de HCl (DM)

Concentración NaOH (DA)

T0 DM-DP-DA 1% (p/v) 10% (p/v) 20% (p/v) T1 DM-DP-DA 4% (p/v) 10% (p/v) 20% (p/v) T2 DP-DM-DA 1% (p/v) 10% (p/v) 20% (p/v) T3 DP-DM-DA 4% (p/v) 10% (p/v) 20% (p/v)

*Las etapas hacen referencia a los procesos de: DM-desmineralización, DP-desproteinización y DA-desacetilación.

Teniendo en cuenta el diseño experimental presentado, las extracciones constan de 4 etapas relevantes las cuales son: la preparación de materia prima (exosqueletos), desproteinización, desmineralización y desacetilación. Es preciso señalar que existen etapas intermedias en el proceso de extracción, como lo son lavados y secados de la materia de estudio, en las cuales las condiciones de estos se mantienen constantes con el fin de tener variables controlables del experimento [35].

Una vez realizada la preparación de materia se debe mantener, tanto la materia seca inicial como el quitosano obtenido, en un lugar sellado al vacío con el objetivo de evitar el aumento o ganancia de humedad. Es por esto que el almacenamiento de las muestras obtenidas se mantiene en un desecador. En el caso de este estudio, se sellaron bolsas Ziploc al vacío y posteriormente se mantuvieron en un desecador hasta su uso final, como se observa en la figura 6. Inicialmente, se empieza la extracción con la etapa de desproteinización usando la materia prima seca que como se establece en el marco teórico, permite la disolución de las proteínas usando soluciones acuosas de hidróxido de sodio. Cabe resaltar, que este paso cuenta

con unas de las variables de proceso con el fin de evaluar si tiene incidencia en el resultado de las variables de respuesta definidas previamente. Para esta etapa se realiza una solución base de la cual se establecieron dos concentraciones de NaOH en el primer nivel se utilizó al 1% (v/v) en una relación 1:10 g/mL agua y en el segundo nivel una concentración de 4%

Figura 6. Almacenamiento de los productos finales.

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(v/v) 1:10 g/mL agua (Figura 7). Este proceso requiere que la materia de estudio sea inmersa en la solución para así llevar a cabo en un montaje de agitación y calentamiento a 400 rpm por 6 horas. Una vez finalizado el proceso de agitación la materia prima es dejada en inmersión durante 24 horas sin agitación dentro de la solución correspondiente a la etapa del proceso, en este caso, la solución de hidróxido de sodio [35]. Este paso se realizó en planchas de calentamiento Kera-Disk™ (Heidolph, Alemania) con agitación llevada a cabo por los agitadores magnéticos.

Figura 7. Montaje realizado para cada tratamiento durante la desproteinización.

Seguidamente, se efectuó un lavado con agua desionizada con el fin de llegar a un pH neutro. Esta etapa se repitió a lo largo de todo el proceso y se realizó en un montaje de filtrado al vacío compuesto por: una bomba de vacío modelo 300 (Rocker, Taiwan), un Kitasato, un embudo Buchner, papel filtro y un agitador de vidrio (figura 8).

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Figura 8. Montaje del filtrado para el lavado de los tratamientos.

El siguiente paso fue la desmineralización. Este proceso, al igual que los anteriores se realizó a partir de la inmersión de los residuos de la cáscara en una solución de ácido clorhídrico a una concentración de 10% en una proporción 1:10 g de exosqueleto/mL de ácido con un tiempo de reacción de 30 min a temperatura ambiente y agitación constante a 400 rpm [35] (Figura 9). En este punto se obtiene la quitina, la cual se lavó con agua desionizada hasta pH neutro y se secó en horno a 80 ºC hasta peso constante [35].

Figura 9. Montaje realizado para cada tratamiento durante la desmineralización.

De la siguiente manera se procedió a realizar la desacetilación, en este proceso se realiza la transformación de la quitina obtenida después de la desmineralización y posteriormente es desacetilada para luego transformarse en quitosano. Este procedimiento se realizó en un montaje igual al de las etapas de desproteinización y desmineralización. Se utilizó una solución de hidróxido de sodio (NaOH) a una concentración del 50% (p/v) 1:20 g/mL con

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agitación constante de 400 rpm a 90 ºC por 30 minutos. Después, se realizó un lavado en el montaje de filtrado al vacío para eliminar la base que se utilizó y se secó en el horno de convección a 60 ºC [10]. El producto obtenido se mantuvo en el desecador en bolsas tipo Ziploc hasta su análisis.

3.2.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído

Como ya se mencionó con anterioridad, se utilizaron cuatro métodos para la caracterización del quitosano con el fin de establecer el grado de desacetilación de producto generado a partir de cada tratamiento.

a. Valoración potenciométrica Para la valoración potenciométrica se realizó un montaje de titulación el cual consiste en: un soporte, una bureta, un beaker de 600 mL, una plancha de calentamiento, un agitador mecánico y un pH-metro S20 SevenEasy™ (Mettler Toledo, Estados Unidos). Para la preparación de la prueba, de acuerdo con la literatura, se preparó una solución con el respectivo tratamiento (T0, T2, T2 y T3) en un medio ácido. El primer paso a seguir fue la preparación de la solución que corresponde a la solución del quitosano al 0.4% del peso de la solución, es decir 0.2 g, en un solución de 120 mL de agua con 40% de ácido clorhídrico 0.05 M y se mantuvo en agitación constante a 300 rpm durante la titulación [29]. El segundo paso, una vez establecido el montaje de titulación, fue la preparación de la base que en este caso fue hidróxido de sodio 0.15M. Se prosigue a realizar la titulación en intervalos de 0.5 mL, registrando lo valores obtenidos y simultáneamente, se almacenan los valores para la consecuente realización de una gráfica en la cual se observe el comportamiento de del pH con respecto al volumen añadido de hidróxido de sodio. La curva resultante tiene dos puntos de inflexión, lo cual permite que se realice la derivada de esta para realizar el análisis respectivo. De manera numérica, se ha determinado una fórmula que permite representar el grado de desacetilación obtenido representado en la ecuación 1:

%#$% =16.1(+ − -)

/ 0(123425ó71)

Los valores que se representan en eta ecuación corresponden a: y el punto de inflexión mayor, x corresponde al punto de inflexión menor, ambos expresados como volúmenes, f es la molaridad de la solución de NaOH, w es la masa en gramos de la muestra y el número 16.1 es un factor asociado al compuesto [37].

19

b. Espectroscopía Haciendo uso del equipo Espectrómetro FTIR Nicolet™ iS50 (Nexus, Singapur) dispuesto para la realización de análisis de reflectancia, se tomó una muestra del quitosano con un peso no superior de 5 a 10 mg [38], el peso fue determinado a partir de la toma de muestra con la espátula recolectora propia del equipo que cuenta con la medida predeterminada, en este caso se obtiene una muestra en forma de una pequeña lámina con el fin de evaluar la transmitancia a lo largo del rango de longitud de onda. Se tomó una muestra por tratamiento y réplica, se ubicó en el lector y se prensó con el equipo para la realización del ensayo. Finalmente, se obtuvo una gráfica que presenta los diferentes picos a lo largo del espectro de transmitancia de luz de la prueba los cuales son representativos de los diferentes elementos del compuesto. Teniendo en cuenta trabajos pasados [39], existen varios métodos experimentales que permiten el cálculo del grado de desacetilación obtenido a partir del espectro obtenido. De acuerdo con esto, en 1997 la pareja de científicos Sabnis-Flock desarrolló un método que permite el cálculo de esta a partir de los valores de transmitancia y absorbancia. A continuación, se presentan las ecuaciones (2-3) requeridas para estimar el grado de desacetilación del quitosano extraído. En primera instancia, se presenta la ecuación 2, en la cual se relaciona tanto la absorbancia y transmitancia, que permitirán realizar los cálculos que se mencionan posteriormente.

%89:;847254 = − log(?;479@5A47254)(B23425ó72) De igual manera la ecuación 3 estipulada por Sabnis -Block [39], permite hallar el grado de desacetilación a partir de una relación entre las absorbancias de dos picos representativos del quitosano como lo son: el pico 1655 y el 3450 nm.

#;4D:D1D19421A5E425ó7(%) = 97.67 − H26.486 ∗%!"##%$%#&

L(123425ó73)

c. Análisis termogravimétrico El siguiente método de estudio fue el análisis termogravimétrico realizado en el equipo Simultáneo de TGA/DSC ST 600 que permite realizar un estudio de cómo varía el porcentaje de peso de una determinada muestra en función de la temperatura. El TGA mide la masa de una muestra mientras esta se calienta o se enfría en una atmósfera definida. Permite así determinar puntos característicos de la composición de los compuestos a estudiar, en este caso el quitosano[40]. Con respecto a las especificaciones del proceso, este se realizó con un flujo de nitrógeno con la siguiente configuración: 25 ºC temperatura mínima, 550 ºC

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temperatura máxima, intervalos de temperatura de 10 ºC/min y un flujo de nitrógeno de 30 mL/min.

d. Tamaño de partícula Finalmente, el ensayo de tamaño de partícula se realizó en el equipo analizador de tamaño de partículas Mastersizer 3000 con la celda de solventes en agua. Para la configuración del equipo se tuvieron en cuenta que las partículas eran no esféricas y se utilizaron los valores predeterminados de absorbancia y refracción del quitosano en el programa, 0.220 y 1.331 respectivamente. Para la medición se realizó una solución al 2% de quitosano en una disolución al 1% de ácido acético [41]. Los resultados que se reportaron de esta prueba fueron los diámetros D [4,3] conocidos por ser los diámetros medios del volumen (ecuación 4) [42]:

$[4,3] ∗=∑ $'%R'(!

∑ $'$R'(!

(123425ó74)

Por consiguiente, con el fin de evaluar los resultados obtenidos a partir de cada extracción se procedió a su análisis estadístico. Para la ejecución de este se hizo uso del software estadístico Minitab 19 que permite la evaluación de los resultados. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos factores teniendo en cuenta un valor de significancia de ɑ: 0.05. Esto se realiza debido a que permite estudiar la relación entre una variable dependiente cuantitativa, en este caso tanto el grado de desacetilación como el tamaño de partícula, y dos factores, cada uno con varios niveles. Los resultados obtenidos fueron los valores-p que hacen referencia a la significancia de los factores con respecto a las variables de respuesta evaluadas [43]. De igual manera, es necesario emplear un test que permita determinarla la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes tratamientos, para ello se empleó la prueba de Tukey.

4. Resultados y Discusión A continuación, se presentan la síntesis de los resultados obtenidos del análisis de las dos réplicas por tratamiento, así como también, el análisis estadístico y discusión de estos.

4.1. Resultados de la etapa de desacetilación Para realizar la comparación entre el grado de desacetilación obtenido con los diferentes tratamientos y a partir de tres técnicas de medición diferentes, se presenta la Tabla 2. Esta

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se realizó a partir de la compilación de resultados que serán analizadas con mayor profundidad en las siguientes secciones del documento.

Tabla 2. Resumen de los grados de desacetilación obtenidos a partir de los diferentes métodos.

Grado de desacetilación (%)

Valoración potenciométrica

Estudio de espectroscopía

Análisis termogravimétrico

T0 85.46 (±0.60) 79.98 (±0.27) 83.08 (±3.45) T1 79.31 (±0.43) 83.08 (±2.45) 67.19 (±2.05) T2 76.77 (±1.70) 83.12 (±1.15) 67.62 (±1.03) T3 82.25 (±0.14) 83.47 (±0.02) 48.05 (±4.36)

A partir de los datos mostrados en la tabla 2, se realizan las posteriores discusiones que permitirán establecer las razones que pueden causar las diferencias en el grado de desacetilación en la medida que cambia cada uno de los métodos. Asimismo, se evalúan de manera más detalladas los estudios estadísticos que se emplean para comparar los diferentes tratamientos empleados con el fin de determinar si existen diferencias significativas para la selección de un método más eficiente.

4.2. Proceso de extracción y producto obtenido De acuerdo con el diseño experimental planteado se obtuvieron 8 diferentes muestras de quitosano (figura 10). A partir de estas se calcula la cantidad de masa obtenida al final con respecto a los valores iniciales de la muestra. De esta manera, será posible establecer en qué medida los tratamientos difieren en cuanto al posible producto final que se puede obtener.

Figura 10. Producto final obtenido de quitosano extraído.

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A continuación, se presentan diferentes resultados de las características más relevantes en cuanto al rendimiento del proceso con respecto al quitosano obtenido. Con respecto a los resultados obtenidos en la tabla 3 es posible discutir acerca del rendimiento de la extracción.

Tabla 3. Características del quitosano obtenido por cada uno de los tratamientos.

Descripción de la cantidad T0 T1 T2 T3

Masa inicial de exoesqueleto (g) 15 [5] 15 [5] 15 [5] 15 [5]

Masa final de quitosano (g) 2.26 [0.80] 2.26 [0.95] 2.67 [0.86] 1.82 [0.80]

Porcentaje de humedad (%) 1.05 [1.23] 2.59 [3.54] 2.34 [1.98] 2.57 [1.54]

Rendimiento de la extracción

(%)

15.06 (±0.47)A

17.26 (±0.87)A 15.6(±0.80)A 17.1(±0.55)A

1Los valores entre [] hace referencia a los resultados obtenidos en la segunda réplica del experimento. 2Los superíndices en la fila de rendimiento de extracción son los resultados de Tukey que representan que las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

De acuerdo con la literatura, el rendimiento ideal en los procesos de extracción a partir de exoesqueletos se encuentra en un rango de 10 a 30% con respecto al peso inicial [44], lo que quiere decir que teniendo en cuenta los resultados obtenidos, éstos se encuentran en el rango. Por lo tanto, se establece que el proceso de extracción empleado fue efectivo en términos de la materia prima final esperada. De acuerdo con el procedimiento planteado, se pretendía hallar un tratamiento que permitiera la obtención de un mayor rendimiento. Sin embargo, los valores obtenidos parecen no tener una diferencia representativa, por lo tanto, se prosiguió a la realización de un análisis estadístico que permita confirmar la hipótesis. Se realizó el análisis de varianzas de dos factores (anexo 1 encontrado en la sección I de anexos). A partir del análisis de la varianza se obtuvo que ni los factores evaluados ni la interacción afectaron significativamente al rendimiento. Asimismo, los resultados obtenidos a partir del test de Tukey permiten realizar la corroboración de cómo se pueden comparar los tratamientos entre estos. En consecuencia, al revisar la tabla 3 es posible analizar que al contener la misma letra correspondiente a la agrupación determinada en el test del Tukey entre los cuatro tratamientos es posible confirmar que ninguno de los factores establecidos durante el proyecto tuvo incidencia en el resultado. Del mismo modo, se obtiene la gráfica del análisis de Tukey que se puede observar en el anexo 2. Con respecto a esta gráfica, ésta permite establecer cuando los diferentes intervalos

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de confianza con un 0 contenido en este indicarán entonces que no existe una diferencia significativa entre cada uno de los tratamientos. Es decir, la gráfica presenta un intervalo entre las posibles parejas de comparación entre los tratamientos dando como resultado seis intervalos. Es por esto que, como se puede observar en el anexo 2 todos intervalos de la comparación entre las medias de los diferentes tratamientos incluyen el valor de 0 dentro de estos, por lo tanto, se corrobora que ninguno de los tratamientos determinados es significativamente diferente entre ellos. A modo de explicación, se puede considerar que estos determinados factores no son significativos debido a que existen factores que representen una mayor incidencia. De acuerdo con la revisión bibliográfica realizada es posible establecer que existen 3 factores principales que afectan el rendimiento de las extracciones. En primer lugar, se deben tener en cuenta el pretratamiento que se le realiza a la materia pues las etapas de limpieza y secado serán de suma importancia en el proceso. Lo anterior debido a que va a garantizar que el rendimiento de la extracción sea mayor generando así una reducción de los solventes utilizados durante ésta [45]. Por otro lado, también se puede obtener un producto no deseado así como la baja conversión de los productos de la reacción [46]. Finalmente, de manera experimental y como observación se produce una pérdida considerable durante el lavado del producto ejecutado en las etapas intermedias. Como bien se observa en los resultados para realizar este tipo de extracciones se recomienda la instauración de un protocolo que se aplique durante la preparación y procesamiento de la materia prima. Lo anterior, con el fin de propiciar la producción de muestras de alta calidad que permitan la ejecución correcta de los procesos de extracción generando así mayores rendimientos en los productos finales y de igual manera la estandarización del proyecto permitiendo que este sea comparable entre tratamientos, a partir de un diseño experimental.

4.3. Métodos de caracterización del quitosano extraído A continuación, se presentan los resultados obtenidos de la caracterización del compuesto, los cuales permitirán la evaluación de las propiedades representativas del compuesto.

4.3.1. Valoración potenciométrica En la figura 11, se observan las diferentes curvas de titulación obtenidas con respecto a las muestras de quitosano de cada tratamiento. Se puede confirmar que el comportamiento de las titulaciones realizadas fue similar al de la figura 4 que representa la curva esperada durante la titulación.

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Figura 11. Curvas potenciométricas de solución del quitosano extraído (donde [a] es T0, [b] T1, [c] T2 y [d] T3).

Ahora bien, de acuerdo con la información planteada en la metodología, este método de caracterización realizado a partir de la titulación permite la obtención de los dos puntos de inflexión tanto el menor como el mayor del proceso, ya que, haciendo uso de la ecuación 1 permite determinar el grado de desacetilación. Con respecto a las titulaciones se obtuvieron los valores reportados en la tabla 4 para el grado de desacetilación con su respectiva desviación estándar:

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

pH

Cantidad de NaOH agregada (mL)

[a]

Titulación (media)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

pH


[b]

Titulación (media)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

pH


[c]

Titulación (media)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

pH


[d]

Titulación (media)

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Tabla 4. Resultados ponderados del grado de acetilación obtenido a partir de la valoración potenciométrica de cada una de los tratamientos realizados.

Tratamiento Grado de desacetilación (%) T0 85.46 (±0.60)A T1 79.31 (±0.43)C T2 76.77 (±1.70)C T3 82.25 (±0.14)B

*Los superíndices en la columna del grado de desacetilación son los resultados de Tukey que representan que las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

De acuerdo con los resultados obtenidos del análisis de la varianza encontrados en la sección de anexos II (Anexo 3), los valores p para los dos factores fueron de 0.000 y 0.046 para orden y concentración, respectivamente. De igual manera, se obtiene que la interacción entre estos factores genera un valor de p de 0.000 significando de igual forma que esta es estadísticamente significativa. A partir de esta información es posible discutir acerca de cómo estos factores de manera independiente y la interacción de éstos afectan a la variable de respuesta en el experimento. En primer lugar, la concentración de NaOH en la solución es incidente debido a que los procesos de hidrolisis se ven directamente afectados por la concentración de la solución [47] que se utiliza durante el proceso como se demostró en el análisis estadístico. Con respecto a este factor, el efecto que ésta tiene sobre el resultado se debe a que, la concentración de NaOH en la solución de desproteinización genera la eliminación de proteínas que no hacen parte de la composición del quitosano. De manera que, estas proteínas pueden reducirse de mejor manera si se realizan con una baja cantidad de NaOH, como se observa en el resultado del tratamiento T0. En adición a que la degradación de la proteína es más efectiva, generando que la reacción se lleve a cabo específicamente a las proteínas de exoesqueleto sin degradar compuestos importantes como lo son los grupos de aminas que se pueden llegar a ver afectados por la solución. Asimismo, el orden de etapas utilizado durante la extracción tiene incidencia en la forma en la cual se degrada la materia prima. Lo anterior, genera diversos cambios a nivel composicional dependiendo del orden en el cual se transforma la materia prima produciendo así un resultado final diferente por tratamiento [10]. De esta manera, el orden de las etapas es significativo debido a los procesos que se están llevado a cabo durante la reacción de cada una de las etapas de extracción. En este caso se obtuvo un mayor grado de desacetilación al realizar la desmineralización en primera medida debido a que esta etapa es la encargada de eliminar los componentes inorgánicos de la materia prima la cual es de suma importancia debido a que la eliminación de estos compuesto genere el aislamiento de la quitina. Lo anterior significa que al realizar en primera instancia la desmineralización, el proceso

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consecuente que es la desproteinización permite la purificación de la quitina eliminando proteínas que no son necesarias, de manera que el compuesto obtenido tendrá menores impurezas y se realizará sin degradar compuestos deseados de manera previa. Es así que se concluye, que, en el caso de la medición realizada a partir de este método, existe una estrecha relación entre la interacción que se genera tanto en la concentración de la solución de desproteinización como el orden de la producción de la extracción. Como se menciona anteriormente, de manera implícita los dos factores se relacionan debido a que el orden de etapas se ve afectado por la concentración de NaOH, de igual manera los resultados variaran dependiendo del momento en el cual se agrega la materia prima a las diferentes soluciones. En adición a lo mencionado con anterioridad, la diferencia principal con respecto a las concentraciones de la solución de desproteinización generan que la cantidad de grupo hidroxilo (-OH) en el compuesto disminuya y genere así la diferencia en el grado de desacetilación. Asimismo, como bien se comentó con anterioridad en la figura 11 evidencian los 3 puntos importantes donde se presenta la neutralización de los iones H+ del HCl en exceso, produciendo así que al realizar el orden de las etapas de diferente manera sea posible que la estructura del compuesto tenga una mayor o menor cantidad de grupos aminos al final de cada una de las extracciones. De estos resultados es posible afirmar que los factores seleccionados durante la extracción, tanto la concentración de NaOH en la solución de desproteinización como el orden de las etapas de extracción, fueron incidentes resultado final generando así que el grado de desacetilación variara de manera significativa. Indicando así que, se debe ejecutar en primera instancia el proceso de desmineralización que haga uso de una solución de NaOH con una concentración del 1% p/v, otorgando así los mejores resultados con un grado de desacetilación de 85.46%. Este valor se determinó debida a la distancia de las diferencias de medias con el cero indicando así que existe una diferencia mayor entre estos. Por lo tanto, a partir de la información brindada por la gráfica de comparación de Tukey (Anexo 4) es posible verificar hubo diferencias significativas entre la media de dos de los tratamientos a estudiar. En este caso tanto T0 como T3 representan los valores más altos con respecto al grado de desacetilación. Esta diferencia permite que se establezca un tratamiento que permita la obtención de un mayor grado de desacetilación. Retomando con el gráfico de intervalos de Tukey del anexo 4, se observa que existen dos intervalos, T3-T0 y T2-T3, que no contienen el valor 0 dentro de éstos, representando así que estos son significativamente diferentes entre ellos. De modo que, a partir de la comparación entre las medias del tratamiento T0 con respecto a los demás, éste representa un mejor grado entre los tratamientos.

27

4.3.2. Espectroscopía FTIR Los siguientes espectros permiten el cálculo del grado de desacetilación debido a que éstos proporcionan diferentes picos en la transmitancia de cada uno de los compuestos característicos del producto obtenido. Este cálculo se realiza a partir de los valores de transmitancia determinados en el gráfico de la figura 12 y estos se reemplazan en las ecuaciones (2-3) de interés. Una vez calculados estos valores se prosigue a realizar el análisis estadístico pertinente. A partir de los espectros obtenidos, se pueden observar las bandas o picos característicos del quitosano. Por ejemplo, los picos detectados entre 3500 y 3200 cm-1 generalmente se asignan al estiramiento de los grupos -OH del agua y los grupos -NH. Por otro lado, de acuerdo con la literatura los picos que se encuentra en una franja de número de onda de 70 a 2852 cm-1 corresponden al estiramiento del grupo -CH de los alcanos. Cabe resaltar que el pico en 1591 cm-1 corresponde a las amidas de la quitina. Por otro lado, existe un pico en 2872.75 cm-1 que sería la representación de grupo carboxílico -ACOOH [48]. Finalmente los picos que se encuentra en el intervalo de 500 a 900 cm-1, hacen parte de los compuestos minoritarios como bien se puede ver tienen una menor transmitancia indicando así que no están presentes en grandes cantidades[49]. Los estudios de espectroscopia proporcionan información suficiente para calcular el grado de desacetilación estimado a partir de las ecuaciones 2 y 3. La figura 12 muestra el espectro obtenido de los diferentes tratamientos comparados con el quitosano comercial. Cabe resaltar que se realizó el estudio tanto para la primera como para la segunda réplica. Sin embargo, al tener resultados similares con respecto a los espectros se tuvo en cuenta la gráfica del espectro de la primera réplica. De igual manera, es posible acceder tanto al espectro individual del quitosano comercial (anexo 5) como al espectro de la segunda réplica en la sección de anexos (anexo 6).

Figura 12. Espectros obtenidos a partir del estudio de los quitosanos estudiados, tanto comercial como extraído

Convenciones T0 (a) T0 (b) T1 (a) T1 (b) T2 (a) T2 (b) T3 (a) T3 (b)

Quitosano Comercial

Con respecto al espectro presentado (figura 12) es posible ver como existen regiones en las cuales la sobreposición es evidente indicando un gran parecido al comercial, por consecuente, se considera que es posible obtener un alto grado de desacetilación, pues los picos obtenidos se sobreponen. Ahora bien, en cuanto a los picos más notorios en los que hay cierta diferencia, se encuentran los ubicados en la zona de los hidroxilos que comprende de 3000 a 3750 cm-1 y las aminas en longitudes de 1580 cm-1 y 1620 cm-1 indicando que a pesar de estar presentes no llegan al nivel de pureza esperado[49]. A continuación, se presenta un resumen (Tabla 5) de los resultados obtenidos a partir de este método haciendo uso de las ecuaciones 2 y 3 que se establecieron con anterioridad.

Tabla 5. Resultados ponderados del grado de desacetilación obtenidos a partir del espectro de cada una de los tratamientos realizados.

Tratamiento Grado de desacetilación (%) T0 79.98 (±0.27)A T1 83.08 (±2.45)A T2 83.12 (±1.15)A T3 83.47 (±0.02)A


De acuerdo con estos resultados, es posible realizar de igual manera el análisis de varianza tanto de los valores obtenidos con el espectro de la figura 12 así como la réplica encontrada en el anexo 7 que permita realizar una discusión más detallada. Con respecto al análisis de varianza encontrado en la sección II de anexos (anexo 7), es posible discutir que tanto el orden de las etapas de extracción de NaOH como la interacción entre el orden de etapas y concentración de NaOH no fueron estadísticamente significativos (valor de p de 0.260 y 0.109, respectivamente). Esto quiere decir que la variación que se realiza en el orden de las etapas no tendrá una incidencia significativa con respecto al grado. Como se puede observar la concentración de NaOH durante la desproteinización de extracción presenta un valor de p de 0.042, lo que significa que tiene incidencia en la respuesta. Como se ha mencionado anteriormente, este primer factor de la concentración de NaOH en la solución es significativo debido a que la conversión de los diferentes grupos que componen el producto final y puede generar compuestos no deseados dependiendo de la concentración de la solución de NaOH en la desproteinización. De igual manera, al variar la concentración de este en la solución se produce que el grado de desacetilación aumente a medida que aumenta la concentración en la solución de desproteinización indicando una relación directa. Sin embargo, los análisis de Tukey establecen de manera más detallada la comparación entre los tratamientos de estudio. De acuerdo con las comparaciones realizadas con el método de

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Tukey (anexo 8) se obtiene que todos los intervalos obtenidos contienen el valor 0 dentro de este indicando que no existen diferencias significativas entre las medias. Por lo tanto, a pesar de que la concentración tiene incidencia significativa, no genera una diferencia considerable en el grado de desacetilación con respecto a los tratamientos estudiados entre sí. A modo de profundización es posible, evaluar como estos factores pueden incidir en la transmitancia pues esta determina la cantidad de energía que atraviesa la muestra de estudio en la unidad de tiempo [50]. Se considera la realización del análisis de esta variable, debido a que como bien se observa en el espectro de la figura 12, existe una sobreposición de algunos picos en algunos tratamientos del quitosano extraído con respecto al comercial, significando la posibilidad de que no existan diferencias significativas entre cada uno de los métodos utilizados y el quitosano comercial. Cabe resaltar, que esta variable se estudió debido a que se ha evidenciado que las concentraciones de las soluciones son consideradas como significativas con respecto al valor de los picos de transmitancia de cada uno de los compuestos o elementos de estudio[51], de manera que se pueda estudiar en el caso de este producto obtenido. De acuerdo con un ANOVA (anexo 9) realizado a esta variable se obtienen que los valores de p son: 0.68 para el orden, 0.791 para la concentración y 0.791 para la interacción. De manera que se puede analizar que ninguno de los factores estudiados, ni su interacción son estadísticamente significativos. A pesar de que la hipótesis planteaba que la concentración de la solución era significativa es posible que al tener en cuenta que el producto final se realiza con una solución final en este caso la de desacetilación, es posible que la solución de desproteización no sea significativa teniendo en cuenta el valor tan pequeño en comparación a la solución utilizada de manera fija al final del proceso de extracción.

4.3.3. Análisis termogravimétrico El análisis termogravimétrico permite realizar una evaluación de los diferentes puntos de degradación del compuesto con el aumento de temperatura. En este caso es importante realizar la revisión de los siguientes puntos: pérdida de peso inicial (agua) y descomposición de anillo de piranosa y finalmente la descomposición total del compuesto [52]. De acuerdo con lo anterior, se obtienen los datos de la curva termogravimétrica que permite presentar de manera visual los resultados. Es importante resaltar que esta gráfica está compuesta por dos curvas. La primera curva hace referencia a la termogravimétrica (TG) que se compone por la relación entre el peso y la temperatura de estudio. Por otro lado, está la derivada termogravimétrica, en la cual se muestra la medida de la variación del peso. A continuación, se muestra la figura 13 se presentan los estudios realizados para cada uno de los compuestos extraídos con el fin de evaluar el grado de desacetilación a partir de los valores obtenidos en el análisis realizado.

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Figura 13. Curvas termogravimétricas de los tratamientos de extracción.

La figura 13 permite el análisis del estudio de descomposición del compuesto a estudiar. En este caso para realizar el estudio de los extractos producidos es posible entender las curvas termogravimétricas a partir de tres etapas esenciales del compuesto. En primer lugar, se observa la pérdida de agua del compuesto, seguido por la descomposición del anillo de piranosa del quitosano y finalmente la degradación del compuesto. Como se puede ver en la tabla 6 se presentan los valores obtenidos durante estos procedimientos.

Tabla 6. Rangos de la temperatura del quitosano obtenido en el estudio termogravimétrico de cada una de los tratamientos realizados.

Temperatura (ºC)

Rangos de temperatura observados (ºC)

Tratamiento Descomposición del anillo de piranosa

Degradación del compuesto obtenido

T0 320-419 >420 T1 220-404 >405 T2 317-429 >430 T3 317-379 >380

32

Como se puede observar en la tabla 6, los diferentes rangos de temperatura permiten establecer información relevante con respecto al estado de los compuestos, en este caso específicamente para el quitosano, se tiene en cuenta la descomposición de un compuesto esencial en el quitosano que es el anillo de piranosa. Por otro lado, se obtienen unos rangos de pérdida de agua establecidos constantemente de 0 a 120 ºC y la degradación total de la muestra del compuesto obtenido. En primer lugar, los valores de pérdida de agua en cada uno de los tratamientos se establecen en 7.91%, 6.95%,8.63% y 7.82%, teniendo en cuenta que el primer valor pertenece a T0, seguido por T1, T2 y finalmente T3. Estas pérdidas de humedad son debidas a que a pesar de los tratamientos de secado realizados en el producto obtenido hay variables como la exposición al ambiente que pueden generar un aumento cuando la muestra se encuentra fuera del desecador. Sin embargo, esta curva no es relevante con respecto a la medición del grado de desacetilación, pero puede significar una observación para futuros almacenamiento y manipulación de la muestra. Una vez establecidos los rangos que se pueden encontrar en la tabla 6, es posible discutir acerca de la descomposición del anillo de piranosa que supone un punto esencial en este estudio pues a partir del porcentaje obtenido en el eje de TG del análisis se obtiene el valor del grado de desacetilación. Es decir, una vez se estabiliza la pérdida de agua, el compuesto prosigue en el proceso de degradación debido a que el compuesto a estudiar tiene la tendencia de tener una menor estabilidad térmica a medida que aumenta su grado de desacetilación. De modo que al analizar las curvas obtenidas se tiene que el tratamiento en el cual se obtiene una mayor curva de descomposición de piranosa tendrá un mayor grado de desacetilación debido a que el comportamiento de la estabilidad térmica del compuesto tiene una menor estabilidad con respecto al resto de las curvas. Sin embargo, se debe realizar un análisis estadístico que permita una comparación más precisa de estos resultados. Con el fin de simplificar la información, la tabla 7 resume los grados de desacetilación obtenidos, teniendo en cuenta la desviación estándar de cada una de las curvas, así como también los resultados entre las comparaciones realizadas con Tukey.

Tabla 7. Resultados ponderados del grado de desacetilación obtenidos a partir del análisis termogravimétrico de cada una de los tratamientos realizados.

Tratamiento Grado de desacetilación (%) T0 83.08 (±3.45)A T1 67.19 (±2.05)B T2 67.62 (±1.03)B T3 48.05 (±4.36)C

33


Con respecto a los valores obtenidos en la tabla 7, se realizó el ANOVA para los grados de desacetilación obtenido a partir de cada uno de los tratamientos. A diferencia de los anteriores métodos es notable que existe una mayor dispersión en los resultados obtenidos, por lo tanto, es necesario hacer uso de un método de comparación estadística para evaluar cual o cuales de los factores puede ser la causal de esta dispersión. Con respecto a esto, se establece que un ANOVA permite evaluar cuál de los factores es estadísticamente significativo que en este caso se obtiene que es la concentración de hidróxido en la desproteinización, obteniendo un valor de p de 0.046 (anexo 10). De igual manera, se realiza una comparación por el método de Tukey que comprueba que cada uno de los resultados es diferente entre ellos. Teniendo en cuenta los valores que aparecen en la tabla 7 se observa que al realizar el test de Tukey (anexo 11) se obtiene que tanto el tratamiento T0 como el T3 son estadísticamente diferentes, lo cual puede significar que teniendo el mayor grado de desacetilación, por este método de estudio, el tratamiento en el cual se realiza primero la desmineralización seguida de la desproteización con una concentración de 1% p/v de hidróxido de sodio en la solución. De manera que con este resultado se puede establecer que, la concentración de este en la solución sea esencialmente importante debido a que en menor proporción se obtiene un mejor resultado en el grado de desacetilación para el compuesto final. Lo anterior se puede deber a que, la menor concentración de hidróxido de sodio (NaOH) en la solución de desproteinización permite que la descomposición de los elementos que componen los exosqueletos del camarón que se convierten durante la reacción, sean degradados de la manera correcta pues se evita la degradación de grupos importantes de la quitina previos al proceso de desacetilación como lo son los grupos de aminas[53]. Por lo tanto, es posible que durante el proceso de desproteinización no sea necesario hacer uso de grandes concentraciones de NaOH en la solución pues esta puede llegar a degradar productos deseados para obtener un grado alto de desacetilación.

4.3.4. Tamaño de partícula A continuación, se presenta la tabla 8 de la recopilación de los tamaños de partícula medios [4,3] que se encuentran en la literatura, de acuerdo con estos, se realizará una asignación con respecto al tipo de quitosano y su tamaño de partícula de los valores obtenidos en la experimentación.

34

Tabla 8. Tipos de quitosanos a partir de su tamaño de partícula obtenidos en la literatura.

Tamaños de partícula del quitosano

D [4,3] literatura D [4,3] (µm)

Aldrich Sigma [54] 54.1-724

Bajo peso molecular [55] 100- 255

Alto peso molecular [56] 255-3450

A partir de los valores de la tabla 8, es posible observar como el quitosano utilizado como referencia para las comparaciones (Aldrich-Sigma) cuenta con un rango de tamaño de partícula muy amplio. Por lo tanto, para determinar el tipo de quitosano, según el tamaño de partícula, en el estudio se realizó la asignación de éste a partir de los tamaños de partícula en literatura tanto para quitosano de bajo como de alto peso molecular. Continuando, a en la tabla 9 es posible encontrar la información pertinente con respecto al estudio de los tamaños de partícula, tipo de quitosano y comparación estadística de los quitosanos obtenidos con cada uno de los tratamientos evaluados en el estudio. Tabla 9. Valores ponderados obtenidos y reportados en literatura del tamaño de partícula del quitosano de cada una de

los tratamientos realizados.

Tratamiento D media [4,3] (µm) Tipo de quitosano

T0 270 (±1.48)A Alto peso molecular

T1 182 (±11.5)A Bajo peso molecular

T2 610 (±5.33)B Alto peso molecular

T3 602 (±0.91)B Alto peso molecular *Los superíndices en la columna del tamaño de partícula son los resultados de Tukey que representan que las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

De acuerdo con el análisis estadístico realizado (anexo 12), se estableció que el factor que genera esta diferencia entre los tratamientos estudiados es la concentración del NaOH debido a que al realizar el análisis de varianzas entre estos se obtiene un valor de p de 0.000 para este factor. Por lo cual se concluye que tamaño de la partícula efectivamente se ve afectado estadísticamente por la concentración. Por otro lado, con un valor de p de 0.071 el orden de

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las etapas no indica un efecto significativo y se puede deber a que a pesar de cambiar el orden los compuestos que producen la extracción no son relevantes pues el producto final será el quitosano. Sin embargo, es importante resaltar que a pesar de que no exista una diferencia estadísticamente significativa en el orden de las etapas del proceso, con respecto a los resultados obtenidos en el estudio es posible discutir acerca de cómo éste puede afectar al resultado. En primer lugar, al tener presente una modificación en el orden de las etapas durante la extracción, es decir las reacciones a las cuales se somete la materia, existe la posibilidad de formación de diferentes grupos de compuestos indeseados o no compatibles durante la extracción. De acuerdo con las propiedades fisicoquímicas de la materia prima al realizar la desproteinización como segundo paso en la extracción, genera que la cáscara ya desmineralizada tenga una mayor capacidad de retener el agua de las soluciones a diferencia de realizar la desmineralización de la cáscara desproteinizada [53]. De acuerdo con esto, es posible asumir que, al tener una mejor retención de la solución utilizada en la etapa, los tratamientos T0 y T1 permiten que se obtengan tamaños de partícula menores en comparación con los tratamientos T2 y T3. A pesar de que el ANOVA descarta que el factor de orden de etapas sea incidente con respecto al resultado en el tamaño de partícula, se analiza la comparación de Tukey (anexo 13) en la cual tanto el tratamiento T0 como el T1, en los cuales se realiza el proceso de desmineralización de primero, tiene una diferencia representativa en sus medias con respecto a los tratamientos T2 y T3. Lo anterior, confirma que a pesar de que el orden de las etapas de extracción no tener una incidencia a nivel estadístico la comparación con respecto a los resultados del tamaño de partícula sí es significativamente diferentes generando mayores o menores valores de acuerdo con el orden de etapas utilizado durante la extracción. Por otro lado, se realiza una asignación entre los valores de tamaño de partícula revisados en bibliografía presentados en la tabla 7 y los valores obtenidos en el experimento (tabla 9) con el fin de establecer que cada uno de los tamaños de partícula obtenidos corresponden a un tipo de quitosano que se vende en la actualidad, es decir, coinciden con valores comparables al quitosano comercial. Como se mencionó con anterioridad el quitosano comercializado en la actualidad tiene un intervalo de tamaño que permite establecer el tipo de quitosano que es. En el caso de los quitosanos obtenidos estos hacen parte del rango siendo T1 de bajo peso molecular, mientras que T0, T2 y T3 representan quitosano de alto peso molecular.

4.4. Discusión general A modo de resumen, se realiza una comparación con respecto a los métodos que se utilizaron para la determinación del grado de desacetilación. Ésta se realiza con el fin de presentar características de cada uno de estos métodos que se deben tener en cuenta al momento de

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realizar caracterizaciones de compuestos, pues estas pueden determinar el procedimiento más eficiente teniendo en cuenta observaciones que puedan mejorar la ejecución de estos. En primer lugar, se realizó la titulación que a pesar de tener un menor costo o no requerir de entrenamiento especializado cuenta con varias desventajas como lo son: el tiempo de muestreo relativamente alto con respecto a los de la espectroscopia y el análisis termogravimétricos pues requieren de una gran cantidad de muestra y es necesario el uso de reactivos externos (soluciones de hidróxido de sodio y ácido clorhídrico). Por otro lado, el equipo de espectroscopía permite obtener resultado de manera más rápida a diferencia de los demás métodos, cuenta con alta precisión y requiere miligramos de muestra. Sin embargo, para obtener resultados es necesario: hace uso de ecuaciones experimentales, tiene alta sensibilidad a la humedad del exterior y el equipo tiene un alto costo. Por lo tanto, como observación es importante hacer uso de la herramienta integrada en la interfaz del software que permite la determinación especifica de los valores de los picos en el espectro. Por último, el análisis termogravimétrico permite obtener los resultados a partir de una cantidad de muestra mínima pues se requieren miligramos, asimismo, no requiere ningún conocimiento técnico previo, más allá de la programación de las condiciones necesarias como lo son el flujo de nitrógeno, el rango de temperatura de estudio y la escala de aumento de temperatura en el tiempo. No obstante, requiere de un tiempo de muestreo alto por lo cual se genera un tiempo alto de espera mientras se realiza el muestreo completo. De igual manera, al igual que el equipo utilizado para FTIR, este presenta un alto costo, además, es necesario del uso de reactivos externos como en este caso una corriente como lo puede ser un flujo de nitrógeno o de aire.

5. Conclusiones Una de las razones por las cuales se eligieron los factores del orden de las etapas de extracción y la concentración de NaOH durante la etapa de desproteinización se debe a que en la literatura se hace uso de diferentes configuraciones con respecto a éstos dando como resultado un grado de desacetilación diferente dependiendo de la combinación. De manera, que al realizar la estandarización del proceso con un protocolo permitan entender la incidencia de cada uno de los factores a evaluar. De acuerdo con los resultados estadísticos del estudio, se concluye que el grado de desacetilación se ve significativamente afectado por cada uno de los factores estudiados. De acuerdo con el estudio realizado, la combinación que permitió un mayor grado de desacetilación y propiedades similares al quitosano comercial fue el tratamiento T0. De manera que se obtiene como mejor resultado el tratamiento en el cual se realiza la desmineralización primero, seguido de la desproteinización con una

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concentración de 1% p/v de hidróxido de sodio. De acuerdo con el quitosano obtenido y las diferentes aplicaciones en la industria, se realizó la obtención de quitosano que cuenta con características propias de un producto con la capacidad de ser utilizado en la producción de recubrimientos, prolongando así la vida útil de los alimentos. Asimismo, se puede concluir que el proceso realizado tiene amplias posibilidades de ser escalable a nivel industrial, pues cuenta con equipos asequibles.

6. Recomendaciones para futuros trabajos Una vez culminado el estudio se realiza una propuesta que permita el mejoramiento del protocolo de extracción para que a futuro este sea escalable a nivel industrial. De manera que se consideran 2 aspectos relevantes para elevar los resultados del proceso. En primer lugar, se considera recomendable, el estudio de la extracción teniendo en cuenta una diminución en el nivel del factor de concentración de NaOH durante la desproteización con el fin de mejorar el porcentaje de rendimiento, el grado de desacetilación y calidad del extracto, y reduciendo la cantidad de reactivo utilizado durante la extracción. De igual manera, se podría evaluar la microestructura mediante microscopia electrónica de barrido la cual permitiría la comparación con el quitosano comercial. Lo anterior con el fin de que el proceso de extracción sea efectuado de manera más efectiva, obteniendo así mejores resultados.

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43

ANEXOS ANEXO I. Etapa de extracción

ANEXO 1. Análisis de varianza del rendimiento (Orden factor A y B concentración factor). ANÁLISIS DE VARIANZA

Fuente SS GDL MS Fo Fcrítico valor-p Orden de etapas 3.001 1 3.00 3.13 7.71 0.15 Concentración de NaOH 3.781 1 3.78 3.94 7.71 0.12 Orden*Concentración 0.252 1 0.25 0.26 7.71 0.64 Error 3.840 4 Total 10.875

ANEXO 2. Gráfico de Tukey del rendimiento obtenido durante las extracciones.

44

ANEXO II. Análisis estadístico de las caracterizaciones

ANEXO 3. Resultados ANOVA de titulaciones potenciométricas.

ANEXO 4. Gráfico de Tukey de las titulaciones potenciométricas (Orden x Concentración).

T1-T0

T2-T0

T3-T0

T2-T1

T3-T1

T3-T2

ANEXO 5. Espectro FTIR del quitosano comercial.

46

ANEXO 6. Espectro FTIR de la segunda réplica del quitosano obtenido.

ANEXO 7. Resultados ANOVA del grado de desacetilación calculado a partir del espectro.

ANEXO 8. Gráfico de Tukey de los resultados para el grado de desacetilación obtenido a partir del espectro.

T2-T0

T1-T0

T3-T0

T1-T2

T3-T2

T3-T1

48

ANEXO 9. Resultados ANOVA del valor de transmitancia calculado a partir del espectroscopia.

ANEXO 10. ANOVA de los resultados obtenidos para el grado de desacetilación por análisis termogravimétrico.

ANEXO 11. Gráfico de Tukey de los resultados para el grado de desacetilación por análisis termogravimétrico.

ANEXO 12. ANOVA del tamaño de partícula con respecto a los valores presentados durante la caracterización.

T2-T0

T2-T0

T3-T0

T2-T1

T3-T1

T3-T2

50

ANEXO 13. Gráfico de Tukey del tamaño de partícula del quitosano obtenido.

T1-T0

T2-T0

T3-T0

T2-T1

T3-T1

T3-T2

Extracción y caracterización de quitosano obtenido a partir de ...

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