Aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie des Zentrums Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von Seza Bolat aus Celle Hannover, 2006
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Aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie
des Zentrums Innere Medizin der
Medizinischen Hochschule Hannover
Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in
humanen intestinalen Mastzellen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Seza Bolat
aus Celle
Hannover, 2006
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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 25.02.2008 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. Stephan C. Bischoff
Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Reinhard Pabst
Koreferentin: Prof.`in Dr. med. Bettina Wedi
Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2008
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Alexander Kapp
Syntaxin-4 (1:50)/ rabbit antibody anti-VAMP-3 (1:100)) und eine erneute
Zentrifugation. Danach inkubierten die MC in Blockingreagenz mit 0,3% Saponin und
den entsprechenden Sekundärantikörpern (Alexa Fluor® goat anti-mouse 488/ Alexa
Fluor® donkey anti-rabbit 594; je 1:200 verdünnt) abgedunkelt für 30 min. Nach
erneutem Waschen wurden die Zellen in 10 µl PBS aufgenommen, auf einen
Objektträger gegeben und nach Absinken der Mastzellen mit Hilfe eines
Konfokalmikroskops betrachtet. Für die Doppelfärbung VAMP-7/ Syntaxin-3
(1:250/1:250) erfolgte eine zusätzliche Kernfärbung mit To-Pro 3 (Molecular Probes)
zur besseren Lokalisierbarkeit der SNARE-Proteine. Für die Kernfärbung inkubierten
die Zellen für 3 min in To-Pro-3 (1:1000 in PBS) und wurden anschließend 10 min in
PBS gewaschen. Die Konfokalmikroskopie wurde mit Hilfe von Herrn Tibor Veres im
Frauenhofer-Institut für Toxikologie und experimentelle Medizin, Abteilung
Allergologie und Immunologie durchgeführt.
Materialien und Methoden
45
2.5.8 Patch-Clamp-Messungen
Die Patch-Clamp-Technik ermöglicht es, die Membranströme von Zellen in vivo zu
messen.
Zunächst wurde eine Suspension aus humanen Mastzellen auf eine mit
Fibronectin (BD Biosciences) gecoatete Petrischale gebracht. Nach einer
einstündigen Inkubation mit SCF (100 ng/ml) adhärierten die Mastzellen auf der
Oberfläche [8]. Anschließend wurde eine dünn ausgezogene Glaskapillare auf eine
intakte Zelle gedrückt. Damit bei der hier angewendeten cell-attached-Konfiguration
die Zellmembran fest an der Glaswand der Pipette anlag und somit ein kleiner
Abschnitt der Zellmembran (Patch) elektrisch von seiner Umgebung isoliert war,
wurde durch leichtes Ansaugen ein Unterdruck ausgeübt. Die Isotypen der Botulinum
Neurotoxin-Leichtketten sollten nun ihre proteolytische Wirkung in der Zelle entfalten
(mind. 5 – 10 min), um anschließend die Degranulation bzw. die
Degranulationshemmung zu messen (mind. 10-15 min). Jedoch erwiesen sich die
menschlichen Mastzellen als zu instabil. Die Zellintegrität konnte nicht bis zum Ende
der Messungen aufrechterhalten werden. Die Patch-Clamp-Messungen fanden in
Zusammenarbeit mit F. Wegner von der Neurologischen Klinik der Universität
Leipzig statt.
2.6 Statistik
Die Daten des Ergebnisteils wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD)
dargestellt. Signifikante Differenzen wurden mittels des one tailed t-Tests bestimmt.
Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von P < 0,05 wurde als signifikant bewertet.
Ergebnisse
46
3. Ergebnisse
3.1 Nachweis von SNARE-Proteinen in menschlichen Darm-
Mastzellen
3.1.1 SNARE-mRNA Nachweis mittels RT-PCR
Als Vermittler der Exozytose in Neuronen, aber auch in verschiedenen sekretorisch
aktiven Zellen, ist eine Gruppe hochkonservierter Proteine, die sogenannten SNARE-
Proteine, beschrieben worden. Bisherige Untersuchungen in Zellen des
Immunsystems zeigten, abhängig von der Zellart, unterschiedliche
Expressionsmuster der SNARE-Isoformen. Die Kenntnisse über das SNARE-
Vorkommen in Mastzellen beruhen hauptsächlich auf der Rattenmastzelllinie RBL-
2H3. Da sich im Nagersystem gewonnene Daten nicht ohne Weiteres auf das
menschliche System übertragen lassen, erfolgte eine Untersuchung verschiedener
Vertreter der VAMP-, Syntaxin- und SNAP-Familien in humanen Mastzellen. Dazu
wurden menschliche Darm-Mastzellen (Abb.2A) mit der humanen Neuroblastom-
Zelllinie MHH-NB-11 (Abb.2B), als Kontrolle für neuronale SNARE-Proteine
verglichen. Weitere Analysen erfolgten an in vitro entwickelten Mastzellen aus
Nabelschnurblut (CBMC) und der Mastzellinie HMC-1. Anhand von eosinophilen
Granulozyten, wurden die Mastzellen mit einem weiteren Vertreter sekretorisch
aktiver Immunzellen verglichen.
Die mRNA der SNARE-Isoformen SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –5, sowie
VAMP-3, -5, -7 und –8 ließ sich in allen untersuchten Zellen zeigen. Dagegen konnte
SNAP-25, das als neuronale Isoform des ubiqutär nachgewiesenen SNAP-23
angesehen wird, nicht in Mastzellen dargestellt werden. Außerdem wurden neben
SNAP-25 auch Syntaxin-1A und Synatxin-1B nur in Neuronen detektiert. Für SNAP-
25 und Synatxin-1B zeigte sich eine zusätzliche, wenn auch schwächere Expression
in HMC-1. In primären humanen Mastzellen waren keine Signale für diese Gene
nachweisbar (Abb.2 C-F).
Ergebnisse
47
Abb.2: Darstellung der Expression von SNARE-mRNA in verschiedenen Mastzellkulturen und Neuronen mittles RT-PCR (C-F). Lichtmikroskopische Bilder humaner intestinaler Mastzellen (A) und der Neuronenzelllinie MHH-NB-11 (B). C GAPDH; D SNAP-23, -25; E Syntaxin-1A, -1B, -2, -3, -4, -6; F VAMP-2, -3, -5, -7, -8; L 1 kb plus ladder zur Fragmentgrößen-Bestimmung, Banden verlaufen im Abstand von 100 bp; 1 - 3 MC1 - MC3; 4 CBMC; 5 HMC-1; 6 eosinophile Granulozyten; 7 humane Neuroblastom-Zelllinie MHH-NB-11. Als Kontrolle wurde die Expression von GAPDH als „house-keeping gene“ dargestellt. Zusätzlich wurde MHH-NB-11 als Positivkontrolle verwendet.
L 1 2 3 4 5 6 7
GA
PD
H
C
SN
AP
-25
SN
AP
-23
D L 1 2 3 4 5 6 7
Stx
-1B
Stx
-2
Stx
-3S
tx-4
Stx
-6
Stx
-1A
E L 1 2 3 4 5 6 7 L 1 2 3 4 5 6 7
VA
MP
-2
L 1 2 3 4 5 6 7
VA
MP
-5
VA
MP
-7
VA
MP
-3
VA
MP
-8
L 1 2 3 4 5 6 7 F
A
B
Ergebnisse
48
3.1.2 SNARE-Protein Nachweis mittels Western Blot
Die Analyse der SNARE-Expression auf Protein-Ebene erfolgte mittels Western Blot.
Für die Western Blots wurden Lysate aus humanen intestinalen Mastzellen (5 x105
Zellen) verwendet. Als Kontrolle diente dabei eine Präparation aus dem
Hirnhomogenat einer Maus. In humanen Mastzellen konnten die t-SNAREs SNAP-
23, Syntaxin-2, Syntaxin-3, Syntaxin-4 und die v-SNAREs VAMP-3, VAMP-7, VAMP-
8 nachgewiesen werden. SNAP-25 und Syntaxin-1A waren in Mastzellen nicht
vorhanden, jedoch gelang in der Postivkontrolle der Nachweis für diese neuronalen
Isoformen (Abb.3). Die mittels Western Blot gewonnenen Daten bestätigten auf
Protein-Ebene die Ergebnisse aus der RT-PCR.
Unterschiede fanden sich dagegen für die SNARE-Proteine VAMP-2 und
Syntaxin-1B. Während VAMP-2 auf mRNA-Ebene nocht starke Signale aufwies, war
es im Western Blot mittels eines monoklonalen Antikörpers nicht darstellbar. Erst bei
Verwendung eines polyklonalen Antikörpers ließ sich eine, wenn auch schwache,
Expression für VAMP-2 nachweisen. Die Positivkontrolle zeigte in beiden Fällen eine
starke Bande. Während Syntaxin-1B in der RT-PCR nicht detektiert wurde, konnte
man auf Protein-Ebene schwache Signale in Mastzellen sehen.
Abb. 3: Verschiedene an der Vesikel- (v-SNAREs) oder Plasmamembran (t-SNAREs) lokalisierte SNARE-Proteine konnten in humanen Darm-Mastzellen nachgewiesen werden. (VAMP-2*: monoklonaler Antikörper; VAMP-2**: polyklonaler Antikörper)
3.2 Untersuchung des Einflusses von Botulinum Neurotoxin auf die
Mastzelldegranulation
3.2.1 Herstellung adenoviraler Konstrukte
Durch Einschleusung von Tetanus-Toxin in eosinophile Granulozyten konnte die
Bedeutung des SNARE-Proteins VAMP-2 für die Exozytose gezeigt werden [135].
VAMP-2 dient sowohl Tetanus als auch Botulinum Neurotoxin Typ B als Substrat und
nach Proteolyse zeigte sich eine Exozytosehemmung in eosinophilen Granulozyten.
Mehrere Ansätze zur Einschleusung der proteolytisch wirksamen Leichketten von
Botulinum Neurotoxin erwiesen sich als nicht praktikabel, da nicht genug Mastzellen
überlebten, um anschließende Stimulationsexperimente durchzuführen. Dazu
gehörten Gangliosidbehandlung, Elektroporation und Patch Clamp-Technik. Ein
weiterer Ansatz bestand in der Verwendung adenoviraler Vektoren. Nachdem in
Vorarbeiten durch Lorentz et al. (unpublizierte Daten) die Infektion von Mastzellen mit
Adenoviren erfolgreich durchgeführt werden konnte, wurden zur Analyse der
Degranulationshemmung durch SNARE-spaltende Neurotoxine adenovirale
Konstrukte verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Aktivität der proteolytisch
aktiven, leichten Ketten von Botulinum-Neurotoxin Typ A, B und C1 untersucht. Dazu
kamen Adenoviren, welche die gewünschten Gene enthielten, sowie ein Kontrollvirus
ohne zusätzliche genetische Information zum Einsatz.
Zur Herstellung der verwendeten Plasmide pBoNT-A, pBoNT-B, pBoNT-C1
wurden die leichten Ketten der Botulinum-Neurotoxine Typ A, B und C1 als N-
terminale Fusionspartner von eGFP in die Multiple Cloning Site des pShuttle-CMV-
Vektors kloniert (Schema in Abb.4). Zunächst wurde das Gen für eGFP über XhoI /
HindIII eingefügt, im zweiten Schritt dann die Gene für die jeweiligen leichten Ketten
über Sal I / Stu I, wobei letztere Restriktionsschnittstelle durch die Klonierung von
eGFP eingebracht wurde. Anschließend erfolgte eine Umklonierung der drei
Konstrukte in den bakteriellen Expressionsvektor über NcoI / MluI. Die Kontrolle des
Klonierungserfolges durch Überprüfen der Größe der produzierten Proteine und der
Ergebnisse
50
Toxin-Protease-Aktivität fand, wie auch die Klonierung der leichten Ketten, in
Kooperation mit Herrn Dr. Specht (Biotecon, Posdam) statt.
Abb. 4: Klonierung der leichten Ketten des Botulinum Neurotoxins in den Vektor pShuttle-CMV; A Plasmidkarte des verwendeten Vektors pShuttle-CMV; B Schnittstellen im Vektor und Reihenfolge der Klonierungsschritte
HindIII XbaISalI NotI XhoIKpnI
pShuttle-CMV
eGFPS‘
StuI HindIII
BglII
eGFPS‘
pShuttle-CMV-eGFP
XhoI (EcoRV)StuINcoISalI
BoNT(A/Bopt/C1)-LS
EcoRV
XhoI MluI
XbaISalI NotIKpnIBglII EcoRV
eGFPS‘
StuI HindIIIXhoI MluI
L(A/Bopt/C)S
XbaIKpnIBglII EcoRV
eGFPS‘
HindIIIMluIStuINcoISalI
L(A/Bopt/C)SpShuttle-CMV-BoNT(A/Bopt/C1)-L-eGFP
B
A
Ergebnisse
51
Das weitere Vorgehen zur Herstellung rekombinanter Adenoviren erfolgte nach dem
System von He et al. [136], das sich als besonders effizient erwiesen hat (Schema in
Abb. 5).
Abb. 5: System nach He et al. zur Herstellung rekombinanter Adenoviren. Zunächst wird fremde DNA in einen Shuttle-Vektor kloniert, dessen Multiple Cloning Site (MCS) von adenoviralen Sequenzen flankiert ist. Als leichte Modifikation des Schemas wurde für die Herstellung rekombinanter Adenoviren pShuttle-CMV und nicht wie dargestellt pAd-Track-CMV verwendet. Nach homologer Rekombination mit pAd-Easy-1 in E. coli erfolgt die Generierung viraler Partikel in permissiven Zellen
CDS kodierende Sequenz; GFP Grün Fluoreszierendes Protein; Kan Kanamycin-Resistenzgen; Amp Ampicillin-Resistenzgen; LITR Left Inverted Terminal Repeats; RITR Right Inverted Terminal Repeats; CMV Promotor des Zytomegalie-Virus; Ori Ursprungsort der DNA-Replikation; PacI Erkenungssequenz für die Endonuklease PacI; PmeI Erkennungssequenz für die Endonuklease PmeI
Ergebnisse
52
Unter Nutzung einer homologen Rekombination konnten adenovirale Konstrukte in
Bakterien kloniert werden, da sowohl das verwendete Shuttle Plasmid als auch das
Backbone Plasmid zwei homologe Bereiche enthielten. Zunächst mussten die
Plasmide pBoNT-A, pBoNT-B und pBoNT-C1 durch den Verdau mit der
Restriktionsendonuklease PmeI linearisiert werden. Die linearisierten adenoviralen
Plasmide wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender
Ethanolfällung aufgereinigt, konzentriert und durch Elektroporation in E. coli der
Zelllinie BJ 5183-Ad1, in denen der adenovirale Backbone Vektor bereits vorlag,
transformiert. Nach einer DNA-Minipräparation konnten die gewünschten Klone
durch Restriktionsverdau mit PacI identifiziert und anschließend in den chemisch
kompetenten E. coli –Stamm XL10-Gold transformiert werden, um größere Mengen
an Plasmid zu erhalten. Nach einer endotoxinfreien Maxi-Plasmidpräparation wurde
durch PCR das Vorliegen des klonierten Gens überprüft (Abb.6).
Abb. 6: PCR zur Überprüfung der klonierten Gene; A BoNT-A; B BoNT-B; C BoNT-C (A-C: die PCR wurde mit den entsprechenden Primern durchgeführt); D-F GFP (in der Reihenfolge BoNT-A, BoNT-B, BoNT-C aufgetragen)
3.2.2 Virusgenerierung
Zur Herstellung infektiöser Viren aus Adenovirusplasmiden wurden Viren des
humanen Serotyps 5 verwendet, die aufgrund einer Deletion der E1- und E3-Region
nur in bestimmten Zelllinien, wie HEK-293, vermehrt werden können. Diese Zellen
transkomplementieren den viralen Defekt, da sie in ihrem Genom die stabil integrierte
E1-Region enthalten, womit eine Virusvermehrung ermöglicht wird. Zunächst erfolgte
eine Linearisierung der Adenovirusplasmide mit der Restriktionsendonuklease PacI,
A B C D E F
Ergebnisse
53
um den für die Herstellung infektiöser Viren notwendigen rechten und linken ITR
(Inverted Terminal Repeat) freizulegen. Dabei wurden gleichzeitig für die stabile
Replikation in E. coli notwendige DNA-Abschnitte entfernt. Nach Aufreinigung und
Konzentration durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit Ethanolfällung wurden HEK
293-Zellen mit rekombiniertem Ad-Easy-1 transfiziert, um den primären Virusstock zu
erstellen. Nach siebentägiger Inkubation fanden die ersten Virusisolationen mit
anschließender Vermehrung und Präparation der Viren statt (vgl. Kap. 2.4.4).
Nicht nur mit Hilfe des zytopathischen Effekts, sondern auch durch die GFP-
Expression sollte die Transfektionseffizienz und später der Transduktionserfolg
abgeschätzt werden können. Es zeigten sich aber bereits während der Transduktion
von HEK 293-Zellen Unterschiede in der GFP-Expression. So wies das Kontrollvirus
AdGFP ein intensiveres GFP-Signal als die anderen rekombinierten Adenoviren auf.
Aber auch untereinander zeigten AdBoNT-A, AdBoNT-B und AdBoNT-C stark
unterschiedliche GFP-Signale (Abb. 7). Als Nachweis für die Replikationfähigkeit und
Infektiösität der Viren diente der bei allen Konstrukten etwa gleich starke
zytopathische Effekt. Er trat etwa zwei bis drei Tage nach Infektion auf - erkennbar
an der Abrundung und Ablösung der Zellen. Abschließend wurde eine
Titerbestimmung der präparierten Viren zur genauen Bestimmung der Infektiösität
durchgeführt. Die Titerbestimmung erfolgte über das Capsid-Protein Hexon, das nur
in infizierten, die E1-Deletion des Adenovirus transkomplementierenden Zellen, wie
HEK 293, produziert wird. In allen drei Fällen konnte ein Titer bestimmt werden.
Ergebnisse
54
Abb. 7: Darstellung der GFP-Expression der verwendeten Adenoviren in HEK
293-Zellen. Alle Bilder wurden mit den gleichen Lichtverhältnissen photographiert,
um die verschiedenen GFP-Signale vergleichen zu können; A AdGFP; B AdBoNT-A;
C AdBoNT-B; D AdBoNT-C;
* Auflicht
A
B
A*
B*
C C*
D D*
Ergebnisse
55
3.2.3 Transduktion der Mastzellen mit rekombinierten Adenoviren
Zur Einschätzung der Transduzierbarkeit von Mastzellen wurden verschiedene
Virustiter verwendet. Erst als etwa 500 infektiöse Viruspartikel pro Zelle eingesetzt
wurden (MOI 500), konnten 1-5 % der Mastzellen mit dem Kontrolvirus AdGFP
transduziert werden. Höhere Viruskonzentrationen erzielten kein wesentlich besseres
Ergebnis, da mit steigender MOI auch der zytopathische Effekt auf die Mastzellen
zunahm. So waren bei Verwendung höherer Titer etwa 70% der Mastzellen nach
72 h abgestorben, während weiterhin keine nennenswerte Infektion beobachtet
werden konnte. Der Transduktionserfolg wurde dabei mittels eines
Fluoreszenzmikroskops anhand der GFP-Expression von AdGFP abgeschätzt. Jede
GFP-produzierende Zelle konnte als erfolgreich infiziert gewertet werden. Aufgrund
der niedrigen Infektionsraten lag die Vermutung nahe, dass bestimmte Strukturen,
die den für die Virusaufnahme notwendigen initialen Kontakt zwischen Zielzelle und
Adenovirus vermitteln, auf Mastzellen nicht exprimiert werden. Das Fehlen dieser für
die Transduktion notwendigen Strukuren konnte durch ein CAR-PDT-Fusionprotein
(coxsackievirus adenovirus receptor; protein transduction domains) behoben werden
[137]. Bestimmte Proteine, wie VP22 aus dem Herpes simplex Virus, können über
rezeptorunabhängige Wege von Säugetierzellen aufgenommen werden.
Verantwortlich für diese Prozesse sind Protein Transduktions Domänen. So bindet
der CAR-Anteil des Fusionsprotein (CARex-VP22) an bestimme
Oberflächenstrukturen der Adenoviren, die sogenannten fiber knobs.
Währenddessen dockt der VP22-Anteil mit seiner PDT-Domäne an die Zielzellen an,
so dass es zu dem notwendigen initialen Kontakt zwischen Zelle und Virus kommen
kann. Die weiteren Schritte, die die Virusaufnahme zur Folge haben, werden durch
verschiedene Integrine vermittelt. Mit Hilfe des Fusionproteins CARex-VP22, das als
Adaptor zwischen den Mastzellen und dem Virus dient, konnte die Effizienz der
adenoviralen Infektion deutlich verbessert werden. Außerdem wurde der
zytopathische Effekt durch den Einsatz niedrigerer Viruskonzentrationen gesenkt.
Nach 48 h waren bei Verwendung einer MOI von 50 etwa 50-60 % der Mastzellen
infiziert. Zu diesem Zeitpunkt waren noch etwa 95 –100 % der eingesetzten Zellen
vital. Mit längeren Inkubationszeiten nahm der zytopathische Effekt der Adenoviren
auf die Mastzellen zu, so dass nach 72 h nur 70-80 % der Zellen überlebten,
Ergebnisse
56
während die Infektionsrate nicht wesentlich weiter stieg. Die GFP-Intensität der
konstruierten Adenoviren zeigte, wie bereits in den HEK 293-Zellen, starke
Unterschiede und war in den Mastzellen sogar heruntergesetzt (Abb.8). Während für
AdBoNT-A und AdBoNT-C, die auch in den HEK 293-Zellen schwache Signale
aufwiesen, in den Mastzellen kein GFP darstellbar war, wiesen AdBoNT-B-infizierte
Zellen nur sehr schwaches GFP auf. Jedoch wurden für alle Konstrukte gleiche
Viruskonzentrationen eingesetzt. Da die Transduktion über Oberflächenproteine von
Viren und Zellen vermittelt wird, die durch die eingefügten Gene nicht beeinflusst
werden, konnte für pBoNT-A, pBoNT-B und pBoNT-C1 von einer dem Kontrollvirus
entsprechenden Infektionsrate ausgegangen werden [137].
Abb. 8: Darstellung der unterschiedlichen GFP-Expression in infizierten
Mastzellen. Alle Bilder wurden mit der gleichen Beleuchtungsstärke photographiert,
um die verschiedenen GFP-Signale vergleichen zu können; A AdGFP; B AdBoNT-B;
In mit AdBoNT-A und AdBoNT-C transduzierten Zellen waren kaum GFP-Signale
detektierbar
* Auflicht
A A*
B B*
Ergebnisse
57
3.2.4 Untersuchung der Exozytose adenoviral transduzierter Mastzellen
Da der Transduktionserfolg unter dem Fluoreszenzmikroskop anhand der GFP-
Signale des Kontrollvirus abgeschätzt werden konnte, erfolgte die Ernte nach etwa
zwei Tagen, als 50-60 % der AdGFP-behandelten Mastzellen mit Hilfe des
Fusionsproteins CARex-VP22 infiziert waren. Zu diesem Zeitpunkt sollten auch die
leichten Ketten der Botulinum-Neurotoxine, deren cDNA in die Adenoviren kloniert
wurde, in den Zellen exprimiert werden. Nach zweimaligem Waschen erfolgte eine
Aktivierung der Zellen. Dazu wurden die Zellen sowohl mit dem gegen die α-Kette
des IgE-Rezeptors gerichteten Antikörper 22E7, als auch mit PMA und Ionomycin für
1 h inkubiert. Nach PMA/Ionomycin-Stimulierung konnte eine
Degranulationshemmung für BoNT-B und BoNT-C festgestellt werden, wobei die
spezifische Histaminfreisetzung mit etwa 50 % insgesamt auf einem hohen Niveau
lag. Zur besseren Anschaulichkeit wurde die Kontrollbedingung, die nur mit dem
Fusionsprotein CARex-VP22 inkubierte Zellen enthielt, als 100 % gesetzt (Abb.9A).
Mit dem Adenovirus AdBoNT-B infizierte Mastzellen zeigten im Vergleich zu AdGFP-
transduzierten Zellen einen um 24,6 ± 23,0 % gesenkten Histaminrelease. Der
hemmende Effekt des Neurotoxins auf die Degranulation war bei BoNT-C
exprimierenden Zellen noch stärker ausgeprägt. Hier wurden nach Stimulation 31,4 ±
25,7 % weniger Histamin freigesetzt. Dagegen konnte für BoNT-A keine signifikante
Reduktion festgestellt werden. Während nach einer PMA/Ionomycin-Aktivierung der
sekretionshemmende Effekt von BoNT-B und –C gezeigt wurde, konnten nach
Stimulation mit 22E7 keine signifikanten Unterschiede durch Botulinum-Neurotoxin-
Einwirkung dargestellt werden. Die spezifische Histaminfreisetzung war hierbei
generell niedriger als nach PMA/Iono-Aktivierung. Sie lag bei etwa 25 %. Auch hier
wurde die Kontrollbedingung als 100% gesetzt (Abb.9B). Auffällig war eine
allgemeine Hemmung der Exozytosefähigkeit, die 22E7-aktivierte Zellen nach
adenoviraler Transduktion zeigten. Für den Kontrollvirus ergab sich eine Reduktion
der Histamin-Freisetzung von 26,8 ± 24,8 %.
Ergebnisse
58
Abb. 9: Nach PMA/Ionomycin-Stimulation zeigt sich die
degranulationshemmende Wirkung von BoNT-B und –C; 2 Tage nach Infektion
der CARex-VP22 behandelten Zellen wurden die Mastzellen geerntet und aktiviert;
durch die GFP-Produktion in AdGFP-infizierten Zellen konnte der
Transduktionserfolg exemplarisch abgeschätzt werden; Für die in Abbildung 9A
dargestellte Bedingung betrug die spezifische Histaminfreisetzung der
Kontrollbedingung, die nur mit dem Fusionsprotein CARex-VP22 inkubierte Zellen
enthielt, etwa 50% und für die Bedingung in Abbildung 9B etwa 25%. Zur Besseren
Vergleichbarkeit wurden die Kontrollbedingungen jeweils als 100 % gesetzt. A
spezifischer Histaminrelease nach PMA/Ionomycin-Stimulation (10-6 M/10-6 M); B
spezifischer Histaminrelease nach 22E7-Stimulation (100 ng/ml); Die Mittelwerte (±
Standardabweichung) für A resultieren aus n = 3 Experimenten, für B aus n = 5
Experimenten.
Ap = 0,02
p = 0,01
B p < 0,01
Kontrolle
AdGFP
BoNT-A
BoNT-B
BoNT-C
0
25
50
75
100
125
His
tam
infr
eise
tzu
ng
nac
h I
nfe
ktio
n (
%)
Kontrolle
AdGFP
BoNT-A
BoNT-B
BoNT-C
0
25
50
75
100
125
His
tam
infr
eise
tzu
ng
nac
h I
nfe
ktio
n (
%)
Ergebnisse
59
3.3 Funktionelle Bedeutung der gefundenen SNARE-Proteine
3.3.1 Intrazelluläre Lokalisation der SNARE-Proteine
Zur genaueren Analyse der funktionellen Bedeutung sollte zunächst geklärt werden,
in welchen Kompartimenten die gefundenen SNARE-Isotypen liegen und ob es zu
einer Translokation nach Stimulation kommt.
Dazu wurden die humanen Darm-Mastzellen mit Saponin permeabilisiert, wodurch es
möglich war, Antikörper durch die Zellmembran zu schleusen, um die intrazellulär
gelegenen SNARE-Proteine der Mastzellen anzufärben. Zur genaueren Analyse der
Lokalisation der angefärbten Strukturen wurden die Zellen konfokalmikroskopisch auf
verschiedenen optischen Ebenen betrachtet. Da es sich bei den untersuchten
Mastzellen um nicht-adhärente Zellen handelte, wurde ein möglichst kleines Volumen
von der angefärbten Zellsuspension auf einen Objektträger getropft. Nachdem die
Zellen abgesunken waren, konnte etwas PBS hinzugefügt werden, um ein
Austrocknen der Zellen während des Mikroskopierens zu verhindern. Trockneten die
Zellen ein, so war eine konfokalmikroskopische Betrachtung über verschiedene
Ebenen nicht mehr möglich, da sie sich nun nicht mehr als runde, sondern als ovale,
stark abgeplattete Strukturen zeigten. Ähnliche Beobachtungen ergaben sich auch
für Cytospins oder mit unterschiedlichen Substanzen eingedeckelte Zellen.
In verschiedenen Doppelfärbungen wurden SNARE-Proteine als vesikel- oder
plasmamembranständige Strukturen nachgewiesen. SNAP-23 zeigte eine deutliche
membranständige Färbung, während sich VAMP-7 vorwiegend im Zellinneren befand
und scheinbar vermehrt in der Nähe des Zellkerns vorlag. Des Weiteren war eine
Darstellung des Syntaxin-4 an der Plasmamembran, sowie eine cytoplasmatische
Färbung von VAMP-3 möglich. Auch weitere Vertreter der VAMP-Familie wurden
untersucht, wobei eine Kernfärbung mit To-Pro 3 zur besseren Lokalisierbarkeit der
SNARE-Isoformen erfolgte. In einer Doppelfärbung mit dem
plasmamembranständigen Syntaxin-3 wurde VAMP-7 nochmals dargestellt. Es
zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung des SNARE-Proteine im Zellinnneren. Die
BoNT-B Zielstruktur VAMP-2, die bereits im Western Blot nur durch Verwendung
eines polyklonalen Antikörpers (pAk) darzustellen war, konnte in der
Ergebnisse
60
Immunfluoreszenz weder durch den monoklonalen noch den polyklonalen Antikörper
aufgezeigt werden. Darstellung der Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopischen
Bilder in Abbildung 10 A-I.
3.3.2 VAMP-7 transloziert während der Exozytose
Die Lage der verschiedenen SNARE-Proteine wurde nicht nur im Ruhezustand,
sondern auch nach einstündiger PMA/Ionomycin-Stimulation untersucht. Dadurch
sollte gezeigt werden, ob bestimmte SNARE-Isoformen während der Exozytose ihre
Lage wechseln, womit ein Hinweis auf ihre Beteiligung an den stattfindenden
Membranfusionen gegeben wäre. Bis auf VAMP-7 behielten alle untersuchten
SNARE-Proteine (s. Kap. 3.3.1) ihre jeweilige Position bei. Nach Aktvierung der
Mastzellen kam es zu einer Translokation des cytoplasmatisch gelegenen VAMP-7
zur Zellperipherie hin. Somit lagen in stimulierten Mastzellen die SNARE-Isoformen
SNAP-23, VAMP-7, Syntaxin-3 und –4 nach Stimulation an der Plasmamembran vor.
Darstellung der Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopischen Bilder nach Stimulation
in Abbildung 10 D * - I*.
Ergebnisse
61
Abb. 10: Darstellung der intrazellulär gelegenen t- und v-SNAREs durch
Immunfluoreszenz an Mastzellen. Gezeigt werden konfokalmikroskopische
Aufnahmen aus der Zellmitte.
D E F
D * E * F *
G H I
G * H * I *
A B C
Ergebnisse
62
zu Abb. 10: A Syntaxin-4; B VAMP-3; C Syntaxin-4/ VAMP-3 (grün/rot); D VAMP-7,
E SNAP-23, F VAMP-7/ SNAP-23 (grün/rot); G-I Zellkerne mittels nukleärem Marker
To-Pro 3 dargestellt (blau) ; G VAMP-7; H Syntaxin-3; I VAMP-7/Synatxin-3 (grün/rot)
Mit * markierte Abbildungen wurden ihrer Bezeichnung entsprechend angefärbt ,
sind aber vorher noch mit PMA/Ionomycin stimuliert worden
3.3.3 Die Inhibition des SNARE-Proteins VAMP-7 bewirkt eine
Degranulationshemmung
Mit der durch Immunfluoreszenz gezeigten Translokation von VAMP-7 nach
Stimulation war ein Hinweis für die Beteiligung diese SNARE-Proteins an
Exozytoseprozessen gegeben. Eine nähere Analyse mittels spezifischer, Antikörper-
vermittelter Inhibition schloss sich zur Klärung der Bedeutung von VAMP-7 an.
Obwohl VAMP-2 in den funktionell den Mastzellen ähnelnden eosinophilen
Granulozyten eine wichtige Rolle spielt, konnte es in der Immunfluoreszenz mittels
eines monoklonalen Antikörpers nicht angefärbt werden. Somit kann angenommen
werden, dass in den humanen Mastzellen kein VAMP-2 vorhanden ist, an das der
Antikörper hätte binden können. Daher diente der anti-VAMP-2 Antikörper als
Kontrolle. Zur Darstellung des Releases nach VAMP-2 bzw. VAMP-7 Inhibition
wurden die für SLO erhaltenen Werte als 100 % gesetzt. Im weiteren Ablauf wurden
zunächst die Zellwände der Mastzellen durch eine SLO-Behandlung so weit
permeabilisiert, dass spezifische Antikörper eingeschleust werden konnten, um
intrazellulär gelegene SNARE-Proteine zu blockieren (Abb.11). Etwa 60-80 % der
Zellen waren zum Zeitpunkt der Antikörper-Einschleusung permeabilisiert. Nach dem
Verschluss der Poren durch Zugabe von calciumhaltigem Medium und Inkubation auf
Eis, wurden die Mastzellen mit 22E7 stimuliert. Mit einem spezifischen Antikörper
gegen VAMP-7 behandelte Mastzellen konnten zwar noch Histamin freisetzen, doch
war dabei die Degranulation, verglichen mit der Sekretionsfähigkeit der
Negativkontrolle (anti-VAMP-2), um 54,7 ± 15,5 % vermindert. Eine
Sekretionshemmung durch die VAMP-7-Inhibition konnte auch im Vergleich zur
alleinigen SLO-Behandlung festgestellt werden. Die Reduktion des Releases betrug
hierbei 38,6 ± 28,0 %.
Ergebnisse
63
Abb. 11: Durch Blockade des SNARE-Proteins VAMP-7 wird die Mastzell-
Exozytose gehemmt. Die Mittelwerte (± Standardabweichung) resultieren aus n = 3
Experimenten. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml
eingesetzt. Während der Permeabilisierung mit SLO (10 µg/ml) wurden die
Antikörper hinzugefügt (anti-VAMP-2 (mAk), 1:250; anti-VAMP-7 (mAk), 1:250). Nach
dem Verschluß der Poren wurden die Zellen mit 22E7 (100 ng/ml) stimuliert. Für jede
Bedingung erfolgte die Messung des gespeicherten, präformierten Histamins, sowie
der basalen, ohne die Stimulation stattfindenden und der durch 22E7 induzierten
Histaminfreisetzung
p < 0,01
SLO
SLO + a
nti-VAM
P-2
SLO + a
nti-VAM
P-7
0
25
50
75
100
125
150
175H
ista
min
frei
setz
un
gn
ach
An
tikö
rper
beh
and
lun
g(%
)
p = 0,02
Diskussion
64
4. Diskussion
4.1 Expression von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen
SNARE-Proteine wurden als Vermittler grundlegender Prozesse der
Membranfusionen in Neuronen und anderen sekretorisch aktiven Zellen, wie
Mastzellen und weiteren Zellen des Immunsystems, nachgewiesen. Vor allem
zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen zeigten sich deutliche
Unterschiede im Expressionsmuster der einzelnen SNARE-Isoformen. Bisher gibt es
wenige Daten über die SNARE-Expression in Mastzellen, wobei die meisten
Kenntnisse anhand der leukämischen Rattenmastzelllinie RBL-2H3 gewonnen
wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Mastzellen verwendet,
die bislang nicht unter dem Aspekt der SNARE-Protein vermittelten Exozytose
untersucht worden sind.
Zu den zentralen Vorgängen, die während der Exozytose ablaufen, gehört die
Anlagerung von drei SNARE-Proteinen zum „core“-Komplex, der die Membranfusion
energetisch begünstigt. Je ein Vertreter der SNAP-, Syntaxin-, oder VAMP-Familie ist
beteiligt. Von Neuronen ist bekannt, dass es sich dabei um SNAP-25, Syntaxin-1 und
VAMP-2 handelt [79]. Diese SNARE-Proteine konnten nicht eindeutig in humanen
Mastzellen nachgewiesen werden. Dabei waren die neuronalen Isoformen SNAP-25
und der Isotyp 1A von Syntaxin weder auf mRNA- noch auf Protein-Ebene
vorhanden. Syntaxin-1B konnte auf mRNA-Ebene, trotz starker Signale für die
Positivkontrolle MHH-NB-11, nicht detektiert werden, obwohl wiederholt positive
Ergebnisse auf Protein-Ebene erzielt wurden. Mittels RT-PCR konnte VAMP-2
detektiert werden. Dagegen wurden im Western Blot auch bei Verwendung eines
polyklonalen Antikörpers nur schwache Signale für VAMP-2 in humanen Mastzellen
gezeigt, während in der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 die Expression dieses
SNARE-Proteins bereits bestätigt wurde [94]. Obwohl die den neuronalen „core“-
Komplex bildenden Isotypen nicht nachzuweisen waren, konnten verschiedene
andere, möglicherweise Exozytose-vermittelnde SNARE-Proteine, in Mastzellen
dargestellt werden. Dazu wurden humane intestinale Mastzellen mit in vitro
entwickelten Mastzellen aus Nabelschnurblut (CBMC) und der Mastzellinie HMC-1,
Diskussion
65
sowie aus menschlichem Blut isolierten eosinophilen Ganulozyten, als weiteren
Vertreter sekretorisch aktiver Immunzellen, auf mRNA-Ebene verglichen. Die
SNARE-Proteine SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –6 sowie VAMP-3, -5, -7 und –8
konnten in allen untersuchten Zellen detektiert werden. Diese Ergebnisse bestätigten
sich für humane Mastzellen auch im Western Blot auf Protein-Ebene. Die Beteiligung
dieser SNARE-Isoformen an Exozytose-Vorgängen, außer für VAMP-5, ließ sich
bereits an verschiedenen Zellen, darunter auch RBL-2H3-Zellen, zeigen [96]. Bis auf
das zusätzlich vorhandene Syntaxin-1 und VAMP-2 entspricht das
Expressionsmuster der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 humanen Mastzellen. In
eosinophilen Granulozyten, die den Mastzellen funktionell sehr ähneln – beides sind
sekretorisch aktive Zellen des Immunsystems - konnte die Expression von SNAP-23,
Syntaxin-3 und –4 sowie VAMP-1 und –2 nachgewiesen werden [138;139]. So
unterscheiden sich humane Mastzellen in ihrem SNARE-Expressionsmuster nicht nur
von neuronalen Zellen, sondern auch von RBL-2H3-Zellen, die bislang als Mastzell-
Modell dienten und von den funktionell nahestehenden eosinophilen Granulozyten.
4.2 Hemmung der Mastzelldegranulation durch Botulinum Neurotoxin
Um nun durch Spaltung und damit Inaktivierung zu zeigen, ob und welche SNARE-
Isotypen für die Exozytose-Vorgänge in Mastzellen notwendig sind, wurden die
Mastzellen mit verschiedenen SNARE-spezifischen Proteasen behandelt. Somit wäre
auch ein therapeutischer Ansatz für die Behandlung mastzellbedingter allergischer
Symptome gegeben, die zum großen Teil durch den ausgeschütteten Mediator
Histamin verursacht werden. Als ein nützliches Hilfsmittel zur Analyse der Bedeutung
der SNARE-Proteine für Degranulationvorgänge erwies sich Botulinum Neurotoxin,
das in Neuronen durch SNARE-Spaltung die Exozytose hemmt. Dabei sind die
bakteriellen Proteasen (Toxine) spezifisch für die jeweiligen SNARE-Subtypen.
Neurotoxine, die von verschiedenen Serotypen der Clostridien gebildet werden,
spalten verschiedene SNARE-Isoformen. Bisherige Erkenntnisse über Expression
und Funktion der SNARE-Proteine, sowie ihre Spaltung durch Neurotoxine, beruhen
größtenteils auf Untersuchungen an Neuronen. Dabei stellte sich heraus, dass
SNAP-25 durch BoNT-A, VAMP-1, -2 (Synaptobrevin) und –3 (Cellubrevin) durch
Diskussion
66
BoNT-B und SNAP-25, als auch Syntaxin-1A, -1B und –2 durch BoNT-C gespalten
werden [121;140;141]. Im Gegensatz dazu erwiesen sich VAMP-7 und VAMP-8 als
Neurotoxin-resistent [96;140]. Eine Hemmung der Exozytose durch SNARE-
spezifische Spaltung mit den verschiedenen BoNT-Isotypen konnte nicht nur in
Neuronen nachgewiesen werden, sondern auch in verschiedenen anderen
sekretorisch aktiven Zellen - unter anderem in azinösen Zellen der Ohrspeicheldrüse,
chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks oder beta-Zellen des Pankreas [142-
144]. Dabei sind vor allem SNAP-25, VAMP-2 und Syntaxin-1 als Zielstrukturen von
Botulinum Neurotoxin von Bedeutung. Zur Untersuchung der SNARE-Abhängigkeit
der Mastzelldegranulation kamen Botulinum Neurotoxin Typ A, B und C zum Einsatz.
Botulinum Neurotoxine binden aufgrund ihrer schweren Kette spezifisch an
Neuronen, in denen sie sich nach rezeptorspezifischer Endozytose anreichern. Um
den Einfluss des proteolytisch wirksamen Anteils des Toxins auf Mastzellen zu
untersuchen, wurden in mehreren Vorversuchen verschiedene Möglichkeiten zur
Einschleusung der Botulinum Neurotoxin-Leichtketten getestet.
Nach vorhergehender Gangliosidbeladung sind chromaffinen Zellen in der Lage,
das eigentlich streng neurotrope BoNT-A aufzunehmen [145]. Obwohl dieses
Verfahren bei verschiedenen Zellkulturen erfolgreich war, sorgte die
Gangliosidmischung bei den primären humanen Mastzellen zu einem vorzeitigen
Absterben der Zellkulturen, wie Vorversuche von L. Sander et A. Lorentz
(unpublizierte Daten) zeigten. Dabei konnte eine konzentrations- und zeitabhängige
Toxizität in entsprechenden Versuchsreihen nachgewiesen werden. Auch die
leukämische Mastzelllinie HMC-1, die üblicherweise eine starke Proliferationstendenz
aufweist, starb nach Inkubation mit den Gangliosiden ab.
Eine alternative Methode zur Einschleusung der Toxine bestand in der
Elektroporation. Die Anwendung dieses Verfahrens für primäre humane Mastzellen
wurde von L. Sander et A. Lorentz getestet. Durch Anlegen einer elektrischen
Spannung für wenige ms entstehen kurzfristig große Poren in der Zellmembran,
durch die Toxine aus dem Medium in die Zellen eindringen können. Es zeigte sich,
dass ein großer Teil der eingesetzten Mastzellen in den ersten Tagen nach der
Elektroporation starb. Erste Experimente mit BoNT-A , -B und –C unter Verwendung
einer Spannung, bei der ca. 30-50 % der Mastzellen überlebten, konnten keine
eindeutigen Ergebnisse bezüglich eines Effekts auf die Histaminfreisetzung aus den
Diskussion
67
Mastzellen liefern. Als zusätzliche Kontrolle wurde die Wirkung von Tetanus
Neurotoxin untersucht, das dieselben Zielstrukturen wie BoNT-B besitzt. Weder
durch Elektroporation der Zellen mit Fluoreszenz-markierten Proteinen und
anschließender Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop noch mittels
Durchflußzytometrie konnte die Proteinaufnahme in die Zellen eindeutig
nachgewiesen werden. Auch nach Elektroporation mit 125I-markiertem Tetanus Toxin
(aus Clostridium Tetani, ein Protein mit etwa dem gleichen Molekulargewicht wie
Botulinum Neurotoxin) gelang kein eindeutiger Nachweis, da ein Anhaften der
Radioaktivität an die Zelltrümmer nicht auszuschließen war. Obwohl die Toxine in
einigen Experimenten scheinbar eine sekretionsinhibierende Wirkung ausübten,
konnten diese Daten aufgrund der auftretenden Zelllyse und der zum Teil geringen
Histaminfreisetzung nicht zufriedenstellend reproduziert werden.
Elektrophysiologische Experimente mittels Patch Clamp-Technik sollten dieses
Problem umgehen, indem über Membranströme die Degranulationsfähigkeit
einzelner toxinbehandelter Zellen untersucht wurde. Jedoch blieb die Zellmembran
bei dieser Methode nicht lange genug intakt, um die notwendigen Messungen
durchzuführen. Nach etwa 5 min gab die Membran nach und die Messungen konnten
nicht weitergeführt werden.
Nachdem das Einschleusen der proteolytisch aktiven Anteile der Botulinum
Neurotoxine mittels Gangliosiden, Elektroporation und Patch Clamp-Technik nicht
möglich war, wurden in einem weiteren Ansatz Adenoviren verwendet. Adenovirale
Vektoren sind als eines der effektivsten Behelfsmittel, Fremd-DNA in Säugetierzellen
zu bringen, in der Lage, ein breites Spektrum von verschiedenen Zellen zu infizieren.
Dazu gehören sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen - Primärzellen konnten
ebenfalls erfolgreich transduziert werden [146]. Mittels adenoviraler Vektoren sollten
die betreffenden Gene nun in primäre humane Mastzellen eingeschleust und
anschließend exprimiert werden. Nachdem die Gene für die Leichtketten von BoNT-
A, -B und –C in einen kleinen Shuttle Vektor kloniert wurden, erfolgte unter
Verwendung des Systems nach He et al. eine Rekombination des konstruierten
Plasmids mit dem adenoviralen Backbone AdEasy-1 [136]. Die Generierung von
viralen Partikeln fand in Packungszellen (HEK 293) statt, die fehlende Faktoren des
adenoviralen Vektors transkomplementierten. Die Expression der Botulinum
Neurotoxin-Leichtketten in den Mastzellen sollte mittels der GFP-Signale der
Diskussion
68
jeweiligen Klone angezeigt werden. Obwohl die Klone alle unterschiedlich hohe GFP-
Signale aufwiesen, konnte anhand der starken GFP-Expression des Kontrollvirus
AdGFP stellvertetend für alle Viren die Infektionsrate abgeschätzt werden [137].
Nachdem die Gene für die proteolytisch wirksamen Leichtketten von BoNT-A, -B
und –C über adenovirale Vektoren in die Mastzellen eingeschleust und anschließend
exprimiert wurden, zeigte sich auch hier eine Senkung der Sekretionsfähigkeit. Dabei
wurde die Mastzelldegranulation durch BoNT-B um 24,6 ± 23,0 % und BoNT-C um
31,4 ± 25,7 % nach Stimulation mit PMA/Ionomycin gesenkt. Ein Effekt für BoNT-A
war nicht nachweisbar. Die Resistenz der Mastzellen gegenüber einer Behandlung
mit BoNT-A lässt sich durch das Fehlen des Substrates SNAP-25 erklären.
Verschiedene SNARE-Proteine werden, wie bereits aufgeführt, in Mastzellen
exprimiert und könnten als Substrate für BoNT-B und –C dienen. Welche SNARE-
Isoformen die Zielstrukturen in Mastzellen darstellen, lässt sich nicht genau sagen.
Da die beiden Neurotoxin Subtypen BoNT-B und -C die Exozytose der Mastzellen
hemmen, scheinen sie bestimmte SNARE-Proteine zu spalten. Die Spaltung von
VAMP, vor allem für die in Neuronen vorkommenden Isoformen VAMP-1 und –2,
aber auch für das ubiquitär exprimierte VAMP-3 (Cellubrevin) konnte für BoNT-B
aufgezeigt werden [140]. Außerdem gelang mittels Tetanus-Toxin eine
Degranulationshemmung in eosinophilen Granulozyten durch VAMP-2-Spaltung
[135]. Eine solche Beteiligung von VAMP-2 scheint in Mastzellen eher
unwahrscheinlich zu sein, da es in der Immunfluoreszenz aufgrund fehlender
Bindungstellen für den spezifischen Antikörper nicht dargestellt werden konnte. So
wäre die Proteolyse des BoNT-B-sensitiven VAMP-3 möglich, während die
Neurotoxin-resistenten Isotypen VAMP-7 und –8 eher keine Bedeutung als BoNT-B-
Substrate haben sollten. Auch VAMP–5 könnte als Zielstruktur eine Rolle spielen.
SNAP-25 und Sxyntaxin-1A, -1B und –2 dienen BoNT-C als Substrate, jedoch
konnten die SNARE-Proteine SNAP-25 und Syntaxin-1A in Mastzellen nicht
nachgewiesen werden, während sich für Syntaxin-1B unterschiedliche Ergebnisse
zeigten. Da im Western-Blot nur eine schwache Expression für Syntaxin-1B detektiert
werden konnten, wäre es möglich, dass die mRNA-Signale zu schwach waren, um
mit der angewandten Methode nachgewiesen zu werden. Auch Syntaxin-2, -3, -4
oder –6 könnten beteiligt sein. Obwohl nicht genau gezeigt werden kann, welche
SNARE-Isoformen für die Mastzellexozytose von unmittelbarer Bedeutung sind und
Diskussion
69
gleichzeitig als Botulinum Neurotoxin-Substrate dienen, lassen sich doch einige
potentielle Kandidaten darstellen, die auch in der Exozytose von Rattenmastzellen
beteiligt sind (vgl. Kapitel 4.1). Außerdem senken BoNT-B und BoNT-C die
Sekretionsfähigkeit in Mastzellen zwar um über 20 Prozent, aber eine vollkommene
Hemmung konnte nicht erzielt werden. Dies könnte darin begründet sein, dass die
Stimulationsexperimente schon etwa zwei Tage nach Infektion stattfanden, als der
zytotoxische Effekt der Viren, erkennbar am Zelltod, noch nicht auftrat. Der gewählte
Zeitraum von zwei Tagen könnte zu kurz gewesen sein, um die Toxine in
ausreichenden Mengen zu produzieren und anschließend die jeweiligen SNARE-
Proteine zu spalten. Des Weiteren waren zum Zeitpunkt der Experimente nur etwa
50-60% der Zellen transfiziert. Die nicht-infizierten Zellen sind in ihrer
Sekretionsfähigkeit nicht beeinträchtigt und tragen somit zum recht hohen
Histaminrelease bei. Denkbar wären auch zusätzliche, teilweise kompensierende
Exozytose-Vorgänge, die durch BoNT-resistente SNARE-Proteine vermittelt werden
oder gänzlich SNARE-unabhängig ablaufen. Außerdem entfalten Botulinum
Neurotoxine ihre proteolytische Aktivität nur an unkomplexiert vorliegenden SNARE-
Proteinen [147]. In verschiedenen Zellen liegen Vesikel als Reserve für eine schnelle
Sekretion bereits der Plasmamembran an [59]. Falls dies auch in Mastzellen der
Fall ist und die SNARE-Proteine der aneinander liegenden Membranen bereits
Komplexe gebildet haben, könnten die Neurotoxin-Behandlung die Exozytose dieser
Vesikel nicht verhindern.
Interessanterweise ließ sich eine Degranulationshemmung nur nach Stimulation
mit PMA/Ionomycin darstellen. Eine solche Senkung der Histaminfreisetzung war
nicht aufzuzeigen, wenn eine Aktivierung durch eine 22E7-bedingte Kreuzvernetzung
der IgE-Rezeptoren erfolgte. Da die Histaminfreisetzung nach 22E7-Stimulation
insgesamt auf einem weit tieferen Niveau stattfand, könnte der Release zu niedrig
gewesen sein, um die hemmenden Effekte der Neurotoxine aufzuzeigen.
4.3 Bedeutung von VAMP-7 für die Mastzelldegranulation
Eine Reihe verschiedener Zellen weist bestimmte SNARE-Proteine auf, die an
Membranen spezieller Kompartimente gebunden sind. Dies deutet darauf hin, dass
Diskussion
70
spezifische SNARE-Komplexbildungen die Richtung der Membranfusionen
regulieren [148], wobei die Lage der jeweiligen SNARE-Proteine von Bedeutung ist.
Während die VAMP-Isotypen an den Membranen verschiedener Kompartimente im
Zellinneren sitzen, liegen die Syntaxine und SNAP-25/-23 an der Plasmamembran.
Mittels Immunfluoreszenz ließ sich diese Einteilung auch für die in Mastzellen
untersuchten SNARE-Proteine bestätigen. So lagen SNAP-23 sowie Syntaxin-3 und
–4 an der Plasmamembran vor, während VAMP-7 und –3 in den Membranen
zytoplasmatischer Vesikel lokalisiert waren. Neben den SNARE-Proteinen SNAP-25,
VAMP-2 und Syntaxin-1, die den neuronalen SNARE-Komplex bilden, sind auch
andere Vertreter der drei SNARE-Familien in der Lage, miteinander in Kontakt zu
treten. Dabei müssen nicht immer die gleichen Partner interagieren. So konnte in
RBL-2H3-Zellen gezeigt werden, dass Syntaxin-4 mit SNAP-23 und verschiedenen
VAMP-Isoformen, außer mit VAMP-7, Komplexe bilden kann [96]. In Normal Rat
Kidney-Zellen (NRK cells) wiederum bildet Syntaxin-4 zusammen mit VAMP-7 und
SNAP-23 SNARE-Komplexe [149]. Abhängig von der Zellart und der Richtung der
Membranfusion scheinen unterschiedliche SNARE-Proteine in grundlegende
Prozesse der Exozytose involviert zu sein. Die große Vielfalt der möglichen SNARE-
Komplexbildungen in RBL-2H3-Zellen lässt eine ähnliche Varianz auch für
Mastzellen vermuten. Potentielle SNARE-Komplexbildner für humane Mastzellen
wurden bereits dargestellt, sollten aber näher untersucht werden.
Während sich VAMP-2 in humanen Mastzellen nicht durch Immunfluoreszenz
zeigen ließ, ergab sich anhand des Isotypen VAMP-7 ein Hinweis auf die Beteiligung
von SNARE-Proteinen an der Mastzellexozytose. Nachdem die Mastzellen stimuliert
wurden, um eine Membranfusion im Rahmen der Exozytose zu erreichen, wanderte
das in der Vesikelmembran liegende VAMP-7 vom Zytoplasma in Richtung
Zelloberfläche. Der für VAMP-7 gezeigte Postionswechsel nach Stimulation weist auf
eine Beteiligung an Degranulationsprozessen in Mastzellen hin. Auch in RBL-2H3
Zellen erfolgt eine solche Translokation von VAMP-7 [100]. Das translozierte
VAMP-7 lag zusammen mit SNAP-23 an der Plasmamembran vor. Während
Syntaxin-4 in RBL-2H3-Zellen keine Komplexe mit VAMP-7 bildet, ist nicht
auszuschließen, dass andere Syntaxine als Vertreter der dritten SNARE-Familie
dazu durchaus in der Lage sind. So wäre etwa ein Komplex, bestehend aus VAMP-7,
SNAP-23 und Syntaxin-3, dessen plasmamembranständige Position nachgewiesen
Diskussion
71
wurde, denkbar. Die für VAMP-7 gezeigte Lageveränderung konnte für andere
SNARE-Isoformen, wie das ebenfalls im Zellinneren gelegene und bestimmte
Membranfusionen vermittelnde VAMP-3/ Cellubrevin [150], nicht dargestellt werden.
Ein weiterer Hinweis für die Bedeutung von Vamp-7 ist dessen Anteil an der späten
endosomalen Sekretion von Makrophagen, die nach Hemmung des SNARE-Proteins
sinkt [151].
Zur weiteren Klärung der Funktion von VAMP-7 in sekretorischen Prozessen der
Mastzellen wurde das Neurotoxin-resistente SNARE-Protein mittels spezifischer
Antikörper gehemmt. Durch eine SLO-Permeabilisierung, die aufgrund der
entstehenden Poren den Eintritt größerer Moleküle in die Mastzellen erlaubte,
konnten spezifische Antikörper gegen VAMP-7 und VAMP-2 eingeschleust werden.
Passend zu den bisherigen Befunden – VAMP-2 konnte in humanen Mastzellen
weder durch Western Blot noch durch Immunfluoreszenz zufriedenstellend
dargestellt werden – zeigte anti-VAMP-2 keine Effekte auf die Mastzellexozytose,
während das in cytoplasmatischen Vesikeln gelegene VAMP-2 in eosinophilen
Granulozyten von entscheidender Bedeutung für die Degranulation ist [137]. Daher
wurde der monoklonale anti-VAMP-2 Antikörper, der keine Bindungsstellen in den
humanen Mastzellen haben sollte, als Isotyp-Kontrolle verwendet. Dagegen wurde
durch anti-VAMP-7 eine Degranulationshemmung von 54,7 ± 15,5 % erreicht.
Obwohl nur etwa 60-80 % der untersuchten Zellen überhaupt permeabilisiert und
somit in der Lage waren, die spezifischen Antikörper aufzunehmen, ließ sich eine
hohe Hemmung der Exozytose nachweisen. Wahrscheinlich käme es zu einer
nahezu vollständigen Inhibition der Histaminfreisetzung, wenn alle Zellen
permeabilisiert wären. Aufgrund des Absterbens der Zellen durch zu hohe SLO-
Konzentrationen konnten nicht alle Zellen permeabilisiert und sämtliche VAMP-7-
Proteine blockiert werden. Gelänge dies, so wäre eine noch höhere Hemmung der
Histamin-Freisetzung denkbar. Außerdem ist es möglich, dass neben der VAMP-7
vermittelten Sekretion noch andere Vorgänge stattfinden, die ausgleichend eingreifen
können. Möglich wäre auch eine Kompensation des inhibierten VAMP-7 durch
andere VAMP-Isoypen, die ebenfalls einen zur Exozytose führenden SNARE-
Komplex bilden könnten, wie etwa das ebenfalls Neurotoxin-resistene VAMP-8 oder
das Neurotoxin-sensitive VAMP-3. Eine Beteiligung dieser beiden Isotypen an
Degranulationsvorgängen wird für RBL-2H3-Zellen angenommen. Die Bedeutung der
Diskussion
72
Neurotoxin-sensitiven SNARE-Proteine an der Mastzell-Exozytose konnte bereits
durch Botulinum Neurotoxin-vermittelte Spaltung gezeigt werden. Daher ist es
möglich, dass beide SNARE-Familien, sowohl die Neurotoxin-sensitiven als auch die
insensitiven, Membranfusionen vermitteln, die zur Sekretion führen
4.4 Ausblick
Ein großer Teil der Kenntnisse über Exozytose-Vorgänge und der dabei beteiligten
SNARE-Proteine beruht auf Untersuchungen an Neuronen, wobei deutliche
Unterschiede zu nicht-neuronalen, sekretorischen Zellen bestehen. Die Bedeutung
der SNARE-Isoformen für die Mastzellexozytose ist noch nicht hinreichend geklärt,
weshalb weitere ergänzende Analysen mit humanen Mastzellen durchgeführt werden
sollten. Dazu gehört die Untersuchung der Komplex-bildenden SNARE-Proteine. In
RBL-2H3-Zellen formt Syntaxin-4 als multifunktionales SNARE-Protein mit SNAP-23
und diversen VAMP-Isotypen unterschiedliche Komplexe. VAMP-7 ist dabei jedoch
nicht involviert. So bleibt zu klären, mit welchen SNARE-Proteinen VAMP-7 in
humanen Mastzellen Komplexe formt, da es hier allem Anschein nach während der
Exozytose Membranfusionen vermittelt. Außerdem sollte analysiert werden, welche
SNARE-Proteine in den Mastzellen durch die Botulinum Neurotoxine gespalten
werden und ob somit eine relevante Senkung der Histaminausschüttung erreicht
werden kann. Dazu sollte die Expression der Botulinum Neurotoxine durch den
viralen Ansatz optimiert werden. Die große Vielfalt der gefundenen SNARE-
Isoformen in Mastzellen, sowie die Tatsache, dass sowohl Neurotoxin-sensitive als
auch insensitiven SNARE-Proteine an entscheidenden Exozytosevorgängen in
Mastzellen beteiligt sind, lässt eine Komplexität der Prozesse vermuten, die zum
besseren Verständnis weiter untersucht werden muss. Dabei könnte die
Ausschaltung von SNARE-Isoformen durch spezifische siRNA behilflich sein, die
mittels adenoviraler Vektoren in die Zellen eingeschleust und anschließend
exprimiert wird. Bessere Kenntnisse über die Mastzelldegranulation und der dafür
essentiellen SNARE-Isoformen könnten die Basis für die Generierung neuer
Therapiestrategien bilden.
Zusammenfassung
73
5. Zusammenfassung
Mastzellen sind als Effektorzellen allergischer Reaktionen (Hypersensitivitätsreaktion
vom Typ I) in der Lage, nach Aktivierung innerhalb kurzer Zeit eine Vielzahl von
Mediatoren mittels Exozytose freizusetzen und dadurch verschiedene physiologische
und pathophysiologische Reaktionen des Organismus zu bewirken.
Die exozytotischen Prozesse eukaryoter Zellen werden durch die Interaktion
sogenannter SNARE-Proteine reguliert, die zuerst als Vermittler der neuronalen
Membranfusion beschrieben worden, aber auch an der Degranulation von
Immunzellen beteiligt sind. Bisher gibt es wenige Daten über die Expression und
Funktion der verschiedenen SNARE-Isoformen in Mastzellen, wobei die meisten
Kenntnisse anhand der leukämischen Rattenmastzelllinie RBL-2H3 gewonnen
wurden. In der vorliegenden Arbeit erfolgten die Untersuchungen an primären
humanen Mastzellen, die bislang nicht unter dem Aspekt der SNARE-Protein-
vermittelten Exozytose analysiert worden sind.
Mittels quantitativer RT-PCR und Western Blot zeigte sich, dass humane
Mastzellen die SNARE-Isoformen SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –6, sowie VAMP-
3, -5, -7 und –8 exprimieren. Unterschiede in der SNARE-Expression zeigten sich im
Vergleich humaner Mastzellen zu der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 und zu den
funktionell ähnlichen eosinophilen Granulozyten. In Eosinophilen konnte VAMP-2
durch Immunfluoreszenz dargestellt werden, während ein solcher Nachweis in
Mastzellen nicht gelang.
SNARE-Proteine stellen Substrate für Botulinum Neurotoxine dar, wobei
verschiedene Isotypen spezifisch für bestimmte SNARE-Subtypen sind. Nachdem
verschiedene Ansätze, wie Gangliosidbehandlung, Elektroporation und Patch-
Clamp-Technik, zur Einschleusung der Neurotoxine nicht zum Erfolg führten, wurde
in dieser Arbeit ein adenovirales System zur Expression der Botulinum Neurotoxine
Typ A, B und C in humanen Mastzellen verwendet. Zunächst wurden die
gewünschten Gene in einen kleinen Shuttle Vektor kloniert und mit einem
adenoviralen Backbone Vektor rekombiniert. In permissiven Zellen erfolgte
anschließend die Generierung von viralen Partikeln, die zur Transduktion primärer
humaner Mastzellen verwendet wurden. Nach adenoviraler Infektion und
Zusammenfassung
74
anschließender Expression der Neurotoxine zeigte sich eine
Degranulationshemmung für BoNT-B und –C, während eine Behandlung mit BoNT-A
die Mastzellexozytose unbeeinflusst ließ.
Im weiteren Verlauf gelang eine Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopische
Darstellung der an der Zellmembran gelegenen SNARE-Proteine SNAP-23,
Syntaxin-3 und –4 sowie der zytoplasmatischen Lokalistion von VAMP-3 und –7.
Dabei zeigte sich nach Stimulation eine Translokation des Neurotoxin-resistenten
VAMP-7 vom Zellinneren zur –peripherie. Dort lag es in Colokalisation zu
plasmamembranständigen SNARE-Isoformen, wie SNAP-23, Syntaxin-3 und –4, vor.
Zur funktionellen Analyse der Bedeutung von VAMP-7 für die Mastzellexozytose
wurden anti-VAMP-7 Antikörper in SLO-permeabilisierte Zellen eingeschleust. Dabei
zeigte sich eine deutliche Exozytosehemmnung von über 50 % für VAMP-7 inhibierte
Zellen, wobei nur etwa 70 % der Zellen permeabilisiert waren.
Zusammenfassend stellt die vorliegende Studie dar, dass komplexe Prozesse, an
denen sowohl BoNT-sensitive als auch -insensitive SNARE-Proteine beteiligt sind,
die Membranfusionen in Mastzellen vermitteln.
Literaturverzeichnis
75
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Literaturverzeichnis
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Danksagung
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7. Danksagung
Mein vornehmlicher Dank gilt Herrn Professor Michael P. Manns für die
Bereitstellung von Laborflächen und Arbeitsgeräten und die Unterstützung des
Projekts.
Besonders möchte ich mich bei Herrn Professor Stephan C. Bischoff bedanken,
der die vorliegende Disseration betreut und ermöglicht hat.
Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Axel Lorentz für die wissenschaftliche
Betreuung und Einführung in wichtige Arbeitsmethoden, sowie für die konstruktiv-
kritische Durchsicht der Arbeit.
Auch Herrn Leif Sander möchte ich danken für die Vorarbeiten in diesem Projekt,
sowie die vielen Anregungen und seine selbstverständliche Diskussionsbereitschaft.
Außerdem danke ich den Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn Professor
Kubicka, und Herrn Dr. Florian Kühnel im Besonderen, für ihre freundliche
Unterstützung beim Erlernen viraler Arbeitsmethoden und ihre selbstverständliche
Diskussionsbereitschaft.
Des Weiteren danke ich Herrn Professor Hans Bigalke der Abteilung für
Toxikologie, des Instituts Pharmakologie und Toxikologie, sowie Herrn Dr. Volker
Specht von der Firma Biotecon, Potsdam und Herrn Dr. Florian Wegner von der
Neurologischen Klinik der Universität Leipzig für ihre freundliche Unterstützung und
Anregungen beim experimentellen Teil meiner Arbeit.
Außerdem danke ich Herrn Tibor Veres vom Frauenhofer-Institut für Toxikologie
und experimentelle Medizin, Abteilung Allergologie und Immunologie für seine
freundliche Hilfe beim Erstellen der konfokalmikroskopischen Bilder. Herrn Dr. Tierry
Galli am INSERM, Paris danke ich für die freundliche Überlassung des anti-VAMP-7
Antikörpers.
Ich möchte auch den Mitarbeitern der Abteilung für Viszeral- und Transplantations-
chirurgie der Medizinischen Hochschule unter Leitung von Herrn Professor Jürgen
Klempnauer ausdrücklich für die gute Zusammenarbeit danken.
Einen großen Dank möchte ich den gegenwärtigen und ehemaligen Mitgliedern
unserer Arbeitsgruppe aussprechen. Hervorheben möchte ich die sehr gute
Danksagung
88
Arbeitsatmosphäre, Unterstützung und Zusammenarbeit - auch außerhalb der
Laborarbeit.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Freunden für ihre motivierende und
moralische Unterstützung bedanken.
Meiner Familie und besonders meinem Vater danke ich für die langjährige finanzielle
und moralische Unterstützung meines Studiums und meiner Dissertation. Deswegen
möchte ich die Doktorarbeit meiner Familie widmen.
Lebenslauf
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8. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Seza Bolat
Geburtsdatum/-ort: 29.04.1981 in Constanta (RO)
Wohnort: Rautenstrasse 4, 30171 Hannover
Familienstand: ledig
Schulbildung
1987- Einschulung, Celle
2000 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife, Celle
Hochschulausbildung
2000 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der
Medizinischen Hochschule Hannover (MHH)
2002 Ärztliche Vorprüfung
2003 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2006 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2006-2007 Praktisches Jahr am Klinikum Braunschweig,
Universitätsklinikum Kapstadt, Südafrika,
Medizinische Hochschule Hanover
Mai 2007 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Berufliche Tätigkeiten
seit Juni 2007 Assistentärztin an der Medizinischen Hochschule
Hannover, Abteilung Neurologie
Hannover, den 28. Februar 2008
Seza Bolat
9. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO
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9. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion
eingereichte Dissertation mit dem Titel
„Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen“
in der Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der
Medizinischen Hochschule Hannover
unter der Betreuung von Professor Dr. med. S. C. Bischoff
ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine
anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe diese
Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion
eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel noch nicht