Explorations complémentaires en Hématologie Cellulaire · Globules blancs 64 G/L ... Étalement des préparations ... Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir des cellules

Explorations complémentaires en

Hématologie Cellulaire

L3 Médecine

4 Octobre 2012

Dr Marina Lafage-Pochitaloff

MCU-PH en Hématologie

Laboratoire de Cytogénétique Onco-Hématologique

Département de Génétique (Pr Lévy)

CHU Timone Enfants Marseille

Aix-Marseille Université

[email protected]

Suspicion d’hémopathie maligne :

signes cliniques et biologiques diversement associés

Signes d’insuffisance médullaire :

Anémie

Syndrome infectieux

Syndrome hémorragique

Signes tumoraux :

douleurs osseuses

splénomégalie

adénomégalie

hépatomégalie

Hémogramme

(NFS avec réticulocytes)

Anémie arégénérative

Neutropénie

Thrombopénie

Hyperleucocytose

( si blastes circulants ou

si myélémie)


exploration de la moelle osseuse

• Myélogramme (frottis)

• Immunophénotypage (EDTA)

• Cytogénétique (Héparine)

Caryotype, FISH

• Biologie moléculaire (EDTA)

transcrits anormaux , mutations , …

Explorations complémentaires dans le cadre

d’une hémopathie maligne

Exemple de deux hémopathies malignes :

Leucémie myéloide chronique (LMC)

Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)

Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (1)

Hémopathie maligne

Pathologie de la souche hématopoiétique

Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP)

ou néoplasies myéloprolifératives de l’OMS

Evolution naturelle en 3 phases :

Phase chronique

Phase d’accélération

Phase aiguë : transformation en leucémie aiguë

Hématopoièse

CMP = CFU-GEMM ; GMP = CFU-GM ; EMP = CFU-EMK

Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (2)

Présence du chromosome Philadelphie (Ph)

Présence du transcrit BCR-ABL

Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)

Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)

Epidémiologie :

Incidence = 10 nouveaux cas/ an / million d’habitants

Prévalence : en augmentation car diminution du taux

de mortalité (progrès thérapeutiques : traitement ciblé

anti-tyrosine kinase)

Facteurs risque : benzène, radiations

Age moyen au diagnostic : 54 ans

Très rare chez l’enfant, exceptionnel avant 5 ans

Sex ratio : 1,4 homme pour 1 femme

Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) : clinique

Circonstances de découverte :

Asthénie

Hémogramme systématique +++

Examen clinique :

Le plus souvent : normal

Parfois :

signes tumoraux : splénomégalie

signes liés à l’hyperleucocytose : thromboses

veineuses ou artérielles

Leucémie myéloïde chronique (LMC) au diagnostic :

frottis de sang , objectif 20

Majorité de PN et de myélocytesHyperleucocytose (100G/L) : polynucléose neutrophile et

myélémie

LMC AU DIAGNOSTIC / : HEMOGRAMME

Globules rouges 5,5 T/L

Hémoglobine 15,5 g/dL

Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine 30 pg

Volume Globulaire Moyen 90 microns cube

Globules blancs 64 G/L

Polynucléaires neutrophiles 58 % soit 37G/L

Polynucléaires éosinophiles 2 % soit 1,3 G/L

Polynucléaires basophiles 4 % soit 2,6 G/L

Monocytes 2 % soit 1,3 G/L

Lymphocytes 6 % soit 3,8 G/L

Myéloblastes 1 % soit 0,6 G/L

Promyélocytes 3 % soit 1,9 G/L

Myélocytes 18 % soit 11,5 G/L

Métamyélocytes 6 % soit 3,8 G/L

Plaquettes : 510 G/L

LMC : pathologie de la cellule souche

avec prolifération et différenciation à la phase chronique

Suspicion de LMC :

exploration de la moelle osseuse et du sang


• Cytogénétique sur moelle

(voire sur sang car myélémie)

Caryotype (+/- FISH)

• Biologie moléculaire sur sang

RQ-PCR

LMC phase chronique : myélogramme obj 20

Moelle très riche , polymorphisme (maturation conservée)

*petits mgc à noyau non segmenté

*

*

*

Myélogramme:

importance du % de myéloblastes

Phase chronique : myeloblastes <10%

Phase accélérée : 10%<ou = myeloblastes <20%

Phase acutisée en LAM : myeloblastes >ou =20% (TA)

LMC phase chronique : myélogramme

Richesse : très riche, en nappe

Mégacaryocytes : nombreux et de petite

taille

Lignée granuleuse : 88 %

Myéloblastes : 2 %

Promyélocytes : 3 %

Myélocytes neutrophiles : 20 %

Myélocytes éosinophiles : 3 %

Métamyélocytes neutrophiles : 27 %

Métamyélocytes éosinophiles : 3 %

Polynucléaires neutrophiles : 26 %

Polynucléaires éosinophiles : 4 %

Polynucléaires basophiles : 2 %

Lignée érythroblastique : 10%

Proerythroblastes : 0 %

Erythroblastes basophiles : 2 %

Erythroblastes polychromatophiles : 4 %

Erythroblastes acidophiles : 4 %

Monocytes: 1 %

Lymphocytes: 1%

Hyperplasie medullaire globale à prédominance granuleuse évocatrice d’un

syndrome myéloprolifératif .

Dystrophie mégacaryocytaire typique de LMC

Conclusion : LMC en phase chronique

1960

• Description du chromosome Philadelphie (Ph1 ou Ph)

•1ère anomalie chromosomique acquise caractéristique d’une tumeur

maligne

Philadelphie , 1960 : caryotype sur sang de LMC

« A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia »

Nowell and Hungerford, Science, 1960

Prélèvement (stérile) :

Moelle osseuse , Sang (si cellules

anormales)

Sur héparine (sans conservateur

toxique)

Transport (cellules vivantes)

rapide

température ambiante

Mise en culture

Hotte stérile

Flacon de culture

milieu de culture avec

ATB

+/- mitogène (facteurs de

croissance, …)

Caryotype hématologique : technique (1)

d’après N Nadal, CHU St Etienne

arrêt de la culture en métaphase :

synchronisation des cultures (blocage en phases S puis déblocage)

colchicine (poison du fuseau mitotique)

culture cellulaire

étuve à CO2 à 37°C

durée : 1 à 3 jours



Étalement des préparations

chromosomiques

Vérification au microscope à

contraste de phase : présence de

cellules en métaphase (mitoses)

Transvasement des flacons de culture pour :

Centrifugations

Choc hypotonique

Fixations


Observation des métaphases

Saisie des métaphases

puis classement des chromosomes (caryotype)

Traitement chimique des lames :

dénaturation des protéines

chromosomiques

Trypsine : bandes G

Chaleur+acide : bandes R

Coloration Giemsa



bandes G bandes R

ISCN, Cytogenet Cell Genet, 21, 6, 1978

Caryotype humain

Bandes G (à gauche) / Bandes R (à droite)

1973 : Janet Rowley identifie l’anomalie Ph comme une translocation

t(9;22)(q34;q11)

CARYOTYPE

Indication : LMC au diagnostic

Caryotype sur : Moelle

Conditions de culture : 48h avec synchronisation

Marquage chromosomique: RHG

Nombre de mitoses photographiées et analysées : 20

Résultats :

Toutes les mitoses sont Philadelphie (Ph) positives sous forme de la

translocation classique, t(9;22)(q34;q11).

Il n’a pas été décelé d’anomalie clonale surajoutée.

Formule chromosomique :

46, XY, t(9;22)(q34;q11) [20]

Conclusion : LMC Ph positive

ABL

BCR BCR-ABL

Philadelphia chromosome (Ph) :

• translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature ,1983)

• fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985) :

gène et transcrit chimérique BCR-ABL

Transcrits chimériques BCR-ABL dans la LMC : MBCR majoritaire

NB : Nomenclature bcr b2=e13 ; b3=e14

PCR en Hématologie : généralités (1)

PCR ( polymerase chain reaction) :

réaction de polymérase en chaine

Utilisée depuis 1990

Très sensible : détecte 1 cellule

sur 1 million

Risque d’échec si ARN dégradé

PCR BCR-ABL

sur la lignée de

LMC K562

Prélèvements pour PCR

Sang le plus souvent ( 1 à 2 tubes EDTA)

Moelle osseuse

Ganglion (lymphome)

Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir des cellules nucléées

1 ml de sang normal contient :

10 millions de cellules nucléées ( NFS : nbre de GB = 10G/L)

soit:

30 à 50 µg d’ADN : PCR génomique

et

1 à 10 µg ARN : RT-PCR (analyse des transcrits)

Transcription de l’ADN vs Reverse transcription (RT) de l’ARNm

PCR ( Polymerase Chain Reaction) : Réaction de polymérase en chaine

30 à 50 cycles :

2 30 copies soit 10 9 copies

A chaque cycle, 3 phases:

• Dénaturation : 95°C

• Hybridation : 50 à 60°C

Amorces (primers) :

oligonucléotides 5’ et 3’

specifiques de la séquence à

amplifier

• Elongation : 72°C

Taq polymérase : enzyme de

la bactérie Thermophilus

aquaticus, ADN polymerase

resistante à haute

température (95°C)

PCR sur gel

Puits 1: marqueur de PM

Puits 2 : contrôle négatif (eau)

Puits 3 : produit d’amplification

RQ-PCR en Hématologie :

RQ-PCR (real-time quantitative PCR):

Utilisée depuis 2000 en Hématologie

Très sensible : détecte 1 cellule sur 1million

Permet de quantifier et donc d’apprécier le taux

de maladie résiduelle après traitement (MRD)

Risque d’échec si ARN dégradé

Real-time quantitative PCR (RQ-PCR)

Deux technologies similaires :

Taqman

Light cycler

Sonde oligonucléotidique interne

fluorescente

Détection de l ’émission de

fluorescence en temps réel

(PCR en temps réel)

Mesure du Ct (cycle threshold),

nombre de cycles nécessaires

pour atteindre un seuil de

fluorescence.

Ct proportionnel à la quantité de

« cible » présente dans

l ’échantillon

RQ-PCR /LMC : amorces (F et R) et sonde (P) EAC

(Europe against cancer program, Gabert et al.,Leukemia, 17, 2003)

RQ-PCR : Technologie Taqman

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

RQ-PCR Taqman : plaque 96 puitsPlaque 96 puits pour Taqman 7700

Transcrit controleTranscrit recherché

Amplification MBCR-ABL

Plasmide 105 Plasmide 104

Patient

Amplification transcrit contrôle (GUS ou ABL )

Plasmide 105 Plasmide 104

Patient

RQ-PCR et LMC

Calibrateur : plasmide avec un insert Mbcr

Expression des résultats :

Rapport nombre de copies BCR-ABL / nombre

de copies du gène de contrôle : nombre de

copies normalisé (NCN)

Suivi :

NCN suivi/ NCN diagnostic

cinétique au cours de l ’évolution ++

RQ-PCR

Indication : LMC au diagnostic

Prélèvement : Sang

Résultats :

Recherche du transcrit MBCR-ABL positive.

Qualité de l’ARN : très bonne (Ct ABL: 24)

Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 104 copies du transcrit contrôle (ABL) :

7564

Valeur de référence (médiane) au diagnostic des LMC en phase chronique : 8709 (100% qui

servira de reference pour le suivi de la maladie residuelle )

Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (2)

Ph absent dans 10% des cas de LMC au diagnostic :

5% des cas : BCR-ABL positif en PCR

5% des cas : BCR-ABL négatif en PCR

Compléter le caryotype et la PCR

par FISH BCR-ABL (sur le prelevement du caryotype)

Caryotype : analyse globale du génome

• 1 caryotype hématologique : 500 bandes

• 1 bande = 5 à 10.106 pb = 5 à 10.000 kb

• Rappel :

• 1 gène : 100 à 1000 kb

• génome : 3.109 pb = 3.106 kb

Caryotype

= Cytogénétique conventionnelle

ABL

BCR BCR-ABL

Philadelphia chromosome (Ph) :

• translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature ,1983)

• fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985)

5’ BCR- 3’ABL FISH probe

technique FISH

Traitement des lames

Sonde spécifique

fluorescente

Co dénaturation

Hybridation

Rinçages post-

hybridation

Contre-

coloration

ADN cible

BCR-ABL

Analyse au

microscope et

analyseur

d’images d’après N Nadal, CHU St Etienne

sonde FISH 5’ BCR- 3’ABL

LMC: t(9;22)

FISH sur chromosomes (FISH métaphasique)

LMC Ph + , Sonde 5’ BCR- 3’ABL

Patient LMCDonneur sain

Sonde 5’ BCR- 3’ABL

FISH sur noyaux (FISH interphasique)

2R2V 1R1V1F

Cytospins de cellules de moelle triées CD34+

9

LMC Ph negative, BCR-ABL positive

Sonde 5’ BCR - 3’ABL : insertion (22;9)

22

der(9)der(22)

5’ BCR- 3’ABL FISH probe :

insertion de séquences ABL dans BCR

chr 9

chr 22

LMC au diagnostic : si absence de Ph au caryotype

(10% des cas)

Le plus souvent : BCR-ABL positif (en PCR et en FISH)

Ph masqué ou cryptique dû à une insertion submicroscopique

( visible uniquement en FISH ) :

insertion de 9 dans le 22

ou

insertion de 22 dans le 9

pour créer un gène chimérique BCR-ABL

répond au traitement ciblé par Imatinib

Plus rarement : BCR-ABL négatif (en PCR et en FISH)

LMC atypique, forme frontière SMP/SMD

ne répond pas au traitement ciblé par Imatinib

Syndromes myéloprolifératifs chroniques (SMP)

ou Néoplasies myéloprolifératives

Pathologies de la cellule souche hématopoiétique

Prolifération et différenciation de la lignée myéloide

Plusieurs entités (OMS) :

SMP de type LMC (Ph et/ou BCR-ABL positive)

SMP non LMC (Ph et BCR-ABL négatifs)

TE

MFP

PV

SMP /SMD (Ph et BCR-ABL négatifs)

LMMC

LMC atypiques

Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms : The 2008 World Health Organization criteria and

point care diagnostic algorythms. Tefferi A and Vardiman JW, Leukemia 2008;22:14-22

Role oncogénique de BCR-ABL

Daley GQ et al,

Science,1990

Protéines Tyrosine Kinases

Protéines ABL et P210 BCR-ABL

(Goldman and Melo, NEJM, 2003)

(Goldman J and Melo JV, NEJM, 2003)

Traitement de la LMC en phase chronique :

Traitement Tolérance Efficacité

Hydréa (hydroxyurée) +++ +/-

Allogreffe +/- - (GVH) ++++ (guérison)

Interféron +/- ++

ATK Imatinib (Glivec) ++ +++

ATK 2ème génération ++ ++++

STI-

571

Inactive Active

Inactive inhibée par IMActivée par l’ATPBCR-ABL Inactive

(Gleevec, Glivec, Novartis)

Suivi des LMC par cytogénétique : critères

d ’évaluation

Kantarjian et al., NEJM, 1997 modifié en février 2002

Réponse cytogénétique majeure :

Réponse cytogénétique complète : 0% Ph

Réponse cytogénétique partielle : 1-35% Ph

Réponse cytogénétique mineure : 36-65% Ph

Réponse cytogénétique minime : 66-95% Ph

Absence de réponse cytogénétique : 96-100% Ph

NB : Caryotype médullaire avec analyse d’au moins 20

métaphases

Patient MBCR : suivi

Plasmide 102

Plasmide 101

Patient

RQ-PCR MBCR-ABL

Indication : LMC Mbcr positive traitée par Glivec depuis 1 an

Prélèvement : Sang

Résultats :

Qualité de l’ARN : bonne (transcrit contrôle :ABL)

Recherche du transcrit MBCR-ABL positive.

Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 104 copies du transcrit contrôle : 4

Valeur de référence au diagnostic : 8709

Taux de maladie résiduelle (local) = 4/8709= 0.0005 =0.05%= 0.5x10-3

Facteur de conversion du laboratoire pour standardisation internationale = 0.8

Taux de maladie résiduelle (international ): TMR = 0.05% x 0.8 = 0.04%=0.4x10-3

Conclusion : Réponse moléculaire majeure (RMM car TMR <10-3 soit 0.1%)

LMC : Niveaux de maladie résiduelle

(European Leukemia Net , Baccarani et al, Blood, 2006)

Evaluation des LMC au diagnostic

Recommandations de l’ELN : Baccarani et al , JCO, dec 2009

clinique et NFS :

Age

Taille de la rate

Taux de plaquettes

Taux de blastes

Basophiles

Eosinophiles

Myelogramme :

% de myeloblastes

caryotype sur moelle :

Anomalies clonales surajoutées au Ph (CCA/Ph+)

FISH BCR-ABL :

Si Ph masqué (pour compléter le caryotype)

Si echec de caryotype

RQ-PCR sur sang

Evaluation des LMC au suivi

Recommandations de l’ELN : Baccarani et al , JCO, dec 2009

NFS : tous les 15j jusqu’à RHC : réponse hématologique complète (rate non palpable, GB<10G/L, plaq<450,pas de myelemie, basophiles < 5%)

RQ-PCR sur sang

tous les 3 mois si traitement par Glivec jusqu’à RMM (réponse moléculaire majeure)

Tous les mois dans le suivi précoce des allogreffes (6 premiers mois) , puis plus espacé (tous les ans après 2 ans post-allo)

Caryotype moelle:

1ère année à 3 mois (ELN 2010),6 mois, puis tous les 6 mois jusqu’à RCC (réponse cytogénétique complète) confirmée par un caryotype 6 mois après , puis tous les ans si pas de RQ-PCR possible

Toujours si échec de traitement (resistance 1aire ou 2aire) ou cytopénie inexpliquée

FISH BCR-ABL :

Si Ph masqué (pour compléter le caryotype)

Si echec de caryotype

Évaluation de la réponse à l’Imatinib : ELN 2009 ( Baccarani et al, JCO,2009)

Réponse Optimale Suboptimale Echec Vigilance

diagnostic NA NA NARisque élevé;ACA dans Ph+

à 3 mois

RHCet au moins RCg mineure

(Ph ≤ 65%)

Pas de RCg(Ph > 95%)

pas de RHC NA

à 6 mois≥ RCgP (Ph ≤ 35%)

< RCgP (Ph > 35%)

Pas de RCg (Ph > 95%)

NA

à 12 mois RCgC < RCgC< RCgP (Ph > 35%)

< RMM

à 18 mois RMM < RMM < RCgC NA

À tt moment

RMM stable ou en amélioration

perte de RMMMutations S à Imatinib

ACA dans Ph+perte RHC ou perte RCgCMutations R à Imatinib

Augmentation du transcritACC dans Ph-

Dr N Nadal, CHU St Etienne

Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)

Evolution naturelle en 3 phases :

Phase chronique

Phase d’accélération

Phase aiguë (crise blastique ou phase

blastique) :

leucémie aigue myéloïde (2/3 cas)

leucémie aigue lymphoïde (1/3 cas) : type B

LMC en phase chronique :

prolifération et différenciation

moins de 10% de myeloblastes

dans la moelle osseuse

clichés Drs S. Laibe et D. Sainty, IPC Marseille

LMC en transformation aigue :

blocage de la différenciation

Moelle osseuse (myelogramme) :

plus de 20% de myeloblastes / blastes

dans la moelle osseuse

TA de LMC en LAL ou LAM :

blocage de la différenciation

Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et caryotype

Phase chronique :

Ph isolé

Phase d’accélération et phase d’acutisation (LA):

Ph et anomalies chromosomiques clonales

additionnelles (ACA)

47,XY,t(3;18)(q11;p11),+8,t(9;22)(q34;q11)

46,XY,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10)

ACA /Ph: iso 17q : perte du 17p donc deletion du gène p53

46,XY,t(3;21)(q26;q22),t(9;22)(q34;q11)

ACA /Ph: translocation (3;21) créant un géne chimérique AML1-EVI1

Anomalies chromosomiques clonales surajoutées au Ph

Anomalies de nombre :

trisomie 8

trisomie19

Anomalies de structure :

Isochromosome 17q : i(17)(q10) ou idic(17)(p11)

isoPh : ider(22)t(9;22)(q34;q11)

t(3;21)(q26;q22) : evi1-aml1

Anomalie de nombre et de structure :

duplication du Ph : +der(22)t(9;22)

Genes associated with CML progression

Radich J P et al. PNAS 2006;103:2794-2799

©2006 by National Academy of Sciences

Gènes impliqués dans la

transformation des LMC

Junia V. Melo & David J. Barnes

Nature Reviews Cancer , 2007

3

Gilliland, D; Gary PhD, MD

Current Opinion in Hematology. 8(4):189-191, July 2001.

Cooperativity hypothesis in acute myeloid leukemias (AML)

Junia V. Melo & David J. Barnes

Nature Reviews Cancer 7, 441-453 (June 2007)

Chronic myeloid leukaemia as a

model of disease evolution

in human cancer

http://www.nature.com.gate2.inist.fr/nrc/journal/v7/n6/full/nrc2147.html






Caractéristiques de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)

Hémopathie maligne

Pathologie de la souche hématopoiétique

Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP)

ou néoplasies myéloprolifératives de l’OMS

Présence du chromosome Philadelphie (Ph)

Présence du transcrit BCR-ABL

Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)

Conclusion : Historique de LMC : avancées tous les 10 ans

1960 : Nowell et Hungerford, chercheurs à Philadelphie mettent en évidence la même anomalie chromosomique dans toutes les cellules de plusieurs cas de leucémie myéloïde chronique (LMC) : le chromosome Philadelphie (Ph)

1973 : Janet Rowley identifie l’anomalie Ph comme une t(9;22)(q34;q11)

1985 : Traitement de la LMC par alpha-interféron : surveillance cytogénétique

1990 : Clonage de la t(9;22) : fusion des gènes BCR et ABL : diagnostic moléculaire et mise en évidence de l’activité oncogénique de BCR-ABL

2000 : Traitement par Imatinib (Glivec), inhibiteur de l’activité tyrosine-kinase de BCR-ABL :surveillance cytogénétique et moléculaire (PCR quantitative)

2005 : ATK de 2ème génération (Dasatinib et Nilotinib) chez les patients resistants au Glivec très actifs (sauf si mutation T315 : allogreffe proposée ).

Explorations complémentaires dans le cadre

d’une hémopathie maligne

2ème exemple d’hémopathie maligne :

Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)

Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (1)

Hémopathie maligne aigue (prolifération mais pas de différenciation)

Pathologie des progéniteurs lymphoides B ou T (lymphoblastes):

LAL B : 75% des cas ; LAL T : 25 % des cas

Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (2)

Rare mais la plus fréquente des néoplasies malignes

de l’enfant

Urgence diagnostique et thérapeutique

Thérapeutique adaptée dépend des explorations

complémentaire

Suspicion d’hémopathie maligne aigue :

signes cliniques et biologiques


Anémie

Syndrome infectieux


Signes tumoraux :

douleurs osseuses

splénomégalie

adénomégalie

hépatomégalie

Hémogramme urgent

Anémie (arégénérative)

Neutropénie

Thrombopénie

Hyperleucocytose

( si blastes circulants )

Suspicion d’hémopathie maligne aigue : hospitalisation en urgence pour exploration de la moelle osseuse

Myélogramme (frottis)

Résultat à J0

Immunophénotypage (CMF)

Résultat à J0-J1

Cytogénétique : Caryotype, FISH…

Résultats à J2-J5

Biologie moléculaire : transcrits , IG-TCR

Résultat à J5-J30

w

LAL :

Répartition enfant /adulte

Entités cytogénétiques

spécifiques de lignée

B ou T (sauf rares exceptions)

Anomalies cytogénétiques

de nombre ou de structure

(Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)

Children

Adults

Valeur pronostique de la cytogénétique

dans les LAL de l’enfant

Survie sans événement (EFS) des LAL de l’enfant du St Jude’s Children

Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants

Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004

LAL

Répartition enfant

/adulte

des entités

cytogénétiques

Survie à 5 ans sans événement

(EFS)

Enfants : 80%

Adultes : 40%

(Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)

Children

Adults

C. Fossat, CHU Marseille

Acheminement rapide : 2-3h

Température ambiante

Sang, moelle osseuse, liquides biologiques

Anticoagulant : EDTA, Héparine

Tissu solide : ganglion

milieu humidifié

Sous la direction des anatomo pathologistes

Typage des blastes : prélèvement pour CMF

D’après C. Fossat, CHU Marseille

Ac mono ou polyclonaux : 350 CD (cluster de différenciation)

Plusieurs clones/ CD

Un épitope antigènique/clone

Ig G1, Ig G2, Ig M : Origine murine

Lyophilisés, liquides, purs ou marqués

MARQUAGE CELLULAIRE pour CMF :

membranaire, cytoplasmique, nucléaire

D’après C. Fossat, CHU Marseille

Principaux marqueurs de lignée lymphoide

Lignée T

CD3

CD5

CD2

CD4

CD8

CD1A

CD2

CD7

Lignée B

CD10

CD79a

CD19

CD20

CD22

CD24

CD138


FITC PE

ECDPC5

Vert à 525 nm. Orange : 590 nm

Rouge profond: 667 nm Rouge à 620 nm.

Les fluorochromes utilisés en CMF


Cytomètre en flux


Cytométrie en flux

FL1

FL2

SSC

FSCLaser

Miroirs

dichroïques

Filtres

PMT

PMT

PMT

FL3FL4FL6FL5FL6


Granulocytes

Monocytes

Lymphocytes

Différenciation hématopoïèse

GTLLF, 2006


Moelle « normale » Expression CD45, CD11b, CD14, CD16,


Acquisition en CMF : 5 105 évènements

Absence de bruit de fond

en FITC, PE, …

CD 45+ CD 19+


Immaturité HLA Dr, CD34, TdT, CD10

Lymphoïde B cytCD79a, cytCD22, CD19

Lymphoïde T cytCD3

Myélo-Mono MPO, cytCD13, CD13, CD33, CD117, CD14, CD4

Plaquettaire CD41, CD42, CD61

Erythroïde Glycophorine A, CD36, CD71

Nature de la prolifération

pathologique d’après le profil en CMF


LAL B : profil antigénique associé à la leucémie

« LAP » (leukemia associated profile)

Intensité d’expression : 100%

CD45, CD10, CD 38, CD19

Asynchronisme de maturation : 50%CD10/CD22, CD34/CD22,

Infidélité de lignée : 20%

CD13, CD33, CD7, CD2,...

Evolution du clone : 20%

Plusieurs combinaisons


« LAP » : LAL B

Blastes

HématogonesLymphocytes


« LAP » des LAL T

Intensité d’expression : 100%

cCD3, CD99

Asynchronisme de maturation : 50%TdT/cCD3, CD1a/TcR,

Infidélité de lignée : 20%

CD13, CD33, CD15,

Evolution du clone : 10%

Plusieurs combinaisons


Classification EGIL

LAL B : cCD79a, cCD22

BI ProB Tdt+, CD10-

BII B Commune Tdt+, CD10+

BIII Pre B Tdt+/-, CD10+, mc+

BIV B Mature Tdt-, CD10+/-, mc+,Igs+


Classification immunologique

LAL T : cCD3

TI ProT CD7+, CD2+

TII PreT CD5+/-, CD8+/-

TIII Cortical CD4+ ou CD8+ ,CD1a+

TIV Mature CD1a-, TcRa/b ou g/d

Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) :

Entités les plus fréquentes

LAL B:

Adulte : LAL Ph

Enfant : Hyperdiploidie et t(12;21)

LAL-B :

anomalies de structure

LAL Ph / t(9;22) / BCR-ABL

Enfant : 3 % des LAL

Adulte : 25% des LAL

Children

Adults

LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR- ABL

LAL-BII (CD10 +) avec souvent marqueurs myéloïdes

Caryotype : t(9;22)(q34;q11)

FISH : sonde BCR-ABL

RT-PCR : 2/3 mBCR, 1/3 MBCR suivi moléculaire ++++

9 22

5’-

Sonde BCR-ABL extra-signal :

Aspect de type M-BCR : 1F, 1V, 2R

Si m-BCR : 2F,1R,1V

m M

LAL Ph :

Pronostic défavorable ( indication classique d’allogreffe)

en nette amélioration depuis l’adjonction des ITK

(Imatinib, Dasatinib)

LAL Ph : apport de l’Imatinib : protocole pédiatrique POG AALL0031 (Schultz K R et al. JCO 2009)

LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR-ABL

Caryotype :

Anomalies clonales additionelles (ACA) :

60% des cas

ACA de type déséquilibrées :

Gains

hyperdiploidie >50 (trisomie2)

duplication du Ph

trisomie 8

Pertes :

monosomie 7, deletion 7p :

pronostic plus défavorable

Deletion Ikaros /IKZF1 en 7p12

58,XY,+X,+2,+3,+5,+6,+8,t(9;22)(q34;q11),

+13,+14,+15,+17,+21,+der(22)t(9;22)

E Delabesse, CHU Toulouse








LAL-B

Hyperdiploidie >50

( 51-65 chr )

Enfant : 25% des LAL

Adulte : 7% des LAL

Children

Adults

LAL-B : Hyperdiploidie 51-65 chromosomes

LAL-B II (CD10+)

Profil chromosomique non aléatoire:

+X, +4, +6, +10, +14, +17, +18, +21,+21

Index d’ADN > ou = 1.16 (soit nombre modal >ou = 53)

(Raimondi S, Blood, 1993)

Très bon pronostic (sauf si Ph associé) :

EFS à 5 ans :

Enfant : 85% (Pui CH, NEJM, 2004)

Adulte : 50 % (Moorman AV, Blood,

2007)

56,XX,+X,+4,+6,+9,+10,+14,+17,+18,+21,+21

LAL-B :

t(12;21)(p13;q22)/TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)

enfant : 22 à 27 % des LAL-B

adulte : 3 à 5 % des LAL-B

très rare après 25 ans

Children

Adults

LAL-B : t(12;21)(p13;q22)/TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)

Phénotype : LAL-BII, souvent CD13+

Caryotype : le plus souvent anormal

mais

la t(12;21)(p13;q22) est invisible au

caryotype (anomalie cryptique)

FISH : sonde TEL / AML1 ES (extra-

signal AML1)

RT-PCR : transcrit TEL-AML1

Pronostic très favorable :

EFS à 5 ans : 86%

12p13

21q22

LAL-B :

anomalies de structure

LAL 11q23/MLL

Myeloid Lymphoid Leukemia

Enfant : 8 % des LAL-B

80 % des LAL du nourrisson <1 an

«infant leukemia »

Adulte : 10% des LAL-B

Children

Adults

Valeur pronostique de la cytogénétique dans les LAL de l’enfant

Survie sans événement (EFS) des LAL de l’enfant du St Jude’s Children

Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants

Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004

LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4

Phénotype : B-I , proB (CD10 neg )

avec souvent marqueurs myéloïdes

FISH : sonde MLL

RT-PCR : transcrit chimérique MLL-

AF4

Pronostic défavorable avec variation

selon l’âge:

très défavorable (indication

d’allogreffe) si :

nourrisson < 6mois

adulte

4 11

MLL 5’V/3’R

der11

der4

From Van den Burg, Leukemia, 2004

Sondes FISH pour déceler les anomalies de structure :

Sondes bicolores :

-Signal de fusion

-Signal de séparation

(break-apart)

LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4

4 11

MLL 5’V/3’R

der11

der4

Leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) :

Valeur pronostique de la maladie résiduelle

Maladie residuelle minime (MRD pour minimal residual disease) :

maladie détectable en dessous du seuil de la cytologie

(5% de blastes residuels )

Recherchée après chaque phase de chimiothérapie

induction soit J30 post diagnostic

1ère consolidation soit J60

2ème consolidation soit J90

MRD moléculaire : valeur pronostique défavorable si

Présence du transcrit bcr-abl dans les LAL Ph

Niveau Ig-TCR >ou = 10-2 après induction dans les LAL de

l’enfant

MRD par CMF : validée aux USA, en cours d’évaluation en Europe

Niveau de sensibilité des techniques de suivi de la maladie résiduelle dans les LA

D’après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003


Infidélité de lignée

Asynchronisme de maturation

Intensité d’expression

Profil phénotypique associé

à la leucémie : « LAP »

Apport de la CMF dans le suivi de la maladie :Etude de la maladie résiduelle


MRD par CMF : exemple d’une LAL de

l’enfant

LAL B II (Mars 2002) – Georgie

Mai 2004 : pris en charge au CHU Timone, pour greffe

allogénique intrafamiliale


MRD-CMF à l’entrée - Moelle

MRD-CMF =30%


MRD-CMF =0.35%

MRD-CMF Pré Greffe - Moelle 25/08/05


MRD-CMF M6 Post greffe - Moelle

MRD-CMF <0.01%



MRD-CMF =0.7%



MRD-CMF = 5.2%



MRD-CMF = 16%

Rechute


Temps (mois)

60483624120

Su

rvie

san

s R

echu

tes

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

p = 0.03

Survie sans rechute LAL : MRD/CMF moelle J21

> 10-1

<10-3

10-1< <10-2

LAL : suivi des patients par IG-TCR

Rearrangement Ig-TCR : existence d’un rearrangement monoclonal spécifique dans plus de 95 % des LAL

Identification par séquençage au diagnostic

puis PCR spécifique pour le suivi de la maldie résiduelle

D’après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003







Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire

au diagnostic (1)

Anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires acquises présentes

dans toutes les hémopathies malignes

Valeur diagnostique des anomalies de type primaire (exemple du Ph)

La majorité de ces anomalies a une valeur pronostique indépendante :

anomalies de type primaire : TEL-AML1 versus BCR-ABL dans LAL

anomalies de type secondaire : ACA dans LMC et LAL Ph, deletion Ikaros

dans les LAL

Prise en compte dans les protocoles thérapeutiques ( décision d’

intensification , allogreffe dans les LAL, …)

Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire

au diagnostic (2)

Marqueurs de clonalité à établir au diagnostic pour le suivi des

patients (maladie résiduelle ou MRD)

Suivi cytogénétique : LMC

Suivi moléculaire : LMC et LA (leucémies aigues)

Suivi par CMF : LA

Complémentarité des techniques :

Analyse globale du génome :

caryotype (résolution 10 000kb)

Analyses ciblées :

FISH (resolution : 50 à 100kb) ,

PCR (transcrits chimériques) ,

séquençage des gènes d’Ig et TCR dans LAL


signes cliniques et biologiques diversement associés


Anémie

Syndrome infectieux


Signes tumoraux :

douleurs osseuses

splénomégalie

adénomégalie

hépatomégalie

Hémogramme

(NFS avec réticulocytes)

Anémie arégénérative

Neutropénie

Thrombopénie

Hyperleucocytose

( si blastes circulants ou

si myélémie)


exploration de la moelle osseuse


• Immunophénotypage (EDTA)

• Cytogénétique (Héparine)

Caryotype, FISH

• Biologie moléculaire (EDTA)

transcrits anormaux , mutations , …

Explorations complémentaires en Hématologie Cellulaire · Globules blancs 64 G/L ... Étalement des préparations ... Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir des cellules

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