1 Explantátové kultury rostlin 1. Charakteristika explantátových kultur explantátové kultury rostlin vznikají aseptickou kultivací izolovaných částí rostlin za umělých podmínek oddělení určité části ze sterilně napěstované nebo povrchově sterilizované rostliny a umístění této části rostliny do sterilního prostředí, kde se kultivuje v rostlinném organismu jsou všechny buňky totipotentní pro odvození explantátové kultury je tedy vhodné jakékoliv pletivo obsahující buňky s funkčním jádrem rostlinné explantátové kultury zahrnují izolaci buněk, pletiv a orgánů a jejich kultivaci ve sterilních podmínkách
Explantátové kultury rostlin. 1. Charakteristika explantátových kultur e xplantátové kultury rostlin vznikají aseptickou kultivací izolovaných částí rostlin za umělých podmínek - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Explantátové kultury rostlin
1. Charakteristika explantátových kultur explantátové kultury rostlin vznikají aseptickou kultivací izolovaných
částí rostlin za umělých podmínek oddělení určité části ze sterilně napěstované nebo povrchově
sterilizované rostliny a umístění této části rostliny do sterilního prostředí, kde se kultivuje
v rostlinném organismu jsou všechny buňky totipotentní pro odvození explantátové kultury je tedy vhodné jakékoliv pletivo
obsahující buňky s funkčním jádrem rostlinné explantátové kultury zahrnují izolaci buněk, pletiv a orgánů a
jejich kultivaci ve sterilních podmínkách
2
růst a vývoj explantátových kultur umožňují kultivační podmínky: kultivační médium - zdroj energie, výživy a regulačních látek světelný režim - intenzita a kvalita světla a fotoperioda teplota vlhkost
za určitých podmínek mohou být z explantátových kultur dopěstovány nové rostliny (cíl většiny manipulací in vitro)
tento proces je uskutečněn podle následujícího cyklu: rostlina – explantát – kultura in vitro - organogeneze nebo embryogeneze – intaktní rostlina
v explántátové kultuře lze vyvolat růst a další vývoj základů orgánů, které již byly založeny na donorové rostlině
podmínky kultivace mohou stimulovat a urychlovat průběh morfogenního procesu; dochází k dokončení vývinu izolovaného embrya a k jeho klíčení, nebo vytváření postranních větví z axilárních pupenů a k tvorbě nových axilárních pupenů na těchto větvích
3
podle charakteru nově vzniklých struktur rozlišujeme organogenezi, somatickou embryogenezi (popř. somatickou polyembryogenezi) a pylovou embryogenezi či androgenezi
mezi nejdůležitější faktory patří: orgán, ze kterého byl izolován explantát fyziologické a ontogenetické stádium rostliny období odběru explantátu velikost explantátu zdravotní stav donorové rostliny genotyp orientace explantátu inokulační hustota
4
2. Laboratoř explantátových kultur 2.1. Zařízení laboratoře explantátových kultur prostor pro mytí skla a laboratorních pomůcek
dřezy k mytí skla zařízení k sušení skla destilační přístroj
prostor pro přípravu a sterilizaci médií chemický stůl analytické váhy vařič (popř. vodní lázeň) pH metr autokláv pro sterilizaci při 121 ºC lednice, mraznička
skladovací prostor na chemikálie a sklo prostor pro aseptickou manipulaci se sterilní kulturou
aseptický box (flow box) germicidní zářivka preparační mikroskop stolní třepačka nástroje pro odběr preparátů kahan
5
kultivační místnost s řízenými kultivačními podmínkami
(teplo, světlo, vlhkost) klimatizační jednotka třepačky
2.2. Základní úkony prováděné v laboratoři mytí skla sterilizace
sterilizace kultivační místnosti sterilizace nástrojů a skla autoklávování sterilizace živných roztoků sterilizace rostlinného materiálu
práce ve flow boxu před prací v boxu je nutné jeho vnitřní strany vytřít dezinfekčním roztokem
(70% ethanol) box je nutné pustit 15 minut před prací (ustálení proudu vzduchu) veškeré předměty používané v boxu musí být sterilní je vhodné pracovat s rukavicemi
6
3. Kultivační média pro explantátové kultury složení kultivačního média je jedním z nejdůležitějších faktorů
ovlivňujících růst a morfogenezi v explantátových kulturách rostlin média používaná pro kultivaci buněk, pletiv a orgánů obsahují
obvykle následující složky: makroelementy mikroelementy sacharidy vitamíny aminokyseliny zpevňující látku růstové regulátory
mezi nejčastěji používaná média patří MS (Murashige, Shoog, 1962) White (White, 1963) B5 (Gamborg et al., 1968) SH (Shenk, Hildebrant, 1968) Lloyd-McCown (Lloyd, McCown, 1981)
koncentrace jednotlivých prvků je závislá na rostlinném druhu
mikroelementy nezbytné - železo, mangan, zinek, bór, měď a molybden. nemusí být nezbytné - kobalt, jód, sodík a chlór
sacharidy zdroj uhlíku a energie - sacharóza
heterotrofní výživy explantátů, schopnost autotrofní výživy je velmi omezena
vitamíny nezbytné pro rostliny katalyzátory metabolických procesů nezbytné k růstu a vývoji rostlin limitující faktor růstu explantátových kultur nejčastěji používané vitamíny - thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin a myo-
inositol ostatní - biotin, kyselina listová, kyselina askorbová, kyselina pantotenová,
riboflavin
8
aminokyseliny zdroj dusíku v organické formě využití přímo k syntéze proteinů dodávány ve směsi aminokyselin (např. kasein hydrolyzát), často se používá také L-
glutamin, L-asparagin a glycin.
látky pro zpevnění média nejčastěji používanou látkou pro zpevnění média je agar další - syntetické látky Phytagel a gerlit.
růstové regulátory rostlinné hormony jsou přirozené i syntetické regulátory růstu přirozené regulátory jsou syntetizovány rostlinou samotnou (fytohormony) rostlinný hormon je organická sloučenina syntetizovaná v jedné části rostliny a
translokovaná do části jiné, kde vyvolává fyziologickou reakci přirozené i syntetické růstové regulátory rozlišujeme na regulátory povahy
stimulační (stimulátory) a povahy inhibiční (inhibitory). růstové látky (stimulátory) lze rozdělit do tří základních skupin:
auxiny, cytokininy a gibereliny zábranné látky (inhibitory) - kyselina abscisová etylen látky s růstově regulačním působením - brassinosteroidy, kyselina jasmonová,
polyaminy, oligosacharidy, turgoriny, benzolinon a další
9
auxiny stimulují v kultivačním médiu růst kalusu a buněk stimulují tvorbu adventivních kořenů na segmentech stonků i u explantátů významný prostředek pro vyvolání somatické embryogeneze spolu s cytokininy základní složkou médií pro explantátové kultury nejčastěji používanými auxiny jsou:
cytokininy stimulují buněčné dělení a tvorbu axilárních prýtů iniciace diferenciace pupenů a kořenů v explantátových kulturách (v interakci
s auxinem) pro růst explantátové kultury, tvorbu kořenů a prýtů (organogenezi) je důležitý
vzájemný poměr stimulátorůo při vysokém poměru auxinu k cytokininu je stimulována iniciace tvorby
kořenů, embryogeneze a iniciace tvorby kalusuo je-li tento poměr nízký, dochází k indukci tvorby adventivních a axilárních
prýtů
10
cytokininy jsou využívány v rostlinných biotechnologiích jako složka kultivačních médií při odvozování a udržování rostlinných explantátových kultur a dále při regeneraci rostlin in vitro
uplatňují se při kultivaci vyvíjejících se somatických embryí a hrají klíčovou úlohu při vytváření apikálního meristému u somatických embryí
cytokininy používané v kultivačních médiích:benzylaminopurin (BAP) - syntetický6-dimetylaminopurin (IPA) - přirozenýfurfurylaminopurin (kinetin) - syntetickézeatin - přirozený
gibereliny stimulují dlouživý růst (pouze nadzemních částí rostlin) stimulují buněčné dělení (dělení je stimulováno v přechodu z fáze G1 do S a fáze S je
obvykle zkrácena) pro většinu explantátových kultur nejsou tyto látky nezbytné gibereliny používané v kultivačních médiích:
GA3, GA7
kyselina abscisová (ABA) způsobuje inhibici růstu, navozuje dormanci pupenů a semen exogenně aplikovaná ABA působí inhibičně na klíčení semen její hladina v semenech se snižuje při výstupu z dormance účinkem nízkých teplot, resp.
světla ABA je důležitá pro maturaci somatických embryí
11
etylen jediný dosud známý plynný hormon stimuluje dozrávání některých plodů inhibuje dlouživý růst a stimuluje růst radiální inhibuje růst kořenů
látky s růstově regulačním působením nejsou řazeny mezi fytohormony z důvodu jejich výskytu ve vyšších koncentracích
než je tomu obvyklé pro hormonální látky brassinosteroidy
- významně zvyšují rezistenci rostlin ke stresům polyaminy (PA)
- způsobují v systémech in vitro růstovou stimulaci- dochází k intenzivnímu buněčnému dělení- PA hrají významnou úlohu v obraně rostlin proti stresům
glukosaminové oligosacharidy - účastní se odezvy rostlin na napadení patogeny - aktivují syntézu fenylalaninamoniaklyázy (PAL), klíčového enzymu syntézy fenolických obranných látek, fytoalexinů - aktivují syntézu stresového hormonu etylenu
12
organické extrakty protein hydrolyzát kokosové mléko sladový extrakt banánový extrakt pomerančová a rajčatová šťáva
jejich použití se však příliš nedoporučuje pro jejich nedefinovatelné složení
13
4. Metody explantátových kultur mikropropagace – tradiční způsob vegetativního množení rostlin výhody mikropropagace
– kultura se odvozuje z velmi malých částí rostlin (explantátů)
– možnost produkce velkého množství rostlin
– rozmnožování v podmínkách in vitro – nedochází ke kontaminaci
– rychlost množení je mnohem vyšší než u tradičních metod
– klonování in vitro je možné po celý rok
– mezi pasážemi nevyžadují prakticky žádnou péči
nevýhody mikropropagace – relativně drahé laboratorní vybavení
– pracná metoda, drahý provoz
– existuje nebezpečí vzniku geneticky aberantních rostlin
14
Teoreticky možné metody mikropropagace množení rostlin indukcí tvorby prýtů z axilárních pupenů
nejrozšířenější metoda kultivace in vitro
založena na simulaci růstu axilárních pupenů při potlačení apikální dominance metoda kultivace vzrostlých vrcholů metoda kultivace jednonodálních stonkových segmentů
tvorba adventivních prýtů nebo adventivních somatických embryípřímou morfogenezí
vznikají přímo na částech orgánu nebo pletiv přímá tvorba adventivních pupenů přímá embryogeneze
nepřímou morfogenezí
- nepřímá organogeneze
z neorganizovaného kalusového pletiva vznikají kořeny, stonky, popř. celé rostliny
- nepřímá somatická embryogeneze
15
Metody mikropropagace rostlin (George and Sherrington, 1984)
množení z axilárních pupenů
množení tvorbou adventivních prýtů nebo embryí
16
Embryogeneze in vitro embryogeneze je proces, při kterém z jedné buňky, nejčastěji zygoty, vzniká
postupnými strukturálními změnami zárodek (embryo) dělením zygoty se vyvíjí zralý zárodek, který je uložen v semeni zárodky mohou vzniknout i z jiných buněk rostliny
zárodky haploidní - z haploidních buněk gametofytu
zárodky diploidní - z diploidní buňky nucellu
- z diploidních somatických buněk
rozlišujeme následující případy embryogeneze:embryogeneze zygotická – základem embrya je zygota,
embryogeneze gametofytická (prezygotická) – základem embrya jsou haploidní gametofytické buňky,
embryogeneze somatická (postzygotická) – základem embrya jsou buňky somatické,
somatická polyembryogeneze – základem embrya jsou rovněž buňky somatické, tento případ embryogeneze je charakteristický pro jehličnany.
17
Somatická embryogeneze
- základem embrya u somatické embryogeneze jsou buňky somatické
- somatická embrya během svého vývoje procházejí stejnými vývojovými fázemi
jako embrya zygotická
- iniciaci, vývoj a diferenciaci somatických embryí ovlivňující následující faktory: původ explantátu, minerální složení kultivačního média, růstové regulátory, cukry, fyzikální podmínky kultivace, kultivační nádoby a konzistence kultivačního média (pevné, tekuté), plynná fáze uvnitř kultivační nádoby, hustota buněčné suspenze.
18
Fáze mikropropagace vývoj rostlin v podmínkách in vitro je možné rozdělit do čtyř fází
odvození sterilní (aseptické) kultury – primokultury
- odebrání vhodného explantátu, jeho sterilizace a kultivace na živném médiu
fáze proliferace explantátové kultury- dosažení vysokého koeficientu množení a získání co největšího počtu nových explantátů cestou somatické embryogeneze, popř. tvorbou adventivních pupenů
- proliferační fáze může být opakována nebo může následovat třetí fáze
zakořeňování in vitro - nevýhodou kořenů vytvořených v podmínkách in vitro je častá absence kořenového vlášení a také jejich křehkost, která způsobuje, že se při přenosu rostlin do půdy lámou
- u většiny druhů indukce tvorby kořenů vyžaduje větší přítomnost auxinu
zakořeňování in vivo a aklimatizace- převod rostlin z kultury in vitro do podmínek in vivo
- Zakořeňování in vivo v nesterilních podmínkách na substrátech (např. perlit, vermikulit, směsi obsahující písek, rašelinu a čedičovou vatu atd.)
19
5. Využití explantátových kultur ozdravování rostlin a produkce bezvirózního materiálu masová produkce geneticky identického materiálu cestou
mikropropagace rychlé namnožení nově vyšlechtěných odrůd uchování genobanky jednotlivých druhů, kultivarů produkce haploidních rostlin jako výchozího materiálu pro
šlechtitelské programy
- využití v programech pracující s rekombinantní DNA (genové inženýrství)
3. Práce s kulturami in vitro, růst a pasážování kultur embryogenní kultura smrku
- jednotlivá somatická embrya jsou složena ze tří částí: z tzv. embryonální skupiny, embryonálních tubulárních buněk a embryonálního suspenzoru
a
c
b
250 m
a
c
b
Rané somatické embryo smrku ztepilého (klon 2/32)
(a) embryonální suspensor, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální skupina
26
- růst kultury probíhá tak, že dochází k neustálému oddělování nových tubulárních a suspenzorových buněk směrem od embryonální skupiny k distální části embrya; tvoří se inokulum čítající větší počet embryí - shluky raných somatických embryí jsou kultivovány v Petriho misce na kultivačním médiu.- při pasáži byly odebírány části shluků s vyvinutými skupinami embryonálních buněk o hmotnosti cca 2,5 – 5,0 mg a přenášeny na novou Petriho misku s médiem (znázorňuje červená šipka).
1
45°
90°
b
c
0°
a d
Fotografie shluku ESE po 14 denní kultivaci in nature z různého úhlu (Fotoaparát Olympus Digital Camera C-4040 ZOOM); (a) 0°, (b) 45°, (c) 90°. (d) Petriho miska se shluky ESE na kultivačním médiu.
27
- mezi nejčastěji využívané metody pro stanovení růstu rostlinných kultur je vážení čerstvé hmotnosti kultury nebo počítání buněk.
- případě kultur raných somatických embryí smrku je vhodné využít analýzy obrazu (IA image analysis)
- IA nezpůsobuje destrukci nebo kontaminaci studovaného materiálu
- při experimentu probíhajícím v čase nemusíme zasahovat do kultivovaného biologického materiálu.
28
Zjištěné plochy jednotlivých
SRSE v zadaných jednotkách
c
ae
d
b
Schéma analýzy obrazu polyembryonální kultury smrku
(a) Petriho miska se shluky raných somatických embryí
(b) digitalizace obrazu Petriho misky pomocí CCD-kamery (c) a programu Grab-IT
(d) zjištění plochy shluků pomocí programu Image-Pro
(e) zjištěné výsledky jsou dále zpracovány v programu MS Excel
29
suspenzní kultura tabáku BY-2
- suspenzní kultura tabáku linie BY-2 je udržována v kapalném MS mediu obohaceném sacharosou (30 g.l-1), KH2PO4 (0.2 g.l-1), thiaminem (1 mg. l-1) a kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou (0.2 mg.l-1) (Nagata, 1992)
- suspenze (20 ml) v 50 ml Erlenmeyerových baňkách je kultivována na třepačce (Kühner Shaker, typ LT-W) za těchto podmínek: tma, teplota 271°C, 135 ot.min-1
- subkultivace je prováděna po 3 nebo 4 dnech přenesením 2 respektive 1 ml suspenze do čerstvého media.
- hustota suspenze je zjišťována pomocí
Fuchs‑Rosenthalovy počítací komůrky
- počet buněk zjištěný mikroskopickým
pozorováním byl převeden na buněčnou
hustotu podle parametrů komůrky
- metoda je časově náročná
- rutinní sledování růstových charakte-
ristik suspenzních kultur také lze realizovat pomocí nepřímého stanovení buněčné hustoty jako např. „objem buněk po centrifugaci“, ovšem zde představuje závažný problém změna morfologie buněk během kultivační doby
30
4. Odebrání vzorku a jeho příprava pro analýzu
embryogenní kultura smrku - pro stanovení životnosti se odebírá malá část shluku ESE z jeho horní části
- pro stanovení intracelulárních esteras se odebírá část shluku ESE o hmotnosti přibližně 100 mg svěží hmotnosti
suspenzní kultura tabáku BY-2
- pro stanovení životnosti se odebírá 37 l suspenze
- pro stanovení intracelulárních esteras se odebírá
0,5 ml suspenze
- vzorky suspenze BY-2 a kultury 2/32 ESE byly promyty
50 mM fosfátovým pufrem (pH 8,7) a centrifugovány
(360 g, 5 min, 20 °C) - tento krok byl zopakován třikrát
- při stanovení težkých kovů je nutné vzorek promýt v EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) - EDTA náleží do skupiny syntetických komplexotvorných sloučenin a má toxické účinky
- využívá se při přípravě modifikovaných kultivačních médií s těžkými kovy – vytváří komplexy s kovy, nedochází k reakcím kovu se složkami média
EDTA
31
5. Stanovení životnosti embryogenní kultury smrku a suspenzní kultury BY-2
- stav kultury je také možné charakterizovat relativním zastoupením životaschopných buněk – viabilitou- pro stanovení viability bylo vyvinuto několik metod- nějčastěji se provádí tzv. „dye exclusion test“, založený na selektivní permeabilitě cytoplazmatické membrán- dále je možné sledovat funkční metabolizmus buněk (jednu z možností představují intracelulární esterasy)
Postup při zjišťování životnosti embryí a buněk suspenze tabáku- odebrání části shluku raných somatických embryí - vytvoření suspenze s 37 μl destilované vody, 10 μl propidium jodidu a 3 μl fluoresceindiacetátu (fluorescenční barviva)- propidium jodid je propouštěn přes cytoplazmatickou membránu dovnitř buňky a způsobuje ve fluorescenčním mikroskopu u mrtvé buňky červené fluorescenční zbarvení- fluoresceindiacetát byl v živých buňkách štěpen na octan a fluorescein, který vydával zelené fluorescenční zbarvení- příprava mikroskopického preparátu a jeho sledování pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu Olympus AX 70
32
suspenzní kultura tabáku BY-2 a ESE smrku ztepiléhoJednotlivé buňky buněčné suspenze sledované pomocí konfokálního mikroskopu, (1) v šedém poli, cytoplazma (C), vakuoly (V), jádro (N). (2) zbarvené pomocí fluoresceindiacetátu. (3) ESE smrku obarvená flourescenčními barvivy FDA/PI. (4) ESE smrku v šedém poli
(a) embryonální suspensor, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální skupina