Introdução 1 1.Introdução O estudo do transporte de fluidos em meios heterogéneos tem aplicação em distintos campos da ciência e engenharia tais como a reologia, geofísica, física e química, física do polímero, a ciência dos colóides, a tecnologia do petróleo, a agricultura e a biotecnologia [1, 2]. Uma subclasse particularmente notável dos materiais heterogéneos é a área dos meios porosos. Mesmo o termo "meios porosos" engloba uma variedade profunda de processos e dispositivos como torres empacotadas, leitos de areia e substâncias como pedra calcária, filtros de papel e partículas catalíticas. Para meios porosos a predição do fluxo do fluido entre fases continua a ser alvo de vários estudos, apesar de já se terem passado muitos anos de pesquisa. As soluções a este problema são de grande importância para muitas aplicações. Por exemplo prever o fluxo e o transporte de contaminantes nos aquíferos e nos movimentos na zona insaturada, do óleo e do gás em reservatórios de petróleo, no calor e no transporte de massa em reactores de leito fixo em engenharia química, em reservatórios geotérmicos e em materiais de construção, na dispersão de poluentes dos depósitos de desperdícios radioactivos, em processos de filtração, e em transporte dos líquidos e dos produtos químicos nos pulmões e nos outros órgãos, como estudos na engenharia biomédica [1, 2]. O movimento de colóides e de microrganismos em meios porosos é um fenómeno extremamente presente na natureza e indústria: no movimento das partículas ao longo do solo, em filtros de purificação de águas, na separação cromatográfica, etc. [3,4,5]. É importante saber como o tamanho e a forma dessas partículas, na forma de matéria dispersa, influenciam o fluxo durante a sua passagem por meios porosos e cromatográficos, em particular. A cromatografia é definida como um processo de separação de componentes de uma amostra pela sua distribuição entre um fluido corrente (fase móvel) e um adsorvente (fase estacionária) [6]. A fase estacionária pode ser um sólido, ser um líquido adsorvido a um sólido ou ser um gel; e pode ser empacotada numa coluna ou espalhada por uma superfície, formando uma camada fina. A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. De acordo com Sewell et al. [7] os parâmetros que caracterizam uma cromatografia são: a assimetria dos picos, a capacidade, a selectividade, o número de andares ou de pratos, a altura dos andares e a resolução. Além disso, pode ser importante conhecer o coeficiente de partição e/ou de retenção. A eluição é caracterizada por um coeficiente de distribuição ou partição, d K dado por: m s d C C K = (Equação 1.1) onde s C é a concentração de soluto na fase estacionária e m C representa a concentração de soluto na fase móvel.
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Introdução
1
1.Introdução
O estudo do transporte de fluidos em meios heterogéneos tem aplicação em distintos
campos da ciência e engenharia tais como a reologia, geofísica, física e química, física do
polímero, a ciência dos colóides, a tecnologia do petróleo, a agricultura e a biotecnologia [1, 2].
Uma subclasse particularmente notável dos materiais heterogéneos é a área dos meios
porosos. Mesmo o termo "meios porosos" engloba uma variedade profunda de processos e
dispositivos como torres empacotadas, leitos de areia e substâncias como pedra calcária, filtros
de papel e partículas catalíticas. Para meios porosos a predição do fluxo do fluido entre fases
continua a ser alvo de vários estudos, apesar de já se terem passado muitos anos de pesquisa.
As soluções a este problema são de grande importância para muitas aplicações. Por exemplo
prever o fluxo e o transporte de contaminantes nos aquíferos e nos movimentos na zona
insaturada, do óleo e do gás em reservatórios de petróleo, no calor e no transporte de massa
em reactores de leito fixo em engenharia química, em reservatórios geotérmicos e em materiais
de construção, na dispersão de poluentes dos depósitos de desperdícios radioactivos, em
processos de filtração, e em transporte dos líquidos e dos produtos químicos nos pulmões e
nos outros órgãos, como estudos na engenharia biomédica [1, 2].
O movimento de colóides e de microrganismos em meios porosos é um fenómeno
extremamente presente na natureza e indústria: no movimento das partículas ao longo do solo,
em filtros de purificação de águas, na separação cromatográfica, etc. [3,4,5]. É importante
saber como o tamanho e a forma dessas partículas, na forma de matéria dispersa, influenciam
o fluxo durante a sua passagem por meios porosos e cromatográficos, em particular.
A cromatografia é definida como um processo de separação de componentes de uma
amostra pela sua distribuição entre um fluido corrente (fase móvel) e um adsorvente (fase
estacionária) [6]. A fase estacionária pode ser um sólido, ser um líquido adsorvido a um sólido
ou ser um gel; e pode ser empacotada numa coluna ou espalhada por uma superfície,
formando uma camada fina. A fase móvel pode ser um líquido ou um gás.
De acordo com Sewell et al. [7] os parâmetros que caracterizam uma cromatografia são:
a assimetria dos picos, a capacidade, a selectividade, o número de andares ou de pratos, a
altura dos andares e a resolução. Além disso, pode ser importante conhecer o coeficiente de
partição e/ou de retenção.
A eluição é caracterizada por um coeficiente de distribuição ou partição, dK dado por:
m
sd C
CK = (Equação 1.1)
onde sC é a concentração de soluto na fase estacionária e mC representa a concentração de
soluto na fase móvel.
Introdução
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O coeficiente de retenção, R , é definido por:
r
m
VV
R = (Equação 1.2)
A capacidade 'k de um dado componente é dada através de:
m
mr
VVV
k−
=' (Equação 1.3)
em que rV é o volume de retenção (ou eluição) do pico do soluto correspondendo a um tempo
de retenção rt , característico de cada proteína e função da sua dimensão, mV é equivalente
ao volume de vazios medido pelo tempo de retenção, 0t de um componente excluído. Logo, é
também válido que:
0
0't
ttk r −
= (Equação 1.4)
No fundo, o factor de capacidade 'k traduz o número de moles, volume ou o tempo da
amostra na fase estacionária, sobre o número de moles, volume ou o tempo da amostra na
fase móvel. O factor de capacidade pode ser considerado uma propriedade intrínseca do
suporte. É função da fracção de vazios (ε ) e do coeficiente de partição ( dK ), sendo este
último uma propriedade do suporte.
No caso de estarem presentes dois compostos na amostra, por exemplo, a selectividade
S da cromatografia está relacionada com a capacidade em distinguir os dois picos (um para o
composto 1, outro para o composto 2), e é definida por:
'1
'2
kkS = (Equação 1.5)
Em cromatografia um “prato” é a maior zona uniforme capaz de acomodar o soluto e tem
uma dada altura, H . Numa mesma coluna pode haver pratos com alturas diferentes. O
número de pratos ( N ) é dado por:
HLN = (Equação 1.6)
sendo L o comprimento da coluna e H a altura do prato.
Uma amostra introduzida na coluna e arrastada pelo eluente, nunca tem um fluxo pistão
perfeito, sofre sempre uma certa dispersão. Como consequência o perfil de eluição é uma
curva de Gauss e a Equação 1.6 pode tomar outras formas. Quanto menor for a altura dos
pratos maior é o número de etapas discretas para um dado comprimento de coluna. Isto
aumenta as hipóteses de se conseguir uma boa separação entre componentes semelhantes.
No entanto, uma pequena altura de prato não significa, necessariamente, uma boa resolução.
Uma boa separação depende de uma combinação de factores: da altura do prato, que é uma
Introdução
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medida da dispersão no interior da coluna e da selectividade e capacidade de adsorção por
parte do material que constitui o enchimento da coluna, relativamente aos diferentes solutos.
O factor de resolução, sR , é uma medida da separação entre picos, ou bandas, que
calcula-se através da expressão:
).(2/1 21
12
ww
rrs tt
ttR+
−= (Equação 1.7)
em que rt é o tempo de retenção do pico (quantidades de soluto em unidades de tempo) e wt
é a largura da base do pico em unidades de tempo.
Uma resolução sR > 1.5 permite a chamada resolução de linha de base, ou seja, a
separação completa de dois picos de igual tamanho.
A selectividade, o número de pratos teóricos e o factor de resolução estão relacionados
através de:
( ) ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
−×= '
'
11
41
kkNSRs (Equação 1.8)
sendo S dado pela Equação 1.5 e 'k o valor médio dos factores de capacidade relativos aos
dois solutos. Como dá para perceber, a resolução pode ser alterada variando os valores de S ,
N e 'k . Por exemplo, um aumento da resolução é adquirido com o aumento do factor de
capacidade (de notar que se 'k > 10 o aumento de 'k não tem efeito), o aumento da
selectividade (por exemplo pela diminuição da velocidade da fase móvel e do diâmetro das
partículas de enchimento ou aumentar o tamanho da coluna) e o aumento do número de pratos
(diminuindo o diâmetro das partículas de enchimento) [7].
Numerosos métodos cromatográficos existentes são poderosos meios de separação de
partículas e moléculas e têm uma base experimental e teórica bem estabelecida. No entanto,
até agora, o movimento de macromoléculas e nanopartículas em meios porosos continua a ser
objecto de investigação [7,8,9].
1.1. Cromatografia de exclusão molecular
A cromatografia de exclusão molecular (SEC, do inglês, size exclusion chromatography)
consiste numa separação em solução por efeito crivo. Isto é, as moléculas são separadas em
função das suas dimensões (do seu volume hidrodinâmico), uma vez que a fase estacionária
(matriz ou resina) tem poros que permitem ou dificultam a entrada das moléculas a separar.
Assim, as moléculas de menor tamanho ficam retidas nos poros e percorrem um caminho
maior, sendo as maiores as primeiras a sair (ver Figura 1.1.1.). Em condições ideais é o
volume hidrodinâmico que determina o fraccionamento das moléculas, não havendo qualquer
interacção de outra ordem com a matriz [7].
Introdução
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Figura 1.1.1 Princípio da Cromatografia de Exclusão Molecular [10]. Para se conseguir uma boa resolução é fundamental a escolha do gel (matriz), o
tamanho da amostra e a qualidade de enchimento da coluna. De um modo geral, deve
escolher-se um gel em que as moléculas de maior dimensão saiam com o volume de espaços
vazios.
A cromatografia de exclusão molecular é um dos métodos standard com mais vasta
aplicação. É, frequentemente, usada como o primeiro passo dum esquema de purificação para
separar moléculas de interesse das que têm características (de tamanho) radicalmente
diferentes. Também pode ser empregue para mudar o ambiente do tampão ou para retirar o sal
de uma amostra de biopolímeros, como por exemplo, a remoção de sal em amostras contendo
proteínas precipitadas por salting – out, sendo um processo menos moroso do que a diálise.
Finalmente, a SEC pode ser implementada como um meio para determinar parâmetros
moleculares como o raio hidrodinâmico e a comum massa molecular, o que é conseguido
usando, por exemplo, proteínas de peso molecular bem conhecido e traçando uma recta de
calibração, como será descrito depois [10].
De acordo com Deutscher et al. [11] na cromatografia de exclusão molecular, um volume
de eluição do pico do soluto, rV , de substâncias de peso molecular elevado ( MW ), tendo um
coeficiente de distribuição, aproximadamente, de 1.0 coincide com o volume de espaços
vazios, intra – partículas da coluna, mV . Para moléculas com um coeficiente de distribuição
menor que 1.0, existe uma relação linear entre o )log(MW e o volume ou tempo de eluição
do soluto. Assim, em condições ideais, a ordem de eluição pode ser prevista, geralmente, pelo
tamanho de moléculas uma vez que existe uma relação linear entre o seu volume de eluição e
o valor logarítmico do seu peso molecular [12].
É exibido, esquematicamente, o gráfico de calibração para a SEC na Figura 1.1.2a. e
um exemplo para proteínas na Figura 1.1.2b.
Em determinadas gamas do peso molecular MW de um soluto ou nanopartículas existe
uma dependência linear de )log(MW com o volume de eluição ou o tempo de retenção,
Introdução
5
V tV 0
Log(
MW
)
Retention time
1
2
3
intervalo 2. Moléculas maiores são excluídas e não separadas numa situação como a do
intervalo 1. Moléculas menores penetram completamente na fase estacionária e não estão
separadas na situação do intervalo 3.
Na Figura 1.1.2b observa-se que algumas proteínas, apesar de terem um peso
molecular semelhante, se dispersam ao longo do tempo de retenção. Goodsell et al. [13]
defendem que a razão deste leque está relacionada com a diferença da forma das
macromoléculas de proteína que pode divergir da esfera ideal.
Figura 1.1.2a. Figura 1.1.2b. Figura 1.1.2a. Representação esquemática da dependência do peso molecular dos
solutos MW com o tempo de retenção, onde 0V é o volume de espaços vazios e tV é o
volume total da coluna.
Figura 1.1.2b. Exemplo da relação linear entre o logaritmo do peso molecular para proteínas
standard e o tempo de retenção. Nesta experiência usou-se uma coluna I-125 com uma fase
móvel que consistia em tampão fosfato de sódio 0,08 M (pH 7.0) contendo 0.32 M de cloreto de
sódio e 20% (v/v) etanol. Caudal, 1 mL/min [12].
Um efeito similar é observado na cromatografia de exclusão molecular de
nanopartículas. Algumas experiências foram levadas a cabo numa coluna com microesferas de
gel de agar (2,5% agar) para a purificação e separação de alguns vírus [3]. A coluna com
dimensões de 2 cm x 30 cm continha microesferas de diâmetro 105 µm a 149 µm. O volume da
amostra foi de 2 mL, o caudal de 6 mL/h. Foram separadas as seguintes espécies em
− Poliovírus tipo I, tamanho 28 nm, MW = 6 800 000;
− ECHO tipo 7, tamanho 24 nm;
− Material celular, e ribossomas celulares.
A posição do pico de retenção para cada uma das espécies mencionada versus o seu
tamanho está esquematizada na Figura 1.1.3. O resultado corresponde ao descrito anteriormente para as proteínas mas a dispersão
dos distintos vírus confirma que a forma das partículas deve ser tomada em consideração.
Introdução
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Figura 1.1.3. Gráfico do tamanho de vírus versus posição do pico de retenção, numa coluna
com 30 mL de espaços vazios, [3].
Os géis podem oferecer um limite de exclusão de partículas entre 300 nm a 400 nm
(para Sephacryl S-1000 Superfine, [14]), mas no caso da Figura 1.1.3., para grandes
macromoléculas e vírus, isso significa que a SEC actua na gama de difusão interior menos
acessível onde a forma da molécula se torna importante. Por exemplo, a separação
cromatográfica em gel do vírus de mosaico do tabaco (TMV) e do vírus de mancha anelar do
tabaco (TRS), referida no trabalho de Mikes [12], foi feita usando apenas pressão hidrostática
durante menos de 10 minutos. O autor demonstrou que o vírus TMV aparece a um volume de
eluição de 18 mL, que corresponde ao volume de espaços vazios da coluna. O vírus TMV
consiste, principalmente, em bastonetes com 300 nm de largura e 15 nm de diâmetro. É
provável que a geometria do vírus impeça a sua entrada nos poros. O vírus TRS consiste num
poliedro com 26 nm de diâmetro. É fácil de ver que a forma das partículas cria um problema no
mecanismo de exclusão por tamanho, onde se assumiu aquela partícula com,
presumivelmente, forma esferóide. A dependência do intervalo de fraccionamento das matrizes na SEC em função do
tamanho dos poros está representada na Figura 1.1.4. baseado nos dados tabelados de
Deutscher et al. [11]. Os limites de fraccionamento superiores e inferiores são representados
por linhas. O limite superior caracteriza moléculas excluídas da matriz (poros intra - partículas).
Como pode ser visto pela linha inferior para o fraccionamento de macromoléculas de MW ~
100 000 e mais alto, o tamanho de poro intra – partícula anda ao redor de 1 µm.
100 101 102 10310-1
100
101
102
103
104
Frac
tiona
tion
rang
e, k
Da
Pore diameter, nm Figura 1.1.4. Intervalo de fraccionamento das matrizes na SEC versus diâmetro do poro,
segundo Deutscher et al. [11]. As linhas oblíquas traduzem o limite superior e inferior de
fraccionamento.
Introdução
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A cromatografia de exclusão molecular baseia-se no equilíbrio que se estabelece entre a
fase móvel e a fase estacionária. Recentemente surgiram técnicas de cromatografia
fundamentadas na separação em situações de não equilíbrio, durante o fluxo de uma solução
numa coluna com poros intra – partículas. Estas técnicas, designadas por cromatografia
hidrodinâmica (HDC, do inglês, hydrodynamic chromatography) e cromatografia slalom (SC, do
inglês, slalom chromatography), baseiam-se no uso de fluxo laminar que ocorre nos espaços
intersticiais originados entre as partículas na coluna. Estes processos dependem da taxa de
eluição e do tamanho das partículas no empacotamento e não do tamanho dos poros ou da
sua natureza química [15].
A HDC foi desenvolvida e aplicada até hoje, sobretudo, na separação de polímeros
sintéticos como poliestirenos. A ordem de eluição na HDC é a mesma que na SEC. A SC tem
sido reportada mais para moléculas de cadeia dupla de DNA e a sua ordem de eluição é
oposta à verificada na cromatografia de exclusão molecular e na cromatografia hidrodinâmica,
portanto [15].
Em seguida descreve-se em pormenor as características de cada uma destas técnicas
de não equilíbrio.
1.2. Cromatografia hidrodinâmica de partículas rígidas
Venema et al. [16] explicam que na introdução da cromatografia hidrodinâmica (HDC)
como uma técnica de separação por tamanho nos anos setenta, esta foi experimentada dentro
de pequenos vasos capilares cilíndricos lineares e em colunas empacotadas com partículas
esféricas de 10 µm a 20 µm, Figura 1.2.1.
Figura 1.2.1. Esboço da separação na cromatografia hidrodinâmica num leito granular e num
capilar cilíndrico.
Durante o fluxo de uma solução de polímeros num capilar, sob a influência do
movimento Browniano (movimento, neste caso, dos polímeros devido ao movimento das
moléculas da fase móvel), cada molécula alcançará todas as regiões acessíveis do espaço
capilar durante o seu transporte. Contudo, a região acessível a cada polímero depende do seu
tamanho molecular. Devido à conformação, o polímero pode não atingir a região perto da
Introdução
8
superfície capilar. Por causa do perfil de velocidades do fluxo (perfil parabólico) surgem regiões
inacessíveis onde a velocidade do fluido é baixa e o gradiente de velocidade é alto (próximo da
parede do capilar). Desde que a densidade da “camada esvaziada” dependa do tamanho
molecular, é desenvolvida uma separação: polímeros maiores deslocam-se mais rapidamente
pelo vaso capilar do que os menores. É neste fenómeno que se baseia a cromatografia
hidrodinâmica (HDC), de acordo com Hoagland et al. [17].
A cromatografia hidrodinâmica oferece um método para a separação de polímeros em
solução ou partículas em suspensão com base no seu tamanho. No leito de uma coluna, a
separação ocorre nos canais intra – partículas e a ordem de eluição é de grandes para
pequenos, análogo ao da cromatografia de permeação por gel [18]. A gama dinâmica da
separação depende do tamanho das partículas do leito de empacotamento da coluna.
A aplicação de HDC num capilar para classificação e separação de fibras com partículas
de tamanho da ordem do mícron é descrita por Pascale et al. [19]. Numa experiência com um
tubo de diâmetro de 15 mm e comprimento de 12 m (fluxo laminar) foram separadas
suspensões de fibras de polpa de papel, e partículas micrométricas usadas na produção de
papel como um aditivo. As fibras de celulose têm um comprimento de 0.2 mm a 4 mm e as
micropartículas (CaCO3) têm um tamanho ao redor dos 3 µm. Obtiveram-se os seguintes
resultados para uma velocidade de fluxo 0.112 m/s ( Re ~ 1650): para fibras dispersão axial e
tempo médio de passagem, respectivamente: 18 ± 4 cm2/s e 91± 4 s; para os aditivos 160 ± 80
cm2/s e 107 s; o tempo médio do fluido portador foi também 107 s. A diferença de tempo entre
o pico dos aditivos e das fibras é 8 s.
A HDC tem sido aplicada, com sucesso, para medição e distribuição do tamanho
molecular de polímeros com peso molecular elevado, solúveis em água [17]. A extensão do
método tem sido testada através de experiências com xantano e poliacrilamida hidrolisada. O
xantano é um polissacárido bastante rígido, considerando aqui a macromolécula do
polissacárido xantano tipo – MW = 1.6E+06 [20], a uma concentração de 400 ppm numa
solução de 5 g/L de NaCl, e pH = 7, na forma de bastonetes rígidos com comprimento 1µm, e
largura 2 nm. A separação ocorre durante a convecção do polímero dissolvido pelo volume
intersticial da coluna de cromatografia empacotada com esferas não porosas. Configurações
em não – equilíbrio do polímero são prontamente originadas pelo fluxo complexo através das
esferas. Essas alterações de configuração afectam, fortemente, as medidas do tamanho
molecular. Para maximizar a resolução, a tensão hidrodinâmica deve ser reduzida pelo
emprego de taxas de fluxo extremamente baixas.
Para poliestirenos (polímeros com estrutura aleatória linear) com massas moleculares
altas (104 Da a 107 Da), foi observado por Stegeman et al. [15], que a resolução parece ser
quase independente da velocidade de eluente. As alturas de prato reduzidas foram
observadas, também, por serem quase constantes para velocidades da fase móvel reduzidas
numa gama de 2 –> 150, sendo a velocidade da fase móvel dada por: mp Dud /=ν em que
Introdução
9
pd é o diâmetro das partículas, u é a velocidade de fluxo, e mD é o coeficiente de difusão da
molécula de soluto. A zona de separação dos poliestirenos dissolvidos, em HDC, foi estudada
numa coluna preenchida com partículas não porosas monodispersas de 1.5 µm. Na gama de
velocidade reduzida, de 2 a 150, foram obtidas alturas de prato reduzidas bem abaixo de 2
para amostras de polímero com massas moleculares de 2200, 43 900 e 775 000 Da. Isto
permite separações de polímero a alta velocidade com eficiência elevada.
Supondo que os canais intersticiais numa coluna empacotada podem ser representados
por um conjunto de tubos capilares, foi desenvolvido um modelo para a taxa de migração de
macromoléculas que em seguida foi comparado com dados de eluição experimentais. Foram
investigadas a influência do tamanho e do tipo de macromolécula, a eficácia do solvente e a
velocidade da fase móvel na eluição na HDC. O comportamento da eluição em colunas
empacotadas parece obedecer, basicamente, a teorias de migração simples desenvolvidas
para tubos abertos. As posições relativas do pico na HDC dependem, ligeiramente, da
velocidade de eluente [21].
Esferas não porosas de sílica com tamanhos na gama de 1.4 µm a 2.7 µm foram
utilizadas como empacotamento para a cromatografia hidrodinâmica também no trabalho de
Stegeman et al. [22] com a mesma altura do prato da coluna H . Foi observado que até pesos
moleculares de 10E+06 o comportamento de eluição dos poliestirenos concorda muito bem
com os modelos teóricos existentes. Porém, para poliestirenos maiores a taxa de fluxo mostrou
uma influência nas posições relativas do pico.
De acordo com dados de Gramain e Myard [23] é possível estimar uma razão do
tamanho da molécula com o tamanho do poro λ e uma razão do tamanho da molécula com o
tamanho da partícula pλ . Para um poliestireno de peso molecular 10E+06 o tamanho da
molécula é cerca de 100 nm, consequentemente, para partículas com tamanho no intervalo de
1.4 µm a 2.7 µm, assumindo uma porosidade do empacotamento de 0.36 tem-se,
respectivamente, λ de 0.19 a 0.1 e pλ de 0.07 a 0.037, o que significa a presença de uma
região de difusão não acessível.
Hoagland e Prud´homme [17] usando um enchimento de partículas não porosas numa
coluna demonstraram que a HDC de macromoléculas flexíveis e rígidas fornece medidas do
tamanho molecular que dependem fortemente da taxa de fluxo da coluna. Esta dependência da
taxa de fluxo é explicada por modelos macromoleculares simples em termos de deformação e
orientação num alongamento uniaxial fixo. Numa experiência de HDC, uma pequena
quantidade de uma solução de polímero diluído foi injectada numa coluna empacotada com
esferas de 10 µm a 40 µm. A coluna proporciona uma rede de poros com passagens de fluxo
por interstícios um pouco maiores do que as dimensões de cada molécula (tamanho de poro ~
Introdução
10
3.5 µm a 15 µm, raio do polímero ~ 0.05 µm a 0.5 µm). A técnica de cromatografia
hidrodinâmica acompanha as mudanças da conformação molecular pela taxa de fluxo
dependente dos volumes de eluição das moléculas, que podem sofrer extensão e orientação
através da tensão hidrodinâmica. A indução do alongamento pelo fluxo num polímero flexível,
acontece quando a cadeia é sujeita a forças hidrodinâmicas maiores em magnitude do que as
forças de relaxamento da cadeia, que surgem do movimento de Brown. A força de um fluxo
pode ser, frequentemente, correlacionada com o seu número de Deborah De : a razão das
forças hidrodinâmicas com as forças de Brown.
Só acontece um significativo alongamento molecular em fluxos estacionários para
valores de De elevados, normalmente a partir de De > 0.5. Uma enorme deformação
molecular acontece quando De é maior do que a unidade [17]. Estas deformações
manifestam-se, sobretudo, em quedas de pressão extremamente altas, mesmo medidas para
soluções de concentração baixa de polímero e bombeadas através dos materiais porosos.
No fluxo de soluções de polímeros não esféricos através de meios porosos não são
encontradas quedas de pressão excessivamente elevadas. Contudo, polímeros rígidos com a
forma de bastonete podem ser capazes de se orientar num fluxo elevado [17]. Embora não
provoque efeitos reológicos dramáticos como no caso de polímeros flexíveis, a orientação de
polímeros com forma de bastonete durante o fluxo através de passagens estreitas da coluna
pode também detectar-se como tendo um comportamento do fluxo dependente da eluição.
Estudos muito recentes têm tentado descrever melhor o movimento de polímeros ao
longo do empacotamento de uma coluna de cromatografia hidrodinâmica.
A maioria das teorias de HDC derivou do modelo usado para descrever a migração de
polímeros em vasos capilares abertos, [24], Figura 1.2.2.
Figura 1.2.2. Princípio de separação da HDC, onde uma partícula com raio efectivo effr é
excluída da parede num canal com diâmetro h no qual um perfil de velocidade parabólico
)(yu é aplicado originando uma velocidade máxima [24].
No modelo de retenção, a migração do polímero é descrita pelo valor de retenção τ
como função da razão λ [16, 25].
)21/(1/ 20 λλτ Cttm −+== (Equação 1.2.1)
Introdução
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onde mt é o tempo de migração do polímero, 0t é o tempo de retenção correspondente fracção
de vazios da coluna e λ é o tamanho relativo da molécula definido como:
)2//(hreff=λ (Equação 1.2.2)
em que effr é o raio efectivo da macromolécula e h é o raio do capilar.
O coeficiente C é considerado uma constante para efeitos secundários [16, 24] e varia
entre 0.5 e 5. Para uma exclusão simples num perfil de fluxo parabólico C = ½ [25]. Num leito
empacotado numa coluna de cromatografia hidrodinâmica são recomendados os seguintes
valores de C : 2.698 [26], 2.7 [16], 2.8 [27].
De acordo com a Equação (1.2.1), na HDC todas as macromoléculas vão eluir no
intervalo ~ rV73.0 a rV , onde rV é o volume de eluição de um soluto de tamanho pequeno ou
o volume de espaços vazios do empacotamento.
Venema et al. [27] argumentam que o raio efectivo pode ser calculado a partir do raio de
giração, gr :
geff rr2π
= (Equação 1.2.3)
O raio de giração pode ser determinado, por sua vez, pela sua dependência com a
massa molecular do polímero: b
g aMWr = (Equação 1.2.4)
onde a e b são constantes e MW é a massa molecular.
Num tubo aberto de HDC, a largura do canal é conhecida precisamente e igual ao raio.
Num leito empacotado de HDC, porém, o raio dos canais intersticiais é muito mais difícil de
definir. Nos leitos empacotados o raio do capilar da Equação (1.2.1) pode ser substituído por
um raio efectivo pela representação dos canais intersticiais como uma ordem de tubos
cilíndricos com a mesma razão de volume por superfície. Deste modo o raio de canal efectivo
cr é determinado por [21]:
εε−
=13
pc
dr (Equação 1.2.5)
onde pd é o diâmetro da partícula e ε é a porosidade da coluna .
Para o cálculo do raio do canal efectivo do leito cr , tem que ser conhecida a porosidade
da coluna, ε . Seguindo o exemplo de Venema et al. [16], ao usar a Equação (1.2.5), o raio do
canal efectivo do leito, para partículas com 1 µm foi calculado obtendo-se o valor de 0.213 µm.
Introdução
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A resistência do leito presente numa coluna, ϕ , dá informação se a coluna está bem ou
mal empacotada e pode ser calculada por:
Ld
P p
νηϕ
2
∆= (Equação 1.2.6)
onde η é a viscosidade do solvente (Pa s), ν é a velocidade linear do solvente (mm/s), pd é
o diâmetro da partícula (mm), L é o comprimento da coluna (mm) e P∆ é a queda de pressão
observada (Pa).
Continuando com o exemplo de Venema et al. [16], a coluna empacotada com partículas
de 1 µm tinha um valor de ϕ igual a 382. Para colunas empacotadas com partículas não
porosas um valor de ϕ próximo de 400 é considerado normal. Nesse caso pode então ser
assumido que a coluna está bem empacotada.
Muitas vezes, na HDC nota-se a presença de um pico alargado. Este desenvolvimento
pode dever-se à dispersão causada pela coluna ou polidispersão dos polímeros na amostra.
Pode também ser provocado por factores externos como o volume de injecção e detecção,
tubulação de conexão. Para minimizar os efeitos externos é necessário calcular o volume do
pico dos eluentes.
A importância relativa da HDC pode aumentar em sistemas onde há fracturas ou
caminhos de fluxo preferenciais com taxas de fluxo mais altas. Pode aumentar ainda em
sistemas de meios porosos com partículas menores, como, por exemplo, areia fina.
Recentemente, para macromoléculas rígidas e semi – flexíveis foi mostrado que a HDC
se converte na SC – slalom chromatography.
1.3. Cromatografia slalom
Hoje em dia são utilizados oligonucleótidos sintéticos em muitos processos biológicos
moleculares. Algumas aplicações, como ensaios de determinação do genótipo dependem
fortemente da pureza dos oligonucleótidos. A metodologia de purificação dos oligonucleótidos
continua a estar dependente de técnicas tradicionais de separação como a electroforese em
gel de poliacrilamida (PAGE), ou HPLC no entanto, é possível utilizar outro processo [28].
A cromatografia slalom (SC) foi descoberta independentemente em 1988 por dois
grupos como um novo método de fraccionamento do tamanho de moléculas relativamente
grandes de DNA (> 5000 bases de pares). Uma característica particular desta cromatografia é
que a separação ocorre por um fenómeno hidrodinâmico em vez de um de equilíbrio. Quer isto
dizer que na SC, grandes moléculas de DNA são eluídas muito depois das pequenas, e que o
grau de retardamento de DNA é afectado, de modo significativo, por vários factores
Introdução
13
hidrodinâmicos como o tamanho das partículas do empacotamento, a taxa de fluxo, a
viscosidade e a temperatura do solvente. Pelo contrário, factores químicos como a natureza e o
tamanho dos poros do empacotamento, assim como a hidrofobicidade do solvente, não têm um
efeito crítico [29].
A principal vantagem da SC é a rapidez e simplicidade do procedimento experimental.
Pode ser executada pela introdução de soluções de DNA num sistema convencional de HPLC
(por exemplo), onde uma separação de DNA rápida, sensível e reprodutível pode ser
automatizada, não sendo necessária a extracção de DNA do gel [29]. A separação baseia-se
no facto de que moléculas longas de DNA (5000 a 50000 bp) têm de se desviar na sua
passagem através dos canais estreitos e tortuosos entre as partículas do empacotamento,
Figura 1.3.1. Quanto mais longa é a molécula de DNA mais difícil é a sua passagem pelos
interstícios [10].
Figura 1.3.1. Princípio da cromatografia slalom [10].
Para modelar o movimento de uma molécula de DNA no interior de uma coluna SC
André e Guillaume [28] definiram o parâmetro, τ , denominado tempo de retenção relativo.
Esse parâmetro é dado pela equação:
( )∞=
tut )(τ (Equação 1.3.1)
sendo )(ut o tempo de migração do DNA à velocidade u da fase móvel e )(∞t o tempo de
retenção quando a molécula está completamente “esticada”. A variável u é equivalente à
variável F (mL/min).
Segundo os autores τ pode ser também dado por: ')1( τψτ +−+= − Eue Eu (Equação 1.3.2)
onde ψ é uma constante empírica que depende de algumas características geométricas do
fragmento de DNA. 'τ é o valor de τ para o valor de velocidade mais baixo da fase móvel
(para este valor a fracção de estiramento do fragmento de DNA →0), E é a constante da
equação:
( )porporEdu
dporx −= . (Equação 1.3.3)
Introdução
14
em que por é o número de poros (ou segmentos) ocupados pela cadeia de DNA. Quando
∞por tem-se o número de poros ocupados pela cadeia de DNA no ponto máximo de
estiramento.
A viabilidade da Equação 1.3.2 no estudo de “rastejamento” de proteínas é analisada no
trabalho exposto por André e Guillaume [28]. Para conseguir este objectivo experimentou-se a
migração de diferentes proteínas numa fase estacionária do tipo C1 (diâmetro das partículas de
enchimento igual a 5 µm) sobre um largo intervalo da taxa de fluxo e da viscosidade da fase
móvel. Sujeitou-se cada uma das proteínas – soro de albumina humana (HSA), soro de
albumina bovina (BSA) e soro de albumina de galinha (CSA) – a separações com diferentes
taxas de fluxo e distintas viscosidades da fase móvel (com glicerol). Partindo dos valores do
tempo de retenção calcularam-se os coeficientes E para cada taxa de fluxo e cada
viscosidade. Verifica-se que na dependência de E com a velocidade do líquido houve uma
interrupção para o valor crítico da taxa de fluxo da fase móvel ( cF ). Para valores baixos da
velocidade da fase móvel ( F < cF ) o valor E mostrou-se desprezável e relativamente
constante ( E ≈ 0), o que significa que a estrutura da proteína se encontrava na forma de “rolo
aleatório”, que é uma estrutura compacta (neste domínioτ → 'τ , comportamento de retenção
hidrodinâmico).
A Figura 1.3.2a. mostra o cromatograma para a separação das três proteínas
analisadas a 0.06 mL/min e com uma viscosidade da fase móvel de 1.17.
Figura 1.3.2a. Figura 1.3.2b.
Figura 1.3.2a. Cromatograma para a HSA, 1, BSA, 2 e CSA, 3, no caso em que F = 0.06
mL/min e a viscosidade da fase móvel µ = 1.17, [28].
Figura 1.3.2b. Curva de cF versus viscosidade para a proteína HSA, [28].
Acima de cF , E aumenta visivelmente, perto ou abaixo de cF o valor de E permanece
relativamente constante. Este resultado confirma o facto que, neste domínio, a estrutura da
proteína começou a perder a sua rigidez e migrou através do empacotamento seguindo numa
forma mais ou menos curvada (distinta uma partícula esférica) pelo modo cromatográfico de
slalom. Nesta gama, para um valor constante de F , o valor de E aumenta com o aumento da
viscosidade da fase móvel. Isto confirma que a viscosidade actua na estrutura da proteína
através de um aumento da sua extensão quando a viscosidade da fase móvel aumenta. A uma
µ
Introdução
15
gama de viscosidades de 1.09 a 1.25 cp, para a proteína HSA, traçando cF versus µ obtém-
se, sempre, um comportamento linear, originando a equação µ15.498.5 −=cF , com um
coeficiente de correlação 989,02 =r (Figura 1.3.2b.). A diminuição de cF é observada em
relação à viscosidade o que mostra uma grande dependência do alongamento da molécula
com a velocidade da fase móvel para os valores mais elevados de viscosidade da fase móvel.
André e Guillaume [28] testaram também as possibilidades de aumentar as capacidades
de fraccionamento da cromatografia slalom. Foram separadas moléculas de DNA de dois tipos:
fragmentos lineares e plasmídeos, que são fragmentos circulares de DNA. Fez-se variar a
composição da fase móvel, pela adição, em separado, de três agentes de compactação a
várias concentrações. As moléculas a separar foram ainda sujeitas a diferentes taxas de
velocidade da fase móvel. Nessas condições observou-se uma diferença no comportamento do
DNA circular e linear que é, potencialmente, muito útil, por exemplo, pelo facto do DNA
genómico linear ser uma contaminação relevante na preparação de plasmídeos.
André e Guillaume [28] concluem, então, que o movimento das moléculas de DNA na
SC é extremamente dependente do alongamento das mesmas. Além disso, agentes de
compactação distintos têm distintos efeitos em moléculas de DNA circulares e lineares,
podendo a SC ser aplicada na sua separação.
Peyrin et al. [30] consideraram a hipótese dos mecanismos de SC e HDC poderem ser
relacionados e alcançados, em simultâneo, no mesmo sistema cromatográfico, em relação às
propriedades elásticas de polímeros flexíveis. Em geral, esperavam que o princípio de
fraccionamento da cromatografia hidrodinâmica fosse preponderante se o polímero estivesse
na forma esférica, enquanto o fenómeno slalom governasse a separação quando ocorresse a
deformação de macromoléculas (elongação da forma).
A teoria destes autores adquire mais sentido sabendo que a forma circular de uma
molécula de DNA tem uma estrutura mais compacta do que o correspondente fragmento linear
(por exemplo, o plasmídeo super – enrolado pGem 1 (3.73 kbp) tem um raio de giração gr igual
a 82 nm e o raio de giração calculado para a forma linear foi de 145 nm), e que uma cadeia
dupla e linear de DNA pode apresentar uma grande variedade de formas.
Para fragmentos entre 20 a 1000 bp, a forma da molécula de DNA é aproximada à de
um bacilo e consequentemente, o mecanismo HDC não pode ser aplicado. Por outro lado,
fragmentos superiores a 2 kbp podem ser tratados como uma estrutura aleatória enrolada em
esfera. Note-se, contudo, que as propriedades elásticas de moléculas de dupla cadeia de DNA
são diferentes das dos polímeros sintéticos como os poliestirenos, classicamente separados
por HDC. Assim, para demonstrarem a esperada transição SC ↔ HDC, os autores testaram o
comportamento cromatográfico de ácidos nucleicos que possuem uma forma aleatória com um
certo grau de consolidação, como uma molécula “super – enrolada” (supercoiled) circular de
cadeia dupla de DNA.
Introdução
16
Os resultados alcançados por Peyrin et al. [30] vieram confirmar a hipótese formulada,
de que pode haver transição entre os regimes de migração HDC e SC. A preponderância
relativa de um dos dois mecanismos é dependente tanto da taxa de fluxo do eluente como da
flexibilidade do polímero, ou seja, da forma da macromolécula.
1.4. Meios Porosos – fundamentos teóricos
Diz-se que um meio poroso é homogéneo quando a resistência ao escoamento é a
mesma em qualquer ponto e segundo uma direcção. A homogeneidade é relativa e depende
das dimensões intrínsecas dos materiais. Um solo com grãos milimétricos será homogéneo em
relação a um valor de escala compatível, como por exemplo 1 dm3. Já um maciço rochoso será
homogéneo se considerarmos um valor de escala muito maior [31].
Quando a resistência ao escoamento é igual em todas as direcções o meio poroso pode
considerar-se isotrópico. A grande maioria dos meios porosos naturais não são isotrópicos, são
anisotrópicos. Anisotrópico diz-se de um corpo fisicamente homogéneo, mas cujos valores de
certas propriedades físicas e químicas variam com a direcção. Os corpos cristalizados são
geralmente anisotrópicos [32].
Apesar da anisotropia os meios porosos podem considerar-se homogéneos desde que
se estabeleça uma escala de homogeneidade compatível com as respectivas dimensões [31].
Existem várias formas de descrever meios porosos e os fenómenos de transferência de
massa associados, neles ocorridos. Normalmente, as duas maiores prioridades consideradas
são o coeficiente de difusividade efectiva (fenómeno de transferência de massa) e o coeficiente
de permeabilidade (fenómeno de fluxo). A previsão e o controlo da difusividade efectiva ou da
permeabilidade de leitos compactos com misturas de partículas, são importantes para
processos tais como: catálise com sedimentação, imobilização de células em matrizes porosas,
cromatografia e biofilmes, entre outros.
Estes dois coeficientes são funções características dos meios porosos, nomeadamente
da porosidade e da tortuosidade.
O coeficiente de difusividade efectiva ( eD ), que caracteriza a transferência de massa
nos meios porosos, é definido por:
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛×=τε
0DDe (Equação 1.4.1)
em que 0D é o coeficiente de difusividade no seio do meio, ε é a porosidade e τ é a tortuosidade [33].
Introdução
17
Em operações unitárias de processos industriais que envolvam o uso de leitos fixos
porosos, é essencial conhecer o coeficiente de permeabilidade do leito ( k ), para relacionar a
velocidade de fluxo do fluido com o gradiente de pressão. De acordo com a bem conhecida
equação de Carman – Kozeny:
( ) LP
Kd
u p
µεε ∆−
= 2
3
136 (Equação 1.4.2)
onde u representa a velocidade do fluido, P∆ é a queda de pressão através do meio, µ é a
viscosidade do fluido, e L é o comprimento do leito. Para um leito de partículas esféricas o
coeficiente de permeabilidade k (m2) depende do diâmetro das partículas pd , da porosidade
ε e da tortuosidade τ .
( ) 02
22
2
23
)1(36136 Kd
K
dk pp
×−×
××⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛=
−××
×=
εε
τε
ε
ε (Equação 1.4.3)
onde o coeficiente de Kozeny ( K ) é dado por 20 τ×= KK . Para leitos granulares K = 4,2-5.
0K é o coeficiente de forma de Kozeny e depende da forma da secção transversal do poro
(para um poro cilíndrico 0K = 2) [34].
Como se pode verificar, a difusividade efectiva e a permeabilidade dependem,
respectivamente, de τε
e 2
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛τε
. Embora tenha sido feito um grande esforço para se estudar
especificamente os meios porosos, a relação entre porosidade, tortuosidade e a distribuição do
tamanho das partículas que constituem o meio, é ainda uma questão em aberto.
Outro aspecto pertinente tem a ver com o facto de, apesar de muitas vezes a forma das
moléculas dos bacilos e outras espécies lineares ser aproximada à de uma esfera, estes
comportam – se, numa separação cromatográfica, de maneira diferente.
A difusão de macromoléculas ou o fluxo de nanopartículas num meio poroso é
acompanhada por efeitos relacionados com a topologia de poros e a natureza da
nanopartícula; alguns factores de interacção são apresentados de imediato:
-relação do tamanho da nanopartícula para o tamanho de poro ou efeito de obstáculo;
-efeito de constrição como uma mudança dramática na área de corte transversal do
poro. Tanto para bastonetes rígidos como para nanopartículas a constrição funciona como um
factor de ordenação de orientação axial;
-tortuosidade ao longo do canal na forma de curvas;
-viscoelasticidade como um produto da geometria do poro, natureza da nanopartícula
como também das condições de fluxo.
Vão aprofundar-se, seguidamente, alguns dos aspectos atrás referidos.
Introdução
18
1.4.1. Porosidade
A porosidade é uma das propriedades mais básicas de um meio poroso [35]. Pode ser
definida como a razão do volume de espaços vazios ( eV ) pelo volume total ( TV ), como se
encontra explicado na Figura 1.4.1. e descrito na Equação (1.4.4).
Figura 1.4.1. Porosidade. Os espaços em branco entre as partículas esféricas constituem os
espaços vazios.
TVVe
=ε (Equação 1.4.4)
Em muitos estudos constatou-se que a porosidade de leitos compostos por misturas de
partículas está dependente da forma como os leitos são formados. Devido à natureza aleatória das misturas de partículas esféricas assim como aos
diferentes métodos de obtenção dos empacotamentos, estes exibem uma oscilação do valor da
porosidade, mesmo em misturas monocomponente [36, 37].
Recorrendo a processos de empacotamento de esferas adequados, estes podem
demonstrar características regulares ou aleatórias [38]. A cada tipo de empacotamento regular
corresponde um número de coordenação, cN , bem definido, representando este o número de
pontos de contacto de cada esfera com as esferas vizinhas.
Dependendo do processo de construção do leito, podem ser obtidos dois tipos de
empacotamento aleatório [37]: empacotamento do tipo denso e folgado. No empacotamento
denso, o número médio de pontos de contacto ( cN ) com as esferas vizinhas é superior ao
existente no empacotamento do tipo folgado. O empacotamento denso poder-se-á obter a
partir do empacotamento aleatório do tipo folgado, por compactação posterior do leito [37].
Os efeitos de parede observam-se quando o diâmetro das partículas é próximo do
diâmetro da coluna utilizada para a construção do leito e são desprezáveis quando o diâmetro
da coluna é pelo menos dez vezes superior ao diâmetro das partículas [34]. Este efeito deve-se
à formação de um empacotamento ordenado junto às paredes da coluna [37].
Nas zonas em que os efeitos de parede são desprezáveis, os valores de porosidade
típicos para misturas monocomponente do tipo folgado situa-se no intervalo 0.4 a 0.42,
enquanto para o empacotamento do tipo denso esse intervalo é de, aproximadamente, 0.36 a
0.38 [37].
Introdução
19
Em misturas multicomponente, a porosidade da mistura depende dos tamanhos das
partículas que compõe o leito, da porosidade inicial dos componentes, da composição da
mistura e do tipo de empacotamento [33].
Yu e Standish [35] definiram dois mecanismos de construção de leitos para misturas
binárias de partículas esféricas. Um mecanismo denomina-se por enchimento, onde a adição
de um componente ao segundo, não altera o esqueleto ou o número de pontos de contacto das
partículas do último. Este, denominado por componente controlador, terá na mistura a mesma
porosidade enquanto puro. O segundo mecanismo designa-se por ocupação ou mistura,
resultando da introdução de um componente, a alteração do esqueleto formado pelas
partículas do outro. Existem nesta zona, interacções entre as partículas de diferente tamanho,
sendo os dois componentes controlador do sistema.
Os autores referem ainda que estas duas zonas se encontram dos dois lados de um
valor de rácio crítico, cδ = 0.154, entre os tamanhos das partículas do sistema binário. O
mecanismo de enchimento ocorrerá em larga extensão para um valor de rácio
154,0≤=Dd
cδ em que d e D são, respectivamente, os diâmetros das partículas de menor
e maior dimensão no empacotamento. O mecanismo de ocupação ocorre em grande extensão
para um rácio δ > 0.154.
Para o caso extremo de δ = 0 a porosidade de um sistema binário de partículas
esféricas pode ser definida por [35, 39]:
( )Dd
dD
xx
0
0
11
εε
ε−−
= Dx ∈ [0, minDx ] (Equação 1.4.5)
D
D
x
011 εε
−−= Dx ∈ [ minDx , 1] (Equação 1.4.6)
em que a porosidade mínima 00Ddεεε = ocorre para uma fracção volúmica de partículas de
maior dimensão, minDx :
00
0
min 11
Dd
DDx
εεε
−−
= (Equação 1.4.7)
0dε e 0
Dε são, respectivamente, a porosidade dos leitos monocomponentes das partículas de
maior e menor dimensão.
A porosidade é representada neste modelo por dois ramos (Figura 1.4.2.). O ramo
direito, Equação (1.4.6), encontra-se enriquecido com partículas de maior dimensão, formando
estas um esqueleto com porosidade 0Dε . Este esqueleto mantém-se inalterado com a adição
de partículas de menor dimensão até se atingir o ponto ( minDx , minε ).
Introdução
20
Adições de partículas de menor dimensão para além deste ponto afastam as partículas
maiores, destruindo o esqueleto das mesmas. Entra-se deste modo no ramo esquerdo do
modelo, Equação (1.4.5), rico em partículas menores, encontrando-se estas agrupadas com
porosidade 0dε .
Admitindo 0dε e 0
Dε igual a 0.4, virá por (1.4.7), minDx = 0.71, e por 00min Dd εεε = ,
minε = 0.16. Na Figura 1.4.2., a intersecção dos dois ramos representa o ponto (0.71; 0,16).
Figura 1.4.2. Representação da Equação 1.4.5 e 1.4.6 para 0dε e 0
Dε iguais a 0.4, em que o
tracejado representa o ramo esquerdo e a linha cheia traduz o ramo direito. Diferindo δ de zero haverá que introduzir funções de correcção no modelo anterior, o
que foi feito por Tokumitsu em 1964 [39]. Para uma mistura enriquecida com partículas de
pequena dimensão, a Equação (1.4.5) originou:
( )( )( )0
0
1111
dD
dD
xx
εφε
ε−−−
−= (Equação 1.4.8)
onde ( )δφ cf+= 1 e cf = 1,0 para δ = 0.5; cf = 1.2 para δ = 0,25; cf = 1.4 quando δ ≤ 0,25.
Para uma mistura enriquecida com partículas de maior dimensão, (1.4.6) deu origem a:
( )3
0
111
csD
D
x ββε
ε+−
−= (Equação 1.4.9)
onde rs δβ = , 2/1=r para partículas esféricas e 1113 −
−+=
D
Dc x
xβ
As porosidades obtidas por (1.4.8) e (1.4.9) são ligeiramente superiores às calculadas
por (1.4.5) e (1.4.6).
Introdução
21
1.4.2. Tortuosidade
A tortuosidade dos meios porosos é o único parâmetro de composição dos meios
porosos capaz de reflectir a anisotropia do material e não pode ser incluída ou comparada
directamente com medições experimentais [40].
A tortuosidade é classicamente definida por:
LLe=τ (Equação 1.4.10)
onde eL é o comprimento realmente atravessado pelo fluido através do meio poroso e L o
comprimento do leito na direcção macroscópica do fluxo [40].
O caso mais simples é considerado um meio poroso composto por um feixe de
capilares.
O caso da tortuosidade de poros curvos difere do anterior pela curvatura dos canais do
poro. Neste caso, τ aumenta com o aumento do comprimento do poro, devido ao aumento de
eL . O aumento do comprimento do poro implica o aumento correspondente da difusão no
percurso das moléculas difusionais. Usualmente para este tipo de poro, não é válida a
condição de diâmetro de poro constante ou secção transversal constante. O perfil de corrente
de fluxo não é equidistante. Com poros curvos os efeitos de inércia e de constrição podem-se
tornar significativos para a difusão macromolecular [40].
A tortuosidade e a composição do meio são relacionadas, usualmente recorrendo à
porosidade. Mota et al. [41] estudaram misturas binárias de partículas esféricas com δ = 0,1,
ondeδ é a razão dos diâmetros entre as partículas de menor dimensão e partículas de maior
dimensão em misturas binárias. Nas suas experiências encontraram valores experimentais de
tortuosidade entre, aproximadamente, 1,45 e 1,71, variando a porosidade aproximadamente
entre 0,4 e 0,26, respectivamente.
Os dados sobre a tortuosidade para o mesmo tipo de meios porosos são um pouco
dispersos, encontrando-se na literatura valores que variam entre 1,4 e 4. Tal dispersão é
devida ao facto da tortuosidade não poder ser encarada como uma constante física,
dependendo de outras características do meio poroso para além da porosidade, como a
homogeneidade do mesmo, processo de empacotamento, diâmetro dos poros e forma dos
canais. A tortuosidade, relativamente à porosidade, é antes uma função complexa de vários
factores. A compressão ou expansão do meio, deposição de partículas ou macromoléculas no
interior dos canais e o tipo de materiais a ser transferido (percolação) poderão influenciar o
valor de tortuosidade obtido, sendo que a tortuosidade determinada para a difusão de um gás e
para a difusão de macromoléculas no mesmo meio poroso, poderá ser diferente [42].
Significa isto que, como tem sido dado a entender, a interpretação da tortuosidade
clássica é uma abordagem simplificada, não sendo sempre válida [42]. Uma análise mais
Introdução
22
detalhada mostra que esta definição não se aplica a todos os casos, uma vez que podem ser
encontrados muitos caminhos com o mesmo comprimento L e eL , mas diferentes
tortuosidades. Os seguintes exemplos explicam a ideia:
Figura 1.4.3. Trajectórias com o mesmo comprimento L e eL e diferente número de
curvaturas [41].
De facto, considerando os quatro caminhos acima ilustrados, é fácil perceber que cada
um, de A a D, tem o mesmo comprimento total ( eL ), assim como a mesma espessura do meio
( L ) (os pontos de partida e chegada estão na mesma posição nos vários casos). Contudo, o
número de curvas aumenta de dois em A para oito em D dando, desse modo, origem a um
aumento na tortuosidade da esquerda para a direita.
Assim, para melhor descrever e estimar a tortuosidade terá de ser levada em conta a
configuração dos poros [42].
Podem ser encontrados vários tipos de configurações para poros:
-poros com simetria recta e uma área de secção transversal variável. Embora o poro
tenha um comprimento igual à espessura do meio poroso, o percurso médio de uma molécula
ou corrente não é igual à espessura do meio. Neste caso, os poros podem ser caracterizados
pela razão entre os diâmetros maior e menor, pela área de secção transversal, ou pela
trajectória mais baixa da corrente. Para este tipo de poro, podem ser esperados vários tipos de
efeitos: inércia, constrição relativa às trajectórias de curva, constrição relativa a uma mudança
da área de secção transversal do poro.
-curvas simétricas dos poros com área de secção transversal variável. A curvatura do
poro aumenta os dois primeiros efeitos descritos anteriormente.
-poros encrespados (frisados). Neste caso, um novo efeito caracterizado pela
amplitude e frequência dos frisos, é adicionado aos efeitos mencionados anteriormente. O tipo
de poros com frisos regulares é obtido se a frequência das curvas da parede do poro aumentar;
-poros com canais aleatórios. É o tipo de poro mais complicado, com as paredes do
canal a assumirem configurações aleatórias e com uma variação casual do comprimento do
canal [42].
Algumas conclusões gerais podem ser colocadas em evidência:
-a tortuosidade é evidente ou latente em todos os modelos de transferência de massa
em meios porosos;
-a tortuosidade não é uma constante física e depende em primeiro lugar das
características do meio poroso, tais como porosidade, diâmetro do poro, forma do canal, etc.;
A B C D
Introdução
23
-a tortuosidade depende muitas vezes de processos que ocorrem durante a
transferência de massa tais como: compressão ou expansão do meio poroso; fenómeno de
deposição de partículas ou macromoléculas dentro do canal do poro até à base do poro;
-a tortuosidade depende também do tipo de material que está a ser transferido
(fenómeno de percolação). Por exemplo, a tortuosidade determinada por difusão de gás e por
difusão macromolecular através de alguns meios porosos, pode ser diferente.
Para um melhor entendimento do impacto da tortuosidade na transferência de massa e
em processos de separação, tratando-se de um problema bastante complexo, é necessário
investigar modelos de meios porosos mais simples. Nesse contexto deve ser considerado o
estudo de leitos de misturas binárias e ternárias de partículas esféricas.
Em misturas binárias de partículas esféricas, Mota et al. [44] representaram a
tortuosidade total, τ , por duas componentes. A primeira, denominada por macro –
tortuosidade, Dτ , é gerada pelos vazios do esqueleto das partículas de maior dimensão. A
segunda representa a tortuosidade gerada pelas partículas de menor dimensão que se
encontram agrupadas no interior do esqueleto das partículas de maior dimensão, sendo
denominada por micro – tortuosidade, dτ .
A tortuosidade total é dada pelo produto da macro e micro – tortuosidade. Este conceito
é estendido a misturas ternárias, surgindo adicionalmente a componente da tortuosidade
gerada pelas partículas de tamanho intermédio, Mτ
Para valores bastante pequenos de δ , e dado que as partículas são esféricas, os
autores propuseram para a região da máxima tortuosidade que Dτ ≈ dτ ≈ 0τ (sistemas
binários) e Dτ ≈ Mτ ≈ dτ ≈ 0τ (sistemas ternários), sendo 0τ a tortuosidade dos
componentes puros e considerada igual para todos os componentes. Previram assim uma
tortuosidade máxima total em sistemas binários e ternários igual a 20τ e 3
0τ , respectivamente.
A influência da tortuosidade no movimento de macromoléculas em meios porosos tem
sido menos investigada que outros factores, como por exemplo, a relação do tamanho da
nanopartícula para o tamanho do poro ou efeito de obstáculo.
Em geral, o factor de tortuosidade combina o percurso percorrido com o factor forma do
canal do poro. Pode-se especular que um caminho tortuoso com condições apropriadas para
um objecto em forma de bastonete cria algum impulso de desordem. Este facto pode reduzir a
velocidade de fluxo do bastonete ou nanopartícula, em comparação com partículas esféricas
de peso semelhante. A partir deste ponto é legítimo colocar a hipótese de que nanopartículas
lineares se movem de modo mais lento do que as esféricas, nas mesmas condições. Este
fenómeno pode ser interessante para processos de bio – separação; sistema de entrega de
medicamentos no sangue, filtração em leitos profundos; movimento de nanopartículas (vírus,
etc.) em meios porosos.
Parece que a tortuosidade, gerada através das bandas do poro, é preferível a outros
factores de tortuosidade como mudar de área de corte transversal do poro, aspereza da parede
Introdução
24
do poro e assim por diante. Na Figura 1.4.4. o esboço do movimento de uma partícula em
forma de bacilo num canal tortuoso é mostrado.
Figura 1.4.4. Meios porosos, preferencialmente, não devem ser super tortuosos mas super
dobrados na maior escala do comprimento da macromolécula.
Cada vez que uma partícula linear rígida atravessa o canal de um poro com a forma de
curva, isto provoca alterações como o aparecimento do factor de desordem das linhas de fluxo
de orientação axial. O movimento de nanopartículas nos canais dos poros pode ser
considerado como um regime de "slalom" onde o efeito de retardamento principal é a força de
fricção quando a partícula passa a região da curva com mudança de orientação no espaço.
A orientação mais "lucrativa" de partículas com a forma linear é ao longo da linha de
fluxo (A) ou do gradiente da força motora (B). Na região da curva as linhas de fluxo e as
principais direcções do eixo da partícula são desviadas: partículas como os bacilos expõem
uma maior área de corte transversal que aumenta a força de fricção e resulta no fenómeno de
retardamento.
Se for assumido que o empacotamento consiste em partículas esféricas de tamanho
pd e que a tortuosidade nos canais dos poros afecta o fluxo de nanopartículas pelo meio de
curvas, Figura 1.4.5., então pode-se calcular o número de saltos.
Figura 1.4.5. Canais dos poros.
O parâmetro de escala do empacotamento pode ser escolhido como sendo igual ao
tamanho da partícula pd . Ippolito et al. [43] executaram um estudo experimental das
propriedades de dispersão de partículas esféricas individuais de tamanho d , movendo-se sob
gravidade num empacotamento aleatório seco de esferas grandes de tamanho pd . A razão
dos diâmetros pdd / situava-se abaixo do valor crítico 0.1547 sobre o qual as esferas mais
pequenas ficam empilhadas dentro do empacotamento. Foi descoberta difusão em paralelo e
Introdução
25
transversal às direcções de velocidade média sendo governada, essencialmente, pelo diâmetro
pd de esferas acumuladas e não pelo tamanho d das partículas pequenas móveis.
Outra condição de limite deve ser relacionada com a nanopartícula e a razão do
tamanho da molécula com o tamanho do poro, pavmol dd /=λ , já descrita atrás. A razão λ
deve estar no intervalo onde se possa evitar a difusão interior completamente desenvolvida
mas o comprimento da macromolécula esteja na mesma escala que o tamanho do poro.
Se H é a espessura do leito e a tortuosidade do caminho “comum”, de comprimento eL
é HLe /=τ , então o número de curvas bn vem dado por:
ppeb dHdLn // ⋅== τ (Equação 1.4.11)
Por exemplo, num empacotamento com apenas um tipo de esferas com H = 0.3 m
(assumindo que τ = 1.4), e pd = 12.33 µm o número de curvas é bn = 3.4E+04; para pd =
4.9 µm o número de curvas é bn = 8.6E+04.
O número de curvas pode ser aumentado com a aplicação de um leito com uma mistura
de partículas segundo Mota et al. [34]. Como foi referido anteriormente, os mesmos autores
consideram que para uma mistura binária de partículas com tamanho, significativamente,
diferente, a tortuosidade total do leito τ torna-se o produto da micro e macro – tortuosidade dτ
e Dτ , respectivamente, [34, 44, 45], ou seja, Dd τττ ⋅= . A fórmula (1.4.11) para
empacotamentos binários, nesse caso, pode ser escrita como:
dH
dHn Dd
pb τττ ⋅== (Equação 1.4.12)
A macro – tortuosidade Dτ (fracção de partículas grandes de tamanho D ) aumenta o
comprimento do caminho pela coluna, enquanto a micro – tortuosidade dτ (fracção de
partículas de tamanho d ) é responsável por um aumento do número de curvas por unidade de
comprimento de poro ou espessura de leito. Agora para H = 0.3 m e pdd = = 12.33 µm o
número de curvas pode ser escrito como bn = 2.5E+04 τ⋅ . Para uma razão grande de
partículas de tamanho maior ( ≥dD / 10 e até 15) é possível assumir um empacotamento de
esferas binárias Dd ττ = = 1.45 e, finalmente, a tortuosidade total do empacotamento é igual a
τ = 1.452 = 2.1, que dá origem a )(binarybn = 5.1E+04.
Mais efectivo, do ponto da tortuosidade, é a aplicação de partículas de tamanho e forma
conhecida como a fracção de partículas de tamanho pequeno, que permite obter uma maior
tortuosidade global.
Introdução
26
1.5. Construção de meios porosos
1.5.1. Tipos de meios porosos usados em cromatografia
Na cromatografia são aplicados dois tipos principais de empacotamento: bi – porosos e
mono – porosos. Os leitos bi – porosos são constituídos por partículas microporosas enquanto
os leitos mono – porosos são formados por partículas não porosas.
Os empacotamentos bi – porosos são, extensamente, usados, por exemplo, no gel da
cromatografia de exclusão molecular (SEC) onde, dependendo do tamanho das moléculas a
separar, são usadas partículas micro ou macroporosas [46]. Para melhorar a separação de
proteínas é desenvolvida uma fase estacionária com grandes poros. Por exemplo, o gel
Sephacryl S-1000 Superfine fornece um limite de exclusão da partícula tão alto quanto 300 nm
a 400 nm [14]. Com base em experiências para partículas macroporosas, Pfeiffer e os seus
colaboradores [47], descobriram que uma estrutura intra – partículas não se comporta como
um leito de microesferas uniformemente acumuladas, mas como uma assembleia não
homogénea de micropartículas. Formalmente, pode-se considerar este leito como um
empacotamento de micropartículas soltas com algum grau de agregação.
O problema mencionado, acima, pode ser solucionado, parcialmente, com a aplicação
de partículas não porosas cobertas por microesferas finas, ficando o empacotamento com uma
estrutura aproximada à de um empacotamento binário de partículas grandes e pequenas não
porosas.
A investigação de processos incluindo o fluxo através de grandes poros, indica que o
efeito máximo de convecção só pode ser alcançado se tudo o que estiver presente na fase
móvel for forçado a fluir através do meio poroso [47]. Há dois modos de levar a cabo esta
condição: usando meios porosos monolíticos (estrutura homogénea) ou aplicando partículas
não porosas. No primeiro caso o problema do controlo da tortuosidade é eliminado. No
segundo é necessário reunir as condições para construir um empacotamento com uma
distribuição do tamanho dos poros estreita.
Um exemplo de aplicação material fibroso para a fase estacionária é dado no trabalho
de Hamaker et al. [48]. As fibras que compõem a fase estacionária têm uma estrutura,
relativamente, não porosa que minimiza o efeito de difusão do poro.
1.5.2. Empacotamento binário com propriedades controladas
Partindo da determinação do coeficiente de permeabilidade k , do coeficiente de Kozeny
K e da tortuosidade média τ , Mota et al. [34, 42] estudaram o efeito de Dx , a fracção
volúmica de partículas esféricas de maior dimensão e de ε , a porosidade de leitos de mistura,
na permeabilidade e na tortuosidade.
Introdução
27
Em geral, num empacotamento binário ε , pavd e τ dependem de Dx , pelo que pode
ser escrito que [42]:
( )( )( ) ( )( )22
0
23
136 ετεε
−=
Kxd
k Dav (Equação 1.5.1)
sendo avd o diâmetro médio das partículas da mistura e dado por [34]:
dx
Dx
dDD
av
)1(1 −+= (Equação 1.5.2)
Por vários raciocínios chega-se à conclusão de que [34]:
Figura 2.2.2. Dependência dos dados experimentais (círculo) e previstos (curva) da porosidade
ε do empacotamento binário com a fracção volúmica de partículas esféricas de maior
dimensão, Dx . A curva foi determinada pela Equação 1.5.3 para 1.0/ == Ddδ e 0ε = 0.383.
A representação do tamanho dos poros quando a porosidade é função do conteúdo
fraccionário do empacotamento )( Dxεε = de acordo a Equação 1.5.2. dá origem à Figura
2.2.3.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
30
40
50
60
70
80
90
100
d pav, µ
m
x D
d = 59µm
Leito da coluna
Figura 2.2.3. Variação dos dados experimentais (círculo) e previstos (curva) do tamanho dos
poros do empacotamento, pavd , com a fracção volúmica de partículas esféricas de maior
dimensão, Dx . pavd foi estimado pela Equação 1.5.2., sendo 1.0/ == Ddδ e 0ε = 0.383.
A Dx = 0.7 o tamanho médio dos poros é maior do que no empacotamento de
partículas de menor tamanho, assim como a tortuosidade dos poros do empacotamento binário
≈= 4.0/1 ετ 1.81 é maior comparativamente com o valor de 1.47 para o empacotamento de
partículas de tamanho pequeno, d .
A influência da fracção volúmica das partículas de maior tamanho na permeabilidade, de
acordo com o modelo de Mota et al. [34], representado atrás pela Equação 1.5.1. e assumindo
Materiais e Métodos
39
que a tortuosidade é dada por 4.0/1 ετ = leva à construção de um gráfico como o apresentado
na Figura 2.2.4. Como é possível verificar na curva 4, a permeabilidade do empacotamento binário
usado nas experiências, em que a porosidade do empacotamento a Dx = 0.7 é cerca de ε ~
0.227, está perto da do leito de partículas menor dimensão d .
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
1E-4
1E-3
5 4 3 2 1
1 - D / d = 22 - D / d = 3.333 - D / d = 6.44 - D / d = 105 - D / d = 20
k*10
6 , m2
x D Figura 2.2.4. Dependência da permeabilidade k com a fracção volúmica de partículas
esféricas de maior dimensão, Dx , para diferentes razões de partículas dD / , baseada no
modelo da Equação 1.5.1. O círculo corresponde à situação experimental em que
1.0/ == Ddδ e 0ε = 0.383. Nas diferentes curvas, por simplicidade, a porosidade 0ε = 0.4
foi assumida em todas as funções de 1 a 5.
Estas observações vêm evidenciar e “provar” a utilização de um empacotamento binário
com Dx = 0.7 e uma fracção dD / = 10.
2.3. Crescimento de Lactobacillus bulgaricus
Em termos microbiológicos, no iogurte destacam-se bactérias das espécies
Streptococcus termophillus e Lactobacillus bulgaricus. Como os próprios nomes indicam, as
primeiras têm forma esférica ou ovóide (diâmetro de 0.5 µm a 2.0 µm), as segundas forma de
bastonete (com comprimento 1.0 µm a 10.0 µm e altura 0.5 µm a 1.2 µm) [58].
No início da investigação tentaram-se isolar Lactobacillus bulgaricus a partir do iogurte,
de acordo com o protocolo da disciplina de Microbiologia Aplicada de Neves [59] apresentado
no Apêndice A.
A forma dos principais microrganismos da flora do iogurte é diferente, no entanto, na
análise microscópica verificou-se sempre um domínio dos cocos. Juntando este factor ao facto
das dimensões serem aproximadas e o facto de ambos corarem de violeta na coloração de
Materiais e Métodos
40
Gram (são células Gram positivas), não foi possível isolar os microrganismos pretendidos – os
bacilos.
Optou-se então por comprar amostras de Lactobacillus bulgaricus à biblioteca belga de
microrganismos BCCM/LMG, onde os microrganismos são disponibilizados na forma liofilizada.
Para promover a sua multiplicação procede-se como indicado no Apêndice C.
Inicialmente a reprodução foi feita em placas de Petri, onde o crescimento era escasso.
Mais tarde fez-se o armazenamento por congelamento da cultura em eppendorfs de acordo
também com o Apêndice C. Esta técnica, contudo, não parece ser muito indicada quando são
exigidos graus elevados de pureza das culturas e quando estas são bastante sensíveis à
temperatura. Além disso, estas células são anaeróbias facultativas, e por vezes
microaerofílicas, o que significa que crescem pouco na presença de ar e melhor na presença
de uma tensão reduzida de oxigénio. Por este motivo, a partir de Abril de 2004, o crescimento
dos bacilos passou a ser estimulado em slants com meio MRS, a 37 ºC numa atmosfera de 5%
de dióxido de carbono (CO2).
Inicialmente os Lactobacillus bulgaricus apresentavam um comprimento médio de 4,03
µm. Na segunda parte do trabalho esse valor subiu para, aproximadamente, 6,80 µm, sendo o
diâmetro de 0,54 µm, o que corresponde a um volume de 1,56 µm3.
Figura 2.3.1. Imagem de Lactobacillus bulgaricus, corados com violeta cristal, captada com
uma objectiva de 40 PHACO 2 no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB.
No leito de mistura binária, considerando o comprimento dos bacilos, a razão do
tamanho da molécula com o tamanho do poro, λ , para a parte II vem então dada
por: 115.05980.6
==mm
µµλ .
Para empacotamentos de partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores de λ
iguais a 0.148 e 0.014, para pequenas e grandes esferas, respectivamente. É também útil
saber o valor da relação 2)1( λ− como se verá na secção seguinte. Obtém-se um valor
de 2)1( λ− = 0.783 para o leito binário, 2)1( λ− = 0.726 para o leito com esferas de diâmetro
d e 2)1( λ− = 0.972 para o leito com esferas de maior diâmetro, D . Se se considerar o
Materiais e Métodos
41
diâmetro dos bacilos (0.54 µm) obtém-se o valor de λ = 0.009 para o leito binário, 0.012 para
partículas de menor dimensão e 0.001 para partículas de maior dimensão. 0.982 é o valor que
se adquire de 2)1( λ− para o leito de mistura, sendo 0.976 e 0.998, respectivamente, o valor
para pequenas e grandes partículas.
2.4. Crescimento de Saccharomyces cerevisiae
As leveduras Saccharomyces cerevisiae, mais conhecidas como “fermento de padeiro”,
são usadas, hoje em dia, em grande escala, na indústria alimentar para produção de vários
materiais, vinhos, e cervejas e alimentares. Na indústria de panificação desempenham um
papel tão crucial que é já mesmo possível encontrar nos hipermercados saquetas que contêm
estas leveduras na forma granular. A sua manipulação não oferece muitos cuidados e o seu
genoma encontra-se completamente sequenciado, pelo que estão também fortemente
envolvidas em investigação.
São unicelulares, globulares e/ou por vezes alongadas na forma, verificando-se ainda,
consoante o estado de crescimento e o meio de cultura, a presença de gémulas.
A indução do seu crescimento é possível de inúmeras formas e depende, sobretudo, do
destino onde se querem aplicar.
Neste trabalho interessava que as leveduras tivessem uma forma circular e um diâmetro
aproximado de 5 µm.
Numa primeira fase utilizou-se fermento instantâneo Fermipan. Depois de experimentar
diferentes meios de cultura, por análise de imagem, chegou-se à conclusão que a forma mais
eficaz e simples de o crescer consistiria em inoculá-lo durante três horas, a 30º C, com ligeira
agitação, num meio esterilizado contendo cloreto de sódio (NaCl) 8 g/L e uma pequena
quantidade de glucose (C6H12O6) 3.2 g/L para as células ficarem mais frescas. Nessas
condições obtinham-se imagens como a Figura 2.4.1.
Figura 2.4.1. Imagem de S. cerevisiae, coradas com violeta cristal, captada com uma objectiva
de 40 PHACO 2 no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB.
Materiais e Métodos
42
Para um maior controlo da assepsia optou-se depois por inocular estas leveduras em
placas de petri contendo meio Yeast Extract Peptone Dextrose – YEPD (descrito no Apêndice
B). A cultura de leveduras é renovada mensalmente numa nova placa. Sempre que se efectua
um ensaio de filtração na coluna, com a ajuda de uma ansa, inoculam-se as leveduras em meio
YEPD líquido.
As Saccharomyces cerevisiae, de forma esférica, mantiveram ao longo de toda a
investigação, um diâmetro médio aproximado de 4,47 µm, que corresponde a um volume de
46,77 µm 3.
Para as leveduras no leito de mistura binária a razão do tamanho da molécula com o
tamanho do poro, λ , calcula-se fazendo: 078.05947.4
==mm
µµλ .
Em leitos de partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores de λ iguais a 0.097 e
0.010, para pequenas e grandes esferas, respectivamente.
Como foi efectuado para os bacilos, é necessário ter conhecimento do valor de 2)1( λ− . Obtém-se um valor de 2)1( λ− = 0.850 para o leito binário, 2)1( λ− = 0.815 para o
leito com esferas de diâmetro d e 2)1( λ− = 0.980 para o leito com esferas de diâmetro, D .
2.5. Procedimento experimental nos ensaios de filtração com
microrganismos e outras partículas
PARTE I
Antes de dar início à filtração de células decidiu-se que, para acautelar o, eventual,
crescimento de biofilme na coluna, deveria retirar-se o meio de cultura onde estas crescem (por
centrifugação).
Construiu-se a curva de calibração de biomassa para cada um dos microrganismos,
como é indicado no Apêndice D.
Estando estimadas, com o auxílio das escalas de lâminas micrométricas e do programa
Image Pro Plus, as principais dimensões das células em questão (no caso das S. cerevisiae o
diâmetro médio, no caso dos L. bulgaricus o diâmetro e a altura médios), nos primeiros três
ensaios de filtração procedeu-se de acordo com o esquema da Figura 2.5.1. Inicialmente não se fazia ideia acerca do “valor razoável” de concentração a empregar
de cada um dos microrganismos, sabendo-se apenas que esta tem de ser igual de modo a que
estes estejam nas mesmas condições. Acabou-se por experimentar uma concentração média
de trabalho de 5g biomassa/ L, o que analisado na câmara de Neubauer correspondia,
aproximadamente, a uma concentração de 2,652E+7 células/mL para as leveduras e de
5,712E+7 células/mL para os bacilos.
Materiais e Métodos
43
O começo de um ensaio de filtração tem um procedimento muito semelhante ao usado e
já descrito para determinar a porosidade. Abre-se a válvula do topo da coluna que dá ligação
ao ar e a válvula da base até a água baixar ao nível do empacotamento.
Nesta fase da investigação, com a ajuda de um tubo de silicone unido a uma seringa,
colocavam-se os 20 mL da combinação homogeneizada das duas culturas. Deixava-se descer,
de novo, o líquido até ao nível do empacotamento. Preenchia-se agora com água a coluna até
à linha referência e fechava-se a válvula do topo.
O processo de separação iniciava-se com a abertura da válvula da base da coluna e a
injecção de água destilada pela outra válvula do topo. Depois de passar um volume que fosse
equivalente ao volume de poros, iniciava-se a recolha das amostras de 2 em 2mL.
A avaliação do número células no final de cada um destes ensaios, como está
evidenciado na Figura 2.5.1., foi feita pelo método de contagem directa, com a câmara de
Neubauer. Os cálculos envolvidos encontram-se elucidados no Apêndice E.
Figura 2.5.1. Esquema do procedimento experimental realizado nos ensaios de filtração da PARTE I.
Crescimento de Lactobacillus bulgaricus em meio MRS Crescimento de S. cerevisiae
em meio contendo NaCl e C6H12O6
Determinação da concentração (g/ L) das leveduras por D.O. e diluição para que Conc. leveduras = Conc. bacilos
Determinação da concentração (g/L) dos bacilos por D.O. e diluição para que Conc. bacilos = Conc. leveduras
Centrifugação e ressuspensão das células em tampão.
Centrifugação e ressuspensão das células em tampão.
10 mL 10 mL
Homogeneização da mistura no vórtex
Recolha de amostras de 2 em 2 mL
Contagem das células na câmara de Neubauer ao microscópio
Coluna com ε = 0,217
Materiais e Métodos
44
PARTE II
Uma das mudanças foi apontada na secção 2.4., e está relacionada com a modificação
do meio de crescimento das leveduras para meio YEPD. Outra foi o início da utilização de
formaldeído para fixar e conservar as células.
O formaldeído é um fixador de células comercializado, normalmente, a 37% (v/v). A
solução aquosa é conhecida como formol ou formalina e a concentração mais usada em
patologia é de 4% (v/v). Tem penetração rápida nos tecidos sem os endurecer, tem poder
coagulante sobre as proteínas e requer, relativamente, pouco tempo de fixação, sendo portanto
um bom fixador. Também é bom conservante, pois sabe-se que os tecidos podem nele
permanecer por mais de dez anos sem grandes modificações nas suas estruturas [60].
Quando se observavam ao microscópio algumas amostras dos microrganismos
constatava-se a presença de aglomerados de células, sobretudo de bacilos, pelo que a
aplicação de ultra-sons se tornou também uma etapa importante na preparação de cada ensaio
de filtração. A aplicação dos ultra-sons é feita por aparelhos, vulgarmente designados por
sonicadores. Consistem num gerador que fornece energia eléctrica de alta-frequência (cerca
de 20KHz) a um transdutor piezo-eléctrico, o que transforma esta energia em vibrações
mecânicas na sonda (haste-metálica) à qual está acoplado. Esta vibração origina a formação
de ondas sónicas ou ultrasónicas (acima dos 16KHz) que causam no meio áreas alternadas de
pressão negativa e positiva. Isto traduz-se na formação de milhões de bolhas microscópicas –
fenómeno designado por cavitação – que se expandem no ciclo de pressão negativa e
colapsam no ciclo de pressão positiva, dando origem a milhões de ondas de choque. Ou seja,
estas bolhas formam turbilhões miniatura, que promovem uma maior transferência de massa e
de calor no seio do líquido, originando, também tensões de corte, uma vez que induzem
gradientes de velocidade. A sonda que emite os ultra-sons é mergulhada na suspensão a
desintegrar e deve ser perfeitamente lisa para fornecer a máxima potência sónica [9].
No caso das leveduras aplicou-se a sonda, em geral, cerca de 10 segundos à potência
5. Para os bacilos repetiu-se três vezes o ciclo de aplicação da sonda durante 10 segundos à
potência 5 seguido de 5 segundos de repouso. Deve-se notar que o tempo de utilização da
sonda foi sempre extremamente curto pois o objectivo era separar os microrganismos e não
matá-los ou remover os seus constituintes intracelulares.
No sentido de facultar a contagem e a distinção dos microrganismos adicionou-se um
volume de 18 µL do corante cristal violeta 0,03 g/mL a cada uma das amostras a examinar,
tendo o cuidado de filtrar o corante, previamente, para remover os cristais que este forma ao
longo do tempo.
A mudança mais importante tem a ver, contudo, com a determinação da concentração
dos microrganismos. Nos primeiros testes a concentração no início de cada ensaio era
determinada pelo método de turbidimetria e no final era calculada com base nas dimensões da
câmara de Neubauer. A partir deste momento, a concentração dos microrganismos passou a
ser avaliada de igual forma no início e no final do ensaio. Cessou-se de utilizar a câmara de
Materiais e Métodos
45
Neubauer para empregar lâminas e lamelas simples. Assumiu-se que a gota (de volume
sabido) que é colocada na lâmina, fica espalhada, uniformemente, por toda a lamela (com área
conhecida). No microscópio começaram a captar-se várias fotografias em pontos diferentes da
lamela, e passou-se a calcular a concentração de cada amostra de microrganismos como está
exemplificado na parte II do Apêndice E
Além de todas as alterações já apontadas, as dimensões principais dos microrganismos
passaram a ser calculadas com o auxílio do Programa Sigma Scan Pro 5, como é também
demonstrado na parte II do Apêndice E.
Algumas das mudanças são esquematizadas na Figura 2.5.2. Uma vez que na PARTE I da investigação a concentração de trabalho empregue
pareceu ser muito elevada, nesta segunda parte, a concentração média de trabalho para as
Saccharomyces cerevisiae e os Lactobacillus bulgaricus foi de 2,80E+06 células/mL (cerca de
dez vezes inferior).
Figura 2.5.2. Esquema do procedimento experimental realizado nos ensaios de filtração da
PARTE II.
Sonicação, centrifugação, diluição e ressuspensão das células numa solução de tampão e formaldeído 4% (v/v)
Sonicação, centrifugação, diluição e ressuspensão das células numa solução de tampão e formaldeído 4% (v/v).
5 mL 5 mL Homogeneização da
mistura no vórtex
Recolha de amostras de 1 em 1 mL
Contagem das células na lamela ao microscópio
Coluna com ε = 0,227
Determinação da concentração (nº células/ mL) ao microscópio e diluição para que Conc. leveduras = Conc. bacilos
Determinação da concentração (nº células/ mL) ao microscópio e diluição para que Conc. bacilos = Conc. leveduras
Adição de 18 µL de cristal violeta 0,03 g/mL
S. cerevisiae L. bulgaricus
Materiais e Métodos
46
PARTE III
Depois de realizar os ensaios com a mistura de leveduras e bacilos, pareceu importante
testar o comportamento de células com uma forma semelhante à das leveduras (circular), mas
volume aproximadamente igual ao dos bacilos. Decidiu-se então avaliar a filtração de
microesferas num leito binário idêntico ao da parte I e II. A investigação de Saccharomyces
cerevisiae e microesferas pode ser também útil devido à sua aplicação como traçadores no
sub-solo [4]. No mercado estão disponíveis microesferas de látex, que são as que interessam no
caso de um empacotamento de esferas de vidro para minimizar interacções. Partindo deste
pressuposto determinou-se o diâmetro aproximado que as microesferas deveriam ter de ter
para apresentar um volume idêntico ao dos bacilos.
Nos ensaios anteriores, encontraram-se os valores médios:
Para as microesferas terem o mesmo volume que os bacilos:
mdrrrr µ4,16978,03397,04
3424,13
4424,1 333
=⇒=⇔=⇔Π
×=⇔
Π=
Optou-se por adquirir esferas de diâmetro 1 µm, em vez de 1,4 µm, para garantir que o
volume destas seria igual ou inferior ao dos bacilos.
As microesferas fluorescentes emitem cores luminosas e distintas quando iluminadas
por luzes com pequenos comprimentos de onda. Esta propriedade resulta num elevado
contraste e visibilidade em relação a materiais de fundo. Além disso os produtos fluorescentes
oferecem uma melhor sensibilidade quando empregues numa vasta área de métodos
analíticos. As microesferas fluorescentes podem ser detectadas com um microscópio de
epifluorescência, num microscópio confocal, num espectrofotómetro de fluorescência ou num
contador de células com fluorescência activa. As partículas podem ser observadas,
directamente, na matriz ou no meio a serem testadas, ou podem ser colhidas em filtros
membranares para posterior examinação no microscópio.
Neste trabalho usaram-se microesferas, em solução aquosa, de poliestireno verde –
fluorescente monodisperso, da Duke Scientific Corporation, com referência G0100. Estas
Materiais e Métodos
47
apresentam uma massa específica de 1,05 g/cm3, uma concentração de 1.8 x1010 microesferas
/mL e um índice de refracção de 1,59 a 589 nm. Como propriedades espectrais apresentam
excitação máxima a 468 nm e emissão máxima a 508 nm. Como foi anteriormente explicado o
seu diâmetro médio é 1 µm [61].
O procedimento nos ensaios de filtração destas esferas foi semelhante ao cumprido
para a mistura de Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus bulgaricus. Como foi referido a
concentração inicial é 1.8 x1010 microesferas /mL, que é um valor muito elevado. Uma vez que
as esferas são menores do que as leveduras, para a massa ser, aproximadamente, a mesma
que se usou nos ensaios anteriores, é necessário usar uma concentração de microesferas
superior.
Sabe-se que:
Vm
=ρ (Equação 2.5.1)
em que ρ é a massa específica das esferas, m e V são a massa e o volume das esferas,
respectivamente. Deduz-se a partir daqui que:
12515
6.
33 =⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛=⇒
Π⇒⇒=
esferas
leveduras
VV
dmVmVm ppρ
esferaslevedurasesferas
leveduras mmm
m125125 =⇒=
Como a concentração média celular usada nos ensaios da parte II foi de 2,80E+6
células/mL, a concentração de esferas a usar devia ser de 085.30680.2125 +≈+×≈ EE
microesferas /mL. Na prática a concentração média de microesferas empregue foi de 2.7E+08
microesferas /mL.
Figura 2.5.3. Imagem de microesferas de poliestireno verde – fluorescente monodisperso, em
solução aquosa diluída, captada com uma objectiva de 40 PHACO 2 no microscópio Leitz do
Laboratório de Imagem do DEB.
Materiais e Métodos
48
As microesferas, que podem ser visualizadas na Figura 2.5.3., são simples de
manusear e o principal cuidado que carecem é não poderem ser misturadas com solventes
orgânicos, já que estes removerão o corante do interior das partículas. Esta incompatibilidade
fez com que, por exemplo, aquando a filtração de uma mistura de esferas e de bacilos, os
últimos não estivessem conservados em formaldeído, mas em tampão PBS (cuja preparação é
indicada no Apêndice B).
A determinação da concentração de microesferas nas várias amostras recolhidas depois
de um ensaio foi feita no espectrofotómetro ELISA a 468 nm, depois de verificar a possibilidade
de medição da fluorescência em diferentes aparelhos (como está apresentado no Apêndice F).
A curva de calibração, bem como o aparelho onde esta foi determinada, são descritos
na parte III do Apêndice F – Observações Experimentais.
A razão do tamanho da molécula com o tamanho do poro, λ , para as microesferas no
leito de mistura binária é igual a 017.059
0.1==
mm
µµλ .
Nos leitos de partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores de λ iguais a 0.021
para pequenas esferas e 0.002 para grandes esferas.
Obtém-se um valor de 2)1( λ− = 0.966 para o leito binário, 2)1( λ− = 0.958 para o leito
com esferas de diâmetro d e 2)1( λ− = 0.996 para o leito com esferas de diâmetro, D .
Ao analisar o comportamento, em leitos porosos, de Saccharomyces cerevisiae, de
Lactobacillus bulgaricus e microesferas, acabou por testar-se a filtração de partículas com
diferentes tamanhos, formas e volumes, que podem ser esquematizados segundo a Figura 2.5.4.
Legenda:
L. bulgaricus
S. cerevisiae
Microesfera
Figura 2.5.4. Esquema do tamanho, forma e volume de Lactobacillus bulgaricus,
Saccharomyces cerevisiae e microesferas de poliestireno verde – fluorescente.
Materiais e Métodos
49
Por que neste trabalho era interessante ter como termo de comparação o
comportamento de um traçador, realizaram-se também vários testes com o azul dextrano.
Os dextranos são polissacáridos (cadeias de açúcares simples) compostos por
monómeros de glicose. Estruturalmente, os dextranos apresentam uma coluna de unidades de
D – glicose unidas, sobretudo, pela ligação α – D (1→6). As propriedades químicas e físicas do
dextrano variam com os métodos de produção, assemelhando-se, muitas vezes, a um colóide
[62].
Actualmente, são produzidos e comercializados, em larga escala, por tecnologia
enzimática. Quando libertados por bactérias Leuconostoc caracterizam-se pelo peso molecular
elevado, boa solubilidade em água e baixa toxicidade. Os dextranos têm uma grande variedade de aplicações. São portadores efectivos para
corantes, indicadores e grupos reactivos. Em determinados casos são usados como
dilatadores de volume do plasma do sangue. O dextrano de ferro é usado para combater
anemia de deficiência de ferro. A indústria fotográfica emprega dextrano, operações mineiras
consomem dextrano, houve até sugestões para que o dextrano pudesse contribuir em
problemas artríticos. Muitos mais usos e aplicações continuam a ser investigados. Além de
tudo isto, dextranos (não carregados) continuam a ser utilizados e a contribuir para a
caracterização de processos de cromatografia de exclusão molecular (SEC) [63].
O azul dextrano é um grande polissacárido (a massa molar comum é aproximadamente
dois milhões de Daltons - 2,000,000 Da) que contém o corante clorotriazina, Cibacron Blue. É,
frequentemente, usado na medição do volume de espaços vazios em colunas de filtração de
gel [64]. O tamanho de estimação de uma molécula de dextrano não é consensual na literatura
e talvez por isso não se encontre facilmente. Seksek et al. [65] apontam um tamanho de,
aproximadamente, 80 nm, 54 nm é o valor apontado por Pluen et al. [66] e 63 nm também
aparece na bibliografia [67], que está perto da média de [65] e [66]. Estes valores indicam que
o dextrano se encontra numa gama de tamanho muito inferior à das outras partículas
analisadas.
A curva de calibração do azul dextrano, a 620 nm, e as condições para a sua
determinação, estão expostas na parte III do Apêndice F – Observações Experimentais. O
modo como foram feitos os ensaios de filtração do azul dextrano, com uma concentração
aproximada de 1000 mg/L, foi praticamente igual ao procedimento usado com as microesferas.
Note-se que ao preparar a solução com a concentração desejada deve ter-se o cuidado de
dissolver bem o dextrano em solução.
Pode-se também estimar a razão do tamanho da nanopartícula com o tamanho do poro
λ que é igual a 80.106759
63000==
mµλ , para o leito de mistura binária, 1369.57 para o
leito de partículas de menor dimensão e 134.04 para o leito de partículas de maior dimensão.
Os valores de ( )21 λ− na mesma ordem são: 1138602, 1872984 e 17700.
Materiais e Métodos
50
PARTE IV e V
O procedimento das filtrações nos leitos com enchimentos de partículas com o mesmo
tamanho, parte IV (0.1115 mm) e V (1,125 mm), assemelhou-se ao efectuado nas partes II e III.
É relevante acrescentar que a partir da parte IV a separação dos microrganismos (leveduras e
bacilos) passou a ser efectuada em separado e que a determinação da sua concentração
passou também a ser feita por absorvência a 620 nm, no espectrofotómetro ELISA.
As curvas de calibração de apoio para as microesferas e o azul dextrano são idênticas
às descritas na parte III (e são visíveis no Apêndice F). As curvas de calibração dos bacilos e
leveduras necessárias na parte IV e V encontram-se apresentadas no Apêndice F –
Observações Experimentais.
PARTE I, II, III, IV e V
Nos distintos testes realizados a bomba da instalação experimental encontrou-se na
posição 40, a que corresponde um caudal volumétrico de F = 0,122 mL/s.
Dado que a superfície de escoamento é dada por:
22
2 .854,1322,4 cmcmrS =⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛×=×= ππ
a velocidade é igual a:
scmEcm
smLSFuap /.3806,8
.854,13/.122,0
2 −===
Esta velocidade é, contudo, afectada pelas partículas de vidro que estão na superfície e
por isso, uma velocidade aparente, apu . A velocidade que traduz essa influência designa-se por
velocidade real e é dada por:
εapu
w = (Equação 2.5.2)
donde vem que: scmEscmEw /.29,3227,0
/.3806,8−=
−= para o empacotamento
binário, w = 0.0231 cm /s para o empacotamento com partículas de menor dimensão e w =
0.0228 cm /s para o empacotamento de partículas de dimensão D .
Apresentação e Discussão dos Resultados
51
3. Apresentação e Discussão dos Resultados
Vão agora apresentar-se e discutir-se os resultados alcançados em cada uma das
partes.
3.1 Resultados obtidos com o empacotamento binário
PARTE I
Na primeira parte do trabalho, realizaram-se três ensaios num leito de mistura binária
com um empacotamento com uma fracção volúmica das partículas de maior dimensão de 0.7,
uma razão das partículas de 0.1 e uma porosidade de ε = 0.217. Analisando, previamente, o
gráfico obtido em A, B e C, apresentados no Apêndice F, evidencia-se uma grande semelhança
entre os dois últimos. Partindo deste facto, calculou-se o valor médio da concentração de cada
um dos microrganismos, ao longo do volume recolhido, para os ensaios B e C. O resultado é
apresentado no gráfico da Figura 3.1.
0 5 10 15 200
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
2
Nº m
édio
de
célu
las
(ens
aio
B e
C) /
mL
v , mL
1
Figura 3.1. Gráfico que traduz a variação da concentração de 1 – Saccharomyces cerevisiae
(●) e 2 – Lactobacillus bulgaricus (x) ao longo do volume recolhido no ensaio B e C da parte I.
A Figura 3.1. evidencia a presença de dois picos: um bem definido, simétrico e com boa
resolução logo no início da separação (1) e outro com base alargada, também simétrico, para
volumes maiores (2). O primeiro pico é relativo aos microrganismos circulares, o outro aos
microrganismos lineares.
O diâmetro médio das leveduras, nesta fase, foi de 5.0 µm e o comprimento de bacilos
4.0 µm. Usou-se uma concentração de 2.575E+07 células/mL para as leveduras e 5.110E+07
células/mL para os bacilos
Apresentação e Discussão dos Resultados
52
De acordo com vários estudos anteriormente efectuados neste laboratório, na área de
filtração e separação, neste contexto, a forma celular tem um papel decisivo. Por este motivo,
embora os bacilos possuam dimensões mais pequenas, a sua forma vai condicionar o
movimento ao longo dos poros. Pelo contrário, as leveduras são favorecidas ao longo do
processo, devendo conseguir “desembaraçar-se” do leito poroso mais rapidamente.
Uma primeira análise dos resultados pareceu indicar que, na verdade, a forma afecta
fortemente a migração de microrganismos e as leveduras beneficiam da sua forma redonda. O
processo de filtração e as variáveis que nele participam, contudo, tiveram de ser ajustados,
sendo os resultados apresentados nas partes seguintes.
Nesta fase ainda, quando as leveduras eram observadas ao microscópio encontravam-
se separadas, no entanto, o aparecimento de gémulas era também muito comum e indesejado.
Para solucionar este inconveniente, em vez de usar fermento de levedura instantâneo, passou-
se a utilizar fermento de padeiro, e crescer as células em meio estéril YEPD, como foi indicado
na secção “Materiais e Métodos”.
Outra das mudanças que ocorreu, e também apontada na secção 2.5., foi no processo
de contagem celular. Nestes ensaios o apuramento foi feito recorrendo à câmara de Neubauer.
A câmara de Neubauer permite quantificar o número total de células por observação directa ao
microscópio. Caracteriza-se por ser um método preciso. É, contudo, estatisticamente
questionável, a menos que seja efectuado um grande número de observações. Além disso, por
vezes, é também preocupante porque depende muito do local onde se retirou a amostra, do
tratamento que esta sofreu (deve ser fortemente agitada para homogeneizar) e da sua injecção
na câmara (devendo aguardar-se 1 minuto até proceder à contagem).
No caso em estudo, embora as células tenham uma morfologia distinta, pode também
ter acontecido que os bacilos estivessem a ser captados de topo e serem contados como
leveduras. No sentido de evitar esta dúvida, e avaliar melhor a dimensão e o contorno das
células, estas passaram a ser coradas com cristal violeta durante poucos minutos. Nos ensaios cujos resultados se irão apresentar de seguida a concentração celular de
partida dos microrganismos passou a ser inferior. Uma concentração de células na ordem das
dezenas de milhões por mililitro é um valor muito elevado e pode ter efeitos negativos como a
acumulação de células nas esferas de vidro. Esta conclusão foi tirada depois de se ter
calculado a percentagem de microrganismos que ficou retida no interior da coluna, valor este
muito elevado.
PARTE II e III
As partes II e III referem-se às experiências efectuadas numa coluna de empacotamento
binário. O empacotamento foi formado por uma mistura de esferas de vidro de 1.125 mm e
0.1115 mm, a uma fracção volúmica de tamanho maior de 0.7, tal como o empacotamento da
parte I, e porosidade 0.227.
Apresentação e Discussão dos Resultados
53
Na parte II filtraram-se Saccharomyces cerevisiae com diâmetro médio 4.47 µm e
Lactobacillus bulgaricus de 6.80 µm de comprimento e 0.54 de diâmetro, com a concentração
média de 2.8 E+06 células/mL.
Na parte III filtraram-se as microesferas verde – fluorescentes de poliestireno de 1 µm de
diâmetro, tendo por comparação o comportamento do traçador azul dextrano.
Os resultados de cada um dos ensaios realizados estão descritos no Apêndice F –
Observações Experimentais. Uma vez que se tornaria exaustiva a análise de cada um,
acharam-se os valores médios e construiu-se o gráfico da Figura 3.2. No caso dos
microrganismos os valores médios que são apresentados foram estimados conjuntamente com
os valores obtidos na parte I.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
CN
v, mL
1 23
Figura 3.2. Resultados da separação das partículas: 1 – microesferas com concentração inicial
média 0C = 10.92 g/L (○), 2 – Saccharomyces cerevisiae com concentração inicial média 0C =
0.358 g/L (●) e 3 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial média 0C = 0.271 g/L (x),
ao longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de
concentração normalizada NC que é igual à razão da concentração de um dado ponto com a
concentração máxima. As curvas são uma aproximação da distribuição de Gauss.
Na observação da Figura 3.2. salientam-se, nitidamente, três picos de concentração
normalizada. De acordo com a ordem de eluição o primeiro corresponde às microesferas, o
segundo às leveduras e o terceiro aos bacilos. À partida, os resultados vão de encontro com
aquilo que era esperado e que já foi, previamente, conseguido nos ensaios da parte I, ou seja,
os microrganismos com a forma circular são favorecidos para estas condições de separação.
Quando comparado o comportamento de separação partículas com forma idêntica, o volume
tem um papel significativo, levando a melhor as microesferas, que têm um volume menor.
Algumas das características principais deste gráfico são apontadas na Tabela 3.1.
Apresentação e Discussão dos Resultados
54
Tabela 3.1. – Características da separação das partículas no empacotamento binário:
microesferas (○), Saccharomyces cerevisiae (●) e Lactobacillus bulgaricus (x), retiradas a partir
O tempo de retenção τ apresenta-se calculado com base na razão do tempo de eluição
do pico de concentração da partícula filtrada com o tempo de eluição do marcador azul
dextrano. A razão do tamanho da molécula com o tamanho do poro λ , no caso dos bacilos, é
apresentada para as duas principais dimensões, correspondendo o valor entre parêntesis ao
valor de λ calculado com o diâmetro destes microrganismos. Ao aumento do volume de
eluição dos picos corresponde uma tendência crescente do tempo de retenção τ , pela
seguinte ordem: microesferas (○), Saccharomyces cerevisiae (●) e Lactobacillus bulgaricus (x). Esta variação verifica-se também com a razão do tamanho da molécula com o tamanho do
poro λ , considerando-se como dimensão principal o comprimento.
Apresentam-se, de seguida, as Figuras 3.3a. e 3.3b.
Figura 3.3a. Figura 3.3b.
Figura 3.3a. Resultados da separação de 1 – azul dextrano com concentração inicial 0C = 1.0
g/L (■) e 2 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial 0C = 0.333 g/L (x) ao longo do
volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de
concentração normalizada NC . As curvas são aproximações pela distribuição de Gauss.
Figura 3.3b. Resultados da separação de 1 – microesferas com concentração inicial 0C =
10.92 g/L (○) e 2 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial 0C = 0.208 g/L (x) ao
longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de
concentração normalizada NC . As curvas são aproximações pela distribuição de Gauss.
0 5 10 15 20 25 300,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
2
CN
v, mL
1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 280,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
2
CN
v, mL
1
Apresentação e Discussão dos Resultados
55
No que diz respeito ao gráfico da Figura 3.3a. o traçador apresenta o pico de
concentração normalizada aos 9.6 mL, enquanto para os bacilos esse pico é visível aos 20 mL
pelo que τ = 2.08. No gráfico da Figura 3.3b. para as microesferas o pico é atingido aos 8.4
mL e τ = 0.913, para os bacilos obtém-se o pico aos 21.3 mL eτ = 2.315.
No caso da Figura 3.4. para o azul dextrano o pico verifica-se aos 9.2 mL eτ = 1. Para
as microesferas o pico é atingido aos 8.1 mL e τ = 0.88.
Foi a partir dos gráficos das Figuras 3.3a., 3.3b. e 3.4. que se alcançaram os valores
0t do traçador utilizados para determinar λ na Tabela 3.1.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
CN
v mL
1 2
Figura 3.4. Resultados da separação de 1 – microesferas com concentração inicial 0C = 10.92
g/L (○) e 2 – azul dextrano com concentração inicial 0C = 1.0 g/L (■) ao longo do volume v, no
empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de concentração normalizada
NC . As curvas são aproximações pela distribuição de Gauss.
A observação das Figuras 3.3a. e 3.4. revela que o comportamento do azul dextrano é,
ligeiramente diferente das outras partículas, nas mesmas condições conduzindo ao
aparecimento de picos de base larga. Este facto faz com que haja um desvio do pico de azul
dextrano da função Gaussiana e está relacionado, provavelmente, com o efeito de partição em
zonas com regime de fluxo de estagnação.
A Figura 3.4. mostra ainda que o pico de eluição das microesferas (○) é inferior ao pico
do azul dextrano (■). Esta não era uma situação esperada. Era previsto que o corante eluísse
primeiro. Como foi apontado na secção “Materiais e Métodos” não existe um consenso, na
literatura, relativamente ao tamanho das moléculas de dextrano, no entanto, pode-se
estabelecer um valor médio de 63 nm. A ordem de grandeza em relação às microesferas e aos
microrganismos é, portanto, de modo grosseiro, cerca de 10 vezes inferior.
Apresentação e Discussão dos Resultados
56
No estudo de Rehmann et al. [5] é relatada uma situação idêntica, transpondo o caso
das microesferas para vírus. Como os meios porosos tornam-se, crescentemente,
heterogéneos (isto é, como 2fσ aumenta, sendo 2
fσ a variância da gama de K.ln , K a
condutividade hidráulica do meio), foi observado por estes autores que o transporte de um
vírus pode ser facilitado a tal um grau que a chegada de vírus precede a chegada de um
traçador. O aumento de 2fσ implica uma quantia crescente de meios porosos pertencendo às
caudas elevadas e baixas da distribuição K.ln , reflectindo a presença de canais com maior e
menor condutividade. A interpretação deste resultado é que são excluídos vírus das regiões de
baixa condutividade por causa dos tamanhos restritivos dos poros em materiais finamente
granulados, relativamente ao diâmetro do colóide (por exemplo, são excluídos vírus de certas
argilas e da porosidade interna – intra-grânulos) mas eles são capazes de se moverem pelas
bandas de condutividade maiores, que são caracterizadas por velocidades de fluxo pelo poro
mais altas. Assim, o aumento do grau de heterogeneidade resulta numa inovação mais rápida
do transporte de vírus pelos meios até ao topo mais elevado da distribuição K.ln .
Pode-se supor que, tal como aquilo que se passa com os vírus, as microesferas, em
condições menos favoráveis ao seu movimento, acabam também por ser excluídas
deslocando-se para zonas de maior condutividade onde são mais facilmente transportadas.
Relativamente às partes I e II é preciso ainda acrescentar que há uma diferença notória
entre os volumes de eluição determinados para os microrganismos Saccharomyces cerevisiae
e Lactobacillus bulgaricus. Na primeira parte obtiveram-se os picos de concentração a 2.5 mL
para as células de fermento e 12.8 mL para os bacilos, enquanto na parte II esses valores
foram de 13.4 mL e 19.0 mL. Em termos gráficos, na segunda parte, houve um deslocamento
de ambos para a direita. Podem ser enunciadas algumas razões que tenham levado a esta
mudança, como por exemplo, a existência de canais preferenciais no primeiro empacotamento.
Contudo, foram vários os parâmetros mudados na segunda parte: a concentração das soluções
empregue, a forma como esta foi medida, entre outras, que tornam difícil descobrir a
verdadeira razão. Note-se que todas as alterações entre a parte I e II visaram optimizar e tornar
mais credíveis os resultados obtidos.
3.2 Resultados obtidos com os empacotamentos com
partículas de um único tamanho PARTE IV e V
Na parte IV e V foram utilizados empacotamentos simples, construídos a partir das
partículas do leito de mistura binária. Foi estudada, em separado, a filtração do traçador azul
dextrano, de microesferas de poliestireno verde – fluorescente monodisperso, de
Saccharomyces cerevisiae e de Lactobacillus bulgaricus. O estudo foi realizado nesta mesma
Apresentação e Discussão dos Resultados
57
ordem, por forma, a evitar que os leitos colmassem com as células maiores, sobretudo no caso
do leito constituído por partículas de menor dimensão, tamanho d .
Nestes ensaios, tal como se tinha procedido no empacotamento binário, utilizou-se uma
velocidade de fluído aparente u = 0.0088 cm/s.
3.2.1. Leito formado pelas partículas menores da fracção de tamanho d = 0.1115 mm
O empacotamento a abordar nesta secção foi construído com esferas de 0.1115 mm de
diâmetro e com a mesma massa que tinha sido empregue no empacotamento binário, ou seja,
120 g. Como é possível imaginar estas esferas são muito pequenas, assemelhando-se, de
modo físico, a um pó fino tendo-se formado um leito com espessura 5.6 cm. A porosidade do
empacotamento determinada foi de 0.381. Pode-se achar a partir daqui o valor de
ε/1/ 0 =VVtotal = 2.625, a velocidade real do fluído através de ε/uw = = 0.023 cm/s, bem
como o tamanho dos poros pavd = 46.00 µm.
As partículas a percolar apresentam, nestas condições, as características: microesferas
)2.821.6/(1 2λλτ −+= ; 3 – 2)1.7/(1 λτ −= ; 3´ – 3)1.55/(1 λτ −= ; 4 – valor de λ para
partículas de menor dimensão quando todos os bacilos foram retidos no empacotamento.
Na situação em que se tem (x) no interior de elipses λ é definido como a razão do
comprimento do bacilo com o tamanho do poro. Mas se se usar λ como a razão do diâmetro
do bacilo com o tamanho do poro, os dados movem-se para a posição indicada pelas setas e a
função de aproximação fica enorme. A curva correspondente nesta situação é dada por: 35)1.55/(1 λτ −= . O coeficiente do módulo )(1 λ− é extremamente elevado e não faz
qualquer sentido. Conclui-se daqui que o comprimento é a característica mais apropriada.
A mesma conclusão foi tirada por Tyn e Gusek [86] com testes efectuados a diversas
proteínas flexíveis em solução, como a TMV. Nos seus ensaios verificaram também que com o
aumento do tamanho das macromoléculas biológicas a forma da molécula na sua separação
torna-se cada vez mais complicada, assim como o problema do comportamento num poro não
– linear e áspero (rugoso).
Para aumentar o impacto das curvas no fluxo de macromoléculas através de um meio
poroso devem ser controlados os seguintes parâmetros: aumentar a tortuosidade total (ao
contrário do HPLC) pelo número de curvas e a velocidade de fluxo da fase móvel.
Apresentação e Discussão dos Resultados
75
Em relação ao aumento da tortuosidade, para a migração de microrganismos em meios
porosos Duffy et al. [87] aplicou um algoritmo de trajecto aleatório em simulação juntamente
com a relação de Einstein, empregue para calcular o coeficiente de difusão bacteriano efectivo.
Foi calculada uma tortuosidade como uma função do tamanho da partícula e comparada com
resultados experimentais disponíveis da migração de Pseudomonas putida em colunas de
areia. Foi descoberta nesta investigação que a tortuosidade aumenta com o decréscimo do
diâmetro de obstáculos, que estava de acordo com os resultados experimentais.
Deve ser realçado que com a redução da escala de curvas em comparação com o
tamanho das partículas, o efeito oposto pode ser esperado.
Concluindo, para aumentar o impacto das curvas no fluxo de macromoléculas através de
um meio poroso devem-se controlar os seguintes parâmetros: aumentar a tortuosidade total
(ao contrário do HPLC) pelo número de curvas e a velocidade de fluxo da fase móvel e reduzir
o tamanho das partículas e a razão da escala curvas/partículas.
Em relação ao facto das células lineares sofrerem um efeito de retardamento em relação
às células de leveduras, podem-se ainda analisar outros estudos realizados na mesma área. O
comportamento dos bacilos não é semelhante ao comportamento de macromoléculas, de
qualquer forma existem vários parâmetros que podem ser comparados.
A separação de proteínas numa coluna Sephadex G-200 com o raio de Stokes medido
pelo método cromatográfico e um coeficiente de sedimentação determinado através de
centrifugação do gradiente de densidade foi investigada por Siegel e Monty, [88]. Foi mostrado
que a ordem de eluição de proteínas da coluna Sephadex G-200 se correlaciona bem com o
raio de Stokes e não depende, fundamentalmente, do peso molecular (comportamento de
ferritina e fibrinogénio, ver Tabela 3.4.). Por exemplo, o fibrinogénio tem uma forma
completamente diferente (bacilo com relação de eixos 20 (por viscosidade) - 29 (por difusão)
[89]) do que outras proteínas mencionadas nessa tabela.
Tabela 3.4 – Parâmetros moleculares de proteínas “standard” [88].
Espécies
Raio de
Stokes, nm
Peso
Molecular
Volume de
eluição, mL
Coeficiente de
distribuição dK
Fibrinogénio 10.7 330,000 88 0.03
Ferritina 7.9 1,300,000 109 0.11
Urease (monómero) 6.1 483,000 132 0.2
Catalase 5.2 250,000 148 0.26
Hemoglobina 2.4 32,000 224 0.58
Soro de Albumina Bovina 3.5 65,000 191 0.43
Scopes [46] é também de opinião de que o volume de eluição está relacionado com o
raio de Stokes, não com o tamanho ou o peso molecular. Pode-se especular que uma
aproximação do raio de Stokes dá bons resultados quando a forma macromolecular está perto
Apresentação e Discussão dos Resultados
76
da forma de esfera e o processo de separação, como a SEC, por exemplo, é governado pelo
fenómeno de partição entre poros micro (intra – partículas) e poros inter – partículas. Neste
caso grandes macromoléculas ou nanopartículas são repartidas por um volume de poros inter
– partículas onde a razão entre tamanho de partícula e o tamanho do poro, λ , é muito
pequena para o efeito topológico no movimento da partícula. Se a diferença entre os tamanhos
da partícula e do poro não pode ser ignorada então a aproximação do raio de Stokes precisa
de uma correcção.
Cannel e Rondelez [75] mediram a difusão de cadeias de poliestireno mono – dispersas,
de peso molecular 110, 233, 390, e 600 kDa através de membranas (Nuclepore Corp.)
contendo pequenos poros quase cilíndricos. A difusividade efectiva eD diminui assim que o
raio do polímero enrolado se aproxima do diâmetro do poro o que é bem explicado, igualmente,
pela equação de Renkin para solutos sólidos (Equação 3.19) ou por relações recentemente
desenvolvidas para soluções de polímeros (Equação 3.20), porH rr / > 0.1:
Figura 3.18. Universalidade da calibração de tamanhos na HDC ( Rf versus raiz quadrada do
diâmetro da partícula) para diferentes tipos de partículas.
O parâmetro Rf é dado por:
amostradaretençãodeTempo
marcadordoretençãodeTempoRf....
....= (Equação 3.21)
No caso desta investigação tem-se microesferas de látex de poliestireno com ρ = 1.05
g/ cm3 e padrão de tamanho nominal 1 µm = 1000 nm (Duke Scientific). No empacotamento
binário τ = 0.87, no caso do empacotamento com partículas de maior dimensão τ = 0.943,
para a coluna com partículas de menor dimensão τ = 0.945. Pode-se tentar comprovar o
31.6
1.23
Apresentação e Discussão dos Resultados
78
comportamento HDC, representando o valor da raiz quadrada do diâmetro das microesferas
que é dado por: 2/162.311000 nmnmd ==
A representação do valor da raiz quadrada do diâmetro das microesferas, conduz a um
valor teórico de, aproximadamente, 1.23. Os valores de Rf obtidos experimentalmente para
os diferentes empacotamentos testados são:
06.1944.01..15.1
87.01
=≈≈== tamanhoDtamanhodmistura RfRfeRf
Como se pode ver, nenhum destes valores corresponde ao valor teórico.
Este resultado não põe em causa o facto de que as microesferas são separadas de
acordo com o princípio HDC. Uma possível causa para explicar o desvio à curva de calibração
é que os autores usam colunas com um diâmetro menor. O que acontece, nestas colunas é
que há uma maior fricção e o perfil de velocidades de fluxo que se estabelece é mais
desenvolvido do que o perfil desencadeado na coluna experimentada nesta investigação, com
42 mm de diâmetro. Nesta última ocorre uma menor separação e uma menor resolução
contudo, os resultados obtidos com as microesferas são bastante satisfatórios, sendo bem
compensados na Equação (1.2.1), para um valor C igual a 2.8, que é, aliás, o coeficiente com
que alguns autores compensam a utilização de um diâmetro pequeno.
No trabalho testou-se um empacotamento binário, e com a mesma quantia e as mesmas
esferas usadas neste leito estudou-se a influência de um empacotamento de partículas de
tamanho d e um empacotamento de partículas de tamanho D . O empacotamento de
partículas de maior tamanho testado apresentou um tamanho de poro extremamente elevado
pavd = 470 µm pelo que o valor de λ é de, aproximadamente, 0.01, sendo o valor de λ de
trabalho recomendado maior. Teria sido interessante analisar um leito “largo” mas com um
diâmetro de poros médio menor. Comparando os empacotamentos, pelas Figuras 3.2., 3.5. e 3.10. conclui-se que a separação é melhorada pela aplicação de um leito de mistura. É este o
que oferece maior resistência e maior selectividade às partículas testadas, e permite obter
picos mais definidos. No fundo, o empacotamento binário oferece maior resistência o que o
torna, para o objectivo proposto, o mais interessante e, consequentemente, mais importante a
nível industrial.
3.3 Análise de dados obtidos pelo fluxo de partículas de vidro
através de poros com partículas do mesmo tamanho
Os dados que se vão apresentar nesta secção foram obtidos num outro estudo mas são
de grande interesse e servem de comparação com os resultados atrás apresentados.
Apresentação e Discussão dos Resultados
79
A coluna utilizada neste estudo tinha 8.2 cm de diâmetro e 30 cm de altura. Foi
empacotada com esferas de vidro do mesmo tamanho, tendo-se experimentado diferentes
tamanhos: pd = 1.125 mm (equivalente ao empacotamento de esferas de dimensão D ), pd
= 0.875 mm, pd = 0.375 mm e pd = 0.15 mm.
As suspensões de partículas de vidro filtradas apresentavam um diâmetro de 4 µm, 19
µm (intervalo das partículas 12 ÷ 26), e 60 µm (intervalo das partículas 40 ÷ 80), tendo-se
partido de uma concentração das partículas em suspensão 0C = 2g/L.
A fase líquida constou de uma solução de água e glicerol, 70% (m/m). O fluído circulou a
uma velocidade de ~ 2.6x10-4 m/s.
Filtraram-se suspensões com 0C = 2g/L de partículas de tamanhos 4 µm (Figura 3.19.),
19 µm (Figura 3.20.), e 60 µm (Figura 3.21.). Cada empacotamento com partículas do mesmo
tamanho foi testado.Os empacotamentos com partículas do mesmo tamanho são apresentados
nas Figuras 3.19. a 3.21. como curva 1 – 1.125 mm; 2 – 0.875 mm; 3 – 0.375 mm.
Figura 3.19. Figura 3.20. Figura 3.21.
Figura 3.19. Filtração de partículas de 4 µm ( 0C = 2g/L) através de um empacotamento com
partículas do mesmo tamanho: 1 – 1.125 mm (●); 2 – 0.875 mm (▲); 3 – 0.375 mm (■).
Espaços vazios da coluna 0V = 550 mL, porosidade ε = 0.380, ε/1/ 0 =VVtotal = 2.63. Para a
Estes resultados podem também ser apresentados na forma inversa, obtidos a partir das
Figuras 3.19. a 3.21. Quer isto dizer, para a coluna empacotada por partículas com o tamanho
1.125 mm (Figura 3.22.), 0.875 mm (Figura 3.23.), e 0.375 mm (Figura 3.24.), filtraram-se
suspensões com 0C = 2g/L de partículas de tamanhos: 1 – 4 µm; 2 – 19 µm; 3 – 60 µm.
Figura 3.22. Figura 3.23. Figura 3.24.
Figura 3.22. Filtração de suspensões ( 0C = 2g/L) de tamanhos: 1 – 4 µm (●); 2 – 19 µm (▲); 3
– 60 µm (■) através do empacotamento de partículas de tamanho 1.125 mm. Espaços vazios
da coluna 0V = 550 mL.
Figura 3.23. Filtração de suspensões ( 0C = 2g/L) de tamanhos: 1 – 4 µm (●); 2 – 19 µm (▲); 3
– 60 µm (■) através do empacotamento de partículas de tamanho 0.875 mm. Espaços vazios
da coluna 0V = 550 mL.
Figura 3.24. Filtração de suspensões ( 0C = 2g/L) de tamanhos: 1 – 4 µm (●); 2 – 19 µm (▲); 3
– 60 µm (■) através do empacotamento de partículas de tamanho 0.375 mm. Espaços vazios
da coluna 0V = 550 mL.
A análise das Figuras 3.19. a 3.21. e 3.22. a 3.24. mostra que com o aumento de λ a
quantia de partículas retidas pelo empacotamento aumenta devido ao efeito de filtração. A
teoria de filtração num leito profundo foi construída a partir da simples base de que a remoção
de partículas é uma mudança da concentração (C ) numa profundidade ( L ) e é governada por
um coeficiente de filtração ( fk ) que é afectado através de vários parâmetros [90]:
CkLC
f=∂∂
− (Equação 3.22)
Contudo, devem ser considerados os importantes mecanismos de transporte:
intercepção, difusão, sedimentação, e efeitos de fluxo hidrodinâmicos. Em processos de
separação com envolvimento de meios porosos a tortuosidade do meio pode afectar a
eficiência do filtro através de modos diferentes, Figura 3.25.
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 20000,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
C, g
/L
V, mL
3
1
2
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 20000,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
3
2C, g
/L
V, mL
1
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
32
C, g
/L
V, mL
1
Apresentação e Discussão dos Resultados
81
Figura 3.25. Esboço de filtração num meio poroso profundo. Possíveis influências da
tortuosidade: efeito de inércia, sedimentação, adsorção.
Do ponto de vista do efeito de exclusão da partícula, os dados apresentados na Figura
3.26. mostram que a retenção τ aumenta com a diminuição do tamanho das partículas. Como
foi referido anteriormente para um capilar cilíndrico a relação entre τ e λ é definida por: 2)1/(1 λτ −= , onde a ordem da potência igual a dois pode ser considerada como a dimensão
de espaço que pode ser testada pela partícula. O coeficiente numérico na equação
apresentada pode ser correlacionado com a tortuosidade do caminho da partícula.
1E-3 0,01 0,1 10,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
τ
λ
12 3
λ = 0.5A B
C
Figura 3.26. Variação do tempo de retenção τ com a razão do tamanho da molécula com o
tamanho do poro λ para partículas de vidro de 4 µm (●); 19 µm (▲) e 60 µm (■), obtida para
colunas com empacotamentos de partículas iguais com o tamanho: A – 1.125 mm, B – 0.875
mm, e C – 0.375 mm. Curvas: 1 – 2)1(551 λ/.τ −= ; 2 – 2)11.35/( λ−=τ ; 3 – )1(1 λτ −= / .
Na Figura 3.27. são mostrados alguns efeitos que podem afectar o movimento de
partículas e são dadas, a seguir, explicações qualitativas observadas nos resultados da Figura 3.26.
Apresentação e Discussão dos Resultados
82
Figura 3.27. Esquema do poro de diâmetro médio avd com movimento descendente de
partículas grandes e pequenas.
Por causa da variação da secção transversal da passagem do fluxo estão presentes no
canal zonas estagnantes. As partículas maiores (partículas com 60 µm) são mais afectadas
pela força da gravidade e movem-se perto da linha central do canal (sofrem um efeito de
exclusão mais significativo assim como também encontram/tornam alguns poros indisponíveis).
Partículas menores (com 4 µm e 19 µm) têm mais espaço e, em comparação com as partículas
maiores seguem, em média, um caminho mais tortuoso.
Para partículas de tamanho 60 µm os dados experimentais aproximam-se à fórmula
)1(1 λτ −= / o que significa, tendo em conta os efeitos atrás mencionados, que os poros de
filtração de partículas são testados como um espaço de dimensão e, respectivamente, o
comprimento do caminho se aproxima a valores mínimos.
As leveduras têm uma forma circular, tal como as esferas de vidro. Por esta razão, é
curioso comparar o comportamento destas partículas que tem a mesma forma mas densidades
diferentes.
Na Figura 3.28. são comparados resultados obtidos para esferas de vidro com os
resultados da filtração de Saccharomyces cerevisiae. O tamanho das leveduras ( d = 4.6 µm) é
próximo do tamanho das partículas de 4 µm mas a densidade das primeiras é cerca de 2.5
vezes inferior à das esferas de vidro e observam-se comportamentos, completamente
diferentes que podem ser descritos pelo modelo de cromatografia hidrodinâmica (HDC) com
um coeficiente de 1.6: )8.221/(6.1 2λλτ −+= .
O coeficiente pode ser considerado como proporcional na fórmula 2τ = 1.6, sendo τ ,
nesta relação, o parâmetro tortuosidade. Consequentemente, a tortuosidade situa-se perto do
valor de 1.265. Esta suposição conduz à equação de HDC modificada na forma:
)8.221/( 2λλτ −+= A e 2τ∝A . Pode-se considerar esta conclusão como o seguinte: o
efeito de HDC pode ser observado a certas condições (presumindo a diferença significativa de
dpav Zona estagnante
Apresentação e Discussão dos Resultados
83
densidades das partículas) quando as partículas eluem depois do traçador e afectam a ordem
de retenção esperada.
1E-3 0,01 0,1 10,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
τ
λ
Leito binário
12
34
Figura 3.28. Variação do tempo de retenção τ com a razão do tamanho da molécula com o
tamanho do poro λ para Saccharomyces cerevisiae (●) e partículas de vidro de 4 µm (●); 19
µm (▲) e 60 µm (■). A seta indica o resultado obtido com o empacotamento binário. Curvas: 1