EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES GINA PAOLA SOLANO FLOREZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de Bióloga PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Bogotá, D. C. 2007
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EVALUACION DE LA DIVERSIDAD GENETICA DE GRANADILLA final
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EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D. C. 2007
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________ Maria del Pilar Márquez M.Sc
Directora
________________________ ________________________ Ingrid Schuler Ph.D José Salvador Montaña M.Sc Jurado Jurado
EVALUACIÒN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________ ______________________ Angela Umaña Muñoz, M.Phil Andrea Patricia Forero Decana Académica Directora de Carrera
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
A Dios y a mis padres por su ejemplo de lucha, por sus sabios consejos; agradezco
su compresión, su dulzura y dedicación
A mi hermana por que ha contribuido con mi formación a lo largo de mi vida y mi
carrera.
A mi familia y Cesar por el cariño y apoyo durante todo este tiempo, a todos gracias
por que hoy alcanzo una meta más en mi vida
vi
Agradecimientos Durante este proceso de preparación como profesional y crecimiento personal han
sido muchas las personas que de una u otra forma han colaborado y enriquecido mi
vida tanto profesional como personal.
A Maria del Pilar Márquez por su colaboración y constante asesoría por su
confianza, enseñanzas y amistad
A la Dra. Ingrid Schuler por brindarme la oportunidad, por la confianza depositada y
por posibilitar tantas oportunidades
A Andrea Forero por introducirme en el mundo de la biotecnología, por sus consejos
y sugerencias constructivas
A William Escobar y Nixon Pérez por su colaboración en el trabajo en campo
Al Centro de investigaciones y Estudios en Diversidad y Recursos Genéticos
CIEBREG
A Colciencias
A mis compañeros de laboratorio Diego Mejía, Paula Aguilar; a mi Amiga Ángela
García, a ellos por el apoyo moral y compañía en este tiempo, por enseñarme que la
paciencia es la mejor compañía y consejera en este trabajo
Finalmente, agradezco a todas aquellas personas de la Unidad de Biotecnología
Vegetal que colaboraron siempre que fue necesario para que este proyecto saliera
adelante; al igual que a todos mis compañeros de carrera.
2.2 Taxonomía Y Botánica ..................................................................................... 4 2.2.1 Descripción botánica de Passiflora ligularis, Juss ..................................... 5
2.3 Origen y distribución ........................................................................................ 6
2.4 Importancia Económica ................................................................................... 6
2.5 Condiciones De Cultivo y Propagación ........................................................ 9 2.5.1 Clima ............................................................................................................ 9 2.5.2 Suelos .......................................................................................................... 9 2.5.3 Biología reproductiva y Propagación ........................................................... 9 2.5.5 Usos y Propiedades ................................................................................... 11
2.6 Problemas Agronómicos y de Cultivo ......................................................... 12 2.6.1 Plagas y Enfermedades ............................................................................. 12
2.7 Marcadores genéticos .................................................................................... 14 2.7.1 Marcadores Moleculares ........................................................................... 14 2.7.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .......................................... 17
2.8 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) ................................. 19 2.8.1. Ventajas del Método ................................................................................. 19
2.9 Marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .............. 20 2.9.1. Ventajas del Método ................................................................................. 21
2.10. Extracción de DNA ....................................................................................... 22
2.12. ESTADO DEL ARTE DEL GENERO PASSIFLORA ................................... 26
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ___________________ 30 3.1 Problema y justificación ................................................................................ 30
5. OBJETIVOS _____________________________________________________ 32 5.1 Objetivo General ............................................................................................. 32
6. MATERIALES Y METODOS ________________________________________ 32 6.2 Material utilizado ............................................................................................. 34
6.3 Fase de Laboratorio ....................................................................................... 34 6.3.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA .............................. 34
6.4 Cuantificación de DNA ................................................................................... 35
6.5 RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar) .............................................. 36
6.6 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................... 38
6.7 Análisis de datos ............................................................................................ 41 6.7.1 Extracción de DNA ..................................................................................... 41 6.7.2 Análisis RAPD y AFLP ............................................................................... 42
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ______________________________________ 42 7.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA ............................... 42
7. 2. Análisis RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado al azar) .................... 49
7.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................... 54
Tabla 10. Condiciones de PCR para RAPD_______________________________51 Tabla 11. Ciclos de temperatura del termociclador_________________________51
Tabla 12. Porcentaje de polimorfismos y bandas en el ensayo de AFLP________54
x
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Comportamiento de la producción de granadilla (Passiflora ligularis) en Colombia desde 1992 hasta 2003. ............................................................................... 7 Figura 2. Representación de las posibles combinaciones de las OTU. ................... 24 Figura 3. Diagrama deSíntesis de la metodología .................................................... 33 Figura 4. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido seco (A) y tejido conservado e frio (B), con los diferentes protocolos .................................................. 43 Figura 5. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido conservado en frio mediante el protocolo 3 (Mc Couch I et al 1988) de los 90 individuos colectados. ... 45 Figura 6. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante marcadores molecualres RAPD………………………..53 Figura 7. Gel de acrilamida al 6% donde se observa la amplificación por medio de marcadores AFLP, combinaciones E- TA x M- CTT (90.63%), E-TT x M- CAA (61.54%), E- AT x M- CTT (90.82%). ......................................................................... 55 Figura 8. Dendrograma usando el algorismo UPGMA, basado en el indice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante maracadores moleculares AFLP……………………….
xi
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Procedencia del material vegetal de Passiflora ligularis analizado mediante RAPD _______________________________________________ 70 Anexo 2. Protocolos evaluados para la extracción de DNA total de tejido foliar de Passiflora ligularis ______________________________________________ 75 Anexo 3. Protocolo de extracción de DNA. MC Couch, S.R, G. Kochert, Z.H. Yu,ZY. Wing, G.S. Khush, W.R Coffman y S.D.Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chomosome. Theor Appl.Genet 76: 815-829 (Modificado) __________________ 77 Anexo 4. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA muestras Quindío, Risaralda y Tolima, protocolo de Mc Cauch modificado tejido fresco _________________ 79 Anexo 5. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido fresco __________ 81 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido fresco ___________________________________________ 81 Anexo B. Cuantificación de cantidad de DNA (µg/ml) Muestras Quindío y Risaralda tejido fresco ___________________________________________________ 81 Anexo 6. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido seco ___________ 82 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido seco ____________________________________________ 82 Anexo B. Cuantificación de Cantidad de DNA (µg/ml) Tejido seco ___________ 82 Anexo 7.Resultados para la prueba de medias de Duncan ________________ 83 Anexo 8. Productos de amplificación marcador RAPD ____________________ 87 Anexo 9. Productos de Pre amplificación marcadores AFLP ________________ 89 Anexo 10. Formato libreta de campo ________________________________ 90 Anexo 11. Protocolo de tinción con nitrato de plata ______________________ 91
RESUMEN
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la
familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia es uno de los mayores productores de esta fruta a escala mundial gracias
a las campañas de consumo de productos exóticos que vienen realizando los países
productores de la fruta en todo el mundo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del
conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se
concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso
de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad
genética y las relaciones entre grupos de interés.
En este estudio se evaluaron individuos de Passiflora ligularis procedentes del eje
cafetero, para estimar la diversidad genética con marcadores RAPD y AFLP, como
un primer acercamiento al análisis de diversidad genética dentro de la especie. El
protocolo de extracción de DNA de Mc Couch modificado (1988) permitió obtener
DNA de calidad y cantidad óptima para la amplificación con marcadores
moleculares.
Se obtuvo un protocolo óptimo de amplificación para los marcadores RAPD,
evidenciándose un bajo polimorfismo en la población evaluada con 11 “primers”, lo
cual se refleja en índices de similitud altos. De la misma forma para los marcadores
AFLP se establecieron las combinaciones de “Primers” que evidencian el mayor
polimorfismo.
Se sugiere que los AFLP pueden generar mayor información en el análisis de
diversidad, debido a que presenta el mayor grado de polimorfismo, siendo las
combinaciones E- AT x M-CTT, E- TA x M- CTT, E- TG x M- CTG las más
informativas con un total de 231 bandas polimórficas.
2
1. INTRODUCCION El conocimiento de la distribución de la variabilidad genética es de suma importancia
para el desarrollo de estrategias de conservación efectivas. La variabilidad puede
ser muy diferente entre especies y entre poblaciones de una misma especie y esta
variabilidad puede ser de gran interés para programas de selección y mejoramiento
de especies con valor comercial y ambiental.
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la
familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia se caracteriza por ser uno de los mayores productores de esta fruta a
escala mundial, junto con Venezuela, Sudáfrica y Australia. La granadilla ha ganado
importancia en el comercio internacional gracias a las campañas de consumo de
productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta a escala
mundial.
La granadilla presenta un mercado interno activo, siendo los departamentos de
Huila, Risaralda, Valle del cauca, Cundinamarca y Tolima los principales
productores. La fruta además se exporta a diferentes países con beneficios
arancelarios que la ponen en una situación ventajosa frente a otros productos. Sin
embargo hasta el momento no existen investigaciones que permitan el desarrollo de
un paquete tecnológico para el fomento del cultivo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del
conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se
concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso
de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad
genética y las relaciones entre grupos de interés. La primera fase de este proceso
requiere ajustar los protocolos de extracción de DNA y amplificación para RAPD y
AFLP, para la especie en estudio.
3
Dentro de estos marcadores moleculares encontramos los RAPD (Random
Amplification of Polymorphic DNA), desarrollados por Williams et al. (1990); los
cuales están basados en la amplificación de DNA geonómico mediante la utilización
de “primers” de secuencia nucleotídica corta (10 nucleótidos) al azar; donde los
productos de amplificación son separados en geles de agarosa.
Por otra parte los marcadores moleculares AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), es un método altamente sensible para detectar polimorfismos de
DNA (Vos et al., 1995), que combina una digestión enzimática con endonucleasas,
con una amplificación posterior por PCR. El análisis de AFLP permite obtener
marcadores dominantes, no específicos para un locus, se caracteriza por presentar
una alta resolución y sensibilidad al mostrar los polimorfismos y no requieren
información previa del genoma en estudio.
Estas son dos de las herramientas más utilizadas y sugeridas para los estudios de
variación genética. Igualmente han sido aplicadas en estudios de genotipificación,
diferenciación poblacional y diversidad genética en una gran variedad de
organismos, al igual que para realizar selección asistida por marcadores.
Con este trabajo se pretende caracterizar molecularmente el material de granadilla
cultivado en una de las zonas de mayor producción en Colombia como lo es el Eje
Cafetero, como un primer paso para el futuro desarrollo de programas de fomento
para esta especie.
4
2. MARCO TEORICO
2.1. Clasificación botánica
Reino: Vegetal
División: Angiospermas
Clase: Dicotyledoneas
Subclase: Archiclamydeeae
Orden: Violales
Suborden: Flacourtineae
Familia: Passifloraceae
Género: Passiflora
Especie: Passiflora ligularis
Nombre común: Granadilla dulce
Sinónimos (Romero 1991): Passiflora ligularis Juss. Var. germiniflora DC
Passiflora loweri Heer
Passiflora serratispula DC
Passiflora tiliaefolia
2.2 Taxonomía Y Botánica
La granadilla, Passiflora ligularis, Juss. Ann Mus. Hist. Nat. 6: 113.1805, pertenece a
la familia de las Passifloraceae. El nombre de la familia y del género principal,
Passiflora, tiene su origen en “flor de la pasión”, refiriéndose a la pasión de
Jesucristo (Escobar 1988).
Dentro de la familia de las Passifloraceae se encuentran plantas comunes como:
La visualización de los fragmentos amplificados se realizó en geles de poliacrilamida
al 6%, los cuales fueron corridos en la cámara de electroforesis vertical Sequi-Gen
GT Sequencing Cell de BioRad®, a 110W durante dos horas y media a una
temperatura de 50ºC. Los geles fueron teñidos siguiendo el protocolo de tinción con
nitrato de plata (anexo 12).
6.7 Análisis de datos
6.7.1 Extracción de DNA
En el análisis estadístico se evaluó cada uno de los factores (método de
extracción (A) y tipo de tejido (B) con el fin de definir la influencia tuvieron en
la calidad y cantidad de DNA extraído.
El modelo corresponde a la siguiente fórmula:
Yijk = μ + A + B + AB + ε
Donde Yijk es la variable de respuesta, μ es el efecto medio general, A es el efecto
del factor i, B es el efecto del factor ij, AB es la interacción del efecto del facto A con
el factor B y ε es el error experimental
42
La información fue procesada con el Programa Statistical Analysis System (SAS),
utilizando el procedimiento de modelos lineales (GLM). Para el análisis estadístico
se realizaron análisis de varianzas y comparación de medias utilizando la prueba de
intervalos múltiples de Duncan
6.7.2 Análisis RAPD y AFLP El análisis de los datos obtenidos de las amplificaciones mediante los marcadores
RAPD y AFLP se realizó mediante el establecimiento de una matriz binaria, donde la
presencia de bandas fue 1 y la ausencia 0, posteriormente estos datos fueron
analizados mediante la utilización del programa estadístico NTSys versión 2.0. con
el cual construyó una matriz de similitud utilizando el coeficiente o índice de Dice.
Una vez obtenida la matriz de similitud, los materiales de granadilla fueron
agrupados en “clusters” a través de un dendrograma, usando el algoritmo de
agrupamiento UPGMA (unweigthed pair group method), lo cual permitió visualizar
en dos dimensiones las similitudes o diferencias entre los materiales evaluados.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA
En general para los estudios de diversidad genética en plantas, utilizando
herramientas biotecnológicas como los marcadores moleculares, se hace necesario
el uso de métodos precisos y eficientes de extracción de DNA; los cuales dependen
directamente de la especie a trabajar, por tal motivo en este trabajo se evaluaron
diferentes protocolos de extracción de DNA, teniendo en cuenta dos tipos de tejido
seco y tejido conservado en frio.
El material colectado (tejido seco y tejido conservado en frio) fue macerado con
nitrógeno líquido lo cual permite que el DNA obtenido sea de alto peso molecular;
permitiendo la separación de células unidas mediante pectina, al igual que permite
el rompimiento de las paredes celulares por daño mecánico y la lisis de los
protoplastos (Boiteux et al. 1999).
43
Empleando el material vegetal seco se evaluó la eficiencia de extracción de algunos
protocolos de extracción de DNA sugeridos en la literatura. La mayor cantidad de
DNA se obtuvo con el protocolo de Mc Couch (3) con una concentración promedio
de DNA 778.97 µg/ml seguido por el protocolo de Doyle & Doyle (2) con una
concentración promedio de 660.16 µg/ml. El protocolo 6 presentó las
concentraciones más bajas de DNA 83.74 µg/ml (anexo 6. B)
Con respecto a la pureza del DNA, los valores más altos se lograron mediante los
protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch I (3) con valores de A260/A280 = 1.34 y
A260/A280 = 1,41 respectivamente; el valor más bajo A260/A280 = 1.18 se obtuvo con el
protocolo 1 (anexo 6.A), resultado que confirma lo observado en el gel de agarosa
(figura 4) donde se vio un alto nivel de degradación en estas muestras.
Figura 4. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido seco (A), (individuos 1- 5) y tejido
conservado en frio (B), (individuos 1-8), con los diferentes protocolos de extracción de DNA.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el tejido seco, se seleccionaron los
protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch (3) para ser evaluados en el tejido
conservado en frio. Los resultados obtenidos indican que con el protocolo de Mc
EXTRACCION DE DNA CON TEJIDO CONSERVADO EN FRIO (B)
EXTRACION DE DNA CON TEJIDO SECO (A)
Doyle & Doyle (2) Mc Couch (3)
Doyle & Doyle (2) Dellaporta II (6) MC Couch (3) Dellaporta (1) Dellaporta I (5) Mc Couch (4)
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Couch (3) se obtiene un DNA de mayor grado de pureza (radio A260/A280 =1.81) que
con el protocolo de Doyle &Doyle (2) (radio A260/A280 =1.79) (anexo 5.A). Sin
embargo, según la prueba de de comparación de medias de Duncan (anexo 7), no
existen diferencias significativas entre los dos métodos (p<0,38) (Tabla 9); mientras
que si existen diferencias significativas con respecto al tipo de tejido utilizado
(p<0,0001) (Tabla 9). Estos resultados sugieren que para la extracción eficiente de
DNA de Passiflora. ligularis puede ser utilizado tejido conservado en frio con
cualquiera de los dos métodos.
Teniendo en cuenta la interacción entre el método de extracción y el tipo de tejido, la
prueba de comparación de medias de Duncan (anexo 7) sugiere que no existen
diferencias significativas (p<0,56) (Tabla9).
La cantidad de DNA obtenida con los protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch
(3) fue de 820,4 ug/ml y 1543,3 ug/ml respectivamente (anexo 5.B). La prueba de
comparación de medias de Duncan indica que no hay diferencias significativas entre
los métodos de extracción empleados (p<0,056) (Tabla9) y la interacción entre el
método y el tejido (p<0,165) (Tabla 9), mientras que si existen diferencias
significativas con respecto al tipo de tejido utilizado (p<0,036) (Tabla9). Nuevamente
los resultados sugieren que para una extracción eficiente de DNA de Passiflora
ligularis debe ser utilizado tejido conservado en frio con cualquiera de los dos
métodos.
Tabla 9. Incidencia de los distintos factores (método y tipo de tejido) y sus interacciones en la pureza y cantidad de DNA extraído según el modelo factorial.
Variables de Respuesta Componentes de varianza (%)
Fuente de Variación Pureza Cantidad Método 1.07 36.76
Tejido 98.46** 44.30*
Método * Tejido 0.47 18.94 *P< 0.05 **P<0.01
45
Aunque las diferencias entre los dos métodos no fueron significativas, se eligió el
protocolo Mc Couch I 1988 (3) para realizar la extracción de DNA de todos los
individuos colectados.
Los resultados de concentración de DNA y pureza obtenidos mediante el protocolo
de Mc Couch I 1988 (3) en los 90 individuos se muestran en el anexo 4 y la figura 5.
Figura 5. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido conservado en frio mediante
el protocolo de Mc Couch I et al 1988 (3) de los 90 individuos colectados.
La degradación observada en algunas de las muestras puede atribuirse a la acción
rápida de nucleasas, liberadas al iniciarse el proceso natural de degradación de los
tejidos (figura 5), este efecto se evidencia en el tejido seco donde se presenta una
mayor degradación con respecto al tejido conservado en frio (figura 4) (Hills et al.
1990).
46
Hills et al. (1990) plantean que la ventaja de un protocolo de extracción de DNA con
respecto a otros está directamente relacionada con el método de preservación del
material inicial (fresco, seco o congelado), siendo ésta la que mayor incidencia tiene
a la hora de obtener una DNA de alta calidad y pureza. De manera similar el estado
sanitario, fisiológico y químico de las muestras, inciden en la calidad y pureza del
DNA, lo cual se evidencia en este trabajo y concuerda con el estudio desarrollado
por Michiels (2003) donde establece que la calidad del DNA extraído está
directamente relacionada con la edad y las condiciones de crecimiento del material
vegetal utilizado.
Adicionalmente Rodríguez (2001) indica que el utilizar cantidades pequeñas de
material para la extracción (miniprep), como se hizo en este trabajo, ayuda a
disminuir la acción de nucleasas y otros procesos degenerativos en la muestra, lo
cual se evidencia en el aumento de la calidad del DNA aislado.
El desarrollo de métodos moleculares ha llevado a la necesidad de crear
metodologías de extracción de DNA más simples y eficientes. Sin embargo
variantes en la eficiencia de la lisis, el rendimiento y la pureza de DNA pueden
afectar los resultados de otras técnicas moleculares como la PCR. Las diferencias
básicas entre las metodologías aplicadas en este estudio radican en el número de
pasos empleados en el proceso de extracción y la composición del buffer de lisis; el
cual generalmente está compuesto de un agente estabilizador del pH, una sal para
precipitar las proteínas del DNA, un detergente para solubilizar las membranas e
inactivar algunas enzimas y un inhibidor de DNAsas (Bered 1998).
Las dos metodologías de extracción de DNA evaluadas se diferencian
principalmente en el buffer de extracción utilizado para la lisis, así como en los
reactivos utilizados para la precipitación de proteínas y sustancias utilizadas para la
remoción de contaminantes.
La presencia de EDTA en el buffer de extracción es de vital importancia, debido a
que es un agente quelante de iones metálicos de Ca++ y Mg++, que rompe la tensión
superficial de los lípidos de todos los sistemas internos de la membranas,
47
contribuyendo a la lisis celular, es por esto que se convierte en uno de los
compuestos fundamentales de todos los buffer de extracción (Gonzáles 1995).
En el protocolo de Mc Couch I 1988 (3) se utiliza como detergente el SDS el cual
solubiliza proteínas y componentes de tejidos de membrana, mientras que con el
protocolo de Doyle & Doyle 1990 (2) se utiliza CTAB que es un detergente catiónico,
que permite la solubilización de compuestos de tipo polisacárido. Se encontró que le
protocolo de Mc Couch I 1988 (3) fue más eficiente en los procesos de lisis, si se
tiene en cuenta que las Passifloras tienen un alto contenido de proteínas (Duke
1989).
En la purificación del DNA extraído se debe tener en cuenta que este se encuentra
ionizado. Los grupos fosfato de carga negativa se encuentran distribuidos a lo largo
de la cadena DNA y al agregar una sal como el acetato de Potasio, se forma una sal
sódica de DNA la cual tiene la capacidad de aumentar el poder iónico de la solución
facilitando la precipitación alcohólica de DNA por medio del isopropanol (Gonzalez
et al. 1995).
En el protocolo de Mc Couch (3) se realizaron dos lavados, uno de ellos con Acetato
de potasio y el otro con u buffer de lavado que contenía acetato de sodio e
isopropanol, lo que representa una ventaja frente al método de Doyle & Doyle 1990
(2) donde se realiza un solo lavado. Teniendo en cuenta que la especie trabajada
presenta altos niveles de contaminantes (Duke 1989), el método de Mc Couch (3)
es más eficiente, lo cual se ve claramente reflejado en la pureza obtenida.
De igual manera el tiempo y los pasos empleados en la purificación de DNA pueden
estar relacionados con la cantidad y la calidad del DNA obtenida al finalizar el
proceso de extracción. Boiteux (1999) evidencio una pérdida significativa de DNA
con protocolos que superaban las 2 horas; sin embargo lo que se observó en este
trabajo es que en el protocolo de Doyle & Doyle 1990 (2), en el cual se emplean 3
horas 40min, se ve una disminución en la cantidad de DNA obtenido. Contario a lo
que sucede con el protocolo de Mc Couch I 1988 (3) donde se emplearon 5 horas
en el proceso, teniendo en este una cantidad y calidad del DNA mayor.
48
Fraga et al (2004) proponen que al disminuir los pasos empleados en el proceso de
extracción y el tiempo de cada uno, disminuye las posibles contaminaciones y
perdida de DNA accidentales; con lo cual se obtendría mayor concentración y
rendimiento del mismo.
Teniendo en cuenta lo anterior se plantea que los protocolos demasiado
simplificados, dan como resultado un DNA parcialmente degradado o con
contaminantes, que a pesar de posibilitar la amplificación por PCR, compromete la
reproducibilidad de los resultados, generando de esta manera, falsos positivos
(Romano 1998, Fraga et al. 2004).
Uno de los mayores problemas que se encuentran al momento de aislar DNA son
los compuestos fenólicos y los metabolitos secundarios que presentan la especies
vegetales, puesto que estos degradan el DNA, al igual que inhiben la acción de la
taq polimerasa, la cual es fundamental en los procesos que involucran PCR
(Molinari 2001).
Se sabe que las especies de Passifloras poseen niveles variados de metabolitos
secundarios, entre los que se encuentran alcaloides, esteroides, flavonoides,
glicosideos, cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos (Duke 1989).
Para la remoción de estos metabolitos secundarios y la eliminación de lípidos se
requiere de métodos orgánicos, en el caso del protocolo de Mc Couch I 1988 (3) se
adicionó un lavado con cloroformo, el cual remueve los residuos fenólicos presentes
en la muestra y disuelve componentes orgánicos como clorofila e hidrofenoles. Por
su naturaleza apolar captura lípidos y evita la precipitación de proteínas
hidrofóbicas denaturadas (Chaves et al. 1995).
Cabe mencionar que la degradación que se presentó en algunas muestras se debe
en principio, a que el tejido vegetal es expuesto a un daño mecánico que hace que
se produzcan fenoles durante la lisis como respuesta al estrés, lo cual afecta
considerablemente la calidad del DNA. Cuando el tejido se oxida se forman
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quinonas, las cuales inhiben la acción de algunas enzimas, por esto se recomienda
la utilización de algunos antioxidantes como PVP, bisulfito de sodio o β-
mercaptoetanol, en el protocolo de extracción (Kim et al. 1997).
Por último para el aislamiento de DNA genómico además del método empleado, es
importante realizar una adecuada selección del material vegetal. Esto incluye,
colectar material joven pero completamente desarrollado y en buen estado
fitosanitario (Dellaporta 1983).
7. 2. Análisis RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado al azar)
Para el marcador molecular RADP no existe un protocolo generalizado que sea
óptimo para todas las condiciones de la PCR; de esta manera se hace necesario
evaluar estas para cada especie a trabajar. Según Mc Pherson et al (1995), algunas
de las recomendaciones a la hora de establecer las condiciones adecuadas para la
PCR son:
Calidad del DNA: esta debe ser evaluada con el fin de obtener una buena
amplificación del mismo. La amplificación con muestras muy diluidas de DNA
generan un exceso de reactivos con respecto a la disponibilidad del DNA a
amplificar, lo cual hace menos probable la colisión entre el “primer” y su sitio de
especificidad y muy poca o nula amplificación (en estos casos se recomienda
adicionar primero los “primers” y luego de pasado un ciclo adicionar los reactivos
faltantes, ayudando a la unión adecuada del primer con el DNA) (Mc Pherson et al.
1995, Varon 2000). Según los resultados de amplificación obtenidos se determinó
que la concentración óptima de DNA es de 30ng por reacción, para obtener una
buena amplificación.
Concentración de cloruro de magnesio: al variar la concentración final se evidenció
que a una concentración final de 2.25mM de MgCl2 no se presentó amplificación,
mientras que con una concentración final de 2.5mM se obtuvieron amplificaciones;
sin embargo las bandas obtenidas con esta concentración no fueron bien definidas y
50
nítidas. Por tal motivo se decidió aumentar la concentración final a 2.75mM, con la
cual se obtuvieron buenos resultados, pues se consiguió una amplificación y una
intensidad de bandas optima para el análisis.
Mc Pherson et al (1995) plantean que la concentración de cloruro de magnesio
(MgCl2) es fundamental para determinar la intensidad de las bandas amplificadas.
En general un incremento en la concentración de este, aumenta el producto de PCR
pero disminuye la especificidad y fidelidad de los productos amplificados; a bajas
concentraciones puede inhibirse la acción de la Taq polimerasa y no producirse
amplificación.
Otra posible explicación a la falta de amplificación de algunos “primers” en donde se
evidencia la ausencia de bandas, es que no exista complementariedad entre las
bases nucleotídicas del “primer” y las bases del DNA molde de la especie vegetal
evaluada (Williams et al. 1990, De Vienne 2003).
Otra de las condiciones que se deben tener en cuenta en la amplificación por medio
de RAPD es la temperatura de anillamiento, debido a que es fundamental para la
hibridación específica de los “primers”; generalmente variando la temperatura de
anillamiento se obtienen diferentes grados de especificidad y eficiencia del proceso
de amplificación. Se ha establecido que la temperatura de anillamiento depende
directamente del tamaño de los “primers” y de su contenido de G-C. Se ha
establecido que para los “primers” de RAPD pueden oscilar entre 36° y 44°C
(Weising et al. 2005, Davis et al. 1994, Mc Pherson et al. 1995). Teniendo en cuenta
los resultados obtenidos con cada una de los perfiles de amplificación ensayados en
este trabajo se estableció que la temperatura óptima de anillamiento es de 40°C.
Las condiciones utilizadas para el análisis de las muestras de Passiflora ligularis
mediante marcadores moleculares RAPD se muestran en el Tabla 10, para una
reacción de 25 µl volumen final; el perfil de amplificación establecido se muestra en
el Tabla 11.
51
Tabla 10. Condiciones de PCR para RAPD Reactivo Concentración
Stock Concentración
Final
Buffer 10 X 1 X
MgCl2 50 mM 2.75 mM
dNTPs 10 mM 0.25 mM
Taq polimerasa 5 u/µl 1 u
Primer 25 µM 7 µM
DNA 5 ng/µl 30 ng/µl
H2O
Tabla 11. Ciclos de Temperatura del Termociclador
Ciclos Temperaturas y Tiempos
Pre denaturación 94° C x 5 min
Denaturación 94° C x 30 seg
Anillamiento 40° C x 30 seg
Extensión 72° C x 1min
Paso 2-4 34 veces
Extensión final 72° C x 5 min
Terminación 4° C
Los 33 “primers” probados inicialmente todos amplificaron, sin embargo de estos se
seleccionaron 11, los cuales presentaron el mayor número de bandas amplificadas.
Los “primers” seleccionados fueron OPB 11, OPB 20, OPAM 4, OPAN 8, OPAA 6,
OPG 8, OPAM 10, OPAN 5, OPAN 17, OPB 18, OPAB 5 (anexo 8). En los que se
obtuvieron un total de 66 bandas, de las cuales 24 fueron polimórficas.
El dendrograma obtenido a partir de los marcadores RAPD (Figura 6) reveló una
baja variabilidad entre las cuatro procedencias de Passiflora ligularis evaluadas,
evidenciándose índices de similitud altos entre la poblaciones; de esta manera se
observa una agrupación entre las procedencias 2 (Quindío, Calarcá) y 3 (Quindío,
Génova) con un porcentaje de similitud del 96%, seguido por la procedencia 1
(Quindío, Salento) con un porcentaje de 89%, siendo la procedencia 4 (Risaralda,
Santa rosa), la que presenta un índice de similitud más bajo 0.84.
52
Por otra parte las agrupaciones obtenidas presentan concordancia con la ubicación
geográfica de las poblaciones evaluadas; sin embargo cabe anotar que los índices
de similitud preliminares obtenidos sugieren que a pesar de la distancia geográfica
entre las poblaciones, la variabilidad intraespecífica de los materiales cultivados se
ha visto disminuida con el tiempo, comparado con los resultados obtenidos por
Fajardo (1998), donde se evidenció una alta variabilidad intraespecífica en
Passiflora ligularis, a pesar de que todas las accesiones evaluadas provenían de la
región donde se concentraban la mayor área de producción (Urrao, Antioquia).
Una posible explicación a la pérdida de pool genético dentro de la especie a través
del tiempo, puede ser el comportamiento errante del cultivo, debido a las
enfermedades que lo atacan, entre las que se encuentran la secadera; de igual
manera, los estándares de calidad exigidos para la exportación de la fruta ha llevado
a concentrar la siembra con individuos más homogéneos, perdiendo de esta manera
la variabilidad entre las poblaciones.
Otro factor que puede estar influenciando el nivel de variabilidad en la región es el
constante intercambio de semillas entre los cultivadores, según los datos
suministrados por los cultivadores, las semillas de las procedencias 2 y 3 son
originarias de Génova (Quindío), esta sería una de las razones por las cuales estas
dos procedencias presentan una alta similitud. Mientras que las semillas de la
procedencia 1 y 4 provienen de Santuario (Risaralda) y Urrao, (Antioquia)
respectivamente.
53
Figura 6. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante marcadores moleculares RAPD. 1 Salento (Quindío), 2 Calarcá (Quindío), 3 Génova (Quindío), 4. Santa Rosa (Risaralda).
54
7.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Se evaluaron diez combinaciones diferentes de “primers”, donde las combinaciones
más informativas fueron E- AT x M-CTT, E- TA x M- CTT, E- TG x M CTG, por
presentar el mayor porcentaje de polimorfismo y mayor número de bandas
amplificadas, como se muestra en el Tabla12. Tabla 12. Porcentaje de polimorfismos y bandas detectadas en el ensayo de AFLP Combinación Número total
de bandas Bandas
monomórficasBandas
Polimórficas Porcentaje de polimorfismo
%
E-AG x M-CAA 10 7 3 30
E-TC x M-CAA 9 6 3 33.33
E-TT x M- CAA 13 5 8 61.54
E-AT x M-CTT 98 9 89 90.82
E-TA x M-CTT 64 6 58 90.63
E-TG x M-CTG 86 4 86 95.35
E-AA x M-CTA 8 6 2 25
E-AC x M-CTA 5 4 1 20
E-AA x M-CAG 12 5 7 58.33
E-AC x M-CAG 7 4 3 42.85
Las combinaciones de “Primers” más polimórficas fueron (E- AT x M-CTT), (E- TA x
M- CTT), (E- TG x M CTG) que generaron en total 231 bandas polimórficas (Tabla10
y figura 7).
55
Figura 7. Gel de acrilamida al 6% donde se observa la amplificación por medio de
marcadores AFLP, combinaciones E- TA x M- CTT (90.63%), E-TT x M- CAA (61.54%), E-
AT x M- CTT (90.82%).
La obtención de bandas polimórficas mediante el uso de marcadores moleculares
AFLP en Passiflora ligularis permite confirmar la aplicabilidad de esta herramienta
molecular en el estudio de diversidad genética de los materiales cultivados de
granadilla del eje cafetero. Según Engelborghs et al. (1998), los microsatélites, y los
AFLP pueden ser los marcadores más adecuados para el análisis de diversidad
genética, debido al alto poder de detección de polimorfismos de estos marcadores.
Lo cual se corrobora al observar el porcentaje promedio de polimorfismo obtenido
mediante los AFLP que es del 92.27%.
Con el dendrograma obtenido mediante marcadores moleculares AFLP (Figura 8) se
obtienen índices de similitud bajos dando como resultado la agrupación entre la
procedencia 2 Calarcá (Quindío) y 3 Cajamarca (Tolima) con un índice de similitud
de 0.63, seguido de la procedencia 1 Calarcá (Quindío) con un índice de similitud de
56
0.48, siendo la población 4 Cajamarca (Tolima) la que presenta el índice de similitud
más bajo entre las cuatro procedencia evaluadas (0.43).
Figura 8. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de
Dice. Muestra la similitud entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante
Weising, K., Nybon,H., Wolff,K., Kahl, G. 2005. DNA Fingerprinting in plants, principles,
Methods, and Application. Second edition. Pp 142.
Welsh, J., Mc Clelland, M. 1990. Fingerprinting Genome Using PCR with arbitrary primers.
Nucleic Acid Research 18: 1213-1218.
Williams, J., Kubelik, A., Livak. K., Rafalski, J., Tingey, S. 1990. DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Research. 18
(22): 6531-6535.
69
11. ANEXOS
70
Anexo 1. Procedencia del material vegetal de Passiflora ligularis analizado mediante RAPD Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
Muestra N Wo
1 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
2 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
3 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
4 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
5 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
6 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
7 Quindío Salento Canaan La Linda 1926 4º 37`00`` 75º35`54,2``
8 Quindío Salento Canaan La Linda 1927 4º 37`00`` 75º35`54,2``
9 Quindío Salento Canaan La Linda 1928 4º 37`00`` 75º35`54,2``
10 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
11 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
12 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
13 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
14 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
15 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
16 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
17 Quindío Salento Palestina Buenos Aires 1699 4º37`24,4`` 75º36`14``
18 Quindío Salento Palestina Buenos Aires 1699 4º37`24,4`` 75º36`14``
19 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
71
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
20 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
21 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
22 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
23 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
24 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
25 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
26 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
27 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
28 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
29 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
30 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
31 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
32 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
33 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
34 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
35 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
36 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
37 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
38 Quindío Génova San Juan Alto La Ilusión 2011 4º9`6,7`` 75º48`14,2``
39 Quindío Génova San Juan Alto La Ilusiòn 2011 4º9`6,7`` 75º48`14,2``
40 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º45`46,11``
72
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
41 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º45`46,11``
42 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º 5`46,11``
43 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
44 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
45 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
46 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
47 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
48 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
49 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
50 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
51 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
52 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
53 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
54 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
55 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
56 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
57 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
58 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
59 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
60 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
61 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
73
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
62 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
63 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
64 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
65 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
66 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
67 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
68 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
69 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
70 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
71 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
72 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
73 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
74 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
75 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
76 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
77 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
78 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
79 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
80 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
81 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
82 Tolima Cajamarca La pepita
74
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
83 Tolima Cajamarca La pepita
84 Tolima Cajamarca La pepita
85 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
86 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
87 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
88 Tolima Cajamarca La palmita
89 Tolima Cajamarca La palmita
90 Tolima Cajamarca La palmita
75
Anexo 2. Protocolos evaluados para la extracción de DNA total de tejido foliar de Passiflora ligularis ETAPAS Dellaporta II Mc Couch Doyle & Doyle Mc Couch (I) Dellaporta Dellaporta I
Isopropanol e incubación a – 80°C por 1 h ó -20 por 2h o toda la noche
Incubación a – 80°C por 1 h ó -20 por 2h o toda la noche con isopropanol
Sobrenadante se mezcla 1:10 con acetato de sodio 3 M pH 5.2 y vol. Igual al del isopropanol
Adicional 700µl de isopropanol . incubar a -80°C por 1h ó a -20°C por 2h
Añadir 1:10 de volumen de acetato de sodio 3M pH 5.2 y 6:20 de isopropsnol . incubar a -20°C por 1h o toda la noche.
76
Lavado del DNA Al pellet se
agrega buffer T50E10 y se incuba a65°C X15´.Agregar isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Remover el isopropanol , dejar secar a T° ambiente
Al pellet se agrega buffer T50E10 y acetato de sodio 3M e isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Centrifugar y lavar con etanol al 70%, centrifugar, secar a T° ambiente
El pellet se lava con 70% y acetato de amonio 10mM. Incubar a -80°C X 1h ó -20°C X 2 o toda la noche, Centrifugar y secar a T° ambiente
El pellet se lava con etanol al 70%. Centrifugar y secar a T° ambiente
Al pellet se agrega buffer T50E10 y se incuba a65°C X15´.Agregar isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Remover el isopropanol , dejar secar a T° ambiente
Lavar e l pellet con 1ml de etanol al 70% a-20°C
RESUSPENCION
FINAL Resuspender en T50E10 RNAsa Incubar a 37°C por 15´
Resuspender en T50E10 con RNAsa. Incubar a 37°C por 15´
Resuspender en TE con RNAsa.
Resuspender en TE con RNAsa. Incubar a 37°C por 30´
Resuspender en TE con RNAsa. Incubar a 37°C por 30
Resuspender en TE pH 8.0 con RNAsa. Incubar a 37°C por 30´
77
Anexo 3. Protocolo de extracción de DNA. MC Couch, S.R, G. Kochert, Z.H. Yu,ZY. Wing, G.S. Khush, W.R Coffman y S.D.Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chomosome.
Theor Appl.Genet 76: 815-829 (Modificado)
1. A 300mg tejido macerado con nitrógeno liquido, agregar 700µl de buffer de
extracción previamente calentado a 65ºC.
2. Incubar la mezcla a 65ºC durante 30 minutos agitando los tubos por inversión
suavemente cada cinco minutos.
3. Adicionar 500µl de de Acetato de Potasio 5M y se mezcla por inversión. Incubar en
baño de hielo durante 30 minutos con agitación
4. Centrifugar a 14 000 rpm durante 10 minutos
5. Rescatar el sobrenadante
6. Adicionar 500µl de cloroformo, mezclar por inversión por cinco minutos
7. Centrifugar a 14 000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente
8. Rescatar el sobrenadante sin tocar el cloroformo
9. Añadir 500µl de isopropanol a -20ºC , mezclar e incubar a -70ºC por una hora.
10. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 minutos a 4ºC
11. Resupender el precipitado en 900µl de buffer TE
12. Centrifugar a 300 rpm durante 10 minutos a 4ºC
13. El sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo, y se adiciona 75µl de acetato de
sodio 3M ph 5.2 y 500µl de isopropanol frió, mezclar e incubar a -70ºC por 30 minutos
14. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min a 4ºC, descartar el sobrenadante
15. Lavar el precipitado de DNA con 800µl de etanol al 70% frio
16. Centrifugar a 12 000 rpm por 5 min a 4ºC
17. Secar el precipitado a temperatura ambiente con el tubo en posición invertida.
18. Resuspender el DNA en 100µl de TE, agregar 1µl de RNAsa a 10mg/ml e incubar
a 37ºC por 30 minutos.
19. Al DNA resuspendido, agregar 1 volumen de cloroformo, mezclar por inversión
durante 5 minutos.
20. Centrifugar a 14 000 rpm durante 190 min.
21. Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo. Agregar 2.5 volúmenes de etanol
absoluto y 1:10 de acetato de amonio. Incubar por 2 horas a -20°C.
22. Centrifugar a 14 000 rpm durante 10 min; eliminar el sobrenadante y secar las
gotas poniendo el tubo invertido.
78
23. Lavar el pellet con etanol al 70%
24. Finalmente centrifugar a 12 000 rpm por 5 min, eliminar el sobrenadante; dejar
secar el pellet en posición invertida por 1 hora
Resuspender el pellet en 100µl de TE, agregar 2 l de RNAsa, incubar por 30 min a
37°C.
Buffer de extracción Tris-HCl 100mM, EDTA 50mM NaCl 500mM SDS 1.25% Bisulfito de sodio 0.38% Β- mercaptoetanol 1.5%
79
Anexo 4. Pureza y cantidad de DNA muestras Quindío, Risaralda y Tolima, protocolo de Mc Couch I tejido conservador en frio
Predio Muestras 260nm 280nm 260/280 Concentraciòn de ADN µg/ml Casa de lata 1 0,345 0,188 1,83 1709,5 Casa de lata 2 0,7 0,391 1,79 3494,5 Casa de lata 3 0,498 0,278 1,79 2494,5 La mirandita 4 0,254 0,138 1,84 1261,4 La mirandita 5 0,338 0,196 1,73 1681,4 La mirandita 6 0,236 0,13 1,82 1187,1
La Linda 7 0,209 0,121 1,73 1038,1 La Linda 8 0,117 0,067 1,75 585,93 La Linda 9 0,3 0,152 1,98 1489,4
El Topacio 10 0,312 0,174 1,79 1571,3 El Topacio 11 0,174 0,097 1,79 886,42 El Topacio 12 0,35 0,206 1,7 586,92 El Topacio 13 0,114 0,059 1,93 549,43 El Recreo 14 0,144 0,079 1,82 719,7 El Recreo 15 0,109 0,054 2 555,38 El Recreo 16 0,917 0,505 1,82 4830
Buenos Aires 17 0,359 0,191 1,88 1796 Buenos Aires 18 0,371 0,201 1,85 1857,8 La aguadita 19 0,116 0,068 1,71 712,56 La aguadita 20 0,208 0,11 1,89 1041,4 La aguadita 21 0,403 0,228 1,77 2011,9 La fortuna 22 0,082 0,041 1,99 412,41 La fortuna 23 0,337 0,186 1,81 1686,5 La fortuna 24 0,271 0,153 1,77 1348,7 Lomitas 25 0,228 0,127 1,8 1149,4 Lomitas 26 0,349 0,199 1,75 1737,8 Lomitas 27 0,801 0,443 1,81 4021,8 Lomitas 28 0,61 0,336 1,82 3052 El jardín 29 0,174 0,098 1,78 888,64 El jardín 30 0,482 0,264 1,83 2422,9 El jardín 31 0,113 0,059 1,92 548,37
La Primavera 32 0,495 0,276 1,79 2474,7 La Primavera 33 0,444 0,253 1,75 2208 La Primavera 34 0,407 0,241 1,69 2057,1
El Pino 35 0,493 0,285 1,73 2452,9 El Pino 36 0,727 0,428 1,7 3636,1 El Pino 37 0,327 0,183 1,79 3309,2
La Ilusión 38 0,433 0,235 1,84 2772,8 La Ilusiòn 39 0,157 0,087 1,8 762,58 La Shakira 40 0,283 0,157 1,8 2644,5 La Shakira 41 0,367 0,201 1,83 1854,8 La Shakira 42 0,172 0,101 1,7 860,49
Los naranjos 43 0,28 0,164 1,71 1416,9 Los naranjos 44 0,108 0,054 2 548,22
80
Los naranjos 45 0,489 0,285 1,72 2447,5 Bella Vista 46 0,382 0,216 1,77 1901Bella Vista 47 0,525 0,298 1,76 2629,6Bella Vista 48 0,2266 0,159 1,67 1325,4
La blanquita 49 0,405 0,23 1,76 2029,9 La blanquita 50 0,585 0,341 1,72 2934,6 La blanquita 51 0,402 0,239 1,68 2006,4 Las Cruces 52 0,189 0,11 1,72 948,85Las Cruces 53 0,318 0,187 1,7 1596,4Las Cruces 54 0,238 0,14 1,7 1173,7
La jirona 55 0,137 0,08 1,71 681,64 La jirona 56 0,326 0,192 1,7 1635,3 La jirona 57 0,279 0,163 1,71 1403,4
Anexo B. Cantidad de DNA (µg/ml) Muestras Quindío y Risaralda tejido conservado en frio
Muestras MC Couch (3) Doyle & Doyle (2)
1 1113,6 678,34
2 1235,2 639,13
3 1195,4 2653,98
4 2516,4 797,97
6 2348,4 532,71
7 1318,1 709,89
9 754,64 433,44
12 943,08 949,14
14 1080,2 224,46
16 2928,1 585,25
1543,312 820,431
82
Anexo 6. Pureza y cantidad de DNA tejido seco
Anexo A. Pureza de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido seco
Anexo B. Cuantificación de Cantidad de DNA (µg/ml) Tejido seco
Muestras Mc
Couch Doyle &
Doyle Dellaporta
modificado II Dellaporta
modificado I Mc
Couch I Dellaporta
1 82,986 793,4 89,45 189.46 451,54 115,89
2 37,952 437,9 5,609 148,02 2638,5 271,85
3 44,919 209,46 70.89 390.87 1029,5 118.9
4 69,365 1135,7 34.67 135.78 260,79 564,3
6 61,475 445,46 118,98 136,89 321,56 256,7
7 70,366 344,48 198.76 90,367 1068,8 134,9
9 103,83 1607,7 345.89 85,226 674,53 389.98
12 524,22 176,5 105.15 1885,7 319,89 267,12
14 0,457 1345 165,13 309,71 456,7 344,22
16 159,33 106 39,56 241,36 567,89 413,41
115,49 660,16 83,7458 413,90 778,97 296,049
Muestras Mc
Couch Doyle & Doyle (2)
Dellaporta modificado II
Dellaporta modificado I
Mc Couch I
(3) Dellaporta
1 1,36 1,18 1,02 1,67 1,34 1,78
2 1,21 1,17 1,47 0,92 1,43 1,14
3 0,92 1,51 1,13 1,98 1,63 0,67
4 1,23 1,09 1,56 1,45 1,46 1,42
6 1,43 1,24 1,23 0,84 1,46 0,98
7 1,38 1,31 1,45 0,95 1,34 1,67
9 1,79 1,45 1,16 1,43 1,33 0,64
12 0,91 1,19 1,37 0,45 1,34 1,45
14 1,33 1,34 1,67 1,15 1,61 0,64
16 1,42 1,89 1,08 1,08 1,16 1,46
1,30 1,34 1,31 1,19 1,41 1,18
83
Anexo 7.Resultados para la prueba de medias de Duncan
The SAS System
The GLM Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
METODO 2 DOYLE Mc COUCH
TEJIDO 2 CONSERVADO EN FRIO SECO
Number of observations 40
The SAS System
The GLM Procedure Dependent Variable: CALIDAD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.85810490 0.61936830 24.22 <.0001 Error 36 0.92055820 0.02557106 Corrected Total 39 2.77866310 R-Square Coeff Var Root MSE PUREZA Mean 0.668705 10.07209 0.159910 1.587650 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 0.02007040 0.02007040 0.78 0.3815 TEJIDO 1 1.82927290 1.82927290 71.54 <.0001 METODO*TEJIDO 1 0.00876160 0.00876160 0.34 0.5620 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 0.02007040 0.02007040 0.78 0.3815 TEJIDO 1 1.82927290 1.82927290 71.54 <.0001 METODO*TEJIDO 1 0.00876160 0.00876160 0.34 0.5620
84
The SAS System
The GLM Procedure Dependent Variable: CANTIDAD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 4820636.78 1606878.93 3.54 0.0242 Error 36 16357764.22 454382.34 Corrected Total 39 21178401.00 R-Square Coeff Var Root MSE CANTIDAD Mean 0.227620 70.90207 674.0789 950.7183 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 1771109.349 1771109.349 3.90 0.0561 TEJIDO 1 2137272.999 2137272.999 4.70 0.0368 METODO*TEJIDO 1 912254.433 912254.433 2.01 0.1651 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 1771109.349 1771109.349 3.90 0.0561 TEJIDO 1 2137272.999 2137272.999 4.70 0.0368 METODO*TEJIDO 1 912254.433 912254.433 2.01 0.1651
85
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for PUREZA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.025571 Number of Means 2 Critical Range .1026 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N METODO A 1.61005 20 Mc COUCH A A 1.56525 20 DOYLE
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for CANTIDAD NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 454382.3 Number of Means 2 Critical Range 432.3 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N METODO A 1161.1 20 MCCAUCH A A 740.3 20 DOYLE The SAS System
86
The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for PUREZA
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.025571 Number of Means 2 Critical Range .1026 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TEJIDO A 1.80150 20 CONSERVADO EN FRIO B 1.37380 20 SECO
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for CANTIDAD
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 454382.3 Number of Means 2 Critical Range 432.3 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TEJIDO A 1181.9 20 CONSERVADO EN FRIO B 719.6 20 SECO
The SAS System
The GLM Procedure Level of Level of -----------CALIDAD----------- -----------CANTIDAD---------- METODO TEJIDO N Mean Std Dev Mean Std Dev DOYLE CONSERVADO EN FRIO 10 1.79390000 0.08614516 820.43100 673.901460 DOYLE SECO 10 1.33660000 0.23409362 660.16000 532.293707 MCCAUCH CONSERVADO EN FRIO 10 1.80910000 0.14273242 1543.31200 757.247065 MCCAUCH SECO 10 1.41100000 0.14032423 778.97000 711.776981
Productos de amplificación “primers” OPAD1, OPAD14, OPAN17, OPAN5, OPAM4,
OPAM13
89
Anexo 9. Productos de Pre amplificación marcadores AFLP
90
Anexo 10. Formato libreta de campo Número de Colección:
Nombre científico: Nombre del colector:
Fecha de colección: Localización: País: Departamento: Ciudad/Pueblo: Vereda: Finca: Altitud: Longitud/Latitud: Detalles de la muestra: tipo de tejido: Cantidad: Método de preservación: Estado fitosanitario de la planta: (nemátodos, Fusarium, virus) Observaciones:
Número de Colección:
Nombre científico: Nombre del colector:
Fecha de colección: Localización: País: Departamento: Ciudad/Pueblo: Vereda: Finca: Altitud: Longitud/Latitud: Detalles de la muestra: tipo de tejido: Cantidad: Método de preservación: Estado fitosanitario de la planta: nemátodos, Fusarium, virus Observaciones:
91
Anexo 11. Protocolo de tinción con nitrato de plata
1. Después de finalizada la electroforesis el vidrio con el gel adherido se coloca
hacia arriba en una cubeta con solución fijadora durante 20 minutos
2. Lavar con agua desionizada durante tres minutos (dos veces) con agitación
constante.
3. Después de los lavados el gel se introduce en la solución de tinción por 30
minutos en total oscuridad (tapando la bandeja)
4. El exceso de plata se retira lavando el gel con agua destilada por diez
segundos(este paso es crítico para obtener un revelado optimo)
5. Luego el gel se coloca en una solución fría de revelado durante cinco
minutos aproximadamente o hasta que se visualicen las bandas
6. Visualizadas las bandas, la reacción de revelado se detiene mediante la
inmersión del gel en la solución de parada durante cinco minutos
7. Por último, se enjuaga el gel por cuatro minutos en agua desionizada
8. Se coloca el gel en un soporte para dejar secar toda la noche
9. Posteriormente podrá ser fotografiado, analizado en scanner e igualmente se
leen los polimorfismos en un transiluminador de luz blanca