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Evaluacin de la actividad antitumoral de nuevos compuestos
metlicos y estudio de la reprogramacin metablica en cncer de pulmn:
bsqueda de nuevas
dianas teraputicas y biomarcadores diagnsticosRoldn Corts
Girldez
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Programa de Doctorado en BiotecnologaDepartament de Bioqumica i
Biologia MolecularFacultat de Biologia
Evaluacin de la actividad antitumoral de nuevos compuestos
metlicos y estudio de la reprogramacin metablica en cncer de pulmn:
bsqueda de nuevas dianas teraputicas y biomarcadores
diagnsticos
Memoria presentada por Roldn Corts Girldez para optar al grado
de Doctor por la Universitat de Barcelona
Marta Cascante SerratosaDirectora
Roldn Corts GirldezDoctorando
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E V A L U A C I ND E L A A C T I V I D A DA N T I T U M O R A L
D EN U E V O S C O M P U E S T O SM E T L I C O S Y E S T U D I O D
E L A R E P R O G R A M A C I NM E T A B L I C A E N C N C E R D E
P U L M N : B S Q U E D A D E N U E V A S D I A N A ST E R A P U T
I C A S Y B I O M A R C A D O R E SD I A G N S T I C O S .
ROLD N C O R T S G I R L D E Z
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Hacer una Tesis parece fcil, pero hay que estar ah.
Friedrich Nietzsche
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 6
0 0 . N D I C E
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00. _NDICE PG. 7
1. INTRODUCCIN GENERAL
.................................................................................................
1.1. El cncer
....................................................................................................................
1.2. El cncer de pulmn
.................................................................................................
1.3. KRAS y cncer de pulmn
.......................................................................................
1.4. El ciclo celular
...........................................................................................................
1.5. La apoptosis
..............................................................................................................
1.6. Mtodos para la evaluacin del ciclo celular y la apoptosis
................................... 1.7. Factores de transcripcin
FOXO y su relacin con el cncer .................................
1.8. Evaluacin de la localizacin intracelular de FOXO
.............................................. 1.9. Metalofrmacos
en quimioterapia
............................................................................
1.09.1. Compuestos cicloplatinados de 7 miembros
..................................... 1.09.2. Compuestos de platino
con iminas polifuncionalizadas .................. 1.09.3.
Compuestos de platino y paladio derivados del
pirazol.................... 1.09.4. Compuestos derivados del
ferroceno.................................................. 1.10.
El metabolismo
tumoral..........................................................................................
1.10.1. La gluclisis y el efecto
Warburg.........................................................
1.10.2. La glutaminlisis
.................................................................................
1.10.3. La sntesis de cidos grasos
.................................................................
1.10.4. La ruta de las pentosas fosfato
............................................................ 1.11.
La metabolmica y la flujmica
.............................................................................
1.11.1. La flujmica basada en trazadores
...................................................... 1.11.2.
Anlisis de la distribucin isotopomrica
.......................................... 1.12. Explotacin de las
alteraciones metablicas del cncer de pulmn
en el diagnstico mediante el anlisis del aire exhalado
....................................... 1.13. Mtodos de anlisis
metabolmico
.......................................................................
2. OBJETIVOS
.................................................................................................................................
3. INFORME DEL DIRECTOR
....................................................................................................
4. RESUMEN DE RESULTADOS, DISCUSIN GLOBAL Y CONCLUSIONES
................. 4.1. Resumen de resultados
..............................................................................................
4.2. Discusin global
........................................................................................................
4.3. Conclusiones
.............................................................................................................
5. BIBLIOGRAFIA
...........................................................................................................................
6. PUBLICACIONES
......................................................................................................................
6.1. Captulo 1
.................................................................................................................
6.1.1. Captulo 1a
...........................................................................................
6.1.2. Captulo 1b
.........................................................................................
6.1.3. Captulo 1c
.........................................................................................
6.1.4. Captulo 1d
.........................................................................................
6.1.5. Captulo 1e
.........................................................................................
6.2. Captulo 2
...............................................................................................................
6.3. Captulo 3
...............................................................................................................
5.4. Captulo 4
...............................................................................................................
08
091216182124262930333334343537404143454648
5052
54
56
60
627379
82
94
9597
109119131141155171203
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ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 8
0 1 .I N T R O D U C C I NG E N E R A L
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 9
1.1. EL CNCER
El cncer es un concepto genrico que designa a un gran nmero de
patologas dife-rentes. Todas ellas, sin embargo, comparten como
caracterstica comn la divisin acelerada y descontrolada de las
clulas del organismo, que son capaces no solo de aumentar su nmero
ms all de los lmites fisiolgicos normales, sino tambin de invadir
otros tejidos de manera local o a distancia, propagndose a travs de
los vasos sanguneos y linfticos. Con cerca de 14.1 millones de
diagnsticos y ms de 8 millones de muertes a nivel global en 2008
(Bray, Jemal et al. 2012) y una incidencia en aumento, el cncer
constituye una de las principales causas de mortalidad no solo en
los pases desarrollados, sino tambin en aquellos en vas de
desarrollo.
En los tejidos sanos la proliferacin celular est estrictamente
controlada me-diante diferentes vas de sealizacin, y una vez
superada la etapa de crecimien-to la gran mayora de las clulas del
organismo nicamente se dividen para reemplazar a otras clulas
daadas o muertas. En el cncer, por el contrario, los mecanismos de
control de la proliferacin celular dejan de funcionar
correcta-mente, lo que provoca que las clulas se multipliquen sin
control de manera autnoma provocando la aparicin de un tumor.
Para que el tumor se desarrolle, en cualquier caso, no basta con
una desregula-cin de las seales que controlan el crecimiento
celular. Tambin es necesario superar diferentes programas biolgicos
que controlan la proliferacin mediante mecanismos muy diversos,
como la muerte celular programada o la respuesta inmunolgica. As,
tanto el desarrollo inicial como la posterior progresin y expansin
del cncer requieren de mltiples adaptaciones que permitan a las
clulas mantener un potencial proliferativo descontrolado y
acelerado a pesar de los distintos mecanismos de control directos e
indirectos existentes en el orga-nismo. Aunque hay una gran
variabilidad intertumoral (e incluso intratumoral) entre las clulas
tumorales, existen ciertas caractersticas comunes a las clulas de
cncer que han sido definidas por Douglas Hanahan y Robert A.
Weinberg (Hanahan and Weinberg 2011) y que se recogen en la figura
1.
La adquisicin de todas las caractersticas necesarias para el
desarrollo del cncer se realiza de manera secuencial. La teora
monoclonal, ampliamente aceptada en la actualidad, sostiene que el
cncer se genera a partir de una nica clula sana, que genera un
tumor canceroso a travs de las tres etapas que conforman el proceso
carcinognico. Esta transformacin resulta de la interaccin entre los
factores genticos propios de cada individuo con factores externos
llamados carcingenos, que pueden ser fsicos (como distintas
radiaciones, entre las que se encuentra la luz ultravioleta),
qumicos (como el humo del tabaco o diversos
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 10
productos contaminantes) o biolgicos (como distintas
infecciones, que pueden ser vricas, bacterianas o
parasitarias).
Observaciones empricas, inicialmente realizadas en modelos
experimentales de melanoma, apuntan a que la carcinognesis es un
proceso dividido en tres pasos diferenciados: La iniciacin, la
promocin y la progresin (Hennings, Glick et al. 1993). En la
primera etapa de iniciacin, un agente iniciador (el carcingeno)
pro-voca un dao en el material gentico celular, lo que resulta en
una mutacin. La exposicin continuada a agentes iniciadores acaba
provocando una acumulacin de diferentes mutaciones en la clula, que
se convierte as en lo que se denomina una clula iniciada. Esta
clula iniciada, aunque an no presenta cambios detecta-bles en su
tasa de proliferacin, s ha incrementado exponencialmente su
suscep-tibilidad para dar origen a un tumor.
La segunda etapa de la carcinognesis, la promocin, requiere la
accin de promoto-res: agentes carcingenos que no son mutagnicos por
s mismos pero que provocan, en el tejido en el que se encuentra la
clula iniciada, un trastorno capaz de propiciar una proliferacin
descontrolada a partir de la misma. La accin de los promotores
facilita la aparicin de tumores benignos, que resultaran fcilmente
reversibles en au-sencia de nuevos promotores pero que pueden
generar un tumor con un crecimiento acelerado consistente si su
efecto se mantiene en el tiempo (Rubin 2003).
Tras la promocin, se forma un tumor con clulas que ya son
capaces de man-tener de manera autnoma un crecimiento acelerado. La
mortalidad del cncer, sin embargo, recae en la capacidad de las
clulas tumorales para extenderse a otros tejidos del organismo
mediante la adquisicin de capacidad invasiva en la ltima etapa
carcinognica: la progresin. En esta etapa intervienen diferen-tes
mecanismos que regulan la invasin local, la angiognesis (generacin
de nuevos vasos sanguneos a partir de los preexistentes), la
intravasacin a vasos sanguneos y linfticos, la extravasacin en
otros tejidos diferentes y la aparicin de tumores metastticos a
distancia.
En las clulas tumorales aparecen, durante la progresin tumoral,
mltiples muta-ciones distintas. De acuerdo a las leyes darwinianas
de la evolucin, las mutacio-nes que confieren a las clulas una
mayor viabilidad son seleccionadas, vindose aumentada su proporcin
en el tumor (Greaves and Maley 2012). Las mutaciones que ms
ventajas aportan para la progresin tumoral no son nicamente las que
aumentan la velocidad de crecimiento celular, sino tambin las que
proporcionan a la clula los mecanismos para sobrevivir en el
entorno tumoral, captar nutrientes y oxgeno o evadir las seales
supresoras del crecimiento o las defensas del sistema inmune del
organismo. Como norma general, una nica mutacin no es sufi-
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 11
ciente para provocar la transformacin de una clula sana en una
clula tumoral, pero en cualquier caso algunas de las mutaciones
aparecidas deben afectar a genes relacionados directa o
indirectamente con el control del crecimiento tumoral. Es-tos genes
reciben el nombre de proto-onocogenes y genes supresores de
tumores.
Los proto-oncogenes estn relacionados con funciones promotoras
de la proli-feracin celular. Codifican para factores de transduccin
y molculas de vas de sealizacin relacionadas con la divisin y el
crecimiento, as como para factores reguladores del ciclo celular o
de la apoptosis (muerte celular programada). Un oncogen es un
proto-oncogen que ha sufrido una mutacin de ganancia de fun-cin, lo
que implica que se encuentra activo de manera constitutiva sin
necesi-
FIGURA 01. Caractersticas del cncer. La figura refleja las
capacidades que la clula debe adquirir para iniciar y mantener la
progresin tumoral. Figura adaptada con permiso Elsevier de
Hallmarks of cancer: the next generation, Cell 144(5): 646-674.
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 12
dad de seales activadoras. As, la aparicin de oncogenes provoca
un aumento de la tasa de proliferacin celular (Adamson 1987;
Weinstein and Joe 2006).
La funcin de los genes supresores de tumores, por otro lado, es
la de limitar el crecimiento tumoral, respondiendo a situaciones de
estrs o a daos bioqu-micos mediante la activacin de mecanismos de
reparacin celular o, en los casos en los que la reparacin ya no es
una opcin, mediante la activacin de programas de muerte celular
programada que eliminan las clulas sobrantes o defectuosas. Cuando
uno de estos genes tiene una mutacin que hace que pier-da su
funcin, se genera un efecto sinrgico al generado por los oncogenes,
con lo que el aumento de la proliferacin celular se ve potenciado
(Weinberg 1991).
En definitiva, mediante el proceso de carcinognesis la clula
adquiere y se-lecciona una serie de mutaciones que le permiten
adquirir las caractersticas necesarias para mantener una
proliferacin acelerada y descontrolada, esqui-var los mecanismos
inmunolgicos y supresores del crecimiento, sobrevivir en el entorno
tumoral e invadir otros tejidos localmente y a distancia generando
metstasis en otros puntos del organismo.
1.2. EL CNCER DE PULMN
El cncer de pulmn es actualmente el tipo de cncer que ms
mortalidad pro-voca a nivel mundial, siendo adems el cncer ms
diagnosticado en hombres y el cuarto ms diagnosticado en mujeres
(Bray, Jemal et al. 2012). La causa ms comn de cncer de pulmn es el
tabaquismo, siendo alrededor del 90% de los pacientes con esta
enfermedad fumadores y ex fumadores. El 10% restante de casos de
cncer de pulmn se atribuyen a una combinacin de causas genticas y
exposicin a agentes carcingenos como el gas radn, el asbesto, la
contami-nacin atmosfrica o el humo de tabaco (fumadores
pasivos).
El cncer de pulmn se clasifica comnmente en dos grupos: cncer de
pulmn de clulas pequeas (SCLC) y cncer de pulmn de clulas no
pequeas (NS-CLC, del ingls non-small cell lung cancer). El NSCLC
constituye alrededor del 85% del total de casos de cncer de pulmn,
y a su vez se subdivide en tres grupos: adenocarcinoma, carcinoma
pulmonar de clulas escamosas y carcinoma pulmo-nar de clulas
grandes. El adenocarcinoma es el tipo de cncer de pulmn ms comn
tanto en fumadores y exfumadores como en no fumadores. El carcinoma
pulmonar de clulas grandes, por otro lado, suele ser el cncer de
pulmn de cre-cimiento ms rpido.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 13
Dependiendo del tamao del tumor generado, el grado de afectacin
linftica y la apa-ricin o no de metstasis distantes, el cncer de
pulmn se puede clasificar en funcin de su grado de desarrollo segn
el mtodo de clasificacin TNM (Goldstraw 2013).
Categoras T de cncer de pulmn:
T1, cuando el tumor no mide ms de tres centmetros, no ha
alcanzado las membranas que rodean los pulmones (pleura visceral),
y no afecta las ramas principales de los bronquios. Si el tumor
mide 2 cm (alrededor de 4/5 de pulgada) o menos, se le llama T1a.
Cuando el tumor mide ms de 2 cm, pero no mide ms de 3 cm, se le
llama T1b.
T2, cuando el tumor presenta al menos una de las siguientes
caractersticas:
Mide ms de 3 cm, pero no ms de 7.
Involucra a un bronquio principal, pero no est a menos de 2 cm
de la carina (el punto donde la trquea se divide en los bronquios
principales izquierdo y derecho).
Ha crecido hacia el interior de las membranas que rodean a los
pulmones (pleura visceral).
El tumor obstruye parcialmente las vas respiratorias, pero esto
no ha causado el colapso de todo el pulmn ni la apari-cin de
neumona.
Si el tumor mide 5 cm o menos, se le llama T2a. Si el tumor mide
ms de 5 cm (pero no mide ms de 7 cm), se le llama T2b.
T3, cuando el tumor presenta una o ms de las siguientes
caractersticas:
Su tamao es mayor de 7 cm.
Ha crecido hacia el interior de la pared del trax, el msculo que
separa el trax del abdomen (diafragma), las membranas que rodean el
espacio entre los dos pulmones (pleura me-diastinal), o a las
membranas del saco que rodea el corazn (pericardio parietal).
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 14
Invade a un bronquio principal, y est ms cerca de 2 cm de la
carina, pero no afecta la carina en s.
Ha crecido hacia el interior de las vas respiratorias lo
suficiente para causar el colapso total de un pulmn o neumona en la
totalidad del pulmn.
Dos o ms ndulos tumorales separados se encuentran presen-tes en
el mismo lbulo de un pulmn.
T4, cuando el cncer presenta una o ms de las siguientes
caractersticas:
Un tumor de cualquier tamao ha crecido hacia el espacio que
existe entre los pulmones (mediastino), el corazn, los vasos
sanguneos grandes cercanos al corazn (tal como la aorta), la
trquea, el tubo que conecta la garganta con el estmago (esfago), la
columna vertebral o la carina.
Dos o ms ndulos tumorales separados se encuentran en l-bulos
diferentes del mismo pulmn.
Categoras N de cncer de pulmn:
N0, cuando no hay propagacin a los ganglios linfticos
adyacentes.
N1, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos dentro
del pul-mn y/o alrededor del rea donde los bronquios entran al
pulmn (a los ganglios linfticos hiliares). Los ganglios linfticos
afectados se encuentran en el mismo lado del tumor primario.
N2, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos que se
encuentran alrededor de la carina (el punto donde la trquea se
divide en los bronquios izquierdo y derecho), o en el espacio entre
los pulmones (mediastino). Los gan-glios linfticos afectados se
encuentran en el mismo lado del tumor primario.
N3, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos que se
en-cuentran cerca de la clavcula en cualquiera de los lados, y/o se
propag a los ganglios linfticos hiliares o mediastinales que se
ubican en el lado opuesto al tumor primario.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 15
Categoras M de cncer de pulmn:
M0, cuando el cncer no se ha propagado a reas u rganos
distantes. Esto incluye al otro pulmn, los ganglios linfticos de
ubicacin ms distante que los mencionados anteriormente en las
etapas N, y otros rganos o tejidos tales como el hgado, los huesos
o el cerebro.
M1a, cuando se da cualquiera de los siguientes casos:
El cncer se propag al otro pulmn.
Se detectan clulas cancerosas en el lquido que rodea el pul-mn
(llamado derrame pleural maligno).
Se detectan clulas cancerosas en el lquido que rodea el cora-zn
(llamado derrame pericrdico maligno).
M1b, cuando el cncer se propag a ganglios linfticos distantes o
a otros rganos, como el hgado, los huesos, o el cerebro.
El cncer de pulmn es uno de los tipos de cncer ms agresivos que
existen. El 50% de los pacientes de cncer de pulmn mueren en el
primer ao tras el diag-nstico, y menos del 15% sobreviven ms de
cinco aos. La limitada eficacia que en la mayora de los casos
presentan los tratamientos quimioteraputicos actuales en NSCLC hace
que la extirpacin quirrgica del tumor sea la estrategia ms
utilizada en el tratamiento de la enfermedad (Padda, Burt et al.
2014), y una de las causas fundamentales de la elevada tasa de
mortalidad del cncer de pul-mn es que los tumores diagnosticados
acostumbran a presentar numeraciones altas segn la clasificacin
TNM, lo que indica que se encuentran en un estado de desarrollo
demasiado avanzado que imposibilita su extraccin por ciruga.
La quimioterapia se suele usar en NSCLC como tratamiento
posterior a la extirpa-cin quirrgica del tumor, con la intencin de
minimizar el riesgo de recada del paciente, as como en los casos en
los que la ciruga no es una opcin viable. En solitario o en
combinacin con radioterapia, los tratamientos ms habituales
impli-can el uso de quimioterapia basada en compuestos de platino,
como cisplatino o carboplatino (Zarogoulidis, Zarogoulidis et al.
2013). A medida que la comprensin de los mecanismos moleculares del
NSCLC ha aumentado, a la quimioterapia convencional se ha aadido el
uso de inhibidores biolgicos dirigidos contra dianas
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 16
moleculares especficas. De entre los ms usados, podemos destacar
los que tienen actividad antiangiognica, como por ejemplo
bevacizumab, y los dirigidos a inhibir el receptor del factor de
crecimiento epidrmico (EGFR, del ingls epidermal growth factor
receptor), como por ejemplo Erlotinib, un inhibidor de la actividad
tirosina quinasa del EGFR que resulta especialmente efectivo en
pacientes con mutaciones activadoras del gen EGFR (Reungwetwattana
and Dy 2013).
As, para mejorar la prognosis del cncer de pulmn, y excluyendo
estrategias pre-ventivas (de entre las cuales la ms exitosa es sin
duda la de no fumar), resulta de cru-cial importancia el desarrollo
de nuevos compuestos con actividad antitumoral que resulten
efectivos en el tratamiento del cncer de pulmn, ya sea por s mismos
o formando parte de nuevas terapias combinadas, as como nuevos
mtodos diagns-ticos que permitan detectar la enfermedad en las
primeras etapas de su desarrollo.
1.3. KRAS Y CNCER DE PULMN
KRAS es parte de la familia de proto-oncogenes RAS, que en
humanos incluye tambin a NRAS y HRAS. La protena codificada por
KRAS, la GTPasa KRas, juega un papel esencial en el control de
distintas vas de transmisin de seal que regulan procesos como la
apoptosis, el progreso en el ciclo celular o la transcripcin, y por
lo tanto KRas tiene un papel clave en la proliferacin, la
diferenciacin y la supervivencia celulares (Chetty and Govender
2013). En c-lulas quiescentes sanas, KRas se encuentra unida a
guanosn difosfato (GDP) en un estado inactivo. Tras recibir seales
de activacin provenientes de receptores de factores de crecimiento,
el GDP pasa a su forma activada guanosn trifosfato (GTP), y el
complejo KRas-GTP resultante es capaz de activar diversas vas,
incluyendo las de proten quinasas activadas por mitgenos (MAPK, del
ingls mitogen activated protein kinases) y fosfo-inositol 3 quinasa
(PI3K).
KRas juega un papel crtico en la transmisin de seal inducida por
diversos re-ceptores de crecimiento, y su activacin constitutiva
hara innecesaria la sealiza-cin mediada por factores de
crecimiento, ya que las vas reguladas por KRas se encontraran
activadas independientemente de la presencia de estos (ver figura
2). Mutaciones activadoras de KRas son comunes en muchos tipos de
cncer, y mutaciones activadoras en el gen KRAS constituyen la
alteracin oncognica ms comn en cncer de pulmn de clulas no pequeas
(Cooper, Lam et al. 2013). Las mutaciones en KRAS son especialmente
comunes en adenocarcinomas de pases occidentales, y resultan ms
frecuentes en varones y en fumadores. Por el contrario, son
extremadamente raras en cncer de pulmn de clulas pequeas.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 17
Es interesante resaltar que otra de las mutaciones ms comunes en
cncer de pul-mn, la del oncogen que codifica para el receptor del
factor de crecimiento epi-drmico (EGFR, del ingls epidermal growth
factor receptor) nunca se presenta en pacientes con mutaciones en
KRAS, por lo que ambas mutaciones se consideran mutuamente
excluyentes. La terapia con inhibidores de tirosina quinasa (TKIs,
del ingls tirosine-kinase inhibitors), como erlotinib, actan sobre
el receptor EGFR y resultan efectivas en el cncer de pulmn de
pacientes con mutaciones en el gen que lo codifica, pero los
pacientes con mutaciones en KRAS no responden a estos tratamientos
(Cardarella and Johnson 2013). En general, la alta frecuencia de
mutaciones en KRAS que presenta el cncer de pulmn abre la
posibilidad de que KRas sea una diana teraputica til en el
tratamiento de la enfermedad, pero desafortunadamente los ensayos
clnicos de productos enfocados a inhibir esta protena han resultado
decepcionantes hasta el da de hoy.
FIGURA 02. Efecto de KRAS. La figura refleja cmo los inhibidores
de EGFR no resultan tiles en los casos en los que KRAS cuenta con
mutaciones que provocan la activacin constitutiva de KRas. KRas se
encuentra por debajo de EGFR en la va de sealizacin que comparten,
y por tanto su activacin constitutiva hace que la va est activada
incluso en ausencia de las seales activadoras mediadas por
EGFR.
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 18
1.4. EL CICLO CELULAR
Se denomina ciclo celular al conjunto de sucesos altamente
regulado por el que una clula origina dos clulas hijas. Este ciclo,
que comprende el periodo entre dos divisiones mitticas, incluye los
procesos durante los cuales la clula aumenta su tamao, duplica su
material gentico y finalmente se divide en dos clulas
independientes. El ciclo celular se puede considerar un proceso
dividido en las di-ferentes etapas representadas en la figura 3,
que conforman la interfase (conjunto de etapas por las que pasa una
nueva la clula hasta que est lista para una nueva divisin) y la
fase de divisin (en la que la clula se divide en dos clulas
hijas).
Concretamente, la interfase se puede subdividir en las
siguientes etapas:
Fase G1: Periodo comprendido entre el fin de la divisin anterior
y el inicio de la duplicacin del material gentico celular. Durante
esta fase, tambin llamada primera fase de crecimiento, la clula
sintetiza nuevo material citoplasmtico, especialmente protenas y
ARN, en preparacin para el inicio de la siguiente etapa del ciclo
en la que ten-dr que sintetizar otra copia de su ADN.
Fase G0: En clulas no proliferantes (la inmensa mayora de las
clulas sanas de un organismo adulto), las clulas entran en un
estado de quiescencia en el que el ciclo celular no avanza hacia
nuevas duplicaciones. Esta fase recibe el nombre de fase G0, que
indica que la clula se encuentra detenida ya que no est programada
para continuar dividindose. Algunas clulas, como las clulas madre
adultas, entran en fase G0 de manera reversible, y bajo estmu-los
fisiolgicos normales pueden volver a entrar en la fase G1,
continuando hacia las siguientes fases del ciclo celular y
convirtindose as de nuevo en una clula proliferante. En clulas de
mamfero completamente diferencia-das, en cambio, as como en clulas
senescentes, la entrada en la fase G0 se considera prcticamente
irreversible, aunque bajo estmulos excepcionales (entre los que se
cuentan la inhibicin de los supresores de tumores p53 y RB) tanto
las clulas senescentes como las terminalmente diferenciadas son
tambin capaces de reentrar en el ciclo celular (Cheung and Rando
2013).
Fase S: La fase S (tambin llamada fase de sntesis) es aquella en
la que la clula sintetiza una segunda copia completa de su ADN.
Cuando acaba la fase S, la clula cuenta con el doble de cromosomas
que al inicio de la misma (4n, ya que las clulas humanas son
diploides y normalmente cuentan con un nmero de cromosomas igual a
2n, siendo n el nmero de cromosomas aportado por cada uno de los
progenitores del organismo).
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 19
Fase G2: La ltima etapa de preparacin antes de la divisin
celular. Tambin recibe el nombre de segunda fase de crecimiento, y
durante la misma contina la sntesis de ARN y protenas mientras la
clula se prepara para su entrada en la fase de mitosis. A medida
que se acerca el final de esta etapa, el ADN empieza a condensarse
y los cromosomas se hacen visibles al microscopio.
La fase de divisin, por otro lado, se divide entre las etapas de
Mitosis, durante la cual se produce el reparto equitativo del
material gentico en la formacin de dos ncleos celulares, y
Citocinesis, el proceso final de separacin fsica del citoplasma que
concluye con la generacin de dos clulas separadas e
indepen-dientes, cada una de las cuales contendr una copia idntica
de ADN. La fase de divisin recibe tambin el nombre de fase M.
El ciclo celular es un proceso estrechamente controlado mediante
seales de diferentes vas reguladoras del crecimiento. En su
regulacin juegan un papel clave las protenas quinasas dependientes
de ciclinas (CDKs, del ingls cyclin dependent kinases) que, como su
propio nombre indica, dependen de subuni-dades reguladoras llamadas
ciclinas. Les CDKs actan de forma secuencial, siendo activadas por
sus ciclinas correspondientes en las distintas etapas del ciclo
celular a medida que este avanza. As, durante la fase G1, se
activan los complejos ciclina D-CDK4/6 y ciclina E-CDK2 para
conducir a la clula a la fase S a travs del punto de restriccin R,
mientras que la fase S es la ciclina A la que forma complejos con
CDK1 y CDK2 para promover la finalizacin de la fase S y
posteriormente son las ciclinas A y B las que se asocian con CDK1
para progresar a travs de la fase G2 y entrar en la fase M
(Gallorini, Cataldi et al. 2012). Debido al papel central que
juegan en el control del crecimiento y la proliferacin celulares,
los mecanismos que controlan el ciclo celular se en-cuentran
alterados con mucha frecuencia en el cncer y constituyen las dianas
de diferentes terapias contra la enfermedad (Chan, Koh et al. 2012;
Salmela and Kallio 2013; Gorjanacz 2014). Para abandonar la fase de
quiescencia del ciclo celular (fase G0), las clulas sanas necesitan
no solo de una serie de estmu-los mitticos regulados por factores
de crecimiento, adhesiones clula-clula o distintos componentes de
la matriz extracelular, sino tambin de la inhibicin de distintas
seales antiproliferativas que bloquean el crecimiento mantenien-do
el ciclo celular en un estado continuado de reposo. Dos de las
principales caractersticas del cncer descritas por Hanahan y
Weinberg, sin embargo, son precisamente la autosuficiencia de
seales de crecimiento y la insensibilidad ante seales
antiproliferativas que presentan las clulas tumorales.
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TESIS DOCTORALUB 2014
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PG. 20
La autosuficiencia de seales de crecimiento es adquirida por las
clulas tu-morales de maneras diferentes. Hay clulas tumorales
capaces de sintetizar y liberar factores de crecimiento a los que
ellas mismas responden, en un proceso denominado autoestimulacin
autocrina. Otras responden de manera especialmente intensa a seales
inductoras de la proliferacin que provienen de clulas de su
microentorno, que son capaces de liberar factores de cre-cimiento
como TGF-, EGF y molculas como Wnt2(Cheng, Chytil et al. 2008;
Ostman and Augsten 2009; Fu, Zhang et al. 2011). La sobreexpresin
de receptores de factores de crecimiento en las clulas tumorales,
que las hace hipersensibles a las concentraciones de ligando
presentes en su entorno ms cercano, contribuye a este fenmeno.
Algunos de los receptores de factores de crecimiento presentes en
clulas tumorales son capaces, incluso, de transmitir seales
promitticas en ausencia total de ligando, y en otros casos son las
vas intracelulares de transduccin de seal, que normalmente slo se
activan al recibir la seal correspondiente de los receptores de
membrana, las que estn activadas de manera constitutiva en las
clulas tumorales. En este ltimo caso, la mayora de las veces el
punto clave lo constituyen protenas de la familia Ras, cuya mutacin
mantiene activadas de forma constante las cascadas de sealizacin
Ras/Raf/MEK/ERK y Ras/PI3K/mTor, que favorecen tanto la
proliferacin como la supervivencia celular (Miller, Yeager et al.
2009). Como hemos visto, este es el caso en muchos cnceres de pulmn
que cuentan con mutaciones activadoras en el gen que codifica para
la protena KRas, con lo que las vas reguladas por esta protena se
encuentran activadas sin necesidad de recibir la seal
correspondiente de los receptores de membrana.
Las seales antiproliferativas, por otra parte, suelen englobar
distintas pro-tenas que regulan el ciclo celular induciendo la
entrada en fase de quies-cencia G0 o bien impidiendo que se superen
los checkpoints del mismo. Los checkpoints son puntos de control
entre las diferentes fases del ciclo celu-lar que slo pueden ser
superados cuando la fase previa al checkpoint se ha completado de
manera correcta. En general, son mecanismos en los que se detecta
si el ADN ha sufrido algn tipo de dao, impidiendo la suplicacin de
la clula si este no puede ser reparado (Kastan and Bartek 2004).
Los chec-kpoints actan a travs de molculas inhibidoras de CDKs y de
ciclinas, que se engloban en dos grandes grupos: protenas INK4
(como INK4A, INK4B, INK4C e INK4D) y las familias Cip y Kip
(compuestas por los inhibidores de ciclinas y CDKs p21, p27 y p57)
(Malumbres and Barbacid 2009). Las molculas que ejercen este tipo
de controles negativos sobre la progresin del ciclo celular tienen
una funcin muy importante en la prevencin de la tumorignesis, y por
ello es comn que se encuentren desreguladas en el cncer
(Diaz-Moralli, Tarrado-Castellarnau et al. 2013).
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 21
1.5. LA APOPTOSIS
La apoptosis es un mecanismo de muerte celular programada
mediante el cual el organismo elimina de manera controlada las
clulas sobrantes, daadas o que puedan representar un peligro para
el organismo. A diferencia de los pro-cesos necrticos, que se
caracterizan por una disolucin de los orgnulos y una prdida de la
permeabilidad de las membranas celulares con la consiguiente
liberacin al espacio extracelular de hidrolasas que generan
inflamacin, la
FIGURA 03. El Ciclo Celular. Esquema simplificado del Ciclo
Celular. Tras la fase M la clula se divide en dos clulas hijas que
pasan a estar en fase G1. Distintos mecanismos de control, llamados
checkpoints, controlan el paso de una fase a la siguiente. Las
clulas pueden entrar en un estado quiescente (fase G0) en el que no
se reproducen.
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PG. 22
apoptosis implica el desmantelamiento completo de las
principales estructuras celulares de forma controlada, de tal
manera que no se producen efectos ad-versos en clulas o tejidos
contiguos.
Para asegurar el grado de control necesario, la apoptosis es un
proceso al-tamente regulado que consta de diversas fases que se
suceden siguiendo un orden establecido. Inicialmente, distintos
mediadores genticos y bioqumicos se activan en un intento de
reparar los daos que pueda tener la clula, mo-mento en el que el
proceso apopttico es an reversible. Si estos mecanismos fallan, sin
embargo, se inicia la llamada fase de ejecucin, a partir de la cual
el proceso es ya irreversible. En la fase de ejecucin la clula
sufre una serie de cambios estructurales que incluyen la
condensacin de la cromatina y la for-macin de los llamados cuerpos
apoptticos, que estn constituidos por restos de componentes
citoplasmticos y nucleares rodeados por membrana celular. Estos
cuerpos, en los que se acaba descomponiendo la totalidad de la
clula, son eliminados del entorno extracelular por clulas
fagocitarias, lo que impide la inflamacin del tejido
circundante.
La regulacin de todos estos pasos est asociada a la activacin de
un con-junto de protenas denominadas caspasas, cuya desregulacin
tiene por tan-to una importante influencia en el cncer (McIlwain,
Berger et al. 2013; Yan, Li et al. 2013). Las vas de activacin de
la apoptosis en las que estn involucradas las caspasas representan
un paradigma particular en el mbito de la transduccin de seal, ya
que esta es transmitida al realizarse cortes especficos en la
estructura de las caspasas, que son los que producen la activacin
de las mismas. As, las caspasas iniciadoras provocan cortes en las
caspasas ejecutoras, activando a estas ltimas para que puedan
hidrolizar enlaces especficos de sus sustratos diana.
La apoptosis puede ser activada por diversos estmulos, como el
cambio en la disponibilidad de hormonas, el estrs oxidativo, el dao
en el ADN o la radia-cin. Como se ve en la figura 4, Hay dos vas
distintas por las que los estmulos pueden activar la apoptosis: la
va intrnseca y la va extrnseca. La va extrn-seca est ligada a
seales externas transmitidas por receptores transmembrana llamados
receptores de muerte (DR, del ingls death receptors). La unin a
estos receptores de ligandos proapoptticos provoca la trimerizacin
del receptor y el consiguiente reclutamiento de la protena
adaptadora de dominio de muerte asociada a Fas (FADD, del ingls Fas
associated death domain) y de las caspa-sas 8 y 10, que se unen al
dominio citoplasmtico del receptor para formar un complejo
sealizador inductor de muerte celular (DISC, del ingls
death-in-ducing signal complex). Las caspasas 8 y 10 son llamadas
caspasas iniciadoras,
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 23
ya que su activacin es necesaria para que se inicie el proceso
apopttico. Su activacin autocataltica en el DISC les permite
activar a las caspasas 3, 6 y/o 7, llamadas caspasas efectoras, que
acaban convergiendo en la va intrnseca de la apoptosis. La
activacin de la caspasa 8 tambin puede provocar la ruptura de la
protena pro-apopttica BID, cuya forma truncada promueve la formacin
de oligmeros de las protenas BAK y BAX, que activan la va intrnseca
en lo que constituye otro punto de convergencia de ambas vas (Khan,
Blanco-Codesido et al. 2014). La va intrnseca, por otro lado, se
induce intracelularmente, concre-tamente desde la mitocondria. Esta
va se activa en respuesta a seales de estrs celular, que se pueden
originar por dao en el ADN, hipoxia, fallos en el ciclo celular o
prdida de factores de supervivencia celular. En esta va, tambin
lla-mada va mitocondrial, la permeabilizacin de la mitocondria hace
que se libere Citocromo c, una protena que forma junto a las
protenas Apaf-1 y pro-caspasa 9 el complejo llamado apoptosoma.
Este complejo es capaz, a su vez, de desen-cadenar la cascada
proteoltica apopttica a travs de las caspasas efectoras 3, 6 y 7.
La va intrnseca est estrechamente regulada por un equilibrio de
protenas de la familia Bcl-2, que tienen funciones pro y anti
apoptticas. Las protenas anti apoptticas de la familia Bcl-2, como
Bcl-XL y MCL-1, tienen como funcin mantener la integridad de la
membrana mitocondrial externa. Las protenas pro apoptticas de la
familia Bcl-2, como BAD y BMF, adems de otras protenas pro
apoptticas como PUMA o NOXA, se ven activadas por seales de estrs
celular de manera que inhiben la accin de las protenas anti
apoptticas men-cionadas (Ren, Tu et al. 2010). Otro subgrupo de
protenas pro-apoptticas, que incluye a Bid y a BIM, son capaces de
activar las protenas efectoras BAK y BAX (Kuwana, Mackey et al.
2002), que oligomerizan formando poros en la membrana mitocondrial
externa, permeabilizndola y provocando que libere al citosol las
protenas citocromo c (que junto con Apaf-1 y pro-caspasa 9 forma el
complejo llamado apoptosoma) y Smac/DIABLO (que se une a
inhibidores de ptotenas apoptticas llamados IAPs, impidiendo que
ejerzan su funcin). El apoptosoma activa por protelisis la caspasa
9, que a su vez desencadena la cascada proteoltica apopttica a
travs de las caspasas efectoras 3, 6 y 7 (Elkholi, Floros et al.
2011; Khan, Blanco-Codesido et al. 2014).
La correcta regulacin del proceso apopttico se ve alterada con
mucha fre-cuencia en las clulas de cncer, y de hecho una de las
caractersticas comunes de las clulas tumorales, descritas por
Hanahan y Weinberg, consiste en la capacidad de evadir la muerte
celular. La inmensa mayora de clulas tumo-rales presentan diversas
mutaciones de genes o inactivaciones funcionales de protenas
relacionadas con la apoptosis, haciendo que incluso en situaciones
de dao en el ADN o estrs celular las clulas sobrevivan evadiendo
todos estos mecanismos de control.
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PG. 24
1.6. MTODOS PARA LA EVALUACIN DEL CICLO CELULAR Y LA
APOPTOSIS
En su sentido ms amplio, la citometra define el anlisis de las
caractersticas de las clulas. La citometra de flujo, por su parte,
es una tcnica de anlisis celular que mide las caractersticas de
clulas en suspensin mediante el paso de las mismas, una a una, por
un sistema ptico consistente en lseres que iluminan a las clulas
junto con distintos filtros que dirigen las seales pticas que estas
producen al interaccionar con el lser al detector
correspondiente.
FIGURA 04. La apoptosis. Esquema simplificado del proceso
apopttico, y de las dos vas por las que este puede ser iniciado. La
va extrnseca est mediada por la unin de ligandos de muerte a
receptores transmembrana. La va intrnseca, en cambio, desencadenada
habitualmente por estrs celular o dao en el ADN, se induce
intracelularmente a partir de la liberacin mitocondrial de
citocromo C.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 25
La clasificacin de clulas activadas por fluorescencia (FACS, del
ingls fluorescence activated cell sorting) es un tipo particular de
citometra de flujo. Mediante esta tcnica, las clulas en suspensin
se hacen pasar por un haz de luz con una de-terminada longitud de
onda, momento en el que un detector mide la dispersin de luz y la
intensidad de fluorescencia que presentan cada una de las clulas
que son procesadas en el anlisis. Podemos marcar distintas molculas
de la clula de manera que, cuando esta interaccione con el lser
emitido por el citmetro, emita fluorescencias determinadas que nos
pueden dar informacin acerca de la presencia y concentracin de las
molculas marcadas en las clulas analizadas. As, mediante la eleccin
de los marcadores fluorescentes adecuados, se pueden estu-diar
mltiples caractersticas celulares, midiendo as diferentes estados
fenotpicos. Algunos ejemplos incluyen la deteccin de la fase del
ciclo celular en la que se en-cuentra la clula, o si en la misma se
est llevando a cabo un proceso apopttico.
El estudio del ciclo celular mediante FACS se puede realizar
previo marcaje de las clulas con ioduro de propidio. El ioduro de
propidio (IP) es un agente intercalante de cidos nucleicos que se
une al ADN celular. As, tras impermea-bilizar las clulas (para
permitir que el IP acceda al ncleo celular) y aplicar este marcaje,
la cantidad de IP que contenga una clula, detectable por FACS ya
que emite fluorescencia a una longitud de onda de 617 nm, ser
proporcional a la cantidad de ADN de la misma (Nunez 2001). Como
hemos visto anteriormente, en la fase G1 la cantidad de ADN de la
clula es de 2n, mientras que en la fase G2 esta cantidad se ha
duplicado. As, midiendo la intensidad de la fluorescen-cia a 617 nm
de clulas marcadas con ioduro de propidio, podremos deducir si una
clula analizada se encuentra en fase G1/G0 (cantidad de ADN: 2n),
en fase G2/M (cantidad de ADN: 4n) o en fase S (en la que el ADN
est en proceso de duplicacin, y por tanto en una cantidad
intermedia entre 2n y 4n).
La deteccin de la apoptosis mediante FACS, por otra parte, se
basa en uno de los cambios morfolgicos que sufre la clula durante
las primeras fases del proceso apopttico. En la primera etapa de la
apoptosis se produce una prdida de la asi-metra de la membrana
plasmtica, con lo que la fosfatidilserina, que normalmen-te se
encuentra anclada nicamente a la parte interna de la membrana (de
manera que queda expuesta al citoplasma celular), se externaliza,
entrando as en contacto con el exterior de la clula (Fadok, Voelker
et al. 1992). La anexina V es capaz de unirse a la
fosfatidilserina, por lo que aadiendo a la suspensin celular un
conju-gado de anexina V unida a FITC (isotiocianato de fluorescena,
un fluorocromo capaz de emitir fluorescencia tras ser excitado a
una determinada longitud de onda) veremos marcaje nicamente en
aquellas clulas que tienen externalizada la fosfatidilserina, que
son aquellas en las que se est produciendo un proceso apop-ttico
(Hammill, Uhr et al. 1999). En el estudio de la apoptosis se suele
utilizar
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PG. 26
tambin IP, que solo accede al material gentico en los casos en
que la clula ha perdido la integridad de sus membranas. As, como se
puede observar en la figura 5, se considera que las clulas que estn
marcadas con IP se encuentran en un pro-ceso apopttico tardo (en
comparacin con las clulas que solo estn marcadas con FITC, que son
las que se encuentran en un proceso apopttico temprano).
1.7. FACTORES DE TRANSCRIPCIN FOXO Y SU RELACIN CON EL CNCER
La familia de factores de transcripcin FOXO (Forkhead Box O)
juega un rele-vante papel en mltiples procesos relacionados con la
proliferacin y supervi-vencia celulares (ver figura 6). Los
factores FOXO, que regulan la transcripcin de gran variedad de
genes, estn implicados en diferentes procesos celulares
in-volucrados en el crecimiento, la diferenciacin o la longevidad
(Watroba, Mas-linska et al. 2012; Eijkelenboom and Burgering
2013).
FIGURA 05. Deteccin de apoptosis por FACS. En una clula normal,
la fosfatifdilserina (PS) se encuentra nica-mente en la cara
interna de la membrana. Al iniciarse el proceso apopttico, la PS
pasa a la cara externa, con lo que se une al complejo Anexina
V-FITC, que marca a la clula con fluorescencia verde. En las ltimas
etapas del proceso apopttico las membranas celulares pierden su
integridad, con lo que el IP accede al ncleo marcando a las clulas
tambin con fluorescencia roja. Figura adaptada de
http://www.imgenex.com
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 27
Se ha demostrado que la delecin de FOXO promueve la aparicin de
tumores (Zhang, Gan et al. 2011) y que la expresin constitutiva de
FOXO promueve la muerte celular en distintos tipos de tejidos
mediante induccin de apoptosis (Zhang, Tang et al. 2011; Zhang,
Zhao et al. 2013). Adems, la expresin de FOXO en c-lulas
proliferantes es capaz de provocar una parada del ciclo celular en
los distintos checkpoints que controlan el paso de una fase del
ciclo celular a la siguiente, mediante diferentes mecanismos como
la promocin de los inhibidores del ciclo celular p21 y p27 (Seoane,
Le et al. 2004; Roy, Srivastava et al. 2010), la inhibicin de los
activa-dores del ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (Schmidt,
Fernandez de Mattos et al. 2002; Ganapathy, Chen et al. 2010) o la
promocin de la expresin de bloqueantes del ciclo celular como la
ciclina G2, un tipoparticular de ciclina que, en vez de promover la
progresin en el ciclo celular, acta bloqueando la entrada al mismo
(Martinez-Gac, Marques et al. 2004; Fu and Peng 2011). La parada o
ralentizacin del ciclo celular puede hacer que la clula tenga el
tiempo que necesita para reparar al ADN daado, y de manera
consecuente los factores FOXO tambin promocio-nan la expresin de
diversos genes relacionados con la detoxificacin de sustancias
reactivas de oxgeno (ROS, del ingls reactive oxygen species) y la
reparacin de ADN (Greer and Brunet 2005; Klagge, Weidinger et al.
2011). Por ltimo, los factores de transcripcin FOXO tambin juegan
un importante papel en la sobre-expresin de distintos genes que
regulan el metabolismo, y especialmente el metabolismo de la
glucosa (Gross, Wan et al. 2009; Kousteni 2012; Kim, Zhang et al.
2013).
Todas estas funciones proapoptticas y antiproliferativas han
hecho que los factores FOXO sean considerados supresores de tumores
que tienen la funcin de mantener la homeostasis celular (Paik,
Kollipara et al. 2007; Dansen and Burgering 2008; Ei-jkelenboom and
Burgering 2013; Webb and Brunet 2014). Existen mltiples eviden-cias
del papel que estos factores juegan en el cncer, ya que la expresin
de FOXO reduce la proliferacin celular y la generacin de tumores y
su inhibicin induce la formacin espontnea de los mismos en
distintos modelos (Kikuno, Shiina et al. 2007; Cornforth, Davis et
al. 2008; Shukla, Bhaskaran et al. 2013). Aunque el efecto de los
factores FOXO como supresores de tumores est bien documentado, y
aun-que existen estudios que indican que existe una delecin de FOXO
en adenocarci-nomas de pulmn (Blake, Mikse et al. 2010; Mikse,
Blake et al. 2010), la inactivacin gentica de FOXO no es comn en
las clulas tumorales. En cambio su inactivacin
post-transcripcional, normalmente causada por mutaciones en la va
Ras, s es habi-tual en distintos tipos de tumores (Dansen and
Burgering 2008).
Todas estas evidencias insinan que la reactivacin de FOXO puede
ser una estrate-gia prometedora en la terapia contra el cncer. Los
factores de transcripcin de esta familia pueden ser regulados
mediante distintas modificaciones post-traducciona-les, incluyendo
fosforilacin, acetilacin y ubiquitinacin (Daitoku, Sakamaki et
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PG. 28
al. 2011; Xie, Chen et al. 2012), aunque la fosforilacin por AKT
es comnmente considerada la va clave de regulacin de FOXO. AKT
fosforila FOXO permitiendo que este se una a la protena 14-3-3,
formndose un complejo que es traslocado des-de el ncleo hasta el
citoplasma celular, localizacin en la que FOXO ya no puede ejercer
sus funciones antiproliferativas ni proapoptticas (Tzivion, Dobson
et al. 2011). La defosforliacin de FOXO, a su vez, provoca la
disociacin del complejo, permitiendo la relocalizacin de FOXO en el
ncleo celular en el que s podr llevar a cabo su funcin como
supresor de tumores (Zhang, Tang et al. 2011).
As, es habitual que procesos tumorignicos impliquen la
fosforilacin de FOXO y su consiguiente acumulacin en el citoplasma,
lo que acaba conllevando su degra-dacin y la inhibicin general de
su actividad transcripcional (Hu, Lee et al. 2004; Huang, Regan et
al. 2005; Yang, Zong et al. 2008; Lam, Brosens et al. 2013). La
des-fosforilacin de FOXO y su consiguiente restauracin en el ncleo
celular, lo que implicara la activacin de sus funciones reguladoras
de la apoptosis, el ciclo celular
FIGURA 06. Funciones de FOXO. Representacin esquemtica de
algunos de los genes diana de los factores de transcripcin de la
familia FOXO, y de los procesos en los que estos estn implicados.
En general, FOXO promueve la transcripcin de numerosos genes
relacionados con inhibir la proliferacin, activar la apoptosis,
resistir el estrs celular y controlar el metabolismo, por lo que es
considerado un gen supresor de tumores. Figura adaptada con permiso
de Elsevier de Stressing the role of FoxO proteins in lifespan and
disease, Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 440-450.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 29
y la proteccin contra el estrs oxidativo, puede resultar por
tanto una estrategia in-teresante para combatir la proliferacin
descontrolada en distintos tipos de tumores.
1.8. EVALUACIN DE LA LOCALIZACIN INTRACELULAR DE FOXO
Como se ha descrito anteriormente, FOXO es un factor de
transcripcin que ejerce su funcin en el ncleo celular y que se
desplaza al citoplasma cuando es inactivado por fosforilacin, por
lo que el estudio de la localizacin intracelular de FOXO es un
mtodo til para evaluar su estado de activacin. Una manera de
estudiar la localizacin de FOXO consiste en introducir una protena
estable FOXO-protena verde fluorescente (GFP, del ingls fluorescent
green protein) en las clulas a evaluar. As, mediante un simple
anlisis por microscopa confocal se puede evaluar si la
fluorescencia verde, indicadora de la presencia de FOXO, se
FIGURA 07. Transfeccin celular. La figura ilustra de manera
esquemtica en qu consiste la tcnica de transfeccin celu-lar. El ADN
de inters es introducido a la clula con la ayuda de liposomas como
agentes transfectantes, que atraviesan la membrana celular mediante
un proceso de endocitosis. Una vez en el citoplasma, el endosoma se
descompone liberando el ADN, que se integrar en el ncleo de las
clulas hijas tras el proceso de divisin celular. Con ello
conseguimos que la clula exprese las protenas para las que codifica
el plsmido introducido. Figura adaptada de
http://www.biontex.com
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PG. 30
concentra principalmente en el ncleo o en el citoplasma celular.
La fluorescencia verde se concentrar en el ncleo cuando FOXO est
activado, mientras que cuan-do FOXO est desactivado la
fluorescencia verde se concentrar en el citoplasma.
Para generar una lnea celular capaz de expresar una protena
quimrica FOXO-GFP hay que someter a la lnea modelo a un proceso de
transfeccin con un plsmido de FOXO-GFP. En el proceso de
transfeccin, el material gentico con-tenido en el plsmido (en este
caso, ADN que codifica para la protena quimrica FOXO-GFP) es
incorporado al material gentico celular gracias a la ayuda de un
agente transfectante, normalmente un liposoma, que sea capaz de
fusionarse con la membrana celular introduciendo en ella su
contenido (ver figura 7).
Una vez finalizado el proceso de transfeccin, la clula incluir
en su material gentico ADN que codifica para la protena quimrica, y
por tanto expresar FOXO-GFP cuya localizacin puede ser detectada
fcilmente gracias a la fluo-rescencia que la GFP emite al ser
excitada a una longitud de onda determinada (Zanella, Rosado et al.
2008).
1.9. METALOFRMACOS EN QUIMIOTERAPIA
Desde el descubrimiento hace ms de 40 aos de la actividad
biolgica del cis-dia-minedichloroplatinum(II), [cis-(NH3)2PtCl2],
el cisplatino (nombre genrico que recibe el compuesto) ha supuesto
un enorme impacto en el tratamiento de muchos tipos de cncer
(Kelland 2007). An hoy, el cisplatino y dos de sus deri-vados
(carboplatino y oxaliplatino) se usan en ms del 50% de los
tratamientos quimioteraputicos de cncer existentes (Gasser, Ott et
al. 2011). Actualmente slo estos tres frmacos han sido
comercializados a nivel global, mientras que compuestos como el
nedaplatino, el heptaplatino y el lobaplatino se comerciali-zan
nicamente en Japn, Corea y China, respectivamente (ver figura
8).
Sin embargo, y a pesar de la utilidad del cisplatino en el
tratamiento de muchos tipos de tumores, el compuesto presenta
mltiples desventajas que hacen que su utilidad se vea reducida. De
entre estas desventajas destacan, por su importancia, los efectos
secundarios del cisplatino y la resistencia al mismo de las clulas
tumorales.
La resistencia al cisplatino es a veces intrnseca de
determinados tipos de tumores, como por ejemplo algunos tumores de
mama, colon o prstata, que resultan re-sistentes al compuesto desde
el primer tratamiento (Kelland 2007). En cualquier caso, incluso
cuando las clulas cancerosas son inicialmente sensibles al
compues-
-
01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 31
to, es comn que con los sucesivos ciclos de tratamiento se
generen resistencias adquiridas (Abu-Surrah and Kettunen 2006). La
evidencia experimental acerca del mecanismo de accin del cisplatino
indica que este se une covalentemente al ADN celular formando
aductos y provocando una distorsin en la estructura del material
gentico, lo que activa diversas vas de sealizacin relacionadas con
la reparacin del dao gentico, la proliferacin, el ciclo celular y
la apoptosis que acaban desembocando en una muerte celular
programada (Kelland 2007). Una de las causas ms comunes de
resistencia al cisplatino se da cuando este no llega a en-trar en
contacto con el DNA celular en una concentracin suficiente, debido
prin-cipalmente a una baja acumulacin del compuesto (Kelland,
Mistry et al. 1992) o a su detoxificacin por glutatin o
metalotionenas (Mistry, Kelland et al. 1991; Holford, Beale et al.
2000). En ocasiones se presentan resistencias incluso aunque la
concentracin del cisplatino en contacto con el ADN sea lo
suficientemente alta, ya sea porque las clulas tienen una
tolerancia elevada al dao en su ADN o porque cuentan con mecanismos
de reparacin del mismo lo suficientemente efectivos (Johnson,
Swiggard et al. 1994).
Por otra parte, los efectos secundarios del cisplatino son
severos y constituyen una importante desventaja de su uso
teraputico. El hecho de que la diana del
FIGURA 08. Metalofrmacos de platino. Estructura qumica de los
complejos de platino que se comercializan en la actualidad como
frmacos antitumorales.
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cisplatino sea ubicua (todas las clulas del organismo tienen
ADN) hace que la interaccin con el mismo no sea especfica de las
clulas cancerosas. El efecto secundario ms problemtico del
cisplatino es su elevada nefrotoxicidad, pero tambin provoca otras
alteraciones de gravedad variable como nauseas, vmitos, neuropata
perifrica, mielotoxicidad y toxicidad en el tracto gastrointestinal
(Abu-Surrah and Kettunen 2006).
Todos estos inconvenientes hacen necesario el descubrimiento de
nuevos compuestos mejorados que presenten una mayor actividad
biolgica y una disminucin de los efectos secundarios. Compuestos
como el carboplatino, un derivado del cisplatino, han pasado a
formar parte de los tratamientos qui-mioteraputicos convencionales.
Pero aunque en muchos casos presentan to-xicidades inferiores y,
por tanto, efectos secundarios menos severos, en general no suponen
un aumento espectacular de la actividad biolgica del cisplatino ni
una solucin a sus problemas de resistencia, ya sea sta intrnseca o
adquiri-da durante el tratamiento. Ciertos avances en el rea de la
resistencia intrnseca se han obtenido con la utilizacin del
oxaliplatino, en el que los ligandos NH3 se han sustituido por el
ligando (1R, 2R)-cyclohexano-1,2-diamino (R,R-dach). El
oxaliplatino es eficaz en cncer de colon resistente al cisplatino
debido a que forma diferentes aductos con el DNA evitando la unin
de protenas re-paradoras del mismo. En cualquier caso, y aunque
tras el descubrimiento del cisplatino se sintetizaron y evaluaron
gran cantidad de compuestos derivados del mismo con la esperanza de
encontrar un tratamiento ms efectivo y se-guro, en los aos
posteriores el ritmo de aparicin de nuevos avances en este campo
disminuy notablemente. En los ltimos aos, sin embargo, el inters
por la sntesis y evaluacin de nuevas generaciones de compuestos de
platino se ha revitalizado, debido sobre todo a los descubrimientos
acerca de los me-canismos que regulan la resistencia a este tipo de
tratamientos.
La investigacin de nuevos compuestos metlicos en la bsqueda de
terapias ms efectivas contra el cncer no se limita a compuestos con
platino, sino que se ha visto ampliada para incluir molculas con
tomos de paladio, hierro, oro, rutenio o iridio, entre otros. Una
gran variedad de compuestos organomet-licos, definidos como
aquellos complejos metlicos que cuentan con al me-nos un enlace
covalente directo carbono-metal, se han revelado recientemente como
molculas con una prometedora accin antitumoral. Los compuestos
organometlicos cuentan con una enorme variedad estructural y
estequiom-trica, son cinticamente estables, relativamente
lipoflicos y a menudo pre-sentan una carga neutra y un bajo estado
de oxidacin de su tomo metlico. Adems, un diseo racional de sus
ligandos permite controlar propiedades clave de los compuestos,
como por ejemplo su facilidad de hidrlisis.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 33
1.9.1. Compuestos cicloplatinados de siete miembros
Los compuestos ciclometalados con diferentes metales han
demostrado en el pasado prometedoras actividades antitumorales
(Gasser, Ott et al. 2011). Resulta digno de mencin el hecho de que
la presencia de un enlace carbono-metal parece incrementar la
estabilidad de los complejos, lo que hace que aumente la
probabilidad de que los complejos ciclometalados alcancen su diana
biolgica con su estructura intacta (Edwards, Black et al.
2005).
Los compuestos ciclometalados cuyas actividades biolgicas han
sido publica-das hasta ahora constan de ciclos planos de cinco
miembros. Por otro lado, exis-ten estudios con diaminas queladas en
los que los complejos con anillos de siete miembros presentan una
mayor actividad antiproliferativa que los complejos de 5 o de 6
miembros (Moradell, Lorenzo et al. 2003).
Por todo ello, la actividad biolgica de los compuestos
cicloplatinados de siete miembros, as como la comparacin de la
misma con la de compuestos simila-res con anillos de cinco
miembros, resulta de especial inters en la bsqueda de nuevos
compuestos con actividad antitumoral.
1.9.2. Compuestos de platino con iminas polifuncionalizadas
La unin del cisplatino al ADN celular provoca una distorsin de
su estructura heli-coidal causando la inhibicin de su replicacin y
su transcripcin, lo que acaba pro-vocando el arresto del ciclo
celular y la activacin de la apoptosis de la clula afectada. La
alterada estructura del ADN que resulta de la unin del mismo al
cisplatino, sin embargo, se convierte en un nuevo sitio de unin de
protenas, como por ejemplo histonas, factores de transcripcin, o
protenas reparadoras del ADN. Estas protenas capaces de unirse al
ADN distorsionado tienen la capacidad de modular la efectividad del
cisplatino o la resistencia al mismo (Wang and Lippard 2005; Jung
and Lippard 2007). As, una de las estrategias principales para
desarrollar nuevos compuestos con capacidad antiproliferativa es la
de disear compuestos que se unan al ADN celular de manera diferente
al cisplatino. Una posible manera de generar estos compuestos
consiste en usar ligandos que exhiban tomos de N con capacidad
donadora de electrones, como ocurre en las iminas. Estudios sobre
la relacin estructura-actividad de este tipo de compuestos pueden
proporcionar interesante informacin acerca de cmo la actividad
biolgica de los mismos se ve alterada por factores como los to-mos
donadores del ligando, su modo de unin al metal, el tamao del
quelato, la presencia de sustituyentes o la naturaleza de los
ligandos auxiliares adicionales.
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TESIS DOCTORALUB 2014
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PG. 34
1.9.3. Compuestos de platino y paladio derivados del pirazol
En la bsqueda de nuevos ligandos N-donadores para la sntesis de
compuestos organometlicos optimizados, los azoles suponen una
alternativa interesante a las iminas. Los azoles heterociclos son
reactivos muy valiosos en la qumica de coordinacin, y se sabe que
su unin a un in metlico afecta a sus propiedades y a su actividad
(Budzisz, Lorenz et al. 2008). En la actualidad apenas existe
informacin acerca del potencial antitumoral de compuestos con
ligandos de pirazol, con lo que resulta interesante la evaluacin de
la actividad biolgica de nuevos compuestos organometlicos derivados
del pirazol, y del efecto que ejercen los sustituyentes del
heterociclo, el tipo de enlace del ligando o incluso el tipo de
metal del complejo sobre su actividad biolgica
antiproliferativa.
1.9.4. Compuestos derivados del ferroceno
En la ltima dcada, compuestos derivados del ferroceno han
adquirido un gran inters debido a su actividad biolgica y a sus
aplicaciones en biome-dicina. Las propiedades nicas del ferroceno,
como su aromaticidad, estabi-lidad en medio acuoso y potencial
redox, hacen que resulte especialmente interesante investigar su
efecto en la actividad biolgica de nuevos com-puestos
antitumorales, aunque los estudios sobre su actividad
antiprolife-rativa siguen siendo escasos. Adems, el uso de
derivados del ferroceno en compuestos organometlicos, con distintos
tomos donadores de electrones capaces de exhibir diferentes modos
de unin al metal o de crear ismeros variados, no ha sido estudiado
a fondo. Por ello, los efectos derivados del tipo de enlace al
metal o de la orientacin espacial de los ligandos sobre la
potencial actividad antitumoral de estos productos permanecen
relativamen-te inexplorados, y su investigacin resulta de especial
inters
Por otro lado, varios frmacos antitumorales, como el paclitaxel,
se caracteri-zan por modular el ensamblaje de microtbulos mediante
la inhibicin de la polimerizacin de la tubulina. Muchos inhibidores
de la polimerizacin de la tubulina se caracterizan por la presencia
de un ncleo indlico, y existen estu-dios sobre derivados del indol
que demuestran su capacidad antiproliferativa en lneas celulares
humanas de cncer de mama (Pojarova, Kaufmann et al. 2007). A tenor
de todo ello, la caracterizacin de la actividad de nuevos hbridos
fe-rroceno-indol, y la comparacin de la misma con respecto a la de
sus anlogos puramente orgnicos, resulta tambin especialmente
atractiva en la bsqueda de nuevas estructuras organometlicas con
potencial antitumoral.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 35
1.10. EL METABOLISMO TUMORAL
El metabolismo es, en su sentido ms amplio, el conjunto de
transformaciones qu-micas que ocurren en una clula u organismo. Las
reacciones metablicas son la base de la vida a escala molecular, y
gracias a ellas los organismos pueden crecer, repro-ducirse,
construir (y mantener) sus estructuras bsicas y adaptarse a las
condiciones cambiantes del entorno en el que viven. El metabolismo
se suele clasificar en dos procesos opuestos pero complementarios:
el anabolismo y el catabolismo. El cata-bolismo engloba los
procesos mediante los que molculas complejas son degradadas a otras
ms sencillas para obtener energa, mientras que el anabolismo
consiste en la formacin de sustancias complejas a partir de otras
ms simples con la intencin de sintetizar diversos componentes
celulares, lo que necesita un aporte energtico.
El metaboloma, por otra parte, se define como el conjunto de
metabolitos o molculas pequeas presentes en un organismo como
producto final de la acti-vidad proteica. El resto de omas (genoma,
transcriptoma, proteoma) tambin definen la funcin celular, pero es
el metaboloma el que refleja de manera ms fiel el fenotipo celular
en un momento dado, ya que de l depende el estado
FIGURA 09. Complejos metlicos. Ejemplos de algunas estructuras
organometlicas cuya actividad antiproliferativa resulta de inters
evaluar. A: Compuestos cicloplatinados de 7 miembros, B: compuestos
de platino (II) con ligandos imnicos, C: complejos metlicos
derivados del pirazol, D: compuestos ciclometalados de platino (II)
y ferroceno, E: complejos hbridos ferroceno-indlicos.
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fisiolgico final de la clula. Histricamente se ha considerado
que la relacin entre los distintos omas era de naturaleza
jerrquica: a partir del genoma se generaba el transcriptoma y este
defina el proteoma, que a su vez era el encar-gado de procesar los
metabolitos controlando as el estado del metaboloma. En la
actualidad, sin embargo, existe la evidencia de que las relaciones
entre todos estos niveles de organizacin celular no son
unidireccionales, ya que cada oma es capaz de regular a (y
susceptible de ser regulado por) todos los dems (ver figura 10).
As, el metaboloma no es nicamente un resultado pasivo del es-tado
del proteoma, el transcriptoma o el genoma, sino que tambin es
capaz de controlar recprocamente estos estados regulatorios (Oltvai
and Barabasi 2002).
FIGURA 10. Regulacin cruzada entre -omas. El genoma, conjunto de
todos los genes del organismo, est formado por secuencias de ADN
que al transcribirse generan el transcriptoma. Los trnscritos se
traducen dando lugar a las pro-tenas que conforman el proteoma, y
stas regulan la sntesis y degradacin de los metabolitos del
organismo, definien-do as el metaboloma. Pero existe una interaccin
recproca entre todos los estados del sistema, con lo que cada
estrato organizativo es influenciado por el resto de estratos, al
tiempo que ejerce su influencia sobre los mismos.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 37
La proliferacin cellular descontrolada que acontece en los
procesos tumorales necesita una reprogramacin del metabolismo
energtico que permita acelerar el crecimiento y la divisin
celulares. Por ello, la alteracin del metabolismo energtico es una
rasgo tan definitorio del cncer como la evasin de los meca-nismos
de muerte celular o la insensibilidad ante seales
antiproliferativas, y ha sido definida como una de las
caractersticas generales del cncer, necesaria para la proliferacin
tumoral (Hanahan and Weinberg 2011).
1.10.1. La gluclisis y el efecto Warburg
Las clulas sanas degradan la glucosa hasta formar piruvato por
la va de la Gluclisis. En condiciones de presencia de oxgeno, el
piruvato entra en la mi-tocondria y se incorpora al ciclo de Krebs,
donde ser oxidado en un proceso conocido como fosforilacin
oxidativa para producir energa en forma de ATP. As, a partir de
glucosa y oxgeno, la clula acaba produciendo CO2 y agua, obteniendo
energa, regulando el potencial redox de la clula (a travs de la
generacin de molculas como NADH y NADPH) y generando adems los
pre-cursores metablicos a partir de los cuales la clula sintetizar
las molculas que necesita para su correcto funcionamiento (como ARN
y protenas).
En condiciones anaerbicas, en cambio, la ausencia de oxgeno
imposibilita la obtencin de ATP mediante este proceso de
fosforilacin oxidativa, por lo que las clulas optan por una va
alternativa en la que el piruvato proveniente de la glucosa es
transformado en lactato. Este mecanismo, conocido con el nombre de
gluclisis anaerbica, no slo es ineficiente como mtodo de obtencin
de energa (se obtienen nicamente 2 molculas de ATP por molcula de
glucosa, en vez de las 36 generadas en la fosforilacin oxidativa),
sino que conlleva el problema aadido de la acumulacin de lactato,
que a diferencia del CO2 o el agua puede resultar txico para las
clulas.
La primera caracterstica metablica diferencial que fue descrita
para las clulas tumorales, hace ya ms de 70 aos, recibe el nombre
de efecto Warburg. Segn este efecto, en las clulas de cncer el
mecanismo de degradacin de la glucosa se encuentra alterado de modo
que, incluso en condiciones aerbicas, la clula favorece la sntesis
de lactato por encima de la entrada de piruvato al Ciclo de Krebs,
en un proceso conocido como gluclisis aerbica. El fenmeno result
inicialmente difcil de explicar, dado que es lgico pensar que las
clulas proli-ferantes tienen unas necesidades energticas mayores
que las clulas sanas, y en cambio la degradacin de glucosa a
lactato tiene, como ya hemos visto, un ren-
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TESIS DOCTORALUB 2014
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PG. 38
dimiento energtico muy inferior al de la fosforilacin oxidativa.
Sin embargo, y a pesar de esta ineficiencia energtica, el efecto
Warburg concede a las clulas cancerosas una serie de ventajas que
resultan cruciales en el particular microen-torno que se genera
alrededor de un tumor (Hitosugi and Chen 2013).
En primer lugar hay que considerar que un tumor genera, al
crecer y expandirse, una masa celular que cada vez est ms alejada
de los vasos sanguneos, con lo que la difusin de oxgeno desde estos
hacia las clulas se ve dificultada. Esto provoca un descenso en la
disponibilidad de oxgeno de las clulas tumorales, situacin en la
que slo proliferarn las clulas con el metabolismo mejor adap-tado a
una situacin hipxica.
Adems, se ha descrito que la cantidad de energa adicional
necesaria para produ-cir una nueva clula es, asumiendo que la
glucosa es el principal sustrato energti-co, nicamente el 50% de la
energa basal necesaria para mantener la homeostasis celular
(Kilburn, Lilly et al. 1969). Esto demuestra que la cantidad de ATP
nece-saria no es dramticamente superior en el proceso de
proliferacin, con lo que la verdadera clave del mismo es la
acumulacin de biomasa y la replicacin de ADN. La sntesis continua
de nuevas biomolculas, adems, implica requerimientos adi-cionales a
la energa proporcionada por el ATP. Por ejemplo, una nica molcula
de glucosa es capaz de proporcionar 5 veces la cantidad de energa
necesaria para sintetizar una molcula de palmitato, mientras que el
NADPH necesario en esta misma sntesis requiere la metabolizacin de
7 molculas de glucosa. De manera anloga, tambin la sntesis de
aminocidos y nucletidos requiere de ms equi-valentes de carbono y
NADPH que de ATP. Todo ello implica que, para que una clula
prolifere, no puede dedicar toda su glucosa a la produccin de ATP,
lo que adems generara un desequilibrio en el ratio ATP/ADP que
podra inhibir el flujo a travs de los intermediarios glucolticos,
limitando an ms la produccin de acetil-CoA y NADPH requerida en la
sntesis de macromolculas. As, se ha pro-puesto que el efecto
Warburg podra suponer un mtodo especialmente efectivo para aumentar
las tasas biosintticas de las clulas tumorales, lo que a la hora de
mantener un ritmo de duplicacin acelerado confiere una ventaja ms
importante que la puramente energtica (Vander Heiden, Cantley et
al. 2009)Go.
La acidificacin resultante de la produccin de cido lctico a
partir del lactato, que supone un problema en tejidos sanos, puede
resultar beneficiosa para el desarrollo de un tumor (Gillies, Robey
et al. 2008; Bailey, Wojtkowiak et al. 2012; Honasoge and
Sontheimer 2013). Esto es as porque esta acidificacin induce la
muerte de las clulas sanas que rodean el tumor, con lo que las
seales inhibidoras de la proliferacin que genera el contacto con
estas clulas sanas se ven disminuidas, facilitndose as el
crecimiento tumoral. La acidosis tambin
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 39
provoca que fibroblastos y macrfagos liberen enzimas
proteolticas que degra-dan la matriz extracelular facilitando la
invasividad y la metstasis, fenmeno que se ve adems potenciado por
el hecho de que la acidosis tambin provoca la secrecin de factores
activadores de la angiognesis (como VEGF).
Teniendo en cuenta que la mitocondria juega un importante papel
en la genera-cin de especies reactivas de oxgeno (ROS), y dado que
est demostrado que estas son capaces de activar la apoptosis, la
reduccin de la entrada de piruvato en la mitocondria provoca que su
actividad metablica disminuya, con la consiguiente reduccin de los
niveles de ROS e inhibicin de la apoptosis que ello conlleva.
Adicionalmente, se ha descrito que el lactato producido por las
clulas hipxicas de un tumor puede ser utilizado como sustrato
energtico por las clulas aer-bicas que lo rodean, ms cercanas a los
vasos sanguneos. Al utilizar el lactato como fuente de energa estas
clulas aerbicas prescinden de la glucosa, aumen-tando su
disponibilidad para las clulas hipxicas tumorales. De este modo se
crea una sinergia entre las diferentes subpoblaciones tumorales que
beneficia el crecimiento del tumor (Semenza 2008; Kennedy and
Dewhirst 2010; Ratti-gan, Patel et al. 2012). De hecho, la
inhibicin de la lactato deshidrogenasa A (LDHA) y de los
transportadores de lactato se ha propuesto como estrategia
teraputica en distintos tipos de cncer (Doherty and Cleveland
2013).
Otra caracterstica diferencial de la gluclisis tumoral la
constituye la expresin preferencial de PKM2, la isoforma M2 de la
piruvato quinasa, frente a PKM1, que es la isoforma predominante en
la gran mayora de tejidos diferenciados. Sorprendentemente, PKM2
tiene menos actividad enzimtica que PKM1, y adems es, al contrario
que esta, sensible a la inhibicin por la sealizacin proveniente de
receptores de factores de crecimiento. Al parecer, la actividad
reducida de esta isoforma provoca la acumulacin de intermediarios
glucol-ticos, que son derivados a las vas anablicas de sntesis de
biomolculas que parten de los mismos, como la de la sntesis de
bases nitrogenadas a partir de la va de las pentosas fosfato. Este
fenmeno refuerza la idea de que las clu-las proliferantes priorizan
las vas anablicas de sntesis de biomolculas por encima de las de
generacin de energa en forma de ATP (Christofk, Vander Heiden et
al. 2008; Hitosugi, Kang et al. 2009; Ward and Thompson 2012).
Por ltimo, aunque la eficiencia energtica de la gluclisis
aerbica es menor que la de la fosforilacin oxidativa, las clulas
tumorales cuentan con un mecanismo compensatorio gracias a la
sobreexpresin de transportadores de glucosa que per-miten aumentar
la tasa de incorporacin de la misma (Jones and Thompson 2009;
Ortega, Sanchez-Arago et al. 2009; Adekola, Rosen et al. 2012;
McCracken and
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Edinger 2013; Szablewski 2013). Adems, la velocidad de sntesis
de ATP por glu-clisis aerbica es mayor que por fosforilacin
oxidativa, lo que proporciona una ventaja importante en condiciones
de competencia por la obtencin de glucosa.
Todas estas evidencias sealan que el efecto Warburg confiere
importantes ven-tajas a las clulas proliferantes de un tumor, lo
que refuerza la teora de que la reprogramacin metablica tumoral no
es nicamente una consecuencia pasiva de los cambios genticos en las
clulas cancerosas, sino que constituye un reque-rimiento esencial
para la progresin de la enfermedad, y por lo tanto una diana
teraputica con una excelente potencialidad para combatirla.
1.10.2. La glutaminlisis
La glucosa es el sustrato energtico principal de las clulas del
organismo, pero no es el nico. Para mantener su elevada tasa de
proliferacin, las clulas tu-morales recurren tambin a la glutamina,
el aminocido ms abundante en el plasma. El proceso por el que la
glutamina es catabolizada para generar lactato y ATP se conoce como
glutaminlisis, una va metablica que se encuentra so-breactivada en
muchos tipos de tumores.
A da de hoy no existe un consenso cientfico acerca del destino
metablico final de la glutamina consumida por las clulas tumorales,
probablemente por-que dependa del tipo celular en estudio y de sus
necesidades en cada momen-to. En general, la derivacin de glutamina
a lactato se puede utilizar para ge-nerar poder reductor (en forma
de NADPH) necesario en procesos anablicos como la sntesis de
nucletidos o la de cidos grasos (DeBerardinis, Mancuso et al. 2007;
Wise, DeBerardinis et al. 2008), para generar una fuente de
nitr-geno con la que sintetizar aminocidos y protenas y nucletidos
(Meng, Chen et al. 2010; Hensley, Wasti et al. 2013) o simplemente
para obtener energa en forma de ATP y conservar la homeostasis
redox celular (Gao, Tchernyshyov et al. 2009), aunque tambin se ha
descrito que la glutamina tiene un papel regu-lador de distintas
vas de sealizacin que promueven el crecimiento celular (Daye and
Wellen 2012; Duran, Oppliger et al. 2012).
El metabolismo de la glutamina comienza por su transformacin a
glutamato, en una reaccin catalizada por la enzima glutaminasa, de
la que existen distintas isoformas codificadas por los genes GLS y
GLS2. La expresin de las isoformas codificadas por GLS correlaciona
con el ratio de proliferacin y la malignidad en distintos modelos
biolgicos (Lobo, Ruiz-Bellido et al. 2000; Gao, Tchernyshyov
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et al. 2009; Wang, Erickson et al. 2010; Cheng, Sudderth et al.
2011). El papel de GLS2 en el desarrollo tumoral, en cambio, es
mucho menos claro, y aunque se ha descrito que su expresin est
aumentada en algunos neuroblastomas, en los que contribuye a la
supervivencia celular (Qing, Li et al. 2012), en otros tejidos GL2
se comporta como un supresor de tumores diana de p53 (Suzuki,
Tanaka et al. 2010).
En cualquier caso, las clulas de cncer consumen una cantidad de
glutamina mucho mayor que las clulas sanas y, como ocurre con los
transportadores de glucosa, las clulas tumorales inducen una
activacin de los transportadores de glutamina, lo que se ve
reflejado en el descenso en los niveles de glutamina circu-lante
que puede ser observado en pacientes de cncer (Chen, Espat et al.
1993).
1.10.3. La sntesis de cidos grasos.
Como ya hemos visto, la proliferacin acelerada y descontrolada
propia de las clulas tumorales no requiere nicamente una mayor
produccin de energa, sino que tambin hace indispensable un mayor
aporte de los materiales bsi-cos con los que generar nuevas clulas
de manera continua. Estos materiales incluyen a los fosfolpidos,
imprescindibles para formar las membranas de clulas y orgnulos de
nueva sntesis.
Cuando la clula necesita sintetizar nuevos lpidos, el citrato
mitocondrial es expor-tado al citosol y convertido, por accin de la
enzima ATP-citrato liasa (ACLY), en oxalacetato y acetil-CoA. El
oxalacetato puede ser transformado en piruvato por la enzima mlica
(ME, del ingls malic enzyme) generando adems NADPH, que resul-ta
necesario en la sntesis de lpidos. Por otro lado, la enzima
acetil-CoA carboxilasa (ACC) transforma el aCoA en malonil-CoA, y
la enzima cido graso sintasa (FAS, del ingls fatty acid synthase)
acopla un grupo acetilo y 7 grupos malonilo para generar cido
palmtico, a partir del cual se generan el resto de cidos
grasos.
Las enzimas que controlan la lipognesis, y especialmente la FAS,
se encuen-tran sobreexpresadas en cncer (Menendez and Lupu 2007), y
en general los tumores presentan un metabolismo de cidos grasos
sobreactivado con respec-to al de las clulas normales (Biswas,
Lunec et al. 2012). Resulta especialmente interesante resaltar que
metabolitos derivados del metabolismo de la glucosa como la misma
glucosa, la glucosa-6-fosfato o la xilulosa-5-fosfato, activan la
expresin de los genes que codifican para enzimas como ACC o FASN a
travs de la protena de unin al elemento de respuesta a
carbohidratos (ChREBP, del ingls carbohydrate response element
binding protein), lo que pone
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TESIS DOCTORALUB 2014
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de relieve la estrecha relacin existente entre metabolismo de la
glucosa y la sntesis de cidos grasos (Kabashima, Kawaguchi et al.
2003; Mitro, Mak et al. 2007) . Finalmente, vale la pena sealar que
la lipognesis est regulada por distintas vas de sealizacin que
suelen encontrarse alteradas en el cncer, como aquellas
relacionadas con la protena de unin al elemento de respuesta a
esteroles (SREBP, del ingls sterol regulatory element binding
protein).
FIGURA 11. Vas del metabolismo central. Representacin de las
rutas metablicas del metabolismo central. Las vas sea-ladas
(gluclisis, ruta de las pentosas fosfato, ciclo de Krebs, sntesis
de cidos grasos y sntesis/degradacin de aminocidos) se encuentran
con frecuencia alteradas en clulas tumorales debido a cambios en la
expresin de las enzimas que las regulan, a la regulacin
post-transcripcional de su actividad o a mecanismos de splicing
alternativo que generan distintas isoformas de las mismas. Hay
metabolitos, relacionados con flechas discontinuas, que forman
parte de rutas metablicas diferentes. G6P: glucosa-6-fosfato, F6P:
fructusa-6-fosfato, DHAP: dihidroxiacetona-fosfato, G3P:
gliceraldehdo-3-fosfato, Ru5P: ribulo-sa-5-fosfato, X5P:
xilulosa-5-fosfato, R5P: ribosa-5-fosfato, S7P:
sedoheptulosa-7-fosfato, E4P: eritrosa-4-fosfato, Pyr: piruvato,
Lac: Lactato, Cit: citrato, Isocit: isocitrato, -KG:
-cetoglutarato, SuCoA: succinil-coenzima A, Succ: succinato, Fum:
fuma-rato, Mal: malato, OAA: oxalacetato, BN: bases nitrogenadas,
aa: aminocidos, FA: cidos grasos, ATP: adenosintrifosfato, NADPH:
nicotin-adenin-dinucletido-fosfato reducido, ARN: cido
ribonucleico, ADN: cido desoxidibonucleico.
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01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 43
1.10.4. La ruta de las pentosas fosfato.
La formacin, a partir de una clula precursora, de dos clulas
hijas que conten-gan la misma dotacin gentica que aquella, implica
necesariamente la duplica-cin del ADN celular. Por ello, la ruta
biosinttica que desemboque en la forma-cin de nucletidos, los
monmeros del material gentico, tiene necesariamente una importancia
capital para mantener el crecimiento tumoral.
La ribosa-5-fosfato (R5P), sustrato inicial para la sntesis de
ADN y ARN, se sin-tetiza a travs de la ruta de las pentosas fosfato
(PPP, del ingls pentose phosphate pathway). Esta ruta mantiene
tambin una estrecha relacin con la sntesis de cidos grasos, ya que
no solo genera xilulosa-5-fosfato (X5P), capaz tambin de regular la
expresin de enzimas lipognicos a travs de ChBREP, sino que ade-ms
constituye uno de los mecanismos de generacin de NADPH, que resulta
imprescindible para la lipognesis.
La ruta de las pentosas fosfato ha sido clsicamente dividida en
dos ramas diferentes: la rama oxidativa y la rama no oxidativa. La
rama oxidativa, irre-versible, transforma la glucosa-6-fosfato
(G6P) en ribulosa-5-fosfato (Ru5P) a travs de tres reacciones
consecutivas que generan dos equivalentes de NA-DPH. La Ru5P se
puede convertir por isomerizacin en xilulosa-5-fosfato y en
ribosa-5-fosfato, que ser la unidad usada para la sntesis de ADN y
ARN. La enzima G6PDH, que cataliza el primer paso de esta va
oxidativa, es con-siderada la controladora del flujo metablico a
travs de la misma (Boren, Montoya et al. 2002).
La rama no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato es, a
diferencia de la oxidativa, reversible. A travs de ella, por tanto,
es posible no solo generar R5P desde la va de la gluclisis, sino
tambin reciclar el exceso de pentosas produ-cido en la va oxidativa
hacia esta. En la rama no oxidativa de la PPP, la ribo-sa-5-fosfato
y la xilulosa-5-fosfato generadas en la va oxidativa se
intercambian dos unidades de carbono gracias a la accin de la
enzima transcetolasa (TKT), lo que genera Gliceraldehdo-3-fosfato
(G3P) y sedoheptulosa-7-fosfato (S7P). Es-tas dos molculas generan,
a su vez, fructosa-6-fosfato (F6P) y eritrosa-4-fosfato (E4P) en
una reaccin catalizada por la enzima transaldolasa (TA).
Finalmente, de nuevo la TKT es capaz de catalizar la transferencia
de un fragmento de dos carbonos entre una segunda unidad de
xilulosa-5-fosfato y la eritrosa-4-fosfato, generando
fructosa-6-fosfato (F6P) y gliceraldehdo-3-fosfato (G3P), que sern
metabolizados siguiendo la va glucoltica o bien reintroducidos en
la va de las pentosas fosfato, ya sea a travs de su rama oxidativa
o a travs de la rama no oxidativa en el orden inverso al que
acabamos de describir (ver figura 12).
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TESIS DOCTORALUB 2014
ROLDN CORTSGIRLDEZ
PG. 44
La va de las pentosas fosfato est regulada por algunos de los ms
importantes proto-oncogenes y genes supresores de tumores. Se ha
descrito que los cnceres con mutaciones en KRAS presentan un
incremento simultneo de los niveles de G6PD, PK y LDH (de Atauri,
Benito et al. 2011), lo que hace que tanto la glu-clisis como la va
de la