EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA DE LA PROPIEDAD BIOCIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Pelargonium graveolens L'Hér. APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER PATRIMONIAL Y DE LAS POSIBLES ALTERACIONES DE LA CELULOSA EN EL PROCESO. DANIEL CAMILO RIPOLL ARISTIZABAL UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION LICENCIATURA EN QUIMICA MINISTERIO DE CULTURA - BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA BOGOTA 2019
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EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA DE LA PROPIEDAD BIOCIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Pelargonium graveolens L'Hér. APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER PATRIMONIAL Y DE LAS POSIBLES ALTERACIONES DE LA CELULOSA
EN EL PROCESO.
DANIEL CAMILO RIPOLL ARISTIZABAL
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION
LICENCIATURA EN QUIMICA MINISTERIO DE CULTURA - BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA
BOGOTA 2019
EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA DE LA PROPIEDAD BIOCIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Pelargonium graveolens L'Hér. APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER PATRIMONIAL Y DE LAS POSIBLES ALTERACIONES DE LA CELULOSA
EN EL PROCESO.
DANIEL CAMILO RIPOLL ARISTIZABAL
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE: Licenciado en Química
Tipo de siembra: Hongos por medio de plugs; bacterias y levadura por técnica de agotamiento
en superficie.
Medio de cultivo: PDA (Papa Dextrosa Agar Difco®)
Temperatura: Ambiente
Tiempo de crecimiento: Hongos (7 días), bacterias y levaduras (2 días).
El consorcio microbiano se preparó a patir de 3 mL de cada microorganismo, considerando el
tubo No 3 de la escala de turbidez de McFarland para la bacteria y levadura y para los hongos
el inóculo a 108 conidias/mL. Los 15 mL se agregaron a 35mL de solución salina estéril para
completar un volumen de 50mL, el cual fue utilizado como el consorcio microbiano final.
6.3.2 Preparación de muestras de papel
Se extrajeron 24 muestras de papel con longitudes de 2*4cm, las cuales fueron obtenidas de
las márgenes de las hojas de un libro del siglo XVIII seleccionado del Laboratorio de
Conservación de la BNC. Las muestras fueron esterilizadas en autoclave a 121ºC y 15psi.
6.3.3 Inoculación de la muestra de papel con el consorcio microbiano
Se empleó un consorcio microbiano para la inoculación el soporte, con el fin de semejar las
condiciones reales de biodeterioro causada por microrganismos
Las muestras de papel fueron clasificadas como: 1. muestras para el tratamiento con el aceite
(18), 2. Control positivo (3) y 3. Control negativo (3). Los grupos de muestras 1 y 2 fueron
inoculados con el consorcio de microorganismos por el método de inmersión en cabina de
bioseguridad, se dispusieron de a tres muestras en las cajas de petri estériles y se dejaron a
temperatura ambiente. Diariamente se adicionaban 150mL de agua estéril sobre la probeta
para facilitar la inducción del biodeterioro.
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6.3.4 Preparación de la solución del AE
Se preparó la solución del AE de P. graveolens al 1% tomando 0.1mL del AE obtenido del
apartado 6.1.3: Extracción de los AE(s) (pág. 30) y se llevó a volumen del 10mL de EtOH al
75%.
6.3.5 Tratamiento de las muestras de papel con la solución del AE
Las muestras correspondientes a los grupos 1 y 3 se humedecieron completamente con 150µL
de la solución del AE de P. graveolens al 1%.
6.3.6 Evaluación de la acción microbicida.
Las muestras fueron sometidas a dos técnicas de cultivo para comprobar la eficacia del AE:
siembra en superficie y técnica de los 25 puntos de inoculación.
A. Siembra de superficie
Las 24 muestras correspondientes a los grupos 1, 2 y 3 fueron dispuestas una a una en
erlemeyers de 25mL con agua destilada estéril. Posteriormente se agitó vigorosamente
en vortex por 30 segundos. Los productos fueron clasificados como Solución SS1, 2 y
3 y Muestras MP1, 2 y 3 (muestras de papel). De la solución SS (agua del Erlemyer) se
tomaron 500µL y se sembraron en superficie en medio PDA. Las muestras se incubaron
a temperatura ambiente.
B. Técnica de 25 puntos
De las muestras MP1, 2 y 3, se tomaron 25 pequeños fragmentos los cuales fueron
sembrados en cajas de Petri con medio de cultivo PDA en una disposición de 5 x 5 con
a una distancia de 1cm entre sí para su incubación.
Debido al tiempo de crecimiento que presenta los diferentes microorganismos que
posiblemente se encontrarían, se evaluaron los resultados a 3, 6 y 10 días. La verificación de
crecimiento a nivel macroscopico de los microrganismos; seria realizada de acuerdo a las
siguientes características morfológicas (Inf. Laboratorio de Ciencias. Cepario):
BDM7: Colonia plana de coloración blanca con producción de pigmento al medio de color marrón.
No produce exudados y su borde es irregular.
LRVIAL15: Colonia elevada brillante de coloración rosa y sin producción de pigmento al medio. Su
borde es regular
AspAM5: Hongo xerófilo de coloración blanca, su centro es verde y no produce pigmento en el
medio. Su textura es aterciopelada, tiene exudados traslucidos y sus bordes son
regulares.
PDM1: Colonia de coloración verde oscuro sin la producción de pigmento al medio, su textura es
aterciopelada y sus bordes son irregulares
STACHYHD322: Colonia de coloración negra o café con producción de pigmento al medio de color café,
su textura es aterciopelada, tiene exudados marrones y sus bordes son irregulares
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7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
7.1 CARACTERIZACIÓN FISICA Y QUÍMICA DEL AE DE P. graveolens
7.1.1 Recolección del material vegetal
La especie fue adquirida en la Plaza de hierbas Samper
Mendoza ubicada en la localidad de Mártires en Bogotá,
y las indicaciones del proveedor que ha sido constante a
lo largo del proyecto muestran que la recolección de la
especie Pelargonium graveolens se llevó a cabo en la
vereda La Balsa del municipio de Chía, Cundinamarca
en las coordenadas geográficas 4°50’34.7’’N
74°04’23.7’’W entre los meses de febrero y marzo de
2018 (figura 09).
Figura 9. Zona de cultivo del material vegetal adquirido
7.1.1.1 Identificación del material
La identificación taxonómica de la especie se realizó en el Herbario Forestal UDBC (Facultad
de Medio Ambiente, UDFJC) a cargo de Lyndon Carvajar Rojas. La especie identificada
corresponde a Pelargonium graveolens L'Hér. ex Aiton (Consular Anexo 2)
7.1.2 Determinación del % de humedad de la muestra de P. graveolens
El porcentaje de humedad relativa de la especie corresponde al 75% de su peso. Resultado
semejante al reportado por Jaramillo y Pinto 2017 el cual fue del 78.5%. Las variaciones del
porcentaje de humedad son atribuidas a los distintos indices de precipitación en el municipio
de Chía en los meses de recolección de la especie.
7.1.3 Extracción del AE de P. graveolens: Caracterización fisica
Se realizó un total de 5 extracciones de AE(s) de la especie vegetal Pelargonium graveolens
(Geraniaceae) cuyas caracterizaciones se encuentran acontinuación:
7.1.3.1 Determinación del % de rendimiento
La coloración del AE es verde palido. En la tabla 08 se pueden encontrar los respectivos
porcentajes de rendimiento. El promedio del porcentaje correspondio a 0.43% el cual se
asemeja a lo reportado por Jaramillo & Pinto 2017.
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Tabla 8. Extracciones de P. graveolens
7.1.3.2 Determinación de constantes físicas
Los ensayos para la determinación de los índices de refracción y densidad del AE se realizaron por triplicado, obteniendo así los resultados consignados en la tabla 09. Tabla 9. Constantes físicas del aceite esencial P. graveolens
Tipo de ensayo: T de 18 ± 2 °C. Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
Índice de refracción 1.468 1.469 1.468 1.468
Densidad (g/mL) 0.908 0.911 0.911 0.910
El AE de P. graveolens obtenido presenta un índice de refracción de 1.468 y una densidad de
0.910 g/mL a 18 ± 2 °C, presentando concordancia con las constantes físicas expuestas por
Jaramillo & Pinto 2017 quienes reportan valores de 1.465 y 0.914 en las mismas condiciones,
y la casa comercial Sigma-Aldrich informa que el índice de refracción del AE es de 1.493 y su
densidad es de 0.887 g/mL a 25°C (Sigma-Aldrich, 2018).
El índice de refracción del AE obtenido (1.468) es cercano al índice de refracción del AE
comercial (1.463) y las diferencias posiblemente se deben a factores como la temperatura, el
lugar de recolección de las muestras y las condiciones en las que se extrajeron los aceites.
Para el presente estudio, se realizó la extracción con material vegetal seco, recolectado en el
municipio de Chía de igual forma que en la investigación desarrollada por Jaramillo y Pinto
2017, lo que permite asociar la similitud de los resultados (Reichert Technologies, n.d.).
Por su parte, las diferencias entre las densidades de los AE experimentales y el AE comercial,
se puede deber principalmente a la variación en la temperatura, la cual es inversamente
proporcional a la densidad como podemos apreciar al comprar las condiciones en las que se
realizaron las mediciones.
7.1.4 Caracterización química por CG-EM
La caracterización cromatografica de la especie vegeral P. graveolens responde a los intereses
del proyecto titulado “Estudio de aceites esenciales a partir de especies vegetales promisoras,
como posibles productos del control del biodeterioro del Patrimonio bibliográfico Colombiano”;
por lo que el reporte anexo (Tabla 10 y figura 10) responde a los resultados cromatograficos
de Jaramillo y Pinto 2017 enmarcados en el mismo proyecto dado a que por problemas de
disponibilidad del equipo, no fue posible repetir este análisis en el actual trabajo.
Fecha de extracción
Órgano empleado
Masa vegetal (g)
Volumen obtenido (mL)
Masa obtenida (g)
% de rendimiento
11-04-18 Hojas-secas 318.4 1.6 1.46 0.46
12-04-18 Hojas-secas 277.0 1.4 1.27 0.46
18-04-18 Hojas-secas 310.6 1.4 1.27 0.41
19-04-18 Hojas-secas 293 1.2 1.10 0.38
26-04-18 Hojas-secas 296 1.4 1.27 0.43
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Tabla 10. Compuestos identificados en el aceite esencial P. graveolens. Recuperado de
Jaramillo & Pinto 2017
Señal NOMBRE % AREA CONC. ppm CLAS. IR
TEORICO IR
EXPERIMENTAL
1 α-Pineno 0,48 29 M* 939 933
2 β-Mirceno 0,47 29 M 991 987
3 α-Felandreno 0,3 18 M 1005 1005
4 Limoneno 0,41 25 M 1031 1021
5 β-cis-Ocimeno 0,4 25 M 1040 1035
6 Cis-Sabineno 0,43 26 M 1068 1043
7 β-Linalool 6,11 374 MO* 1098 1097
8 p-Mentona 4,17 255 MO 1154 1149
9 α-Terpineol 0,85 52 MO 1189 1181
10 β-Citronelol 10,51 644 MO 1228 1229
11 Trans-Geraniol 29,99 1837 MO 1255 1255
13 α-Citral 0,66 40 MO 1270 1263
14 2-Undecenal 0,31 19 AC* NR 1338
15 Neril acetato 0,78 48 E* 1365 1356
16 Ácido Decanoico 2,38 146 AC NR 1353
17 β-Elemeno 0,36 22 S* 1375 1481
18 α-Copaeno 0,46 28 S 1376 1365
19 Acetato geranilo 2,94 180 E 1383 1380
20 β-Bourboneno 0,62 38 S 1384 1381
21 (-)-Aristoleno 4,4 270 S 1416 1415
22 Cariofileno 0,3 18 S 1418 1407
23 Neril propionato 1,64 100 E 1454 1447
24 Germacreno D 1,42 87 S 1480 1478
25 α-Bulneseno 0,52 32 S 1505 1419
26 γ-Cadineno 0,49 30 S 1513 1514
27 δ-Cadineno 0,31 19 S 1524 1531
28 Geranil butirato 0,65 40 E 1562 1567
29 Fenil etil tiglato 1,32 81 E 1584 1597
30 γ-Eudesmol 2,64 162 SO* 1630 1628
31 Geranil tiglato 2,67 164 E 1700 1697
Tabla 11. Abundancia y clasificación de compuestos mayoritarios del AE de P. graveolens
* TIPO DE COMPUESTO MAYORITARIO # %
M MONOTERPENOS 6 2.49
MO MONOTERPENOS OXIGENADOS 6 52.29
S SESQUITERPENOS 9 8.06
SO SESQUITERPENOS OXIGENADOS 1 2.64
E ESTERES 6 10
AC ACIDOS 2 2.69
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Figura 10. Cromatograma del AE de P. graveolens en las condiciones de estudio.
Se identificó que el 78.99% del aceite esencial estaba conformado por 30 compuestos (la señal
12 correspondía al patrón interno); y si bien se evidencio en la composición del aceite, un grupo
de 6 monoterpenos, 6 monoterpenos oxigenados, 9 sesquiterpenos, un sesquiterpeno
oxigenado, 6 ésteres y 2 ácidos (ver tabla 11); los monoterpenos oxigenados son el grupo más
representativos en la composición del aceite, conformando así el 52.29% del AE y del cual el
29.99% es trans-geraniol, el 10.51% β-citronelol y el 6.11% linalool (Jaramillo & Pinto, 2017).
Al analizar los resultados y en concordancia con la investigación de Birendra Kumar, se
observa que el porcentaje de trans-geraniol es mayor al de β-citronelol, esto debido a que los
AE fueron extraídos en una fecha post recolección del material vegetal (Kumar et al., 2005).
Ahora bien, bajo las consideraciones del apartado 5.5.3.3 sobre la caracterización del AE de
P. graveolens (pág. 27), se asume que el grupo de metabolitos que se encuentra en el AE
obtenido en la presente investigación es similar al grupo de metabolitos que fueron
encontrados en la investigación realizada por Jaramillo & Pinto 2017. Y, que las posibles
diferencias metabolicas que se pudieran presentar, corresponderian a variaciones mínimas en
el porcentraje de abundancia de cada uno de los contituyentes del AE, debido a que factores
como el lugar de procedencia de la muestra y el estado en que fue extraida (seca) responden
a la misma metodología.
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7.2 EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA
CELULOSA POR TRATAMIENTOS CON EL AE
7.2.1. Caracterización general del soporte de papel
Las muestras de papel utilizado en la investigación fueron seleccionadas de un documento
que como se caracteriza en la tabla 12 corresponde a papel elaborado manualmente a
mediados del siglo XVIII. En la figura 11 se muestra el documento, el cual presenta marcos
amplios sin información consignada; las muestras fueron tomadas de allí con el fin de no alterar
su propiedad intelectual. Además de esto, la elección del material se realizó debido que este
no responde a los parámetros de documento patrimonial consignados en el apartado 5.1.1
del marco legal colombiano (pág. 6-7), donde la ley 594 del 2000 considera que un documento
patrimonial contribuye a la historia y cultural nacional y la ley 1379 del 2010 que amplia esta
definición a la construcción de identidad nacional. Sin embargo la muestra seleccionada es
catalogada como un soporte patrimonial dada su procedencia y su tipo fabricación.
Tabla 12. Descripción de la muestra de papel estudiada
Descripción
Fecha de elaboración Medidados del siglo XVIII
Generalidades Coloración amarilla con signos de oxidación en los bordes
Gramaje 71,597 g/m2
Calibre 0,273 mm
Tipo de Fibra Papel manual con fibras alargadas, cortas, estriadas con
líneas transversales y dobleces en forma de cinta con
canales estrechos, características de fibras de lino y
algodón
Procedencia Pulpa de trapo
Figura 11. Libro en proceso de restauración de la BNC
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7.2.2 Evaluación del nivel de pH
El pH de la muestra de papel patrimonial y los grupos de probetas tratadas A) Control, B)
Control + aceite, C) Envejecido y D) Solución de AE + Envejecimiento. El ensayo se realizó a
una temperatura de 20.3°C y los resultados son consignados en la tabla 13
Tabla 13. Resultados medición del pH del grupo de papel patrimonial con respectivos tratamientos.
Muestra 1 2 3 4 5 Prom.
Control 6.73 6.67 6.96 6.67 6.68 6.74
Control + AE 6.49 6.69 6.51 6.60 6.65 6.58
Envejecido 7.44 7.35 7.40 7.37 7.49 7.41
Envejecido + AE 6.96 6.85 6.95 6.82 6.61 6.83
El nivel de pH del papel depende del contenido de agua en las muestras y el grado de oxidación
del mismo; la adición de AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% provoca una ligera
disminución en la escala de pH, como se puede observar en la tabla 13. Esta variación se
considera baja y posiblemente se deba a la interacción celulosa-agua con el solvente, el cual
podría cambiar el equilibrio y la cantidad de agua en la celulosa, como consecuencia de la
polaridad del solvente, el cual puede acaparar el agua al formar puentes de hidrogeno,
favoreciendo la volatilización de moléculas de agua en la muestra, y provocando así el
aumento en el nivel de acidez en el soporte (Calderón Delgado, 2008).
En cuanto a la variación de los niveles de pH provocados por el proceso de envejecimiento
acelerado, se denota un aumento de alcalinidad en la muestra (de 6.74 a 7.41). Estos
resultados se encuentran en contradicción al ser comparados con lo reportado por Jaramillo y
Pinto 2017, quienes evidencian un aumento en la acidez en los soportes a casusa del proceso
de envejecimiento para este mismo tipo de muestras (de 6,75 a 6,54). El resultado se considera
anómalo ya que por el mismo proceso de envejecimiento acelerado, en el cual se someten las
muestras a una temperatura de 80°C en un horno por un periodo de 72 horas, se esperaría
que los niveles de agua disminuyan y aumenten los niveles de acidez. Sin embargo la
heterogeneidad de las muestras de PAPEL ARTESANAL, las cuales si bien proceden del
mismo libro, no lo hacen de la misma hoja; pueden ser los causantes de los valores observados
y el comportamiento que presento.
7.2.3. Cuantificación de azúcares reductores
Para la cuantificación de los azúcares reductores, se realizó una comparación de dos métodos
debido a que, en los anteriores marcos del proyecto, se ha encontrado limitaciones
experimentales para el método de Dubois por el rango de concentración para los valores en la
curva de calibración (Jaramillo & Pinto, 2017) y la posible sulfonación del fenol (López et al.,
2017).
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Sobre el método de Dubois, se busca disminuir el rango de concentración para la detección y
con el método del ácido sulfúrico-UV se quiere observar el comportamiento que se presenta
en ausencia del fenol. De acuerdo a López, el método de ácido sulfúrico-UV es más óptimo
por la estabilidad de los complejos de HMF formados en la reacción del azúcar con el ácido y
su capacidad de absorber en el espectro UV (López et al., 2017).
7.2.3.1 Selección del método para la cuantificación de azúcares
Curva de calibración método del fenol sulfúrico (Dubois): A continuación se presenta el
barrido espectrofotométrico de 400 a 700nm y los máximos de absorbancia (490nm) realizado
en el equipo Shimadzu UV/VIS 1800 para cada una de las diluciones preparadas en el apartado
6.2.2 (Ver figura 12).
Figura 12. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg/mL)
en fenol-ácido sulfúrico a longitudes de onda de 400 a 700 nm.
Se realizó la respectiva regresión lineal (figura 13),
con la curva de calibración obtenida y se calculó el
valor de R en 0,99577. Considerando la ecuación de
Ley de Beer-Lambert se determinó que la
concentración para la solución A es de 0.01695
mg/mL (0.2399 mg/g papel) y para la solución B es
de 0.02675 mg/mL (0.4097 mg/g papel).
A partir de los resultados anteriores, es posible destacar que la muestra de papel procedente
de Sln B presenta un mayor contenido azúcares reductores en relación con Sln A. Estas
variaciones responden a los procesos de elaboración del papel para ambas muestras
(apartado 5.2.1 de historia pág. 8 y 5.2.3 de composición química pág 13), debido a que la Sln
A proviene de fibras de caña de azúcar con altos grados de polimerización en la celulosa y Sln
B proviene de procesos de reciclaje en los que se encuentran diferentes fuentes de celulosa y
Figura 13. Curva de calibración y regresión lineal.
0
0,5
1
1,5
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
43
cuya estabilidad dimensional sería menor dada la fracturación de la celulosa en el momento
de la elaboración de este soporte, causando que las que las fibras se encuentren en menores
grados de polimerización y cuente con un mayor contenido de azúcares reductores tal como
se evidencia (Melorose et al., 2015).
Curva de calibración método del ácido sulfúrico – UV: A continuación se presenta el barrido
espectrofotométrico de 200 a 400nm y los máximos de absorbancia (315 nm) realizado en el
equipo Shimadzu UV/VIS 1800 para cada una de las diluciones preparadas en el apartado
6.2.2 (Ver figura 14).
Figura 14. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08
mg/mL) en ácido sulfúrico a longitudes de onda de 200 a 400 nm
Se realizó la respectiva regresión lineal (figura 15), con
la curva de calibración obtenida y se calculó el valor de
R en 0,92525. Dadas las variaciones en medida de la
absorbancia para esta región, el método no se
considera para la evaluación de azúcares reductores en
muestras de papel.
Figura 15. Curva de calibración y regresión lineal.
Al observar los resultados del barrido espectrofotométrico en la curva de calibración por el
método del ácido sulfúrico-UV, se denota: 1. Señales de ruido por el alto contenido de enlaces
dobles y pares de electrones libres que presenta la molécula de hidroximetil furfural (HMF)
formada por la reacción (Retomar anexo 1), y 2. Un efecto hipercrómico e hipocrómico de
variación en la intensidad de la absorbancia, el cual podría estar asociado a los cambios en la
concentración de las muestras, lo que cuestionaría la sensibilidad de este método en la
cuantificación de azúcares (Universidad de Granada, 2004).
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De igual forma, al llevar este método a la cuantificación de azúcares en soportes de papel, es
necesario considerar que por la reacción de deshidratación de azúcares con ácido sulfúrico
(Retomar anexo 1) se formaría tanto HMF proveniente de la deshidratación de los
constituyentes de la celulosa, como algunos derivados del HMF provenientes de las
hemicelulosas en el papel, por ejemplo el Hidroxifurfual (HF) que se forma por la deshidratación
de pentosas. Las diferencias estructurales en los productos formados ocasionarían efectos
batocrómicos y/o hipsocrómicos (variación de la longitud de onda de máxima de absorción);
como consecuencia de los diferentes sustituyentes en los productos en la reacción; se
entorpecen los procesos de cuantificación (Universidad de Granada, 2004).
Pese a que el tratamiento de las muestras para el método de Dubois y ácido sulfúrico-UV en
la determinación de azúcares se realizó en las mismas condiciones como lo sugieren los
autores López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo, 2017, se encuentra que es necesario
replantear los rangos de concentración de la curva de calibración y evaluar sensibilidad del
método ácido sulfúrico-UV, como también es necesario considerar que para el tipo de muestras
con alta complejidad en el contenido metde azúcares, se enmascararían los resultados por el
método del ácido sulfúrico-UV, presentando un mayor número de limitaciones en el ensayo.
Finalmente, con los cambios realizados en la concentración de las muestras por el método de
Dubois se logró observar una respuesta confiable en la lectura de las muestras desconocidas,
y al controlar el orden y los tiempos en la adición de los reactivos (adición de fenol a la muestra
de azúcar e inmediatamente después el ácido sulfúrico) se disminuye la posibilidad de la
sulfonación del fenol. Por lo anterior se selecciona el método de Dubois para la cuantificación
de azúcares reductores en los soportes de papel.
7.2.3.2 Determinación de azúcares reductores
En las tablas 14, 15, 16 y 17 presentadas a continuación se expresan los resultados de la
cuantificación de azúcares reductores en las muestras de papel evaluadas, donde A.
corresponde a la muestra de referencia, B. a la muestra impregnada el AE, C. a la muestra
sometida a envejecimiento acelerado y D. Muestra impregnada el AE y sometida a
envejecimiento acelerado.
Tabla 14. Cuantificación de azúcares reductores en muestra de referencia
A Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,377 0,5123 0,02288 0,03268 0,63792
2 0,382 0,5227 0,02320 0,03314 0,63408
3 0,342 0,4823 0,02061 0,02944 0,61049
Promedio 0,62749
Tabla 15. Cuantificación de azúcares reductores en
muestra impregnada con AE
B Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,599 0,6215 0,03725 0,05321 0,85618
2 0,45 0,5341 0,02760 0,03943 0,73829
3 0,579 0,6514 0,03595 0,05136 0,78849
Promedio 0,79432
45
Tabla 16. Cuantificación de Azúcares reductores en
muestra sometida a envejecimiento acelerado
C Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,649 0,4579 0,04049 0,05784 1,26307
2 0,648 0,5124 0,04042 0,05774 1,12692
3 0,865 0,5873 0,05447 0,07781 1,32491
Promedio 1,2383
Tabla 17. Cuantificación de azúcares reductores en
muestra impregnada con el AE y con
envejecimiento
D Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 1,472 0,5674 0,09376 0,13395 2,36075
2 1,114 0,5736 0,07059 0,10084 1,75802
3 0,961 0,5232 0,06068 0,08669 1,65693
Promedio 1,70748
*No se considera como dato como confiable
Tabla 18. Concentración de azúcares reductores en muestras de papel
Muestra Azúcares reductores [mg/g papel] Aumento de azúcares (%)*
Referencia 0,62749 -
Con AE 0,79432 26.59
Envejecido 1,23830 97.34
Envejecido + AE 1,70748 172.11
*El % de aumento de los azúcares reductores fue realizado bajo una consideración del 100% de la muestra de referencia
La cuantificación de azúcares reductores evidencia un aumento significativo en las muestras
de papel que fueron impregnadas con el AE (ver tabla 18), evidenciando un aumento del
26.59% de los azúcares reductores con respecto a la muestra de referencia. Dicho aumento
puede deberse a su carácter higroscópico (Ver: Propiedades estructurales: absorción y
humedad relativa pág. 8-9), que le permite absorber el solvente utilizado en la preparación de
AE adicionado (EtOH 75%), lo cual debilita los enlaces entre las fibras de la celulosa, y podría
disminuir su grado de polimerización, facilitando su degradación al aumentar el % de azúcares
reductores en la muestra (Marquerie & Santos, 2015; Melorose et al., 2015).
De igual forma, el proceso de envejecimiento acelerado contribuye en gran medida al aumento
de azúcares reductores en las muestras de papel, ya que como lo vimos en la alteración en
las propiedades ópticas pág. 11 y en la evaluación química del deterioro de la celulosa pág.
20; el suministro de energía requerido para simular el proceso de envejecimiento que sufriría
el papel en 50 años, daría lugar a procesos de lisis que degradarían la celulosa, aumentando
el nivel de azúcares reductores, el cual se puede observar al comparar la muestra de referencia
con la del proceso de envejecimiento acelerado, que provoca un aumento del 97.34% de los
azúcares reductores. Así mismo, cuando se trata de muestras de papel la impregnación del
AE más el envejecimiento acelerado, se suman los efectos que provocarían un aumento de
los azúcares reductores siendo este aumento del 172.11%.
7.2.4 Evaluación colorimétrica (Tonalidad en coordenadas CIEL*a*b*)
Se determinaron los valores de las coordenadas CIEL*a*b* con el equipo Spectro-Guide 45/0
gloss – BYK. Los valores numéricos fueron tratados estadísticamente y posteriormente fueron
evaluados (transformados) en los distintos sistemas de coordenadas para representar las
tonalidades de color. En la tabla 19 se muestran los resultados colorimétricos de las muestras
estudiadas.
46
Tabla 19. Resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*a*b* en muestra control
Considerando que la especie B. subtilis se encontraba inicialmente en un medio celulósico con
otros microorganismos (Rhodotorula mucilaginosa, Aspergillus sp, Penicillium sp y
Stachybotrys sp); se cree posible que la formación de endósporas se presentó una vez se
reducía la disponibilidad de los recursos alimenticios en el medio.
Así mismo, B. subtilis es capaz de formar estructuras asociativas complejas denominadas
biofilms, en las que las células se unen a manera de cadenas en un estado sésil (asociadas
entre sí) proporcionando rigidez y una serie de ventajas para desarrollarse en el entorno.
La matriz estructural de un biofilm cuenta con una serie de proteínas y polisacáridos que
las mantienen juntas; y en presencia del ácido poli-γ-glutámico (γ-PGA) su morfología y
robustez se ve favorecida (Yu et al., 2016). De acuerdo con lo anterior, se ha reportado
que hongos del genero Aspergillus sp durante la degradación de fuentes de carbono como
la celulosa, liberan el γ-PGA al entorno, de manera que es posible que se hubiera
presentado la formación de biofilm de B. subtilis y que además este se beneficiase por los
productos (γ-PGA) antes del tratamiento con el AE dada la presencia de Aspergillus sp en
el consorcio microbiano (Quijano & Zuleta, 2006). De igual forma, el biofilm de B. subtilis
produce exopolisacáridos (EPS) y proteínas como la BslA en la parte superior del biolfilm
que sirven como capa hidrofóbica lo cuál brinda mayor protección a la especie (Mielich-
Süss & Lopez, 2015; Rao et al., 2013).
55
En el contexto anterior, la presencia de B. subtilis después del tratamiento con AE de P.
graveolens al 1% en EtOH al 75% puede estar asoaciada a:
La hidrofobicidad de la membrana del organismo, la cual cuenta con una gran cantidad
de capas de peptidoglicano compuesta por polimeros derivados de carbohidratos (N-
acetil-glucosamina y ácido N-acetilmuránico) de gran tamaño molecular y una serie de
peptidos formados por aminoacidos como L-Alanina, D-Ácido glutámico, L-Lisina y D-
Alanina que la dotan la estructura de un marcado carácter hidrofobo que no permitiria
facilmente interacciones con el solvente del AE.
Su capacidad para formar endósporas, las cuales por su carácter igualmente hidrofobo
y la serie de capas que la conforman (proteinas, polisacaridos, y peptidoglicano) le
permetirian permetirian resistir de manera latente hasta que las condiciones del medio
mejoren y favorezcan de nuevo su germinación y desarrollo.
La posible formación de biofilm robusto dada la presencia de γ-PGA en el medio, el cual
estaria compuesto por una serie de EPS (polimeros de carbohidratos con proteinas de
caracteristica hidrofoba) y proteinas como la BslA igualmente de carácter hidrofobo.
Figura 25. De izquierda a derecha: Proteína BslA, geraniol y citronelol. Tomado de Rao et
al., 2013
La proteina BslA (ver figura 23) es una hidrofobina altamenta apolar que en conjunto
con el grupo de EPS dificultaria las interacciones de la membrana del microorganismo
con el solvente (EtOH 75%) y el grupo de metabolitos presentes en el AE como
monoterpenos oxigenados (principalmente trans-generiol y β-citronelol). Su caracter
hidrófobo protegerian a la bacteria de procesos de lisis y denaturalización de sus
macromoleculas ocasionados normalmente por las interacciones de los componentes
metabolicos de los AE (Rao et al., 2013)
56
Por otra parte, Fisher & Phillips, 2008 mencionan que la actividad microbiocida de los AE en
bacterias puede depender de:
1. La Concentración del aceite
2. El Tiempo de exposición: Las diferencias morfologicas de algunos microorganismos
hacen que las intereacciones de sus membranas con los AE se vea entorpecida y
requiera de más tiempo para producir el efecto. Según la NTC 5230, los procesos de
desinfección tradicional requieren normalmente de entre 5 y 15 minutos, y en el ensayo
se dejó un tiempo mayor a 24horas con ningún efecto microbicida para la bacteria.
Así, se ha reportado un efecto microbiocida del AE de P. graveolens en concentraciones del
50 y 20% frente al B. subtilis, mientras que no se reportaba este mismo efecto en
concentraciones del 10% (Prabuseenivasan, Jayakumar, & Ignacimuthu, 2006).
En las condiciones de estudio, el AE de P. graveolens se encontraba al 1% en EtOH al 75%
y la evaluación de su efecto microbicida inicio 48 horas post aplicación. Acorde a los resultados
de Prabuseenivasan, Jayakumar & Ignacimuthu, 2006 y las consideraciones de Fisher &
Phillips, 2008 dejamos la siguiente pregunta abierta en el contexto de la investigación.
¿Se justificaría evaluar el AE de P. graveolens considerando que la preparación de 1L de AE
al 1% en EtOH representaría un costo de $52.800, al 10% representaría un costo de $528.000
y al 25% $1.320.000 sin considerar el costo del etanol?
En la actualidad la BNC realiza este tipo de tratamientos con el desinfectante TIMSEN
conformado por 40% de radicales alquílicos y bencílicos y un 60% de urea quelatadatipo
G.R.A.S. (Amonios cuaternarios). El costo de 1Kg de TIMSEN es de 200.000 y se requiere de
1g/L para realizar los tratamientos de desinfección de los soportes de papel, por lo que con
1Kg de TIMSEN se prepararian 1000 L de solución desinfectante, sin embargo a pesar de su
rendimiento, los resultados de los controles de calidad que se hacen en el labororatorio,
evidencia un efecto microbicida no significativo sobre bacterias aerobias, esporuladas.
Por lo tanto es necesario continuar investigando nuevas moleculas que brinden un amplio
espectro de acción frente a la diversidad de agentes deteriorantes, siempre identificar los
microorganismos para conocer la fenomenología de la posible resistencia que generen los
productos de control y pensar en la vulnerabilidad permanente de los soportes a los
compuestos químicos de diferente naturaleza.
57
8. CONCLUSIONES
El rendimiento de la extracción del AE de P. graveolens por arrastre de vapor empleado
material vegetal seco corresponde a un 0.43%
Se considera que el método de Dubois adaptado en el presente trabajo, es el más apropiado
para la cuantificación de los azúcares reductores en soportes de papel tipo manual.
En la aplicación del AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% sobre soportes de papel de
carácter patrimonial tipo manual, se observa que en parámetros como acidez y tonalidad, no
hubo alteración significativa. Sin embargo se evidencia el aumento de los azucares reductores
de un 26.59%
El AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% presenta actividad microbicida frente a la
levadura Rhodotorula mucilaginosa y los géneros de hongos Aspergillus sp, Penicillium sp y
Stachybotrys sp cuando estos se encuentran en un consorcio microbiano sobre soportes de
papel tipo manual.
La bacteria B. subtilis persiste en los soportes de papel, aún después de la aplicación del AE
de P. graveolens al 1% en EtOH al 75%.
Se logró desarrollar un método experimental inoculando el soporte de papel con un consorcio
de microganismos que simula las condiciones reales de biodeterioro microbiano en soportes
documentales.
9. RECOMENDACIONES
Continuar con el método de evaluación de productos de control de biodeterioro utilizando
consorcios de microorganismos, lo cual permite una mayor aproximación a las condiciones
reales post tratamiento del material patrimonial.
El aceite esencial de Pelargonium graveolens a la concentración evaluada, no tiene efecto
bactericida frente a Bacillus subtilis en las condiciones de estudio, y dados los altos costos de
obtención, no se recomienda continuar los ensayos a concentraciones mayores del AE.
El aceite esencial de Pelargonium graveolens presenta actividad microbicida frente a hongos
filamentosos y no filamentos, por lo que se sugiere la posibilidad de realizar ensayos con
mezclas de aceites esenciales que afecten la totalidad de microorganismos de los consorcios
(Bacterias y hongos filamentosos y no filamentosos). En marco del proyecto, se sugiere
mezclas con los aceites extraídos de las especies vegetales: Ocinimum basilicum, Lippia alba
y Pelargonium graveolens, este último en mezclas a baja concentración, y centrando gran
interés en Lippia alba por su contenido de monoterpenos como D-limoneno y carvona y sus
porcentajes de rendimiento.
58
Otro aspecto importante a considerar en el estudio de los AE como agentes microbicidas para
el control de biodeterioro en soportes documentales, es el diseño experimental de un
procedimiento que permita evaluar los costos de su aplicación en materiales de la BNC.
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ANEXOS
Anexo 1. Métodos para determinación de azúcares que emplean ácido sulfúrico. Recuperado de
Jaramillo & Pinto 2017 y adaptado de López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo, 2017
Dubois El método se fundamenta en la reacción de azúcares reductores con
ácido sulfúrico concentrado para formar furfurales (HM con pentosas)
o 5- hidroximetilfurfurales (HMF con hexosas). Dicho derivado entra
en procesos de protonación/desprotonación debido al medio
fuertemente ácido y es reconocido por el fenol en exceso, presente
en el medio, formándose compuestos de color amarillo/café que se
pueden leer a 490 nm.
O
H
HO
H
HO
H
OH
OHHH
OH
H2SO4 O
OH
O
+
OH
O
OH
O
OH
O
2
Glucosa Hidroxi-metil furfural Fenol
[5-( hidroximetil) furan-2-il]( difenoxi) metanol Ác. Sulfúrico-Fenol En concordancia con el método de Dubois, la reacción de fenol-ácido
sulfúrico ocurre una sulfonación del fenol, el ácido fenolsulfónico
formado es capaz disminuir la intensidad de color del HMF, el furfural
entre otros, afectando las lecturas espectrofotométricas.
Por lo que en esta metodología se sugiere un intercambio en el orden
de adición de los reactivos, manteniendo el fundamento de Dubois.
Ác. Sulfurico-UV
El HMF producido por la deshidratación de alcoholes con ácido
súlfurico concentrado, posee la capacidad de absorción en longitudes
de onda de luz en el rango ultravioleta
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Anexo 2. Certificado de identificación del material vegetal estudiado.
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Anexo 3. Procesamiento colorimétrico
Conversión coordenadas cromáticas Sistema CIE L*a*b* al Sistema CIE L*C*h*
Para calcular L*: es el mismo del sistema L*a*b* Para
calcula C*: 𝐶∗ = √(𝑎∗)2 + (𝑏∗)2
Para calcular h*:
El resultado se expresa en grados (°)
Nombre sistemático del color y asignación del orden Munsell: L* h*/C*
Se consultan las tablas que se anexan y se asignan los valores L*, C* y h* siguiendo el
orden mostrado arriba. Para asignar el nombre sistemático del color, inicialmente se
toma el valor h*, luego el valor C* y por último el valor L*. Si se compara el color Munsell
con los catálogos, primero se toma el valor del matiz (H), después el valor (V) y por
último el croma (C).
Conversión de valores del sistema CIE L*a*b* al sistema XYZ y coordenadas cromáticas x y z.
Inicialmente se calculan las dimensiones Yn, Xn y Zn usando las siguientes fórmulas:
Luego se calcula X Y Z usando las siguientes fórmulas:
X = 95,047 Xn Y = 100 Yn Z = 108,883 Zn
Los resultados se aproximan y expresan en números enteros.
Para calcular las coordenadas cromáticas x y z se calcula el cociente entre el valor X, Y
o Z y la sumatoria de los tres valores.
La sumatoria de las coordenadas debe ser igual a 1.
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Sistema de asignación de nombres de colores del sistema CIE L*C*h* y Munsell.
Laboratorio de fisicoquímica Escuela de conservación, Restauración y Muséografía, INAH
Calle general Anata No. 187, Col. San Diego Churubusco, 04120 (Coyoacán) México, D.F., México