UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER Ecole doctorale Biologie - Santé - Biotechnologie THESE Pour l’obtention du grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III Discipline : Biologie Cellulaire et Moléculaire Présentée et soutenue par Charlotte Mailhat Le 31 Octobre 2007 Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M du cycle cellulaire Directeur de thèse : Bernard DUCOMMUN JURY M. Bernard DUCOMMUN, Professeur Hospitalo-Universitaire, Toulouse Directeur de thèse Mme May MORRIS, Chargée de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur M. Patrick JOUIN Directeur de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur M. John HICKMAN, Directeur Cancérologie SERVIER, Croissy sur Seine Examinateur Mme Anastassia HATZOGLOU, Professeur des Universités, Toulouse Président du jury Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109 118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1 31062 TOULOUSE cedex 9
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UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER
Ecole doctorale Biologie - Santé - Biotechnologie
THESE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Discipline : Biologie Cellulaire et Moléculaire
Présentée et soutenue par
Charlotte Mailhat
Le 31 Octobre 2007
Etudes des modifications post-traductionnelles de la
phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition
G2/M du cycle cellulaire
Directeur de thèse : Bernard DUCOMMUN
JURY
M. Bernard DUCOMMUN, Professeur Hospitalo-Universitaire, Toulouse Directeur de thèse
Mme May MORRIS, Chargée de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur
M. Patrick JOUIN Directeur de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur
M. John HICKMAN, Directeur Cancérologie SERVIER, Croissy sur Seine Examinateur
Mme Anastassia HATZOGLOU, Professeur des Universités, Toulouse Président du jury
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109
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Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier l’ensemble des membres du jury pour avoir accepter de juger mon travail de thèse. Ce travail de thèse a été financé par le laboratoire pharmaceutique SERVIER et je remercie le
Docteur John Hickman pour son accueil chaleureux au sein du laboratoire de cancérologie de l’institut de recherche SERVIER. J’en profite également pour remercier le Docteur Roy Golsteyn et les membres de son équipe “Cycle cellulaire” : Aurélie et Céline qui ont accompagnés mon projet de recherche pendant un an au sein de l’IdRS et m’ont permis de découvrir le monde de la recherche en industrie. Je remercie le Professeur Bernard Ducommun pour m’avoir accueillie dans son équipe au sein
de LBCMCP et pour avoir endossé la casquette de directeur de thèse. Bernard je te remercie tout particulièrement pour ta patience, tes encouragements et ta
disponibilité, mais également pour m’avoir permis de terminer au mieux ce travail. Je remercie également tous les membres de l’équipe BDuc, en particulier Jean-Pierre pour son
aide précieuse pour la purification de Cdc25C et ses nombreux conseils aussi bien scientifiques que techniques qui m’ont permis d’avancer tout au long de ma thèse. Merci aussi à Odile, Martine et Valérie pour m’avoir aidée à avancer dans mes manipes de dernières minutes. Et je n’oublie pas l’ensemble des membres du LBCMCP pour m’avoir accompagnée et soutenue tout au long de ma thèse. Je tiens aussi à remercier Bernard Monsarrat et son équipe pour m’avoir permis de découvrir
les joies de la spectrométrie de masse et m’avoir permis d’accéder à la plateforme de spectrométrie de masse de la génopôle de Toulouse. Je remercie chaleureusement Carine pour ses formations, ses conseils et son aide précieuse dans les déchiffrages des spectres MS/MS. Pour terminer, je souhaite également remercier mes amis et ma famille : Tout d’abord, mes amies du labo : Corine T, Isa, Corine L, Christelle et Bernie qui m’ont
permis de passer trois supers années, et m’ont permis d’oublier les moments de stress et de découragement. Je regretterais non seulement toutes nos pauses thé ou café, les moments de détentes que nous avons passées ensemble mais aussi tout simplement votre présence et votre compagnie qui m’ont apporté beaucoup tout au long de ma thèse. Je pense également à Chrys avec qui nous nous sommes suivies tout au long de nos thèses
respectives et qui a partagée avec moi chaque étape de nos thèses. Et tous les Ginos qui me suivent maintenant depuis de nombreuses années et qui m’ont
toujours soutenue. Un grand merci à : Tibo, Annef, Mathieu, Marie-Alix, Marie-Pierre, Fabien, Sophie, Xavier, Laurent, Florent, Charlotte, Valérie et Gilles pour vos encouragements et votre amitié sans faille.
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Je souhaite enfin dire un petit mot de remerciement à ma famille et à ma belle-famille pour les grandes choses qu’ils m’ont permise de réaliser. Je remercie tout particulièrement mes parents et mes frères : Guillaume, Cyril et Maxime pour leur patience et leur gentillesse et leur compréhension… Et pour terminer, toutes mes pensées vont à mon mari Nicolas qui m’a toujours soutenue et
qui a joué une grande part dans la réussite de ce projet !
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Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase
Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M du cycle
cellulaire
Directeur de thèse : Bernard Ducommun
Résumé :
La phosphatase Cdc25C est un acteur critique de la progression du cycle cellulaire par son rôle
jouée dans le contrôle de l’activation du complexe CDK1-Cycline B lors de l’entrée en mitose et
de la mise en place des mécanime de surveillance. Son activité est régulée par de nombreuses
kinases impliquées dans les cascades de signalisation cellulaire résultant dans la phosphorylation
de nombreux résidus. Au cours de cette étude, nous avons purifié Cdc25C à partir de cellules
humaines et réalisé une approche protéomique globale dans le but d’identifier de nouvelles
modifications régulatrices. Nous présentons dans ce manuscrit la mise au point des conditions de
purification de la phosphatase et les différentes modifications post-traductionnelles que nous
avons identifiées par spectrométrie de masse, en particulier deux phosphorylations sur les résidus
S168 et S263 et une méthylation sur le résidu R35. Pour terminer nous avons réalisé une analyse
fonctionnelle des phosphorylations sur les S168 et S263. Nous avons montré par imagerie
cellulaire que la mutation de la S263 en alanine conduisait à l’accumulation nucléaire de Cdc25C.
Nous proposons ainsi que la phosphorylation de la S263 soit impliquée dans un mécanisme de
régulation qui module l’import nucléaire de Cdc25C.
Mots clés :
Cycle cellulaire, points de contrôle, Cdc25C, phosphatase, modification post-traductionnelle, localisation.
Discipline administrative :
Biologie Cellulaire et Moléculaire
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération
Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109
118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1
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Liste des abréviations ADN : Acide DéoxyriboNucléique UV : Ultra- Violet CDK : Cycline Dependent Kinase MPF: M-phase promoting factor MCM : Mini-Chromosome Maintenance CAK : CDKs Activating Kinase CKIs : CDK inhibitors CRS : Cytoplasmique Retention Signal CAK : CDK Activating Kinase INK4 : Inhibitors of CDK4 ATP : Adenosyl tri phosphate MAT1 : Ménage à Trois Cks : CDC kinase subunit RINGO : Rapid Inducer of G2/M progression in Oocytes Cdc25 : Cycle de Division Cellulaire DSPases : Dual Specificity Phosphatase NES : Nuclear Export Signal NLS : Nuclear Localisation Signal APC : Anaphase Promoting Complex SCF : Skp1/Cullin/F-box) CK2 : Caséine Kinase 2 C-TAK1 : Cdc Twenty-five C Associated Kinase 1 CaMKII : Calcium calmoduline-dependent protein Kinase II Plk : Polo kinase Chk : Checkpoint Kinase IR : Radiation ionisante RPA : Replication Protein A MRN : Mre11/Rad50/NBS1 NHEJ : Non Homologous End Joining ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated ATR : ATM and Rad3 related PIKK : Phospho-Inositide 3-Kinase related Kinases p38SAPK : p38 Stress Ativated Protein Kinase MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase ERK : Extracellular-signal Related Kinase SAPKJNK : Stress Activated Protein Kinase/ c-Jun N-terminal Kinase MK2 : MAPKAP-K2 - MAP Kinase Activated Protein Kinase 2 Tap-tag : Tandem Affinity Purification tag BIA-MS : Biomolecular Interaction Analysis – Mass Spectrometry MPT : Modification Post-Traductionnelle MS : Mass Spectrometry ESI : Electrospray LC : Liquid chromtography SDS-PAGE : Sodium Dodécyl Sulfate- PolyAcrylamide Electrophoresis PI : point isoelectrique
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IEF : isoelectric focalisation PMF : Peptide Mass Figerprint MALDI :Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation TOF : Time Of Flight IT: Ion Trap Q : Quadrupole NCBI :National Center for Biotechnology Information IMAC : colonne d’ion metalliques immobilisé NTA : acide nitrilo-acétique HA : hemagglutinin du virus Influenza A IDA : Information-Dependant Acquisition PCC : Condensation prématurée de la chromatine
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE .......................................................................................................... 15 Préambule ............................................................................................................................................... 17
I- Biologie du cycle cellulaire ................................................................................................................ 19 I-2-A : Les complexes CDK-Cyclines ............................................................................................ 21 I-2-A-a : Les complexes CDK-Cycline dans le cycle cellulaire .............................................. 22 I-2-A-b : Les autres rôles des complexes CDK-Cycline ......................................................... 23
I-2-B : La régulation des complexes CDK-Cyclines .................................................................... 24 I-2-B-a : La liaison avec les Cyclines .......................................................................................... 24 I-2-B-b : Les inhibiteurs CKIs .................................................................................................... 27 I-2-B-c : Les modifications post-traductionnelles .................................................................... 28 (i) Phosphorylations activatrices ................................................................................................. 28 (ii) Phosphorylations inhibitrices ................................................................................................ 29 (iii) Déphosphorylations activatrices .......................................................................................... 29 I-2-B-d : Les autres mécanismes de régulation ......................................................................... 30
I-3-A : Présentations des phosphatases Cdc25 humaines ........................................................... 33 I-3-B : Caractérisation des phosphatases Cdc25 humaines ......................................................... 34 I-3-B-a : Le rôle des phosphatases Cdc25 dans le cycle cellulaire ......................................... 34 I-3-B-b : Régulation des phosphatases Cdc25 .......................................................................... 36 (i) Cdc25A ...................................................................................................................................... 36 (ii) Cdc25B ..................................................................................................................................... 39 (iii) Cdc25C .................................................................................................................................... 42
II- La réponse du cycle cellulaire aux dommages sur l’ADN .......................................................... 47 II-1-A : Dommages sur l’ADN et fonctionnement des points de contrôles ........................... 49 II-1-A-a : Les senseurs ................................................................................................................. 49 II-1-A-b : Les transducteurs ........................................................................................................ 49 (i) Les kinases apicales .................................................................................................................. 50 (ii) Les kinases distales ................................................................................................................. 51 II-1-A-c : les effecteurs ................................................................................................................ 51
II-1-B : Arrêt à la transition G1/S .................................................................................................. 52 II-1-C : Arrêt à la transition G2/M ................................................................................................ 53 II-1-C-a : Les événements de régulation post-traductionnels ................................................ 53 II-1-C-b : les événements de régulation transcriptionnelle ..................................................... 54
II-2-A : Modèle d’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux stress génotoxiques .............................................................................................................................................................. 55 II-2-B : La sortie des points de contrôle ........................................................................................ 56 II-2-B-a : Retour dans le cycle cellulaire .................................................................................... 57 II-2-B-b : Apoptose ...................................................................................................................... 57
III- L’analyse protéomique ................................................................................................................... 61 III-1-A : Les interactions entre les protéines ................................................................................ 62 III-1-B : La recherche de modifications post-traductionnelles .................................................. 63 III-2-A : La séparation des protéines ............................................................................................. 68
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III-2-A-a : L’électrophorèse sur gel ............................................................................................ 68 III-2-A-b : La chromatographie .................................................................................................. 70
III-2-B : L’identification et la caractérisation des protéines ........................................................ 70 III-2-B-a : Histoire et principe de la spectrométrie de masse ................................................ 71 III-2-B-b : MALDI-TOF MS ..................................................................................................... 72 III-2-B-c : LC-ESI-MS ................................................................................................................. 73 III-2-B-d : La spectrométrie de masse en tandem ................................................................... 75
III-2-C : Les stratégies mises en œuvre pour l’identification des protéines .............................. 77 III-2-C-a : La protéolyse .............................................................................................................. 78 III-2-C-b: Spectrométrie de masse en protéomique ................................................................ 78 III-2-C-c : L’interrogation dans les banques de données ........................................................ 79
III-3-A : Détection des phosphopeptides ...................................................................................... 81 III-3-B : Détermination des sites de phosphorylation par MS/MS. .......................................... 82 III-3-C : Méthode d’enrichissement ............................................................................................... 82
RESULTATS .............................................................................................................................................. 85 Projet de thèse ........................................................................................................................................ 87 A- Situation du projet ............................................................................................................................ 87 B- Présentation des travaux de thèses................................................................................................. 88
I- Construction des outils ..................................................................................................................... 89 I-1 : Description de la lignée cellulaire ................................................................................................ 90 I-2 : Description de la stratégie de purification ................................................................................. 91 I-3 : Construction et clonage de la phosphatase Cdc25C ................................................................ 91 I-3-A : Construction du plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His ................................................ 91 I-3-B : Validation de la construction de HA-Cdc25C-His dans les U2OS .............................. 93
I-4 : Activation du point de contrôle en G2/M ................................................................................ 96 I-5 : Les Voies de signalisation en réponse au traitement étoposide ............................................ 100 I-6 : Validation de la stratégie de purification de HA-Cdc25C-His .............................................. 101 I-6 : Conclusion .................................................................................................................................... 102
II- Analyse protéomique ..................................................................................................................... 105 II-1 : Spectrométrie de masse et recherche de MPT ...................................................................... 105 II-1-A : préparation des échantillons ............................................................................................ 106 II-1-B : Recherche des modifications par spectrométrie de masse .......................................... 107
II-2 : Séparation par gels bidimensionnels ....................................................................................... 114 II-2-A : Cartographie par électrophorèse en gel bidimensionnel ............................................. 114 II-2-B : Effet de l’étoposide sur la cartographie des isoformes de Cdc25C par gels bidimensionnels ............................................................................................................................... 116
III- Analyse fonctionnelle des phosphorylations S168p et S263p ................................................ 119 III-1 : Le développement des outils .................................................................................................. 119 III-1-A : Construction des mutants .............................................................................................. 119 III-1-B : Génération d’anticorps phospho-spécifiques .............................................................. 120
III-2 : Effet des mutants de Cdc25C ................................................................................................ 122 IV-1-A : Etude de la phosphorylation de la S263 ....................................................................... 124 IV-1-B : Etude de la phosphorylation de la S168 ....................................................................... 128
III-3 : Recherche des kinases impliquées dans la phosphorylation de S168 et S263 ................. 130
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DISCUSSION .......................................................................................................................................... 133 I- Validation du modèle d’étude ........................................................................................................ 135
I-1 : La stratégie de purification ................................................................................................ 136 I-2 : Le contrôle du cycle cellulaire .......................................................................................... 137
II- Analyse protéomique ..................................................................................................................... 138 II-1 : La préparation de HA-Cdc25C-His pour la LC-MS/MS ........................................... 139 II-2 : Le taux de couverture de séquence ................................................................................ 140
III- Caractérisation fonctionnelle des phosphorylations identifiées............................................. 144 CONCLUSION GENERALE .............................................................................................................. 149
MATERIELS ET METHODES........................................................................................................... 153 I- Analyse des protéines ...................................................................................................................... 155 I-1 : Western blot ................................................................................................................................. 155 I-2 : Immunofluorescence .................................................................................................................. 155 I-2-A : Indirecte ............................................................................................................................... 155 I-2-B : Directe .................................................................................................................................. 156
I-3 : Cytométrie en flux ....................................................................................................................... 156 I-4 : Essais kinases in vitro ................................................................................................................... 156 II- Culture cellulaire ............................................................................................................................. 157 II-1 : cellules U2OS ............................................................................................................................. 157 II-2 : Transfection transitoire ............................................................................................................. 157 III- Extraction des protéines et purification .................................................................................... 158 III-1 : Protocole classique ................................................................................................................... 158 III-2 : Protocole adapté à la spectrométrie de masse et purifiactions .......................................... 158 IV- Protéomique .................................................................................................................................. 159 IV-1 : spectrométrie de masse ............................................................................................................ 159 IV-2 : Electrophorèse bidimensionnelle ........................................................................................... 160
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INTRODUCTION GENERALE
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Introduction générale
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Préambule
Le cancer est défini comme une prolifération anormale de cellules saines ayant subi des
altérations spécifiques sur leurs génomes, les conduisant à acquérir les capacités nécessaires pour
échapper à la régulation homéostatique de la division cellulaire, envahir les tissus voisins et
générer des métastases vers des sites plus éloignés dans le corps humain. En France, les cancers
représentent la première cause de mortalité chez les hommes et la deuxième chez les femmes
après les maladies cardiovasculaires. 280 000 nouveaux cas sont détectés chaque année et 150 000
personnes en meurent. Un homme sur trois et une femme sur quatre décèderont d’un cancer. Un
thème central dans les efforts pour contrôler et éliminer les cancers est de promouvoir la
recherche en science fondamentale afin de mieux comprendre la biologie du cancer avec l’espoir
de générer de nouvelles interventions thérapeutiques qui pourraient être transformées en
traitements cliniques contre le cancer. Les cancers humains présentent de nombreuses altérations
génétiques qui peuvent conduire à plus d’une centaine de type de tumeurs différentes. Douglas
Hanan et Robert Weinberg ont proposé que six mutations essentielles du processus cellulaire
normal sont responsables de l’apparition de la majorité des cancers. Ces mutations sont :
« l’indépendance vis-à-vis des signaux prolifératifs, l’insensibilité aux signaux inhibiteurs de la
prolifération, l’abolition de la mort cellulaire par apoptose, une capacité proliférative illimitée, une
capacité à susciter l’angiogénèse et la capacité d’invasion de tissu et de prolifération dans des sites
étrangers (métastases) » (Hanahan and Weinberg, 2000). Afin de bien comprendre comment
l’instabilité du génome humain peut contribuer au phénotype tumoral, il est important de
connaître le fonctionnement du processus biologique fondamental avant qu’il ne dérive. Le
travail que nous présentons ici fait parti de l’effort compréhension de la biologie du cycle
cellulaire et la régulation de la machinerie de division cellulaire. Cette étude a également été
entreprise en collaboration avec un partenaire industriel dans le but de mettre en avant les
mécanismes conduisant aux dérégulations de la machinerie de division cellulaire qui pourraient
définir de nouvelles cibles de traitements contre les cancers.
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I- Biologie du cycle cellulaire
I-1 : Le cycle cellulaire
C’est au cours du cycle cellulaire qu’une cellule se divise pour donner naissance à deux cellules
filles identiques. La division cellulaire est à l’origine de la croissance et du développement de tous
les êtres vivants et est au centre de leurs hérédités et de l’évolution. Depuis que Rudolph Virchow
(1821–1902) a proclamé son célèbre “Omnis cellula e cellula”1, la compréhension des mécanismes
contrôlant la division cellulaire et la transmission fidèle de l’information génétique entre chaque
génération est considérée comme un problème majeur en biologie.
Les principaux évènements du cycle cellulaire sont définis par la réplication du matériel
génétique et la ségrégation du génome répliqué conduisant à la division de la cellule (Mitchison
and Creanor, 1971). Chez les eucaryotes ces évènements moléculaires et cellulaires sont séparés
dans le temps et l’espace et sont régulés suivant un ordre chronologique précis.
C’est au cours de la phase S (Synthesis) qu’à lieu la réplication semi-conservative des
chromosomes et la ségrégation des chromosomes répliqués est réalisée durant la phase M ou
mitose (le terme vient du grec mito qui signifie fil) où les chromosomes, visibles et condensés,
ségrègent pour donner deux cellules filles après la cytokinèse (Mitchison and Salmon, 2001). Les
phases G1 (Gap 1) et G2 (Gap 2) précédant respectivement la phase S et la mitose ont pour but
de préparer la cellule aux processus fondamentaux du cycle cellulaire. Au cours de la phase G1 la
cellule prépare la duplication de l’ADN et intègre les signaux environnementaux (mitogènes ou
facteurs de croissance) qui conduiront soit à sa division, soit à son entrée en phase G0 de pause
ou quiescence, soit à sa sortie du cycle cellulaire pour se différencier. La phase G2 est une étape
de transition qui permet à la cellule de se préparer à la division mitotique (figure 1).
Afin de s’assurer que chaque cellule nouvellement formée reçoive un génome complet, le
déroulement du cycle cellulaire est contrôlé de telle manière que chaque phase du cycle cellulaire
n’ait lieu qu’une seule fois par cycle et qu’aucune phase ne puisse commencer sans que les
précédentes ne se soient correctement déroulées. Ce sont les points de contrôle ou en anglais
checkpoint qui sont mis en place aux étapes clés du cycle cellulaire et assurent la coordination des
transitions entre les différentes étapes. Par exemple une cellule ne pourra pas se diviser si tous les
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chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque métaphasique ou ne pourra pas
répliquer son ADN avant d’avoir franchi la mitose (Hartwell and Weinert, 1989; Murray, 1993;
Smith et al., 2002). D’autre part, ces points de contrôle peuvent également provoquer une pause
dans la progression du cycle cellulaire pour permettre à la cellule de se défendre contre les
agressions extérieures à la cellule (radiations ionisantes, UV, drogues, etc.) ou provenant de la
cellule elle-même (radicaux oxygénés, erreurs de réplication, fourches de réplication arrêtées, etc.)
qui peuvent endommager l’ADN et perturber l’intégrité du matériel génétique.
I-2 : les complexes CDK-Cycline
Les kinases dépendantes des Cyclines (Cyclin-Dependent Kinases ou CDK) en association avec
les Cyclines régulatrices conduisent les événements du cycle cellulaire eucaryote et son horloge
interne (figure 2) (Morgan, 1997). Bien que la liaison avec les cyclines soit le premier
Figure 1 : Le cycle cellulaire des cellules eucaryotes
Représentation schématique du cycle cellulaire : la réplication fidèle du matériel génétique a lieu en phase S et la ségrégation du matériel génétique dupliqué a lieu en mitose ou phase M. Les phases G1 et G2 préparent respectivement la progression de la cellule vers la phase S et la phase M.
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déterminant de l’activité des CDK, dont l’expression et la dégradation cyclique donnent le
tempo pour chaque phase du cycle, d’autres facteurs régulent l’activité des complexes CDK-
Cyclines tels que la phosphorylation des CDKs et des cyclines, la déphosphorylation des
CDKs, la liaison à des protéines inhibitrices ou encore la localisation subcellulaire des
complexes CDK-Cyclines.
I-2-A : Les complexes CDK-Cyclines
Les travaux réalisés dans les années 1970 sur les ovocytes d’amphibiens ont conduit à la
découverte d’une activité enzymatique présente dans le cytoplasme, le MPF (M-phase promoting
factor) qui est capable d’induire l’entrée en méiose ou en mitose lorsqu’il est micro-injecté dans un
ovocyte ou une cellule (Ecker and Smith, 1971; Masui and Markert, 1971). Les études
biochimiques et génétiques menées en parallèle sur de nombreux organismes ont à leur tour
montré que le MPF est en fait constitué de la sous-unité enzymatique kinase dénommée
maintenant CDK1 (Russell and Nurse, 1986) et d’une sous-unité régulatrice correspondant à la
cycline de type B (Labbe et al., 1989). Le complexe CDK1-Cycline B qui est conservé de la levure
jusqu’à l’homme a alors été défini comme le régulateur universel de l’entrée en mitose.
A la suite de la découverte du complexe CDK1-Cycline B, de nombreux homologues des
CDKs et des cyclines ont été caractérisés chez divers organismes et sont impliqués dans la
progression de l’ensemble du cycle cellulaire, une CDK pouvant s’associer à différentes cyclines.
Il a également été montré que les complexes CDK-Cycline participaient aussi à la régulation
d’autres événements que le cycle cellulaire.
Actuellement chez l’homme 11 CDKs (CDK1 à CDK11) ont été caractérisées et au moins 29
gènes codant pour des protéines apparentées à la famille des cyclines par la présence d’une
séquence conservée de 150 acides-aminés : “la Cyclin box” ont été mis en évidence. Les cyclines
peuvent être classées en trois groupes : (i) Le groupe des cyclines de phase G1, auquel
appartiennent les Cyclines D et E et qui régulent la progression en phase S et la transition G1/S ;
(ii) Le groupe des cyclines de phase G2 auquel appartiennent les Cyclines A et B, impliquées dans
la transition G2/M (Murray and Marks, 2001) et (iii) le troisième groupe de cycline (notamment
les Cyclines C, K, L et T) qui est impliqué dans la régulation de la transcription (Murray and
Marks, 2001).
Introduction générale
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I-2-A-a : Les complexes CDK-Cycline dans le cycle cellulaire
C’est l’association de la Cycline D, activée par les signaux mitogènes, avec les kinases CDK4 et
CDK6 qui assurent la progression de la phase G1 du cycle cellulaire. Ces complexes
phosphorylent et inhibent la protéine de sensibilité au rétinoblastome (Rb) qui libère alors le
facteur de transcription E2F et permet la transcription des gènes nécessaires à la transition G1/S.
Parmi les cibles de transcription du facteur E2F se trouvent les gènes codant pour les Cycline E,
A et B. La Cycline E est essentielle à l’activation de CDK2 et ainsi à la progression de la phase
G1 vers la phase S (Cobrinik, 2005; Malumbres and Barbacid, 2001, 2005). Ce processus est
supposé rendre les cellules indépendantes aux signaux mitogènes et correspond au fameux “point
de restriction” ou point de non retour, qui est défini comme un passage après lequel la cellule n’a
plus recours aux stimuli mitogènes pour engager sa division cellulaire (Dannenberg et al., 2000;
Malumbres and Barbacid, 2001; Sage et al., 2000). De récentes études ont montré que CDK3
pouvait, elle aussi, phosphoryler et inhiber la protéine Rb, il semblerait ainsi que le complexe
CDK3-Cycline C permette aux cellules de sortir de l’état de quiescence (G0) et assure le retour
des cellules à l’état prolifératif lors de la transition G0/G1 (Ren and Rollins, 2004).
La transition G1/S est alors stimulée par le complexe CDK2-Cycline E en permettant, entre
autre, aux protéines MCM (Mini-Chromosome Maintenance) de se fixer aux origines de réplication, ce
qui déclenche l’initiation de la réplication de l’ADN (Hwang and Clurman, 2005; Pagano et al.,
1993). Par ailleurs, CDK3 associée aux Cyclines A et E est peut-être aussi impliquée dans la
transition G1/S (Hengstschlager et al., 1999). Puis, une fois les cellules installées en phase S, le
complexe CDK2-Cycline E est réprimé afin de prévenir les phénomènes de “re-réplication” et le
complexe CDK2-Cycline A achève correctement la phase S et prépare la transition vers la phase
G2 (Hwang and Clurman, 2005; Malumbres and Barbacid, 2005). A la fin de la phase S la Cycline
A s’associe avec CDK1 et assure la progression tout au long de la phase G2, puis la Cycline A est
dégradée alors que la Cycline B est activement synthétisée. CDK1 s’associe alors avec la Cycline
B et conduit à la progression des cellules en mitose. Ce complexe, essentiel à la transition G2/M,
est responsable de la phosphorylation de plus de 70 protéines impliquées dans la progression du
cycle des cellules de mammifères. Sa localisation subcellulaire est finement régulée et permet de
contrôler son rôle dans la fragmentation du réseau golgien, la séparation des centrosomes, la
nucléation des microtubules, la condensation des chromosomes et la déstructuration de
l’enveloppe nucléaire (Nigg, 2001). Finalement la sortie de mitose est assurée par une chute
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brutale de l’activité CDK1-Cycline B via la dégradation de la Cycline B (Malumbres and Barbacid,
2005).
I-2-A-b : Les autres rôles des complexes CDK-Cycline
Les autres CDK ne sont pas impliquées dans la progression proprement dite du cycle
cellulaire. Les CDK7, 8, 9, 10 et 11 sont impliquées dans le contrôle de la transcription avec
néanmoins pour certaines d’entre-elles un rôle direct dans le contrôle du cycle cellulaire (Loyer et
al., 2005). Quant à CDK5, elle est activée par les protéines du cerveau p35 et p39 où elle aurait un
rôle dans le développement et la maintenance du système nerveux central. La dérégulation de
CDK5 est impliquée dans plusieurs maladies neurodégénératives et en particulier la maladie
d’Alzheimer (Cruz and Tsai, 2004; Kesavapany et al., 2004).
Figure 2 : Les complexes CDK-Cycline et la progression du cycle cellulaire
La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par l’activation et l’inactivation successive des complexes CDK-Cycline.
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I-2-B : La régulation des complexes CDK-Cyclines
Faisant suite aux études sur le cycle cellulaire qui ont menées à la découverte des CDKs,
quatre mécanismes majeurs de régulation se détachent et gouvernent l’activité des CDKs. Le
premier qui est aussi le principal est la liaison activatrice avec la sous-unité cycline régulatrice. Il
semblerait cependant que l’activation complète de la plupart des CDKs requiert aussi la
phosphorylation d’un résidu thréonine par la CAK (CDKs Activating Kinase). Enfin le complexe
pleinement actif peut aussi être inhibé : par la liaison avec les sous-unités inhibitrices des CDKs
(CKIs, CDK inhibitors) et par la présence de phosphorylations inhibitrices sur des résidus
conservés dans la région amino-terminale des CDKs.
La détermination de la structure de CDK2 (De Bondt et al., 1993), puis du complexe CDK2-
Cycline A (Jeffrey et al., 1995) associées à des études biochimiques, a permis de mieux
comprendre les mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité catalytique des complexes
CDK-Cycline.
I-2-B-a : La liaison avec les cyclines
La structure de CDK2 humaine est, comme pour les autres protéines kinases, constitué d’un
petit lobe amino-terminal, contenant le domaine PSTAIRE, associé à un lobe carboxy-terminal
plus grand. L’étroite cavité située entre ces deux lobes constitue le site actif. La forme non
modifiée et donc non active de CDK2 est alors caractérisée d’une part par la présence d’une
boucle flexible ou “T-Loop” sortant du lobe carboxy-terminal et qui ferme l’entrée du site
catalytique empêchant la liaison avec le substrat et d’autre part par le positionnement du domaine
PSTAIRE, qui gène la réaction de phosphorylation par un désalignement des résidus clés du site
catalytique (De Bondt et al., 1993 ; Morgan, 1995). Ainsi la protéine kinase doit subir un profond
changement pour pouvoir être activée. La liaison avec une cycline est une étape essentielle au
cours de l’activation des CDKs.
L’interaction entre les domaines “Cyclin box” de la Cycline A et le domaine PSTAIRE de
CDK2, a pour principale conséquence d’abaisser la boucle flexible T-Loop, qui obstruait le site
de liaison avec le substrat, et permet un réalignement des résidus importants pour la
phosphorylation du substrat qui sont ainsi dans une position plus favorable (figure 3). Ce
changement de conformation rend disponible aux phosphorylations un résidu thréonine
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hautement conservé chez les CDKs (T161 sur CDK1 et T160 chez CDK2) (Jeffrey et al., 1995).
D’autre part, en plus du changement conformationnel favorable à l’activité de la kinase, le choix
de la cycline interagissant avec la kinase CDK va permettre de moduler la spécificité du substrat
de la kinase (Cross et al., 1999; Pines, 1995).
Figure 4 : Régulation temporelle de l’activité des complexes CDK-Cycline
La régulation fine de l’activité des complexes CDK-Cycline permet un contrôle de la progression dans chaque phase du cycle cellulaire (d’après Pines, Nature Cell biology 1999).
Figure 3 : Interaction entre CDK2 et la Cycline A
Représentation schématique de l’impact de la liaison de la Cycline A sur l’activation de CDK2. L’interaction se fait entre le domaine PSTAIRE de CDK2 et la séquence conservée des cyclines, la Cyclin box. L’impact majeur de cette interaction est le déplacement de la séquence T-loop qui obstruait le site catalytique de CDK2.
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L’oscillation de la concentration des cyclines dans la cellule est en partie responsable des
changements dans l’activité des CDKs au cours du cycle cellulaire (figure 4) (Pines, 1999). Ainsi la
synthèse d’une cycline est responsable du passage à travers une phase particulière du cycle et sa
dégradation conduit à la transition vers la phase suivante. Le niveau des cyclines est donc
strictement contrôlé par un ensemble complexe de mécanismes actifs, aussi bien au niveau de la
transcription des gènes (Breeden, 2000) que de la dégradation des protéines, dépendante du
protéasome (Deshaies, 1995) et spécifique pour chaque étape du cycle cellulaire. En outre,
certaines cyclines possèdent des séquences de localisation cellulaire qui permettent de cibler la
kinase CDK associée dans un compartiment subcellulaire particulier et régulent son activité dans
l’espace en la maintenant éloignée de son substrat (Yang and Kornbluth, 1999). Une séquence
CRS (Cytoplasmique Retention Signal) permet à la Cycline B1 de se lier au facteur d’export nucléaire
Crm1 et conduit ainsi à une localisation principalement cytoplasmique au cours de la phase G2
(Hagting et al., 1998; Porter et al., 2003). Lors de l’entrée en mitose, la Cycline B1 est
phosphorylée par CDK1 et Plk1, elle ne peut plus être exportée ce qui conduit à la relocalisation
nucléaire du complexe CDK1-Cycline B1 (figure 5) (Toyoshima-Morimoto et al., 2001).
Figure 5 : Localisation de CDK1-Cycline B au cours du cycle cellulaire
Le complexe CDK1-Cycline B, même après son activation par la CAK, est maintenu dans le cytoplasme par un export nucléaire supérieur à son import. En fin de phase G2 le complexe devient nucléaire pour assurer la mitose et est dégradé en fin de phase M, conduisant à la sortie de mitose.
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I-2-B-b : Les inhibiteurs CKIs
Les inhibiteurs des CDKs ou CKIs sont des petites protéines qui ont la capacité de se lier aux
complexes CDK-Cycline afin d’inhiber leurs activités. Des analyses biochimiques ainsi que des
études cristallographiques ont permis de révéler les mécanismes d’action par lesquels ces
inhibiteurs abolissent l’activité des CDKs. Ils sont au nombre de trois : l’inhibition directe de
l’activité kinase du complexe CDK, l’interférence contre l’activation des CDKs par la CAK (CDK
Activating Kinase) et enfin la compétition avec les Cyclines pour la liaison aux CDKs (figure 6)
(Arellano and Moreno, 1997). Chez les mammifères, il existe deux familles de CKIs : la famille
Cip/Kip et la famille INK4 (Inhibitors of CDK4) (Elledge et al., 1996). La famille Cip/Kip
comprend trois membres p21 WAF1/CIP1, p27KIP1 et p57KIP2, qui ont la capacité d’interagir avec tous
les complexes CDK-Cyclines. La détermination de la structure du complexe CDK2-Cycline A-
p27KIP1 a permis de mieux comprendre leurs mécanismes d’action (figure 7) (Russo et al., 1996).
p27KIP1 se lie avec la Cycline A par son domaine amino-terminal (sans affecter sa structure) alors
que sa région carboxy-terminale interagit fortement avec le lobe supérieur de CDK2, ce qui
conduit à changement conformationnel et empêche la fixation de CDK2 à l’ATP. La famille
INK4 comprend quatre membres : p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, et p19INK4d qui inhibent
spécifiquement CDK4 et CDK6 en empêchant leur association avec la Cycline D (figure 6) (Russo
et al., 1998).
Figure 6 : Les inhibiteurs des CDK
Répartition des inhibiteurs de CDK (CKI) dans le cycle cellulaire. La famille Cip/Kip inhibe tous les complexes CDK-Cycline et la famille INK4 inhibe uniquement les complexes CDK4/6-Cycline D.
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I-2-B-c : Les modifications post-traductionnelles
Les modifications post-traductionnelles sont impliquées dans la régulation de nombreux
mécanismes du cycle cellulaire (voir plus loin). Dans le cas particulier de la régulation des
complexes CDK-Cycline, un jeu de phosphorylations/déphosphorylations de la sous-unité
catalytique CDK intervient, soit pour renforcer l’activité de la kinase, soit pour l’inhiber (figure 8).
(i) Phosphorylations activatrices
L’association avec la Cycline B n’est pas suffisante pour activer pleinement le complexe
CDK1-Cycline B. L’activation nécessite la phosphorylation du résidu thréonine 161 (T161)
présent sur la séquence T-Loop. La kinase CAK est responsable de cette phosphorylation durant
la phase G2 (Solomon et al., 1992; Watanabe et al., 2005). Chez les vertébrés la CAK est un
complexe trimérique constitué de la kinase CDK7 et des protéines Cycline H et MAT1 (Ménage à
Figure 7 : Inhibition des complexes CDK-Cycline par les CKI Les CKI inhibent les CDK soit par une liaison directe avec le complexe CDK-Cycline, soit par une compétition avec la Cycline.
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Trois) (Harper and Elledge, 1998). La déphosphorylation semble ensuite être assurée par les
phosphatases de la famille PP2C et PP2A (Cheng et al., 2000; Lee et al., 1994; Lorca et al., 1992).
(ii) Phosphorylations inhibitrices
Les complexes CDK-Cycline impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire sont inhibés par
une phosphorylation de la kinase CDK au niveau du résidu tyrosine 15 (Y15) fortement conservé
au cours de l’évolution (Gu et al., 1992). Chez les eucaryotes supérieurs, un deuxième site de
phosphorylation sur la thréonine 14 (T14) est aussi impliqué dans l’inactivation du complexe et
semble simplement renforcer l’inactivation de CDK1 (Krek and Nigg, 1991; Norbury et al.,
1991). Les T14 et Y15 sont toutes les deux situées dans le site catalytique de la kinase à proximité
du site de liaison de l’ATP sur CDK1 et leurs phosphorylations empêcheraient la fixation de
l’ATP ou la reconnaissance du substrat (Berry and Gould, 1996; Morgan, 1997). Wee1 est la
kinase responsable de la phosphorylation sur la Y15 de CDK1 dans les cellules en interphase afin
d’empêcher l’activation du complexe CDK1-Cycline B avant l’entrée en mitose (Russell et al.,
1989). Chez les vertébrés la kinase Myt1, une kinase transmembranaire localisée au niveau du
réticulum endoplasmique apparentée à la famille de Wee1, phosphoryle aussi bien la T14 et la
Y15 (Booher et al., 1997; Mueller et al., 1995). La modulation du taux de phosphorylation sur ces
deux sites est particulièrement importante pour l’activation du complexe CDK1- Cycline B à
l’entrée de la mitose, mais participe également au contrôle de l’activation des CDKs à la transition
G1/S ainsi qu’en phase S.
(iii) Déphosphorylations activatrices
La Y15 et la T14 de CDK1 sont déphosphorylées par les phosphatases de la famille Cdc25,
qui sont conservées au cours de l’évolution. Trois isoformes ont été identifiés chez les
mammifères : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C, et feront l’objet de la partie suivante de l’introduction
générale.
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I-2-B-d : Les autres mécanismes de régulation
Suc1 identifiée chez Schizoaccharomyces pombe est une petite protéine adaptatrice qui appartient à
la famille des Cks (CDC kinase subunit) et a la particularité de pouvoir s’associer aux CDKs. Les
Cks sont conservées de la levure jusqu’à l’homme (Cksh1 et Cksh2), et malgré la structure
cristallographique du complexe Cks1-CDK2 (Jeffrey et al., 1995), leurs rôles restent mal connus.
Il semblerait cependant que la liaison de Cks1 créé un site de liaison aux phosphoprotéines pour
le complexe CDK-Cycline et aurait un rôle activateur lors de l’entrée en mitose et inhibiteur en
fin de mitose (Harper, 2001; Pines, 1996).
Enfin, plus récemment, il a été montré chez le xénope que les CDKs pouvaient être activées
par leur association avec les protéines RINGO (Rapid Inducer of G2/M progression in Oocytes) sans
recourir à une liaison avec une Cycline (Nebreda, 2006). Ces protéines sont nécessaires à la
Figure 8 : Régulation du complexe CDK1-Cycline B
L’activation complète du complexe CDK1-Cycline B nécessite en plus de la déphosphorylation des résidus Y15 et T14, préalablement phosphorylés par Wee1, la phosphorylation par la CAK du résidu T161 dans la séquence T-loop.
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maturation de l’ovocyte et peuvent s’associer à CDK1 et CDK2 et l’interaction avec RINGO
suffit à la pleine activation de CDK1-RINGO et CDK2-RINGO sans avoir recours à la
phosphorylation par la CAK sur les thréonines 161 et 160 respectivement (Ferby et al., 1999;
Lenormand et al., 1999).
I-3 : Les phosphatases Cdc25
La complémentation fonctionnelle du mutant Cdc25 chez la levure à fission Schizosaccharomyces
pombe a permis de mettre en évidence une protéine jouant un rôle majeur dans le Cycle de
Division Cellulaire (Cdc25) (Russell and Nurse, 1986). La délétion de Cdc25 dans la levure
entraine une absence de division cellulaire accompagnée d’une croissance anormale de la cellule.
Cela suggère que Cdc25, fonctionnant comme un antagoniste de Wee1, qui est un inhibiteur de la
progression dans le cycle cellulaire (voir plus haut), est essentielle pour l’entrée en mitose (Gould
and Nurse, 1989; Russell and Nurse, 1986). Plusieurs études ont permis de caractériser Cdc25
comme une phosphatase impliquée dans la déphosphorylation activatrice du résidu tyrosine 15 de
la kinase CDK1 : (i) tout d’abord la preuve phénotypique que Cdc25 était un antagoniste de la
protéine kinase Wee1 ; (ii) l’accumulation de complexes CDK1-Cycline B inactifs car
phosphorylés sur la tyrosine 15 corrélée à l’augmentation du taux de phosphotyrosine dans les
cellules délétées pour Cdc25 ; (iii) la mutation du résidu tyrosine 15 de CDK1 en phénylalanine
qui rend les cellules de levure résistantes à la délétion de Cdc25 (Gould and Nurse, 1989) et (iv)
l’ajout de Cdc25 purifiée à des extraits d’ovocyte de xénope qui induit leur entrée en mitose
accompagnée d’une déphosphorylation du résidu Y15 de CDK1 et d’une augmentation de
l’activité du complexe CDK1-Cycline B (Jessus and Beach, 1992; Kumagai and Dunphy, 1991).
Mais il fut montré que le produit du gène cdc25 était en réalité une phosphatase atypique. Cdc25
est en effet capable de déphosphoryler à la fois un résidu tyrosine et un résidu thréonine sur la
même molécule (Millar and Russell, 1992). Elle a donc été classée au sein d’une sous famille : les
phosphatases à double spécificité ou DSPases (Dual Specificity Phosphatase) qui appartiennent à la
famille des phosphatases à spécificité tyrosine (PTPases).
Il a été ensuite clairement établi dans les cellules humaines que Cdc25 catalyse la réaction de
déphosphorylation des résidus tyrosine 15 et thréonine 14 de CDK1 préalablement phosphorylés
par les kinases Wee1 et Myt1 (Honda et al., 1993; Sebastian et al., 1993). Trois homologues de
Cdc25 : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C ont été identifiés chez les mammifères et plus
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particulièrement chez l’homme soit par complémentation fonctionnelle dans la souche de levure
Cdc25-22TS, soit par PCR avec des amorces dégénérées dirigées contre les séquences conservées
entre les Cdc25 (Galaktionov and Beach, 1991; Nagata et al., 1991; Sadhu et al., 1990).
Les trois homologues humains complémentent avec succès la souche mutante de levure
Cdc25-22TS. Il est maintenant connu que leur expression est dépendante du cycle cellulaire dans
les cellules de mammifères : l’ARNm de Cdc25C est majoritairement exprimé au cours des
phases G2 et M, l’expression de l’ARNm de Cdc25B oscille tout au long du cycle cellulaire et est
prédominante en phase G2, enfin l’expression de l’ARNm de Cdc25A oscille aussi au long du
cycle cellulaire avec un pic d’expression au cours des phases G1 et S (Jinno et al., 1994; Sadhu et
al., 1990)(Nagata 1991).
Figure 9 : Les phosphatases Cdc25 au cours du cycle cellulaire
Les phosphatases Cdc25A, B et C sont impliquées dans la progression du cycle cellulaire par la déphosphorylation activatrice des CDK. Chaque phosphatase Cdc25 participe à plusieurs étapes clés cycle cellulaire.
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I-3-A : Présentations des phosphatases Cdc25 humaines
La majorité des travaux qui ont été abordés ici se rapportera aux phosphatases Cdc25
humaines. Ceux qui concernent d’autres organismes, comme la levure ou le xénope seront
présentés soit pour appuyer les résultats obtenus dans les cellules humaines, soit pour apporter
des données complémentaires.
Les trois isoformes humains Cdc25 sont codés par trois gènes situés sur des chromosomes
différents Cdc25A localisé en 3p21, Cdc25B en 20p13 et Cdc25C en 5q31. La famille des Cdc25
humaines est encore compliquée par un épissage alternatif qui génère au moins deux variants
pour Cdc25A (Wegener et al., 2000) et cinq de chaque pour Cdc25B (Baldin et al., 1997b; Forrest
et al., 1999) et Cdc25C (Bureik et al., 2000; Wegener et al., 2000). Bien que le rôle exact de ces
différents variants d’épissage soit inconnu, il semblerait que dans les cas de Cdc25A et Cdc25C,
les variants d’épissage jouent un rôle différent en fonction des lignées cellulaires ou diffèrent dans
leur distribution au sein du cycle cellulaire. De plus l’épissage alternatif pourrait éliminer des sites
consensus de phosphorylation spécifiques, soumettant ainsi les variants d’épissage à des
mécanismes de régulation différents. La délétion de tels motifs chez Cdc25B conduit à une
diminution de son activité phosphatase et l’activité de Cdc25C a été décrite comme étant
augmentée à la suite de phosphorylation (Baldin et al., 1997b; Gabrielli et al., 1997; Theis-Febvre
et al., 2003; Wegener et al., 2000).
Au niveau protéique, les DSPases Cdc25 sont structuralement divisées en deux domaines
majeurs : un domaine carboxy-terminal hautement conservé représentant environ 30% de la
protéine et délimité par le motif LIGD ; et un domaine amino-terminal dont la taille varie et qui
est peu conservé entre les trois isoformes humains (Draetta and Eckstein, 1997). Le cœur
catalytique des Cdc25 constitué du motif canonique des PTPases HCX5R (ou X représente
n’importe quel acide-aminé) est situé dans le domaine carboxy-terminal. Ainsi, alors que le
domaine carboxy-terminal des Cdc25 renferme la machinerie catalytique de l’enzyme, le domaine
amino-terminal est perçu comme la région régulatrice de la protéine contenant de nombreux sites
de phosphorylation qui peuvent agir soit comme des activateurs, soit comme des inhibiteurs de
l’enzyme (Bulavin et al., 2002; Draetta and Eckstein, 1997; Lyon et al., 2002; Nilsson and
Hoffmann, 2000).
Les structures des cristaux des domaines catalytiques de Cdc25A et Cdc25B ont été résolus à
2,3Å et 1,9Å respectivement mais aucune structure de Cdc25 pleine taille n’a été décrite. Les deux
phosphatases contiennent le motif consensus HCX5R caractéristique du site catalytique des
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PSPases, niché au sein du motif structurel “P-loop” typique des phosphatases à spécificité
tyrosine (Fauman et al., 1998; Reynolds et al., 1999; Zhang, 1998). Les données de structure
semblent appuyer les études biochimiques qui suggèrent que dans le cas de Cdc25B sa spécificité
avec le substrat est régulée par sa queue carboxy-terminale de 17 acides-aminés et que Cdc25A
nécessite un degré de promiscuité plus élevé pour la sélection de son substrat (Wilborn et al.,
2001; Xia et al., 1999).
I-3-B : Caractérisation des phosphatases Cdc25 humaines
I-3-B-a : Le rôle des phosphatases Cdc25 dans le cycle cellulaire
Les rôles de Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C dans les différentes phases du cycle cellulaire ont été
bien étudiés (figure 9).
La principale fonction attribuée à Cdc25A est de promouvoir la transition G1/S du cycle
cellulaire et la progression en phase S par la déphosphorylation activatrice des complexes CDK2-
Cycline E et CDK2-Cycline A. En effet la surexpression de Cdc25A dans les cellules humaines
accélère l’entrée en phase S avec une activation prématurée de la kinase CDK2, alors que la
micro-injection d’anticorps dirigés contre Cdc25A dans des cellules synchronisées en phase G1
provoque un arrêt du cycle cellulaire (Blomberg and Hoffmann, 1999; Hoffmann et al., 1994;
Jinno et al., 1994). Cependant le niveau protéique de Cdc25A ainsi que son activité restent élevés
après la phase S et augmentent jusqu’à l’entrée des cellules en mitoses où Cdc25A est dégradée
(Bernardi et al., 2000; Molinari et al., 2000), suggérant un rôle à la transition G2/M. En fait c’est
le complexe CDK1-Cycline B1 qui, en phosphorylant Cdc25A, permet sa stabilisation jusqu’à
l’entrée des cellules en mitose (Mailand et al., 2002). De plus l’inhibition de l’expression de
Cdc25A par ARN interférence entraîne une diminution du nombre de cellules entrant en mitose
alors que sa surexpression conduit à une entrée prématurée des cellules en mitose par
déphosphorylation du complexe CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005; Mailand et al., 2002).
L’inhibition de Cdc25B par la micro-injection d’anticorps conduit à un arrêt des cellules en
phase G2 (Honda et al., 1993; Lammer et al., 1998). Ainsi Cdc25B a été initialement décrite
comme étant impliquée dans l’entrée des cellules en mitose en déphosphorylant le complexe
CDK1-Cycline B1 (Gabrielli et al., 1997). De plus, Cdc25B est capable de déphosphoryler
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d’autres complexes CDK-Cycline dont la spécificité est dépendante du cycle cellulaire : CDK2-
Cycline A en phase S (Goldstone et al., 2001) (Lammer et al., 1998) et CDK1-Cycline A en phase
G2 (Sebastian et al., 1993) (Lammer et al., 1998). Enfin une autre étude a proposé un rôle de
Cdc25B en phase S (Garner-Hamrick and Fisher, 1998).
Il a tout d’abord été admis que Cdc25C induisait l’entrée des cellules en mitose et catalysait la
progression mitotique par la déphosphorylation du complexe CDK1-Cycline B1 (Gautier et al.,
1991; Lee et al., 1992; Millar et al., 1991b; Strausfeld et al., 1991). En effet la micro-injection
d’anticorps dirigés contre Cdc25C conduit à l’arrêt des cellules en phase G2 (Millar et al., 1991a)
et son activité phosphatase est maximale en ce point du cycle cellulaire (Hoffmann et al., 1993).
De plus Cdc25C déphosphoryle uniquement le complexe CDK1-Cycline B1 (Gabrielli et al.,
1997). Cependant des études plus récentes ont permis de montrer que Cdc25C jouerait également
un rôle lors la transition G1/S (figure 9). En effet, la micro-injection d’ARN antisens dirigés
contre l’ARNm codant pour Cdc25C ainsi que la transfection de cellules HeLa par des siRNA
anti-Cdc25C provoque une inhibition de la réplication et un arrêt des cellules en phase S
(Turowski et al., 2003). Enfin seule la surexpression de Cdc25B conduit à une entrée précoce des
cellules en mitose, même si la réplication de l’ADN n’a pas été correctement accomplie, alors
qu’il faut co-exprimer en même temps la Cycline B avec Cdc25C pour qu’une accélération de
l’entrée en mitose soit observée (Gabrielli et al., 1996; Karlsson et al., 1999). Le modèle actuel
présente donc Cdc25B et Cdc25A comme les activateurs initiaux du complexe CDK1-Cycline
B1, tandis que Cdc25C permet la progression de la cellule en mitose, après son activation par
CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005).
Des souris invalidées pour les gènes de cdc25b (Lincoln et al., 2002) et cdc25c (Chen et al., 2001)
ont été générés. Il est intéressant de noter que ces souris sont viables, ont des cycles cellulaires
normaux et répondent correctement aux points de contrôles (en réponse aux cassures double
brin ou aux arrêts de la réplication). Seule les souris femelles cdc25b-/- sont stériles, leurs ovocytes
sont bloqués en prophase de méiose I par leur incapacité à activer le MPF (Chen et al., 2001;
Lincoln et al., 2002). Plus récemment des souris invalidées pour les deux gènes cdc25b et cdc25c
ont été obtenues, de la même manière ces souris sont viables, répondent correctement aux points
de contrôle et Cdc25A est régulée normalement (Ferguson et al., 2005). Ces résultats suggèrent
que Cdc25B et Cdc25C ne sont pas requises pour le développement des souris ou lors de l’entrée
en mitose, suggérant que peut être Cdc25A ou d’autres phosphatases sont capables de compenser
fonctionnellement la perte de cdc25b et cdc25c chez les souris.
Introduction générale
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I-3-B-b : Régulation des phosphatases Cdc25
En tant qu’acteurs majeurs du cycle cellulaire, les phosphatases Cdc25 sont finement régulées
au cours du cycle. Elles sont ainsi régulées par différents mécanismes qui contrôlent notamment
leur localisation, leur activité catalytique et leur dégradation. Nous verrons dans la partie suivante
de l’introduction générale que ces mécanismes de régulation sont mis à profit dans l’activation
des points de contrôle lors de la réponse cellulaire aux dommages sur l’ADN.
(i) Cdc25A
L’activité et l’abondance de Cdc25A est régulée par des évènements de phosphorylation
réversibles, des interactions protéine-protéine, ainsi qu’une protéolyse ubiquitine-dépendante
(figure10) (Bernardi et al., 2000; Hoffmann et al., 1994; Mailand et al., 2002; Molinari et al., 2000)
(Conklin et al., 1995).
La régulation subcellulaire de Cdc25A au cours de cycle cellulaire est contrôlée par un
processus dynamique de navettes entre le noyau et le cytoplasme (Kallstrom et al., 2005). Cette
dynamique est dépendante de la présence d’une NES (Nuclear Export Signal) qui a la
caractéristique de ne pas se lier au facteur d’export nucléaire, l’exportine-1, et d’une NLS (Nuclear
Localisation Signal) bipartite canonique KRX10-12KRRK (Kallstrom et al., 2005). A l’origine
Cdc25A était considérée comme une protéine strictement nucléaire, ce qui était en accord avec
son activité d’activation des complexes nucléaires CDK2-Cycline A et CDK2-Cycline E en G1/S
(Blomberg and Hoffmann, 1999). Cependant la mise en évidence de sa localisation également
cytoplasmique montre un rôle de Cdc25A en mitose où elle déphosphorylerait les complexes
CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005).
La phosphorylation de Cdc25A par le complexe CDK2-Cycline E au moment de l’entrée en
phase S conduit à une augmentation de son activité phosphatase (Hoffmann et al., 1994). Cette
phosphorylation de Cdc25A par son propre substrat crée une boucle de rétrocontrôle positif qui
conduit à l’augmentation de l’activité des complexes CDK-Cyclines lors de la transition G1/S.
Mais la phosphorylation par CDK2-Cycline E et/ou CDK2-Cycline A pourrait également avoir
un contrôle négatif sur la phosphatase Cdc25A (Ducruet and Lazo, 2003). De plus au début de la
mitose, CDK1-Cycline B phosphoryle Cdc25A sur les résidus S18 et S116, conduisant à une
Introduction générale
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stabilisation de la protéine par un mécanisme inconnu qui empêcherait son ubiquitinylation
(Mailand et al., 2002).
Au cours du cycle cellulaire Cdc25A est dégradée par l’intermédiaire de deux ubiquitine-ligases
différentes. A la sortie de mitose Cdc25A est ubiquitinylée par le cyclosome ou APC (Anaphase
Promoting Complex) en association avec la protéine Cdh1. Cdh1 reconnaît le motif KEN de
Cdc25A, alors que la mutation de ces résidus inhibe l’ubiquitinylation par l’APC/C-Cdh1. Par
contre en interphase, Cdc25A est ubiquitinylée indépendamment du motif KEN par le complexe
SCF (Skp1/Cullin/F-box) (Donzelli et al., 2002). La dégradation en phases S et G2 de Cdc25A est
dépendante de la phosphorylation par la kinase Chk1. En effet en absence de dommages sur
l’ADN, Chk1 phosphoryle les résidus : S124, S178, S279 et S293 (Sorensen et al., 2003; Zhao et
al., 2002). Il semblerait qu’elle soit aussi responsable de la phosphorylation du résidu S76, alors
que la protéine kinase responsable de la phosphorylation des acides-aminés S82 et S88 du motif
DSG est encore inconnue. Ces phosphorylations sont nécessaires à la liaison de βTrCP
permettant ensuite le recrutement du complexe ubiquitine-ligase SCF (Busino et al., 2004; Busino
et al., 2003; Jin et al., 2003).
De plus il semblerait que Chk1 soit également responsable de la liaison aux protéines 14-3-3,
impliquées dans la régulation et la localisation de Cdc25A au cours du cycle cellulaire. Cependant
ces études sont controversées. Chk1 phosphoryle la thréonine 504 de xCdc25A et la thréonine
507 de hCdc25A, qui sont situées dans une région conservée en fin du domaine carboxy-terminal
(Chen et al., 2003; Uto et al., 2004). Cette phosphorylation est responsable de la liaison aux
protéines 14-3-3, cependant il apparaît que la liaison aux 14-3-3 ne provoque pas directement la
diminution de l’activité de Cdc25A observée après la phosphorylation par Chk1 (Uto et al., 2004).
La fin du domaine carboxy-terminal de Cdc25A et Cdc25B a été décrite comme le site de liaison
aux substrats (Powers et al., 2000; Wilborn et al., 2001). Ainsi la phosphorylation de la thréonine
507 empêcherait la liaison de la phosphatase à ses substrats, conduisant à la diminution de son
activité catalytique observée après la phosphorylation par Chk1 (Uto et al., 2004).
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Figure 11 : Les principaux variants d’épissage de Cdc25B
Les trois isoformes de Cdc25B diffèrent par la présence ou l’absence des séquences codantes pour les domaines A et B de 14 et 41 acides aminés respectivement.
Figure 10 : Régulation de la phosphatase Cdc25A Les phosphorylations de Cdc25A par Chk1 conduisent aux liaisons avec les 14-3-3. Cdc25A est stabilisée en mitose par des phosphorylations de CDK1. La dégradation de Cdc25A est dépendante de SCF/βTrCP qui induit son ubiquitinylation et de manière dépendante de la boite KEN, le complexe APC/C conduit également à la dégradation de Cdc25A à la suite de son ubiquitinylation en fin de mitose.
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(ii) Cdc25B
Parmi les cinq variants d’épissage de Cdc25B dont les séquences sont accessibles dans les
bases de données, trois variants ont été relativement bien décrits : Cdc25B1, Cdc25B2 et
Cdc25B3 (Baldin et al., 1997b). Ils sont différenciés par la présence de deux domaines situés dans
la région amino-terminale régulatrice : le domaine A qui est composé de 14 acides aminés et le
domaine B de 43 acides aminés (figure 11). Ainsi le variant Cdc25B1 ne possède pas le domaine A,
le variant B2 ne possède pas le domaine B et le variant B3 contient les deux domaines A et B. Ces
trois variants ont été exprimés dans la levure à fission et sont capables de complémenter la
souche de levure Cdc25-22TS. C’est le variant Cdc25B2 qui présente la plus forte activité inductrice
de mitose (Baldin et al., 1997b).
Cdc25B fait la navette entre le noyau et le cytoplasme au cours du cycle cellulaire. Cette
variation de localisation s’explique par la présence d’une NES et d’une NLS bipartite située dans
la région amino-terminale régulatrice de Cdc25B (Davezac et al., 2000; Lindqvist et al., 2004;
Uchida et al., 2004) (figure 12). Ces signaux de localisation sont présents dans les différents
variants de Cdc25B, cependant il semblerait que Cdc25B1 soit plutôt localisée dans le noyau où
elle est active lors de l’entrée en mitose (Baldin et al., 2002), alors que Cdc25B3 doit être
cytoplasmique pour entraîner les cellules en mitose (Lindqvist et al., 2004), suggérant ainsi une
régulation de la localisation différente pour chaque variant d’épissage.
Trois sites de liaison aux protéines 14-3-3 sont présents dans le domaine régulateur amino-
terminal de Cdc25B et sont impliqués dans la régulation de sa localisation et de son activité :
RFQpS151MP, RPSpS230AP et RSPpS323MP (Giles et al., 2003; Uchida et al., 2004). La mutation
en alanine de la sérine 323 conduit à une inhibition de la liaison aux protéines 14-3-3 et entraîne
une localisation strictement nucléaire de Cdc25B (Davezac et al., 2000), alors que les simples et
doubles mutations en alanine des sérines 151 et 230 entraînent une augmentation de la
localisation cytoplasmique de la phosphatase. La proximité de ces résidus par rapport aux
séquences NES et NLS pourrait ainsi permettre aux protéines 14-3-3 de réguler la localisation
intracellulaire de Cdc25B en bloquant la liaison de Crm1 ou des Importines à leur séquence de
reconnaissance respective, NES ou NLS (Giles et al., 2003). Il semblerait que la liaison aux
protéines 14-3-3 joue également un rôle dans la modulation de l’activité de Cdc25B en bloquant
l’accès de Cdc25B à son substrat CDK1-Cycline B1 (Forrest and Gabrielli, 2001; Giles et al.,
2003).
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Il a d’autre part été montré que Cdc25B jouait un rôle dans l’activation initiale du complexe
CDK1-Cycline B1 dans le cytoplasme des cellules, au niveau des centrosomes (Jackman et al.,
2003; Lindqvist et al., 2005). De récentes études ont permis de montrer des événements de
régulation positifs et négatifs de Cdc25B aux centrosomes. Tout d’abord la protéine Chk1 régule
négativement la transition G2/M du cycle cellulaire en conduisant à une inhibition de l’activité
des complexes CDK1-Cyclines B aux centrosomes (Kramer et al., 2004). Des travaux de notre
équipe ont montré que Cdc25B3 était phosphorylée par Chk1 in vivo sur son résidu thréonine 563
(homologue du résidu T507 sur Cdc25A) et sur la sérine 230 aux centrosomes (homologue de la
S178 de Cdc25A) (Schmitt et al., 2006). Les acides aminés S151 et S323 sont également
phosphorylés in vitro par la kinase Chk1 (Schmitt et al., 2006) et Cdc25B3 portant une
phosphorylation sur la S323 est localisée aux centrosomes (Lemaire et al., 2006). La T563 de
Cdc25B est localisée dans le domaine carboxy-terminal, qui est bien conservé avec Cdc25A, et
permet la liaison aux substrats. Ainsi la phosphorylation par Chk1 de la T563 conduit à une
inhibition de la liaison de Cdc25B avec les cyclines A1, B1 et E1 (Uto et al., 2004). La protéine
kinase mitotique Aurora A phosphoryle et active Cdc25B3 sur le résidu sérine 353 au niveau des
centrosomes, ce qui a pour conséquence le recrutement et l’activation des complexes CDK1-
Cycline B lors de l’entrée des cellules en mitose (Dutertre et al., 2004) (Hirota et al., 2003). Enfin,
la protéine kinase Eg3 est responsable de la phosphorylation de la S169 de Cdc25B3 qui est
située dans le domaine B (Mirey et al., 2005). Cette phosphorylation a été détectée au niveau des
centrosomes, elle n’a pas d’effet sur l’activité catalytique de Cdc25B in vitro et son mécanisme
d’action au sein de la cellule reste encore à déterminer. Cependant la co-expression des deux
protéines dans les cellules humaines montre qu’Eg3 a un effet négatif sur l’entrée des cellules en
mitose et que cet effet est antagonisé par Cdc25B (Davezac et al., 2002), ainsi Eg3 pourrait agir
comme un régulateur négatif de Cdc25B.
D’autre part la localisation cellulaire de Cdc25B est également régulée par la phosphorylation
de la sérine 353 par la protéine kinase PKB/Akt. En effet, la surexpression d’une forme
constitutivement active de PKB/Akt dans les cellules humaines conduit à une relocalisation
cytoplasmique de Cdc25B dépendante du facteur d’export nucléaire Crm1 (Baldin et al., 2003).
La protéine kinase CK2 (Caséine Kinase 2) qui interagit avec Cdc25B par sa sous unité β,
phosphoryle les résidus S186 et S187, ce qui se traduit par une augmentation de l’activité
phosphatase de Cdc25B observée in vitro mais aussi in vivo (Theis-Febvre et al., 2003). Des
boucles d’amplifications positives et négatives impliquant Cdc25B et les complexes CDK-
Cyclines ont été décrites. CDK1-Cycline A phosphoryle Cdc25B1 et induit sa dégradation de
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manière dépendante du protéasome en phase G2 du cycle cellulaire (Baldin et al., 1997a). Le
complexe CDK1-Cycline B1 phosphoryle, lui aussi, Cdc25B1 sur le résidu sérine 146, situé dans
le domaine B (sérine 160 de Cdc25B3), ce qui entraîne une inhibition de son export nucléaire
mais n’a pas d’effet sur l’activité phosphatase de Cdc25B1 (Baldin et al., 2002). Il a d’autre part
été montré au laboratoire que CDK1-Cycline B1 phosphoryle in vitro de nombreux sites dans la
région régulatrice amino-terminale de Cdc25B (Bouché JP, en préparation). Parmi ces sites, la
phosphorylation in vivo du résidu thréonine 69, situé dans le domaine A de Cdc25B et donc
absente de Cdc25B1, contribuerait à l’augmentation de l’activité de Cdc25B2 et Cdc25B3 en
mitose (Izumi and Maller, 1993; Margolis et al., 2006).
Figure 12 : Régulation de la phosphatase Cdc25B Cdc25B est régulée négativement par Chk1 et Eg3. La phosphorylation sur les S151, S230 et S323 par Chk1 conduit à la liaison avec 14-3-3 et une diminution de l’activité phosphatase. Aurora A régule positivement Cdc25B à l’entrée en mitose et il semblerait que Cdc25B soit également phosphorylée par CDK1.
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Enfin Cdc25B est une protéine instable qui est dégradée au cours de la mitose par le
protéasome (Baldin et al., 1997a). Des études récentes réalisées dans notre laboratoire ont permis
de montrer que les différents variants de Cdc25B étaient dégradés de manière différentielle
dépendant du domaine B. Ainsi les variants Cdc25B1 et Cdc25B3 sont dégradés suivant un
mécanisme dépendant du complexe SCF/βTrCP entre la transition métaphase-anaphase de la
mitose (Kieffer et al., 2007).
(iii) Cdc25C
L’activité de Cdc25C doit être finement régulée afin de permettre la progression des cellules
en mitose de manière rapide et irréversible. La présence d’une NES dépendante du facteur
d’export nucléaire Crm1 et d’une NLS bipartite canonique au niveau de la région amino-
régulatrice de Cdc25C permettent à la phosphatase de réaliser une navette continue entre le
cytoplasme et le noyau de la cellule (Graves et al., 2001; Yang and Kornbluth, 1999). En réalité,
en interphase Cdc25C est phosphorylée sur la sérine 216 et est majoritairement cytoplasmique et
devient majoritairement nucléaire lors de l’entrée en prophase (Dalal et al., 1999). Cette
phosphorylation de la S216 crée un site de liaison aux protéines 14-3-3 qui cache probablement la
séquence de localisation nucléaire et maintient la phosphatase sous une forme inactive dans le
cytoplasme (Dalal et al., 1999; Graves et al., 2001; Peng et al., 1997). Cette interaction entre 14-3-
3 et Cdc25C, cruciale pour le contrôle de l’entrée en mitose, est dépendante de la
phosphorylation de la S216. En effet, la mutation en alanine de la S216 empêche la liaison avec
14-3-3 et conduit à l’observation de cellules présentant une condensation prématurée de la
chromatine (Graves et al., 2001). En absence de dommages sur l’ADN la protéine kinase C-
TAK1 (Cdc Twenty-five C Associated Kinase 1) est responsable de la phosphorylation de ce résidu
(figure13) (Peng et al., 1998). Cependant il est aussi possible que Chk1 soit impliquée dans cet
événement de phosphorylation en raison de son rôle joué lors de la régulation du cycle cellulaire
en absence de dommages sur l’ADN. Lors de l’entrée en mitose, la dissociation de la liaison entre
Cdc25C et 14-3-3 permet l’import nucléaire de la phosphatase où elle peut activer pleinement les
complexes CDK1-Cycline B1. Cdc25C est alors activée par CDK1-Cycline B1 à travers une
boucle de retro-contrôle positif (Bulavin et al., 2003a; Bulavin et al., 2003b). Ainsi CDK1
phosphoryle le résidu sérine 214 très proche de la sérine 216 et empêche la phosphorylation de la
S216. Des études réalisées chez le xénope ont permis de montrer que Cdc25C et 14-3-3 sont
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dissociées après la phosphorylation de la T138. Le site S285 (S214 de hCdc25C) est alors
accessible à la phosphorylation par la kinase CDK1, accélérant considérablement le recrutement
de la phosphatase PP1 qui induit la déphosphorylation de la S216 et entraîne l’entrée des cellules
en mitose (Margolis et al., 2006; Margolis et al., 2003). Cdc25C est également régulée par un
processus d’isomérisation dépendant de la protéine Pin1 (Stukenberg and Kirschner, 2001). Pin1
est une peptidyl-proline isomérase qui interagit par son domaine WW avec Cdc25C phosphorylée
par CDK1 au niveau des motifs pS/pTP (Crenshaw et al., 1998; Shen et al., 1998) (Zhou et al.,
2000). La résultante de la conversion peptidique des liaisons S/TP induit un changement
conformationnel de la phosphatase accompagné de la déphosphorylation par PP2A de motifs
phosphorylés par CDK1, inhibant ainsi Cdc25C (Zhou et al., 2000).
Enfin d’autres phosphorylations sont impliquées dans la régulation de Cdc25C. Ainsi la
protéine kinase CK2 qui phosphoryle le résidu thréonine 236 très proche de la NLS, inhibe la
liaison aux importines α/β et prévient l’import nucléaire de Cdc25C (Schwindling et al., 2004).
La protéine kinase CaMKII (Calcium calmoduline-dependent protein Kinase II), dont les sites de
phosphorylation ne sont pas encore identifiés, permet l’augmentation très nette de l’activité
phosphatase de Cdc25C (Patel et al., 1999). De la même manière la phosphorylation en amino-
terminal de Cdc25C par Pim1 entraîne une augmentation de son activité lors de la progression
G2/M (Bachmann et al., 2006). Cdc25C est aussi phosphorylée par les membres de la famille Plk
(Polo kinase). En effet la sérine 198 est phosphorylée in vitro par Plk1 et Plk3 (Toyoshima-
Morimoto et al., 2002) et la sérine 191 est elle aussi phosphorylée par Plk3 (Bahassi el et al.,
2004). Ces études montrent que les phosphorylations engendrées par les kinases Plk conduisent à
une accumulation nucléaire de Cdc25C suggérant un rôle important des Plk lors du contrôle de la
translocation nucléaire de Cdc25C lors de l’entrée de la cellule en mitose (Bahassi el et al., 2004)
(Toyoshima-Morimoto et al., 2002).
Il a aussi été démontré chez l’ovocyte de xénope que les kinases Erk/MAPK étaient
impliquées dans la phosphorylation de trois résidus de Cdc25C lors de la transition G2/M,
associées à une augmentation de son activité (Wang et al., 2007). Ces résidus sont hautement
conservés chez la phosphatase humaine : T48, T67 et S168, et ont été montrés, en plus des
résidus S122 et T130, comme étant phosphorylés in vivo lors de l’entrée en mitose (Izumi and
Maller, 1993; Strausfeld et al., 1994). Il semblerait que ces sites soient phosphorylés par CDK1
lors de la boucle d’auto-amplification entre Cdc25C et CDK1-Cycline B1 à l’entrée en mitose.
Enfin une étude récente a permis de montrer qu’un événement de phosphorylation était
impliqué dans la dégradation de Cdc25C. La sérine 216, phosphorylée par la kinase p90ARF,
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semble induire la dégradation de manière dépendante de l’ubiquitine de Cdc25C (Eymin et al.,
2006).
La présentation globale des mécanismes de régulation et des rôles joués par les phosphatases
Cdc25 au cours de la progression du cycle cellulaire, nous permet de proposer un modèle général
de la progression de la phase G2 vers la phase M du cycle cellulaire en absence de dommages.
Ainsi il semblerait que Cdc2A et Cdc25B soient activées initialement dès l’approche de la
prophase. L’activation précoce des complexes CDK1-Cycline B1 aux centrosomes par Cdc25B3
et Plk1 permettrait d’engager la maturation des centrosomes. Puis les complexes CDK1-Cycline
B1 actifs seraient dirigés vers le noyau et pourraient ainsi activer les phosphatases nucléaires
Figure 13 : Régulation de la phosphatase Cdc25C C-TAK1 phosphoryle la S216 de Cdc25C conduisant à la liaison avec les 14-3-3 et à l’inactivation ainsi que la rétention cytoplasmique de la phosphatase. Lors de l’entrée en mitose, la dissociation de l’interaction avec les 14-3-3 permet à CDK1 de phosphoryler la S214 conduisant à l’activation de Cdc25C. Puis le complexe CDK1-Cycline B actif va ensuite phosphoryler Cdc25C pour permettre d’activer pleinement Cdc25C.
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Cdc25A et CDC25B1. L’entrée ensuite de Cdc25C dans le noyau permettrait aux complexes
CDK1-Cycline B1 d’activer les phosphatases Cdc25C qui, à leur tour, amplifieront l’activation
des complexes CDK1-Cycline B1 nécessaires à la condensation des chromosomes et à la rupture
de l’enveloppe nucléaire.
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II- La réponse du cycle cellulaire aux dommages sur l’ADN
Nous venons de voir que la régulation des phosphatases Cdc25 et des complexes CDK-
Cycline au sein de la progression dans le cycle cellulaire correspond à un schéma complexe qui
fait intervenir des mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation ainsi que des interactions
avec des partenaires. L’ensemble de ces modifications va moduler soit l’activité catalytique des
enzymes, soit leur localisation intracellulaire et permettre la bonne progression du cycle cellulaire.
Un certain nombre de ces régulations sont reprises et adaptées pour arrêter le cycle cellulaire, ce
sont les points de contrôle. Ces points de contrôles interviennent à des étapes clés de chaque
phase du cycle cellulaire afin de contribuer au maintien de la stabilité génétique (Hartwell and
Weinert, 1989). Ainsi, en réponse à des dommages sur l’ADN, à un stress réplicatif ou a un
mauvais alignement des chromosomes, les points de contrôle seront activés, conduisant à un
arrêt du cycle cellulaire pour permettre à la cellule de réparer les dommages ou d’achever
correctement une étape.
Au cours de la partie de l’introduction générale suivante, nous nous intéresserons plus
particulièrement aux mécanismes de surveillance impliqués dans la réponse aux dommages sur
l’ADN. En présence d’un endommagement de l’ADN, la cellule s’arrêtera spécifiquement en
deux points précis du cycle cellulaire qui sont la transition entre les phases G1 et S et la transition
entre les phases G2 et M du cycle cellulaire. On parle alors des points de contrôles “G1/S” ou
“G2/M”.
II-1 : Les points de contrôle
Les points de contrôle sont des voies de signalisation qui ont pour buts, lors de la réponse
cellulaire aux dommages sur l’ADN, d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire, à la réparation des
dommages et, dans le cas de dommages trop sévères, à la mort cellulaire par apoptose. Des
mécanismes de surveillance sont également mis en place aux étapes clés du cycle cellulaire afin de
contrôler la bonne progression du cycle cellulaire. C’est pourquoi une cellule ne pourra pas se
diviser tant que tous ses chromosomes ne seront pas correctement alignés ou ne pourra pas
dupliquer son ADN avant d’avoir franchi la mitose (Smith et al., 2002). La cellule peut employer
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différents mécanismes de surveillance en réponse aux signaux externes (radiations,
génotoxiques…) ou internes à la cellule (radicaux oxygénés, erreurs de réplication…) :
- Ainsi le point de contrôle G1/S conduit à l’inactivation de la transition G1/S et permet
d’empêcher la réplication d’erreurs en phase S.
- Plusieurs points de contrôle en phase S surveillent les arrêts des fourches de réplication et
les dommages.
- Le point de contrôle G2/M bloque la progression des cellules de la phase G2 vers la
mitose et permet d’empêcher la dissémination des erreurs et des dommages sur l’ADN.
- Et enfin le point de contrôle du fuseau mitotique permet de contrôler la ségrégation
correcte des chromosomes lors de la transition métaphase/anaphase.
Dans le cadre de notre projet, nous nous intéressions plus particulièrement à l’activation des
points de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN. C’est pourquoi nous développerons
dans la partie suivante uniquement le fonctionnement des points de contrôle impliqués dans la
réponse aux dommages, c'est-à-dire les points de contrôle G1/S et G2/M.
Parmi les acteurs de ces voies de signalisation, trois catégories se distinguent par leurs rôles et
leur chronologie : les senseurs, les transducteurs et les médiateurs (figure 14) (Sancar et al., 2004).
Figure 14 : La signalisation des points de contrôles
Les dommages sur l’ADN sont détectés par les senseurs. Les transducteurs vont ensuite diffuser l’information conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire, à la réparation des dommages et en cas de dommages trop importants à la mort cellulaire, par l’intermédiaire des protéines effectrices
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II-1-A : Dommages sur l’ADN et fonctionnement des points de contrôles
II-1-A-a : Les senseurs
La première étape dans la mise en place des points de contrôle est la détection par la cellule
des dommages sur l’ADN. Les senseurs sont des protéines capables de se lier à l’ADN et dont le
but est de détecter ces dommages (Zhou and Elledge, 2000). Il existe différents types de
dommages de l’ADN qui sont fonction des stress que subit la cellule : par exemple les dimères de
pyrimidines produits par les radiations ultraviolettes (UV), les cassures simples et doubles brins
de l’ADN induites par les radiations ionisantes (IR) ou les radicaux oxygénés (Sancar et al., 2004).
Les protagonistes sont encore mal connus, cependant nous décrirons succinctement deux types
de complexes qui semblent jouer un rôle de senseurs dans la voie de signalisation des dommages
de l’ADN.
Le complexe RPA (Replication Protein A) est impliqué dans les mécanismes de réplication de
l’ADN et présente une forte affinité pour l’ADN simple brin. RPA reconnaît également les
lésions induites par les UV (Cline and Hanawalt, 2003). Il est constitué de trois protéines p70,
p34 et p14 et il a de plus été montré que p34 était hyperphosphorylée en réponse aux dommages
sur l’ADN (Binz et al., 2004).
Le complexe MRN (Mre11/Rad50/NBS1) semble être impliqué dans la détection des cassures
doubles brins de l’ADN (Lisby et al., 2004; Lisby and Rothstein, 2005). Le complexe MRN
intervient dans les mécanismes de réparation des cassures de l’ADN doubles brins
(recombinaison homologue et NHEJ, Non Homologous End Joining) et colocalise avec RPA en
réponse à certains dommages. Des mutations des gènes Mre11 et NBS1 sont caractérisées au
niveau cellulaire par une instabilité génomique et des points de contrôle défectueux en réponse
aux radiations ionisantes (Robison et al., 2005).
II-1-A-b : Les transducteurs
Après la détection des dommages sur l’ADN par les senseurs et l’initiation des voies de
signalisation, les transducteurs ont alors comme principal objectif de mettre en place la diffusion
du signal. Ce sont des protéines kinases de transduction du signal qui amplifient le signal en
phosphorylant d’autres kinases ou protéines. Ce processus fait appel a des kinases “apicales” ou
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proximales qui répondent aux signaux reçu des senseurs et des kinases “distales” qui transmettent
à leur tour le signal reçu des kinases apicales.
(i) Les kinases apicales
Parmi les membres de ce groupe figurent ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et ATR (ATM
and Rad3 related) qui appartiennent à la famille des PIKK (Phospho-Inositide 3-Kinase related Kinases)
impliquées dans la réparation de l’ADN et les points de contrôle (Abraham, 2004).
La mutation du gène ATM conduit à l’“Ataxia Telangiectasia” qui est une maladie conférant aux
malades une forte prédisposition aux cancers accompagnée d’une grande sensibilité aux radiations
ionisantes. ATM est une protéine dimérique qui, par un mécanisme d’autophosphorylation en
réponse à des cassures doubles brins de l’ADN, semble reprendre une forme monomérique et
peut alors phosphoryler ses substrats (Bakkenist and Kastan, 2003). ATM est ainsi responsable de
la phosphorylation de nombreux substrats comme : Chk2, BRCA1, p53, MDM2 et Chk1.
La kinase ATR est en revanche essentielle à la viabilité cellulaire chez les mammifères. En effet
l’invalidation du gène ATR chez la souris conduit à une létalité embryonnaire, alors que les souris
ATM-/- sont viables (Sancar et al., 2004). Ces résultats suggèrent ainsi un rôle essentiel de la
kinase en absence de dommages sur l’ADN. ATR est activée en réponse aux cassures simples
brins de l’ADN mais également en réponse aux cassures doubles brins de l’ADN et est
impliquées dans la phosphorylation de Chk1, p53, BRCA1, MDM2 et Chk2 (Gatei et al., 2003;
Liu et al., 2000).
Ainsi les kinases ATM et ATR ont de nombreux substrats en commun en particulier les
kinases de réponse aux stress Chk1 et Chk2. Il a d’ailleurs été démontré récemment qu’en
réponse aux radiations ionisantes les kinases ATM et ATR participeraient à une même voie de
signalisation (Cuadrado et al., 2006). Ces récentes découvertes contrebalancent le dogme initial où
il avait été proposé qu’ATM activait uniquement Chk2 en réponse aux radiations ionisantes alors
qu’ATR activait Chk1 en réponse aux UV.
La kinase p38SAPK (p38 Stress Ativated Protein Kinase), qui appartient à la famille des MAPK
(Mitogen Activated Protein Kinase), joue également un rôle essentiel dans la voie de signalisation en
réponse aux stress induits par les UV ou par des agents génotoxiques (cisplatine, doxorubicine)
conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire (Reinhardt et al., 2007). Trois principales voies de
signalisation sont décrites au sein de la famille des MAPK : la voie ERK (Extracellular-signal Related
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Kinase) qui est impliquée dans la prolifération cellulaire, la voie SAPKJNK (Stress Activated Protein
Kinase/ c-Jun N-terminal Kinase) et p38SAPK qui sont activées en réponses à différents stress (Dent et
al., 2003) (Pearce and Humphrey, 2001).
(ii) Les kinases distales
Les protéines appartenant à ce groupe sont à leur tour impliquées dans la transduction du
signal en réponse aux dommages sur l’ADN suite à leurs phosphorylations par les kinases
apicales. Ces kinases vont phosphoryler les cibles nécessaires à l’arrêt du cycle cellulaire. Parmi les
principales kinases de ce groupe, on peut citer notamment Chk1, Chk2 et MK2 (MAPKAP-K2 -
MAP Kinase Activated Protein Kinase 2).
Chk1 est essentielle à la viabilité cellulaire, les souris invalidées pour le gène Chk1-/- meurent
dès le stade embryonnaire. En réponse aux radiations ionisantes ou aux UV, Chk1 est activée par
ATR, mais aussi par ATM dans certains cas et est impliquée dans la mise en place du point de
contrôle G2/M. Chk2 au contraire de Chk1 n’est pas essentielle à la viabilité cellulaire, en effet les
souris Chk2-/- sont viables, cependant des mutations au niveau de la région codante du gène Chk2
conduirait au syndrome de Li-Fraumeni dans certains cas (Niida et al., 2005). Chk2 est activée
principalement par ATM et semble jouer un rôle prépondérant dans l’activation du processus
apoptotique en réponse aux radiations ionisantes (Ahn et al., 2004). L’invalidation du gène MK2
chez la souris est viable, cependant de récentes études ont montré l’importance de MK2 dans la
mise en place des points de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN. MK2 est une cible de
p38 en réponse aux UV et intervient dans la régulation du cycle cellulaire. Ainsi ces protéines, par
leurs capacités à induire un arrêt précis du cycle cellulaire, jouent un rôle prépondérant dans la
réponse cellulaire aux dommages sur l’ADN.
II-1-A-c : les effecteurs
Comme leur nom l’indique, les effecteurs sont des protéines qui, par leur activation ou leur
inhibition, permettent d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire et à la réparation des dommages. Dans
certains cas, lorsque les dommages sont trop importants, les effecteurs peuvent aussi conduire à
la mort cellulaire par l’initiation du processus apoptotique. Le suppresseur de tumeur p53 et la
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famille des phosphatases Cdc25 sont les principaux effecteurs des points de contrôle mis en place
en réponse aux dommages sur l’ADN.
p53 est un facteur de transcription. Au cours d’un cycle cellulaire normal p53 est maintenu à
un niveau d’expression relativement bas. En réponse aux dommages sur l’ADN, p53 est stabilisée
par des phosphorylations engendrées par les kinases ATM et ATR, et peut ainsi activer la
transcription de ses gènes cibles impliqués dans la réparation (Sengupta and Harris, 2005), l’arrêt
du cycle cellulaire (comme p21 ou 14-3-3σ) ou l’apoptose (Meek, 2004). De plus p53 peut aussi
réprimer la transcription des gènes essentiels au déroulement de la mitose comme CDK1, Cyline B
ou Cdc25C (St Clair and Manfredi, 2006; Taylor and Stark, 2001).
Les phosphatases Cdc25, par leur activation des complexes CDK-Cycline, sont essentielles à la
progression des cellules dans chaque phase du cycle cellulaire. Ce sont donc des cibles privilégiées
pour conduire à l’arrêt du cycle cellulaire lors de l’activation des points de contrôle en réponse
aux dommages sur l’ADN (Karlsson-Rosenthal and Millar, 2006). Les kinases Chk1 et Chk2
phosphorylent et inactivent les phosphatases Cdc25 en présence de dommages sur l’ADN en
conduisant soit à une modification de leur localisation cellulaire, soit à une inhibition de leur
activité phosphatase ou encore à leur dégradation. Cependant de récentes études ont permis de
mettre en évidence d’autres voies de signalisation impliquées dans l’activation des points de
contrôle, ciblant également les phosphatases Cdc25 (voir ci-après).
II-1-B : Arrêt à la transition G1/S
En réponse à la détection de dommage sur l’ADN en phase G1 du cycle cellulaire, deux voies
de signalisation dépendantes d’ATM/ATR et Chk1/Chk2 sont mises en place et conduisent à
l’inhibition du complexe CDK2-Cycline E. Tout d’abord Cdc25A est rapidement inhibée
conduisant à un arrêt rapide du cycle cellulaire et l’activation de p53 va entrainer une réponse
différée mais plus stable (Bartek and Lukas, 2001a, b).
En réponse aux rayonnements UV, Cdc25A est phosphorylée sur la sérine 214 par Chk1 et
Chk2, ce qui conduit à sa dégradation rapide par le protéasome (Falck et al., 2001; Mailand et al.,
2000). Ainsi la phosphorylation sur la tyrosine 15 de CDK2 est maintenue et les cellules ne
peuvent pas débuter leur phase S. En parallèle de cette voie de signalisation très rapide, la
deuxième cascade d’événements se met en place pour assurer un arrêt plus stable des cellules qui
les conduira vers l’apoptose si les dommages sont trop importants. p53 est stabilisée suite aux
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phosphorylations des kinases ATM/ATR et Chk1/Chk2 (Vogelstein et al., 2000) et va entre autre
permettre la transcription de la protéine inhibitrice p21CIP1 qui va conduire à l’inhibition du
complexe CDK2-Cycline et assurer le blocage total des cellules.
II-1-C : Arrêt à la transition G2/M
Le blocage des cellules à la transition G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN fait
intervenir l’inhibition du complexe CDK1-Cycline B par le maintien de ses phosphorylations
inhibitrices sur les résidus T14 et Y15 (Gabrielli et al., 1997; Jin et al., 1996; Peng et al., 1997;
Sanchez et al., 1997). De la même manière qu’en G1/S, l’activation du point de contrôle G2/M
fait intervenir deux voies de signalisation. Une réponse rapide qui fait intervenir des événements
de régulation des protéines intervenant dans la transition G2/M par des modifications post-
traductionnelles et une réponse différée et stable qui fait appel à des événements de régulation
transcriptionnelle.
II-1-C-a : Les événements de régulation post-traductionnels
La cascade de signalisation ATM/ATR, par l’activation ou l’inhibition de nombreux
effecteurs, va conduire à l’inactivation du complexe CDK1-Cycline B bloquant ainsi les cellules
en G2/M. L’activité kinase de Wee1 est augmentée suite à la phosphorylation par Chk1 (figure 15)
(O'Connell et al., 1997; Walworth, 2001). Chk1 est aussi impliquée dans la phosphorylation de la
sérine 216 de Cdc25C en réponse aux dommages sur l’ADN créant un site de liaison aux 14-3-3
et conduisant à sa rétention cytoplasmique et à une diminution de son activité catalytique
(Hutchins and Clarke, 2004). Une étude récente a permis de montrer que la S216 de Cdc25C
pouvait également être phosphorylée par la voie Erk1/MAPK et serait impliquée dans sa
dégradation dépendante du protéasome (Eymin et al., 2006). D’autre part, en réponse aux
radiations UV, la kinase SAPK/JNK semble être impliquée dans la phosphorylation inhibitrice de
Cdc25C sur la S168 (Goss et al., 2003). Enfin il a été également décrit une dégradation de
Cdc25C en réponse au point de contrôle G2/M suite à un traitement par l’arsenite. Cette
dégradation est dépendante de la séquence KEN et semble être indépendante de la
phosphorylation sur la S216 (Chen et al., 2002). Cdc25A est ciblée pour la dégradation par
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l’ubiquitine ligase SCF-βTrCP en réponse à des événements de phosphorylation en amino-
terminal et notamment sur la S124 par Chk1 (Busino et al., 2004; Jin et al., 2003). De plus Chk1
contrôle l’activité catalytique de Cdc25A en phosphorylant la S178 et la T507, ce qui conduit à la
création de sites de liaison aux protéines 14-3-3(Chen et al., 2003). En réponse à un stress
oxydatif PKB/Akt inhibe Cdc25B par une phosphorylation sur la S353, aboutissant à son export
nucléaire (Baldin et al., 2003). De récentes études ont également montré que Cdc25B est inhibée
en réponse aux dommages induits par les radiations par les kinases p38 et MK2 (Bulavin et al.,
2001; Lemaire et al., 2006; Manke et al., 2005). Ainsi, bien que ces mécanismes soient encore mal
compris, l’inactivation de Cdc25B est requise lors de l’activation du point de contrôle G2/M
(figure 15). D’autre part, Plk1 qui est responsable de l’activation de Cdc25C et de CDK1-Cycline B
et de l’inhibition de Wee1, semble être aussi inactivée de manière indirecte par les kinases Chk1
ou Chk2 (Tsvetkov and Stern, 2005).
II-1-C-b : les événements de régulation transcriptionnelle
Une voie de signalisation dépendante de p53 permet aussi l’activation du point de contrôle
G2/M. Ainsi p53, comme dans le cas du point de contrôle G1/S active la transcription de p21CIP1
qui inactive le complexe CDK1-Cycline B1. p53 agit aussi sur la transcription de la protéine 14-3-
3σ qui va permettre de maintenir le complexe CDK1-Cycline B dans le cytoplasme. Enfin p53
permet de réprimer directement la transcription de CDK1 et CyclineB1 (Taylor and Stark, 2001).
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II-2 : La biologie des points de contrôle
II-2-A : Modèle d’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux stress génotoxiques
Le point de contrôle G2/M est un mécanisme de surveillance critique du cycle cellulaire dans
la réponse aux dommages sur l’ADN, qui est bien conservé au cours de l’évolution. La grande
variété d’agents impliqués dans l’activation du point de contrôle G2/M en fait un mécanisme
complexe dont il reste encore de nombreux composants à identifier. De plus, il existe de
multiples redondances dans la régulation de ce point de contrôle en réponse aux larges spectres
Figure 15 : Régulation des Cdc25 au point de contrôle G2/M Le complexe CDK1-Cycline B est la cible finale du point de contrôle G2/M. Il est maintenu inactif par de l’inhibition des phosphatases Cdc25 et de l’activation de Wee1. Cdc25C et Cdc25A sont des cibles de Chk1 ce qui créé un site de liaison aux 14-3-3 accompagné d’une rétention cytoplasmique des phosphatases. Cdc25A peut également être dégradée à la suite de sa phosphorylation sur la S124 par Chk1 et Cdc25C semble être dégradée à la suite d’une phosphorylation par les kinases Erk. Cdc25B dans le cytoplasme est la cible des kinases p38 et MK2 conduisant à son inactivation.
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de stress génotoxiques. Afin de mieux comprendre la fonction générale de ce point de contrôle
en réponse aux dommages, un modèle simplifié, basé sur les données présentées ci-dessus peut
être proposé.
Différents types de stress induisent des voies de signalisation différentes. La première cascade
de signalisation est responsable de l’initiation du point de contrôle et régule majoritairement la
phosphorylation de Cdc25B dans le cytoplasme. Ainsi, on peut citer par exemple l’activation de la
voie p38MAPK en réponse aux radiations UV, la kinase p38 est responsable in vivo de la
phosphorylation du résidu S309 de Cdc25B conduisant à un site de liaison aux protéines 14-3-3.
L’inhibition de p38 par l’inhibiteur SB202190 empêche l’initiation rapide du point de contrôle
G2/M. La régulation de la phosphorylation de Cdc25B par p38 est donc un évènement critique
de l’initiation de l’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux radiations UV (Bulavin
et al., 2001). Mais une autre cascade de signalisation est activée en réponse aux dimères de
thymidine produits par les radiations UV. Ces voies de signalisation qui semblent être légèrement
moins précoces, impliquent les protéines participant à la détection et à la signalisation des
dommages sur l’ADN. Ainsi, la kinase ATR conduit à l’activation de Chk1 qui va elle-même
cibler Cdc25C sur la S216 conduisant ici aussi à un site de liaison aux 14-3-3 et à une inhibition
de la phosphatase. Cette voie de signalisation est impliquée dans la maintenance du point de
contrôle G2/M tant qu’il reste des dommages non réparés sur l’ADN. Donc une réponse
précoce aux stress va conduire à l’initiation de l’activation du point de contrôle G2/M en ciblant
Cdc25B dans le cytoplasme. Si l’ADN n’est pas endommagé, les cellules vont pouvoir entrer en
mitose et terminer leur cycle cellulaire dès que le stress aura été éliminé. En revanche si des
dommages sur l’ADN sont détectés, la progression vers la mitose est alors contrôlée par un
système régulant l’état de phosphorylation de Cdc25C dans le noyau, tel que la voie ATR/Chk1.
Dans ce cas là, les cellules ne pourront entrer en mitose que lorsque les dommages sur l’ADN
seront réparés et dans le cas de dommages trop sévères, les cellules seront conduites vers
l’apoptose (Bulavin et al., 2002).
II-2-B : La sortie des points de contrôle
A la suite de l’établissement d’un point de contrôle, deux choix s’offrent à la cellule : soit le
retour dans le cycle cellulaire après la réparation correcte des dommages, soit dans le cas contraire
la programmation de la mort cellulaire.
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II-2-B-a : Retour dans le cycle cellulaire
Les études menées sur l’établissement des points de contrôle ont permis d’avoir une meilleure
vision sur la mise en place des cascades de signalisation en réponse aux différents stress.
Cependant les mécanismes permettant le retour des cellules dans le cycle cellulaire sont encore
très mal connus. De récentes études ont montré que Cdc25B et Plk1semblaient jouer un rôle
primordial dans la sortie des points de contrôle après la réparation des dommages sur l’ADN.
Ainsi Cdc25B serait impliquée dans l’activation du complexe CDK1-Cycline B1 lors du retour
dans le cycle cellulaire alors que Plk1 cible la kinase Wee1 (Bugler et al., 2006; van Vugt et al.,
2005). Par ailleurs des études ont montré que la surexpression de Cdc25B empêchait
l’établissement d’un point de contrôle (Forrest and Gabrielli, 2001; Miyata et al., 2001). Enfin,
notre équipe a montré récemment que la surexpression de Cdc25B dans les cellules U2OS
conduisait à la sortie prématurée du point de contrôle G2/M, induit par la doxorubicine ou
l’étoposide, et conduit à une entrée en mitose illégitime (Bugler et al., 2006).
Ces résultats permettent d’envisager que Cdc25B soit un élément clé contrôlant la reprise du
cycle cellulaire à la suite de la réparation des dommages sur l’ADN. Cependant, au vu de la
complexité générale des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire, il n’est pas exclu que de
nombreux autres mécanismes régulent finement la sortie des cellules à la suite de l’activation d’un
point de contrôle.
II-2-B-b : Apoptose
La protéine suppresseur de tumeur p53 est impliquée dans les mécanismes apoptotiques. p53
participe à l’induction de la transcription de FAS et intervient dans la production de certaines
protéines de la famille Bcl-2 comme BAX, PUMA et NOXA. Mais d’autres facteurs sont
impliqués dans l’apoptose. Par exemple Chk2 est responsable de la phosphorylation du facteur de
transcription E2F-1 en réponse aux dommages sur l’ADN. L’activation d’E2F-1 est responsable
de l’expression d’un grand nombre d’effecteurs de l’apoptose dans les cellules humaines
(Norbury and Zhivotovsky, 2004).
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II-3 : Dérégulation des points de contrôle et stratégies anti-
tumorales
Bien que le cancer soit une maladie maintenant bien décrite, les évènements conduisant à
l’apparition des cancers sont encore mal compris. Ainsi la meilleure compréhension de la
régulation des acteurs du cycle cellulaires et des points de contrôle permettra le développement
de nouvelles stratégies anti-tumorales conduisant à la production de molécules thérapeutiques.
Dans plus de la moitié des cancers, la protéine p53 est mutée et donc inactive. Cette mutation
conduit principalement à la perte du point de contrôle G1/S et à l’accumulation dans la cellule
d’une multitude d’erreurs non réparées lors de la réplication (Hofseth et al., 2004). De plus des
surexpressions d’acteurs impliqués dans la régulation des CDK tels que Plk1 (Eckerdt et al.,
2005), Cdc25 (Boutros et al., 2007), ATM (McKinnon, 2004) ou Chk2 (Bartek and Lukas, 2003),
aboutissent à une dérégulation des CDK qui entraine par conséquence une absence de point de
contrôle ou une hyperprolifération. La dérégulation des points de contrôle peut conduire à une
accumulation de dommages non réparés ou à une progression trop rapide dans la phase suivante
du cycle cellulaire, alors que la précédente n’était pas terminée, et ainsi mener à une instabilité
génétique.
L’implication de la dérégulation des principaux acteurs du cycle cellulaire et des points de
contrôle, rend difficile le développement spécifique de stratégies anti-tumorales. L’utilisation en
chimiothérapie de molécules à activité anti-proliférative, comme les inhibiteurs des
topoisomérases (doxorubicine, étoposide), les radiomimétiques (bléomycine), les inhibiteurs de la
réplication (gemcitbine), les agents alkylants (cisplatine) ou les poisons des microtubules (taxol,
vinblastine) ont permis d’aboutir à des résultats encourageants, elles ne sont cependant pas
spécifiques des cellules cancéreuses. Toutes les cellules en division de l’organisme sont touchées,
provoquant des effets secondaires qui peuvent être gênants et ne permettent pas d’atteindre des
index thérapeutiques élevés (Zhou and Bartek, 2004). Ainsi, les avancées de la recherche dans la
compréhension des mécanismes gouvernant le cycle cellulaire ont permis de cibler plus
particulièrement les acteurs spécifiques des cellules cancéreuses. On peut citer par exemple le
Glivec (imatinib mesylate) qui a pour cible la kinase BCR-Abl qui n’est présente que dans les
cellules de leucémie myéloïde chronique (Capdeville et al., 2002). Cependant, ce cas n’est pas
représentatif de la majorité des cancers, c’est pourquoi de nouvelles stratégies se tournent vers un
traitement faisant appel à l’association de molécules.
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Pour cela deux grandes stratégies se développent. La première stratégie consisterait à bloquer
les cellules en phase G2 du cycle cellulaire, tout en les traitants conjointement avec une molécule
induisant l’apoptose des cellules cancéreuses (les radiations ionisantes par exemple). Ainsi cela
permettrait d’augmenter en même temps la résistance des cellules normales tout en guidant les
cellules cancéreuses vers un processus de mort cellulaire. Pour cela des molécules inhibant
l’activité de CDK1 ou des Cdc25 sont décrites dans la littérature (Prevost et al., 2003; Shapiro,
2006). La deuxième stratégie est basée sur des thérapies conduisant, au contraire, à l’inhibition du
point de contrôle G2/M (Kawabe, 2004). L’association d’inhibiteurs, ciblant par exemple la
kinase Chk1, avec des traitements génotoxiques induisant des dommages importants sur l’ADN,
mènerait les cellules cancéreuses à travers le point de contrôle G2/M pour entrer illégitimement
en mitose catastrophique qui mènera les cellules vers la mort cellulaire (Carrassa et al., 2004).
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III- L’analyse protéomique
III-1 : Les principaux objectifs de la protéomique
Le terme “protéome” désigne l’ensemble des protéines exprimées par un génome pour une
cellule, un tissu, un organe ou organisme à un moment donné et dans des conditions données
(Wilkins et al., 1996).
Depuis la première séquence complète du génome de la bactérie Haemophilus influenzae en 1995
de nombreux génomes ont été déterminés. Il est clair aujourd’hui que l’ancien modèle du gène
encodant une seule protéine n’est plus admissible à cause des processus qui augmentent la
diversité chimique des protéines comme les phénomènes d’épissage alternatif, l’édition des ARN,
ou encore les modifications post-traductionnelles. La complexité du protéome excède ainsi de
très loin la séquence du génome.
Comprendre la complexité du protéome est le défi majeur de la protéomique. Mais le
développement n’aurait pas été possible sans les avancées technologiques qui permettent l’étude
du protéome telles que :
- Le séquençage de génomes complets qui alimentent les banques de données.
- L’évolution des techniques de séparation des protéines et de préparation de
l’échantillon avec l’électrophorèse sur gel (mono ou bidimensionnels), l’apparition de
systèmes de micro et nano-chromatographie liquide et leur couplage avec la
spectrométrie de masse.
- Le développement des spectromètres de masse en terme de sensibilité, de précision et
de résolution ainsi que l’apparition régulière de nouvelles générations d’instruments
toujours plus performants.
- Des outils bioinformatiques de plus en plus fiables et puissants.
Aujourd’hui, la protéomique a démontré qu’elle était indispensable à une meilleure
compréhension des processus normaux ou pathologiques, qu’elle pouvait contribuer au
développement de nouveaux biomarqueurs pour le dépistage de diverses maladies et accélérer la
recherche pharmaceutique (Hanash, 2003).
Les enjeux actuels de la protéomique sont d’une part le développement de la protéomique
fonctionnelle, à travers l’étude des interactions entre les protéines et l’étude des modifications
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post-traductionnelles dans le but d’appréhender la fonction des complexes protéiques, et d’autre
part le développement de l’analyse quantitative. L’enjeu de la protéomique quantitative est de
mettre en évidence l’abondance des protéines qui sont dépendantes de l'état physiologique d'une
cellule ou d'un tissu.
L’aspect quantitatif de la protéomique est principalement représenté par la protéomique
différentielle qui est une des approches les plus anciennes de la protéomique. Elle consiste en la
comparaison de protéomes d’origines diverses, dans le but de mettre en évidence des régulations
positives ou négatives de certaines protéines. Les applications médicales sont diverses et
consistent entre autre à identifier les protéines régulées lors de certaines pathologies ou en
réponse à certaines drogues. L’électrophorèse bidimensionnelle est classiquement employée, elle
permet la comparaison des gels bidimensionnels provenant de différents mélanges protéiques et
la visualisation des protéines régulées de manière positive ou négative. De plus l’émergence de la
spectrométrie de masse permet une identification plus rapide et plus sensible de ces protéines
régulées et qui a largement remplacé la méthode de dégradation d’Edman plus difficile à mettre
en place, plus longue et moins sensible.
La protéomique fonctionnelle consiste à étudier la fonction des protéines exprimées par un
génome. Le plus souvent, les protéines interagissent entre elles au sein de complexes dans
l'établissement d'une fonction. La fonction d'une protéine peut donc être élucidée via la fonction
de ses partenaires et constitue la protéomique des interactions. Ajouté à cela, la caractérisation
fine d'une protéine et de ses modifications post-traductionnelles (MPT) constitue le second enjeu
de la protéomique fonctionnelle.
III-1-A : Les interactions entre les protéines
De manière générale, pour exercer leurs fonctions biologiques, les protéines interagissent entre
elles au sein de complexes protéiques. Par exemple les protéines kinases interagissent avec leurs
substrats en formant un complexe aboutissant à la mise en place du groupement phosphate ou
encore certaines enzymes ne sont actives qu’au sein de complexes protéiques comme c’est le cas
des kinases CDKs. Ainsi la connaissance de la fonction des partenaires protéiques d’une molécule
peut aboutir à la compréhension de la fonction de cette dernière. C’est la protéomique des
interactions.
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Traditionnellement, les interactions protéiques étaient étudiées individuellement par
différentes techniques comme la méthode du « phage display », la chromatographie d’affinité, la
co-immunoprécipitation … (Phizicky and Fields, 1995). Depuis quelques années des techniques
ont été développées et adaptées pour identifier les interactions protéiques à grande échelle
(Drewes and Bouwmeester, 2003).
Aux côtés des méthodes de biologie moléculaire comme la technique du double-hybride
limitée aux interactions binaires et excluant les interactions liées à des modifications post-
traductionnelles (Fields and Song, 1989), il se développe des méthodes biochimiques d’analyse
des complexes purifiés couplés à la spectrométrie de masse. Nous pouvons citer par exemple le
système Tap-tag (Tandem Affinity Purification tag) (Rigaut et al., 1999), ou encore la technique BIA-
MS (Biomolecular Interaction Analysis – Mass Spectrometry) (Lopez et al., 2003).
III-1-B : La recherche de modifications post-traductionnelles
Au sein du deuxième volet de la protéomique fonctionnelle qui est l’étude de MPTs, un des
principaux enjeux est la caractérisation fine d’une protéine par l’intermédiaire de la mise en
évidence de ses modifications post-traductionnelles.
Les modifications post-traductionnelles (MPT) sont des événements covalents qui modifient
les propriétés physico-chimiques d’une protéine par un clivage protéolytique ou bien l’ajout de
groupements chimiques sur un ou plusieurs acides aminés. Loin d’être seulement des
“décorations”, la présence de MPT sur une protéine peut intervenir sur son activité, sa
localisation, sa stabilité, ainsi que sur ses interactions avec d’autres protéines. Par exemple dans le
phénomène de signalisation cellulaire, les cascades de protéines kinases sont activées ou
inactivées par un jeu réversible d’ajout ou de suppression de groupements phosphates (Cohen,
2000) ou bien, au cours du cycle cellulaire, l’ubiquitinylation marque les Cyclines pour induire leur
dégradation à des moments précis. Les principales modifications avec leurs fonctions sont
présentées dans le tableau 1 (Mann and Jensen, 2003).
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Type de MPT
∆ Masse (Da) Stabilité Fonctions et notes
Phosphorylations pTyr pSer, pThr
+80 +80
+++ +/++
Réversibles, activation/inactivation des enzymes, interactions moléculaires, stabilité, signalisation…
Acétylation
+42
+++
Stabilité, protection du N terminal, régulation des interactions protéines-ADN
Méthylation +14 +++ Régulation de l’expression des gènes
Stabilité protéique, blocage de l’extrémité N-terminale
Ubiquitinylation
>1000
+/++
Signal de dégradation
Nitratation des tyrosines +45 +/++ Oxydation / processus inflammatoire
Stabilité : + labile en spéctrométrie de masse en tandem, ++ modérement stable, +++ stable
Tableau 1 : Présentation des modifications post-traductionnelles les plus communes et importantes
Source : (Mann and Jensen, 2003)
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Malgré la grande importance des MPT dans les fonctions biologiques, de part leurs propriétés
intrinsèques (charge, masse, labilité, structure), leur étude à grande échelle a été entravée par leur
grande diversité (plus d’une centaine de MPT sont dénombrées à l’heure actuelle) et par un
manque de méthodes appropriées. Ces méthodes doivent en effet être choisies en fonction de la
modification recherchée. Cependant les récents développements en spectrométrie de masse
combinés avec l’émergence de méthodes d’enrichissement et d’extraction par affinité et les
techniques de séparations multidimensionnelles ont contribué à rendre particulièrement
attrayante la recherche globale des MPT en protéomique. Ces différentes approches sont très
bien décrites dans la littérature (Jensen, 2004; Mann and Jensen, 2003; Mann et al., 2002;
Schweppe et al., 2003). Nous présenterons succinctement dans ce chapitre, sans prétendre à
l’exhaustivité, les principales stratégies mises en œuvre pour la caractérisation des modifications
les plus importantes, autant du point de vue de leur fréquence que de leur rôle physiologique
(tableau 1).
Les stratégies développées diffèrent en fonction de la stabilité de la modification lors de
l’analyse MS.
L’étude des modifications stables est sans doute la plus simple à mettre en place, puisqu’une
analyse protéomique standard est suffisante pour mettre en évidence une différence de masse
caractéristique d’une modification spécifique. Néanmoins, certaines stratégies ont été décrites,
notamment pour l’étude des méthylations ou des acétylations. L’exemple, bien connu, de
l’acétylation et la désacétylation réversible des histones représente la conservation au cours de
l’évolution de modifications post-traductionnelles qui jouent un rôle important lors de la
régulation de la transcription, de la réparation de l’ADN et de la réplication (Hake et al., 2004).
D’autres modifications des histones ont été décrites comme les phosphorylations,
l’ubiquitinylation ou encore les méthylations. La méthylation des résidus arginines des histones
H3 et H4 conduit généralement à une activation de la transcription alors que la méthylation des
lysines engendre soit une activation soit une répression dépendante de l’état de méthylation
(Andersen and Mann, 2000; Santos-Rosa et al., 2002). Les approches de spectrométrie de masse
ont apporté de réels progrès pour la mise en évidence rapide et sensible des acétylations et des
méthylations. Ainsi la MS/MS permet la détection d’ions “signatures” dont les masses ont été
caractérisées et qui sont spécifiques de la modification permettant ainsi d’identifier
spécifiquement le type de modification (Brame et al., 2004; Gehrig et al., 2004). En effet, on peut
citer comme exemple l’arginine portant une double méthylation (N-diméthylarginine), caractérisée
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par la détection d’un ion diméthylammonium (m/z 46) et d’un ion diméthylcarodiimidium (m/z
71) en mode ESI-MS/MS (Brame et al., 2004).
Mais le caractère labile de certaines MPT conduisant à la perte du groupement chimique lors
de l’analyse MS/MS, a contribué au développement de nouvelles stratégies. C’est le cas de la
phosphorylation des résidus sérines et thréonines.
La phosphorylation est une des plus importantes et des plus abondantes modifications. En
effet, plus de 30% des protéines sont modifiées par l’attache covalente d’un groupement
phosphate (Hubbard and Cohen, 1993). Les plus communs et importants des sites de
phosphorylation chez les eucaryotes sont les résidus sérine, thréonine et tyrosine. Les résidus
sérine et thréonine sont plus fréquemment phosphorylés que les résidus tyrosine, avec un ratio de
(pS:pT:pT) 1800:200:1 dans une cellule de vertébré.
Les principales techniques utilisées pour la mise en évidence des phosphoprotéines sont
représentées dans le tableau 2 figurant dans la partie suivante de l’introduction générale (Cf. § III-
3) (Mann and Jensen, 2003). Traditionnellement, l’analyse des phosphorylations est étudiée à
l’aide d’un marquage métabolique avec du phosphore 32 (32P). La révélation par autoradiographie
des protéines ayant incorporées du 32P est la plus sensible et la plus spécifique. Cependant cette
technique est efficace lorsqu’elle est appliquée sur des échantillons de faible quantité ou pour
étudier des phosphorylations in vitro, mais le “radiomarquage” in vivo des protéines est limité à
l’étude des peptides monophophorylés et lourd à mettre en place (Boyle et al., 1991). L’utilisation
d’anticorps dirigés contre les acides aminés phosphorylés permet aussi de détecter spécifiquement
les phosphoprotéines à partir d’échantillon divers. Mais si les anticorps dirigés contre les
phosphotyrosines sont spécifiques, les anticorps dirigés contre les phosphosérines et les
phosphothréonines le sont beaucoup moins. L’utilisation de colorants fluorescents spécifiques
comme le ProQ diamond permet de mettre en évidence des phosphoprotéines sur les gels de
polyacrylamide (Laugesen et al., 2006). Cette technique présente l’avantage d’être simple et rapide
à mettre en place et permet la réalisation d’une analyse par spectrométrie de masse. Cependant
cette technique est peu sensible, les colorants sont onéreux et nécessitent l’emploi d’un matériel
lourd et coûteux pour la visualisation des spots et leur découpe en vue d’une analyse MS.
Avec la généralisation de l’utilisation de la spectrométrie de masse, d’autres approches ont
également été développées et feront l’objet d’une partie ultérieure de l’introduction générale (Cf. §
III-3).
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III-2 : Approches générales de la protéomique
Classiquement l’analyse protéomique se divise en deux grandes approches faisant appel à la
spectrométrie de masse : l’approche dite “hors-gel” moins commune mais qui subit un fort
développement, et l’approche “en gel” qui est la plus couramment utilisée (figure 16). Si l’approche
hors-gel subit un réel essor, c’est pour s’affranchir des limites liées à la séparation
électrophorétique des mélanges de protéines. Dans cette approche, l’hydrolyse enzymatique a lieu
en solution et le mélange peptidique peut être séparé par chromatographie liquide
multidimensionnelle (Kislinger et al., 2005). Cependant nous développerons plus particulièrement
l’approche “en gel” qui a été mise en œuvre au cours de notre projet. Cette approche repose sur
la séparation préalable des mélanges de protéines par des méthodes d’électrophorèse mono ou
bidimensionnelle. Les fragments de gel contenant les protéines d’intérêt sont alors découpés et
soumis à une hydrolyse enzymatique dans le gel. Les mélanges peptidiques obtenus après élution
du gel peuvent ensuite être analysés suivant deux stratégies distinctes : soit les mélanges
peptidiques sont analysés par cartographie peptidique massique, soit les mélanges peptidiques
sont analysés par LC-MS/MS qui permettra d’obtenir également des informations de séquence
(voir ci-dessous). Enfin l’identification et la caractérisation de la protéine est réalisée par
interrogation des banques de données à l’aide d’outils bioinformatiques.
Figure 16 : Approches générales de la protéomique
Deux approches principales se sont développées. Lors de l’approche “en gel” les protéines sont préalablement séparées par électrophorèse avant d’être hydrolysées dans le gel. La deuxième approche “hors gel” s’affranchit de l’étape d’électrophorèse et les protéines sont hydrolysées en solution. Les mélanges peptidiques obtenus sont ensuite analysés par spectrométrie de masse pour conduire à l’identification des protéines
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III-2-A : La séparation des protéines
Un défi important de la protéomique est de pouvoir séparer les protéines issues de complexes
ou de mélanges protéiques. Les protéines sont des molécules présentant des propriétés chimiques
très hétérogènes. Le point isoélectrique (pI) des protéines peut aller de moins de 3 à plus de 12.
Elles sont hydrophobes ou hydrophiles, et leur taille varie de quelques centaines à plusieurs
millions de Dalton. De plus chez les eucaryotes supérieurs, une large proportion de protéines est
modifiée (voir ci-dessus). Ces modifications sont souvent essentielles pour la fonction, la solubilité,
la stabilité et la localisation des protéines. Enfin les protéines présentent une forte variabilité de
concentration. La différence de concentration entre les protéines abondantes et rares dans un
fluide biologique peut dépasser 109 et 90 % de la masse d’un protéome est représentée par
seulement 10 % des protéines. La purification de ces objets biologiques qui présentent une telle
variabilité en termes de caractéristique chimique et de quantité est un défi important qui est
difficilement envisageable par une seule méthode. Un des défis est de pouvoir identifier les
protéines présentes en très faible quantité. Aujourd’hui, les principales méthodes de séparation
des protéines sont basées sur des approches chromatographiques et électrophorétiques.
III-2-A-a : L’électrophorèse sur gel
Dans de nombreux cas, l’électrophorèse sur gel est la méthode de choix pour séparer un
mélange de protéines simple : par exemple les protéines purifiées par immunoprécipitation,
affinité, GST-pull-down. La technique de SDS-PAGE (Sodium Dodécyl Sulfate- PolyAcrylamide
Electrophoresis) permet de séparer les protéines selon leur taille et leur poids moléculaire (Shapiro
et al., 1967). Le principe consiste à faire migrer les protéines dans un champ électrique en
fonction de leur charge vers l’électrode de charge opposée à travers un réseau de polymère
d’acrylamide plus ou moins réticulé. La présence de SDS permet de dénaturer les protéines en
rompant les liaisons non covalentes et d’introduire une densité de charge équivalente sur toute la
longueur de la protéine (Laemmli, 1970). L’utilisation de réseau d’acrylamide en gradient permet
aussi de séparer les protéines sur une plus grande plage de masse, mais sera moins résolutive.
Une approche particulière de l’électrophorèse sur gel est la focalisation isoélectrique (IEF).
Dans ce cas les protéines sont soumises à une électrophorèse dans un gel comprenant des
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ampholytes avec un gradient de pH connu. Au cours de cette étape les protéines soumises à un
champ électrique constant migrent dans le gel jusqu’à atteindre une valeur de pH égale à leur
point isoélectrique pour laquelle la charge globale de la protéine est nulle (Dossi et al., 1983).
C’est en 1975, que l’association de ces deux séparations permettra de séparer les protéines
selon deux paramètres indépendants et marquera ainsi la naissance de l’électrophorèse
bidimensionnelle (2D) (O'Farrell, 1975; Scheele, 1975). L’électrophorèse par gels 2D est
actuellement la méthode la plus résolutive de séparation d’un mélange complexe de protéines,
loin devant les approches chromatographiques. Il reste cependant des limitations à cette
technique qui sont majoritairement la faible détection des protéines peu abondantes, basiques ou
hydrophobes, en particulier pour les protéines membranaires, même si récemment des
chercheurs ont relevé ce défi et ont montré la séparation de protéines hydrophobes par gels 2D
(Luche et al., 2003).
La détection des protéines immobilisées dans des polymères d’acrylamide peut être réalisée par
plusieurs techniques. La première, la plus sensible, est l’utilisation de la radioactivité par
incorporation d’acides aminés radioactifs. C’est la seule méthode qui permet de visualiser les
protéines néo-synthétisées. La seconde méthode, qui et aussi la plus classique, est l’utilisation du
bleu de coomassie. Cette technique de coloration présente cependant deux principaux
inconvénients : une faible sensibilité et une gamme de linéarité faible (Neuhoff et al., 1988). La
troisième méthode est la coloration à l’argent qui présente une bonne sensibilité, mais une faible
linéarité et qui est moyennement compatible avec l’analyse par MS (Gharahdaghi et al., 1999;
Shevchenko et al., 1996). Enfin, la dernière méthode, la plus récente, est l’utilisation de la
fluorescence par couplage covalent de molécules fluorescentes (Unlu et al., 1997) ou l’utilisation
des complexes organométalliques fluorescents du type Sypro-Ruby (Berggren et al., 2000;
Rabilloud et al., 2001). Ces colorations fluorescentes sont très sensibles, présentent une très
grande gamme de linéarité et sont parfaitement compatibles avec la spectrométrie de masse. Ces
colorations sont à l’origine de nouvelles avancées dans les études comparatives par
électrophorèse 2D. Cependant, comme pour l’utilisation du ProQ diamond (voir plus haut, § III-1-
B) les colorants sont onéreux et nécessitent l’emploi d’un matériel lourd et couteux pour la
visualisation des spots et leur découpe en vue d’une analyse MS.
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III-2-A-b : La chromatographie
Toutes les méthodes de chromatographie peuvent constituer une étape de pré-fractionnement
lors d’une analyse protéomique. La chromatographie est une méthode qui est employée pour
diviser l’extrait protéique sans à priori et selon les critères physico-chimiques de la protéine
(charge, hydrophobicité, taille, affinité…) par l’utilisation de différentes phases. Ainsi la
chromatographie sur phase inverse sépare les analytes en fonction de leur hydrophobicité. La
phase mobile est en général constituée de solvants organiques (acétonitrile, méthanol) et est
acidifiée afin de maintenir les analytes sous forme chargée. L’utilisation de ce type de solvants
peut ainsi permettre un couplage direct avec la spectrométrie de masse. Par ailleurs, les fractions
obtenues peuvent être séparées par une autre chromatographie (c’est par exemple la
chromatographie multidimensionnelle (LC/LC) (Davis et al., 2001; Washburn et al., 2002)) ou
par électrophorèse bidimensionnelle (Butt et al., 2001).
Un grand nombre de combinaisons de chromatographies liquides ont été développées en
mode LC/LC (Shen and Smith, 2002). En règle générale la deuxième étape de LC est une phase
inverse afin de permettre un couplage direct avec la spectrométrie de masse, mais la première
étape peut être constituée par de multiples types de chromatographies liquides. L’avantage de ces
méthodes est d’éviter les inconvénients liés à l’électrophorèse bidimensionnelle. Elles sont plus
rapides à réaliser, présentent une meilleure reproductibilité et apparaissent plus facilement
automatisables.
III-2-B : L’identification et la caractérisation des protéines
L’identification des protéines a été réalisée dans le passé par des techniques comme la
composition en acides aminés ou le séquençage d’Edman. Depuis une dizaine d’année, la
spectrométrie de masse est devenue incontournable dans l’étude et la caractérisation des
macromolécules biologiques et en particulier dans l’étude des peptides et des protéines.
L’empreinte peptidique massique ou Peptide Mass Figerprint (PMF) a progressivement remplacé le
séquençage d’Edman pour l’identification des protéines. L’analyse en PMF consiste en la mesure
des masses du mélange peptidique obtenu par digestion enzymatique d’une protéine inconnue et
son identification rapide par des outils informatiques. A l’heure actuelle, avec les progrès réguliers
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effectués dans le développement des spectromètres de masse, l’identification et la caractérisation
des protéines se fait principalement par des approches de type LC-MS/MS.
III-2-B-a : Histoire et principe de la spectrométrie de masse
Un spectromètre de masse est un système composé de trois éléments. L’échantillon liquide,
solide ou gazeux est ionisé dans la première partie du spectromètre de masse appelée source. Une
source est couplée à au moins un analyseur qui est un système de triage des ions en fonctions de
leur rapport masse sur charge (m/z). Enfin, un détecteur complète le spectromètre de masse et
dénombre les ions séparés dans l’analyseur. Un système informatique est nécessaire pour collecter
toutes les informations et permettre le traitement du signal et la visualisation du spectre (figure 17).
La spectrométrie de masse est une technique ancienne que l’on peut associer au physicien
Joseph John Thomson (1856-1940) de l’université de Cambridge. Il recevra le prix Nobel de
physique en 1906. Des améliorations seront apportées par Francis W. Aaston (prix Nobel de
physique en 1922). La première analyse d’une molécule biologique date des années 1960. Mais
c’est dans les années 1980 que les applications biochimiques commenceront à apparaître. Peu de
temps après, de nouveaux progrès dans les méthodes d’ionisation comme l’électrospray (ESI)
Figure 17 : Principe de la spectrométrie de masse L’échantillon est ionisé au niveau de la source. Les ions générés sont triés dans l’analyseur en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z). Les ions séparés par l’analyseur sont alors dénombrés par le détecteur qui est couplé à un système informatique permettant le traitement du signal.
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développé dans le laboratoire de John Fenn (Fenn et al., 1989) et de désorption/ionisation laser
assisté par matrice (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation, MALDI) (Karas and Hillenkamp,
1988; Tanaka et al., 1998) permettront à la spectrométrie de masse des macromolécules
biologiques de franchir un nouveau cap. John Fenn et Koichi Tanaka ont été récompensés par le
prix Nobel de chimie en 2002. Parallèlement au développement de nouvelles sources d’ionisation,
des analyseurs permettant le tri des masses ont été développés. On peut citer les analyseurs à
temps de vol (Time Of Flight, TOF), à filtre quadripolaire (Q) ou à piège ionique (Ion Trap, IT).
Dans les années 1990, les appareils combinant des sources MALDI et des analyseurs à temps de
vol ou des sources ESI couplées à des analyseurs quadripolaires ont dominé les applications en
biologie. Les couplages MALDI-TOF ou ESI-Q sont bien adaptés, mais aujourd’hui de plus en
plus d’appareils hybrides combinant des sources avec différents analyseurs sont disponibles, on
peut citer par exemple : le Q-TOF, le Q-Trap ou encore le LTQ-Orbi-Trap.
III-2-B-b : MALDI-TOF MS
L’analyse en MALDI-TOF nécessite un appareil constitué d’une source MALDI associée à un
analyseur de type TOF. Depuis la description par Karas et Hillenkamp (Hillenkamp and Karas,
1990) de la technique de désorption/ionisation par laser assisté par matrice appelée MALDI, les
appareils basés sur cette technologie se sont répandus dans les laboratoires de spectrométrie de
masse ainsi que dans les laboratoires de biochimie. Cette technique est simple d’utilisation et est
appliquée à des peptides de quelques acides aminés, mais peut aussi être utilisée pour l’analyse de
protéines entières avec des molécules de plus de 150 kDa. L’ionisation MALDI utilise un faisceau
de laser pulsé pour désorber et ioniser un mélange d’échantillon co-cristallisé avec une matrice
sur une plaque métallique (Karas and Hillenkamp, 1988). La matrice absorbe l’énergie et
provoque l'amputation d’une partie de cette matrice qui est transformée en gaz entraînant des
molécules d’échantillon (figure 18). Un des avantages de l’ionisation MALDI est qu’elle présente
une relative tolérance vis-à-vis des tampons, des sels et de certains détergents. Les ions gazeux
obtenus sont alors accélérés vers l’analyseur par application d’un champ électrostatique.
L’ionisation sous l’effet de l’impact laser génère principalement des ions mono-chargés, ce qui
facilite l’analyse des spectres de masse obtenus en MALDI-TOF MS (Karas et al., 2000). Ce type
d’ionisation est couramment associé à un analyseur à temps de vol. Le TOF mesure le ratio m/z
d’un ion en déterminant le temps nécessaire pour que l’ion traverse le tube de vol. De plus, le
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couplage MALDI avec un analyseur TOF permet d’obtenir des spectres avec de bonnes
résolutions (>15000) et précisions de masse (<20ppm), ce qui aboutit a une grande spécificité de
recherche dans les banques de données.
Cependant il existe un phénomène de suppression de signal en mode MALDI-TOF (Kratzer
et al., 1998). Ce phénomène s’explique par la différence d’ionisation des peptides, liée à leur
composition en acides aminés. Ainsi dans un mélange peptidique complexe, les peptides
faiblement ionisés peuvent être masqués rendant l’identification des protéines par PMF
inefficace.
III-2-B-c : LC-ESI-MS
La deuxième approche qui joue un rôle primordial dans l’analyse des macromolécules
biologiques est la spectrométrie de masse en mode électrospray (Fenn et al., 1989) Le mécanisme
de l’ionisation par électrospray n’est pas encore parfaitement compris. Néanmoins, on peut
décrire le phénomène. Dans un premier temps, une solution d’échantillon est introduite dans un
capillaire qui est porté à un haut potentiel électrique. Ce champ électrique provoque la formation
Figure 18 : Principe de l’ionisation MALDI Une matrice est cocristallisée en présence d’analyte sur une plaque. L’énergie émise par le laser est absorbée par les molécules de matrice provoquant leur désorption entrainant aussi les molécules d’analyte. Les ions ainsi formés sont ensuite dirigés vers l’analyseur du spectromètre de masse (TOF généralement).
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d’un nuage de gouttelettes chargées qui se dirigent vers l’entrée du spectromètre de masse. Par
évaporation, ces gouttelettes vont porter une charge positive de plus en plus importante qui
provoquera une succession d’explosion coulombiennes pour aboutir à la fin du processus à des
ions moléculaires multichargés de type [M+nH]n+ ou n est le nombre de charges portées par la
molécule analysée de masse M (figure 19).
Les sources ont été peu à peu miniaturisées ce qui permet d’augmenter la sensibilité de
l’analyse LC-ESI-MS. À côté des sources ESI classiques, on trouve des sources microélectrospray
(microESI) (Emmett et al., 1995), nanoélectrospray (nanoESI) (Shevchenko et al., 1996) ou
picospray (picoESI) (Valaskovic et al., 1996). L’échantillon est simplement solubilisé dans un
solvant compatible avec l’électrospray comme un mélange méthanol-eau 1:1 (v/v) contenant 1%
(v/v) d’acide formique en mode positif ou en présence de NH4OH pour le mode négatif.
Cependant, contrairement au MALDI, les détergents et autres sels sont très mal tolérés par les
sources ESI. Les sources ESI peuvent être associées à des techniques séparatives comme la nano-
chromatographie en phase liquide (nanoLC). On parle alors de LC-ESI-MS ou encore de LC-
ESI-MS/MS ou LC/LC-ESI-MS/MS. Ce dernier indique la chromatographie bidimensionnelle
Figure 19 : Principe de l’ionisation par electrospray (ESI) Un échantillon est porté à haut potentiel électrique (3-6kV) lors de son passage à travers un capillaire métallique. Au cours de leur trajectoire, les gouttelettes sont désolvatées créant une accumulation de charges à leur surface. Lorsque la densité de la charge devient trop importante, les gouttelettes explosent pour former des espèces désolvatées et multichargées.
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couplée à la MS en tandem (§III-2-A-b et §III-2-B-d). La production d’ions multichargés permet
d’analyser des molécules de hautes masses avec des analyseurs de masse possédant une gamme
limitée. Les sources électrospray ont été très souvent couplées à des analyseurs de masse
quadripolaire, comme le quadripôle ou le piège ionique (Jonscher and Yates, 1997). Mais ces
sources sont de plus en plus fréquemment couplées à d’autres analyseurs comme le Q-TOF
(Chernushevich et al., 2001) ou le FT-ICR (McLafferty et al., 2001).
III-2-B-d : La spectrométrie de masse en tandem
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) combine au moins deux analyseurs
permettant d’étudier les informations structurales d’un échantillon. Le principe général est décrit
en figure 20. Les ions formés dans une source entrent dans un premier analyseur qui permet de
sélectionner l’ion que l’on souhaite fragmenter. Cet ion est appelé l’ion précurseur, il sera le seul à
sortir du premier analyseur et viendra entrer en collision avec des molécules de gaz neutres
placées dans une chambre de collision. La collision provoquera sa fragmentation en peptides plus
petits qui seront utilisés pour déduire la séquence en acide aminés. Les rapports m/z des
fragments sont triés par un second analyseur. La formation de ces ions suit des règles précises et
l’étude du spectre MS/MS obtenu donne des informations fiables sur la séquence de l’ion
précurseur. On peut observer des fragments N-terminaux obtenus en cassant une liaison
peptidique et en conservant la charge du côté N-terminal. Ils sont appelés les ions a, b, c. Les
fragments C-terminaux sont complémentaires des fragments N-terminaux, mais la charge est
localisée du côté C-terminal. Ils sont appelés les ions x, y, z. La nomenclature associe à ces
fragments un indice qui indique le nombre de résidus portés par l’ion fragment (figure 21)
(Biemann, 1990b). En protéomique, ce type d’expérience est notamment utilisé pour déterminer
la séquence d’un peptide, pour identifier des modifications post-traductionnelles ou la présence
de mutations.
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Figure 20 : Principe de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Les deux analyseurs MS1 et MS2 sont séparés par une cellule de collision. Les ions isolés dans le premier analyseur sont fragmentés dans la cellule de collision. Les ions fragments obtenus sont alors analysés dans le deuxième analyseur pour générer des spectres MS/MS
Figure 21 : Fragmentation préférentielle observée en mode MS/MS de peptide Illustration de la nomenclature des fragmentations d’après Biemann sur un tripeptide, les chaînes latérales sont notées R1, R2 et R3. La nomenclature de Biemann permet de classer les fragments générés (Biemann, 1990a). Après fragmentation la charge peut être retenue sur le fragment amino-terminal (ions a, b et c) ou bien sur le fragment carboxy-terminal (ions x, y et z). les ions fragments sont généralement caractérisés par un chiffre (y1, y2, y3…) traduisant le nombre de résidus portés par le fragment.
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III-2-C : Les stratégies mises en œuvre pour l’identification des protéines
L’identification des protéines en protéomique peut être effectuée par deux types d’approches
faisant appel à la spectrométrie de masse. La stratégie “Bottom-Up” qui consiste à analyser un
mélange peptidique issu d’une protéolyse enzymatique et la stratégie “Top-Down” qui permet
d’identifier une protéine par spectrométrie de masse sans passer par la protéolyse (figure 22)
(Bulavin et al., 2002; Reid et al., 2001; Sze et al., 2002). Nous développerons dans ce chapitre plus
particulièrement l’approche “Bottum-Up” qui est la plus classiquement utilisée et celle que nous
avons suivie lors la réalisation de notre projet.
La stratégie Bottum up est apparue en 1993, et est très bien décrite dans la littérature
(Aebersold and Goodlett, 2001; Mann et al., 2001). Elle consiste en l’identification, par
spectrométrie de masse MALDI-TOF ou LC-ESI-MS/MS, de peptides issus de l’hydrolyse
enzymatique de la protéine. La comparaison des données expérimentales avec les fragmentations
“théoriques” issues de l’hydrolyse virtuelle des protéines contenues dans les banques de données
permet ainsi d’identifier les candidats.
Figure 22 : Identification des protéines par la spectrométrie de masse L’identification des protéines par spectrométrie de masse peut être réalisée par l’analyse de protéines entières. Cependant l’approche la plus courante consiste à hydrolyser les protéines à l’aide d’une protéase (en générale la trypsine) et l’identification est réalisée à partir du mélange peptidique obtenu.
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III-2-C-a : La protéolyse
La trypsine est la protéase classiquement utilisée en protéomique. C’est une protéine de
23,5kDa qui a la capacité de pénétrer entre les mailles d’acrylamide, permettant de réaliser la
protéolyse des protéines candidates directement dans le gel d’acrylamide. Elle a la capacité de
cliver spécifiquement les protéines en carboxy-terminal de leurs résidus lysines et arginines. La
fréquence d’occurrence de ces résidus basiques permet de générer des peptides dont la taille
moyenne est d’environ 10 nucléotides ce qui correspond à un poids moléculaire de 1100Da, taille
idéale pour une analyse par spectrométrie de masse. Aussi les peptides générés par la trypsine ont
la particularité d’avoir un résidu basique en position carboxy-terminal, ce qui facilite l’ionisation
en mode positif et favorise la formation d’ions de la série y dans les expériences de fragmentation
en mode MS/MS. Cependant, des alternatives à l’hydrolyse par la trypsine ont été développées,
en particulier lors de la caractérisation fine d’une protéine (variant ou recherche de modifications
post-traductionnelles) qui passe par l’obtention d’une couverture de séquence le plus large
possible.
Ainsi l’endoprotéinase Lys-C clive spécifiquement en carboxy-terminal des lysines, mais
génère des peptides plus longs que ceux de la trypsine. L’endoprotéinase Asp-N clive
spécifiquement en amino-terminal des résidus asparagines et glutamines, mais génère des peptides
non chargés qui sont plus difficiles à ioniser. Enfin la chymotrypsine clive de manière peu
spécifique en carboxy-terminal des résidus tryptophanes, tyrosines, phénylalanines, leucines et
moins fréquemment les résidus méthionines et histidines. Le clivage chimique au bromure de
cyanogène, très spécifique des méthionines est une alternative à l’utilisation des endoprotéinases
mais génère des peptides plus longs.
III-2-C-b: Spectrométrie de masse en protéomique
Les peptides obtenus sont analysés par spectrométrie de masse et leur rapport m/z est mesuré.
Pour cela deux types d’approches sont possibles : soit la cartographie peptidique en mode
MALDI-TOF MS, soit la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem, le mode LC-ESI-MS/MS.
Le mode PMF consiste à mesurer le rapport m/z des peptides en mélange (voir ci-dessus, §III-2-
B-b). Cette technique présente l’avantage d’être simple, rapide d’utilisation et facilement
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automatisable. Cependant l’analyse en mode MALDI est limitée par les phénomènes de
suppression ce qui conduit à un risque de perte d’information.
Le mode ESI-MS/MS, de son côté, en couplage avec une chromatographie liquide permet de
séparer les peptides dans le temps et donc de minimiser le phénomène de suppression.
L’avantage majeur de cette approche réside dans la possibilité de réaliser des expériences de
fragmentation en mode MS/MS et d’atteindre ainsi une très grande spécificité lors de
l’interrogation dans les banques de données. Cependant cette technique est plus longue à mettre
en œuvre principalement à cause de la durée de la chromatographie. C’est pourquoi la stratégie
LC-MS/MS n’est réalisée que lorsque la cartographie peptidique massique n’est pas suffisante
pour l’identification ou la caractérisation de la protéine. Cette technique est également bien
adaptée à l’analyse de mélange complexe de protéines, de protéines de faible abondance et de
petites protéines.
III-2-C-c : L’interrogation dans les banques de données
Les banques de données sont des collections de fichiers regroupant les séquences des
protéines connues avec des annotations sur leurs fonctions, leurs modifications post-
traductionnelles connues ou encore les variants connus des différentes protéines. Les banques
contenant des informations non redondantes les plus complètes sont SWISSPROT et Protein
Information Ressource (PIB). Parmi les autres banques de données ont peut citer la Protéine
Data Bank qui est une banque de structure protéique, TrEMBL qui correspond à la traduction de
la banque génomique EMBL, déductions faites des entrées de SWISSPROT et GenePept, la
traduction de GenBank gérée par le National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Enfin la banque protéique du NCBI a été compilée à partir de sources multiples incluant
SWISSPROT, PIR, PDB et la traduction de régions codantes dans GenBank.
Les outils bio-informatiques sont donc essentiels dans les sciences protéomiques. L’apparition
d’internet a permis de partager l’information à une vitesse impensable quelques années
auparavant. Le serveur ExPASy a permis dès 1993 d’interroger la banque de données
SWISSPROT. Ainsi, ces bouleversements informatiques ont permis de développer une multitude
d’outils bio-informatiques, en particulier des algorithmes permettant d’identifier des protéines à
partir des résultats obtenus par spectrométrie de masse par l’intermédiaire de l’interrogation des
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banques de données. Il faut citer par exemple pour l’analyse des cartographies peptidiques
massiques les sites de Protein Prospector (Clauser et al., 1999) ProFound (Zhang and Chait,
2000), Mascot (Perkins et al., 1999), Phenix et Sequest (Klimek et al., 2007). Outre la masse
expérimentale des peptides trypsiques plusieurs paramètres sont pris en compte dans les
algorithmes de recherche dans les banques de données. Nous pouvons citer par exemple l’origine
de la protéine, ses propriétés physiques et la nature de la protéase utilisée qui peuvent permettre
de restreindre la recherche. Mais encore la prise en compte de la présence de modifications post-
traductionnelles sur la protéine. Bien que sensiblement différente, l’interrogation en banques de
données à partir des données de MS/MS fait intervenir les mêmes éléments. Enfin des
algorithmes de séquençage de Novo de plus en plus performants sont disponibles et permettent
d’identifier une séquence à partir de spectres MS/MS qui n’ont pas été interprétés. Par exemple,
les logiciels PEAKS (Anderson et al., 2003), MassLynx de Micromass et Biotools de Bruker.
III-3 : Analyse protéomique pour l’étude des phosphorylations
Comme nous l’avons vu dans les parties précédentes de l’introduction générale, les
phosphorylations sont des évènements majeurs intervenant dans la régulation de l’activité, de la
localisation ou de la stabilité des protéines. L’identification et la caractérisation précise des
évènements de phosphorylation régulant une protéine sont des éléments déterminants pour la
compréhension de la fonction biologique liée à cette molécule. Le caractère transitoire de la
phosphorylation et la faible proportion des protéines phosphorylées par rapport aux protéines
non phosphorylées rendent leur étude très difficile. L’étude des phosphorylations est donc
devenue un défi majeur de la protéomique et de nombreuses approches ont été développées
(figure 23).
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III-3-A : Détection des phosphopeptides
L’étude des phosphorylations par spectrométrie de masse suit, le plus généralement, une
stratégie de type Bottum up (voir ci-dessus). Ainsi les mélanges protéiques ou les protéines purifiées
pour lesquelles les phosphorylations sont recherchées sont préalablement hydrolysées. La
trypsine est la protéase classiquement utilisée. Le mélange peptidique obtenu est ensuite soumis à
une analyse par spectrométrie de masse.
Les phosphopeptides sont détectés par l’augmentation de masse caractéristique du
groupement phosphate (HPO3), qui correspond à +80Da pour une espèce monophosphorylée.
La différence de masse de -80Da consécutive à un traitement phosphatase facilite aussi
l’identification des phosphopeptides.
Figure 23 : Approches protéomiques utilisées pour l’analyse des phosphopeptides Voici un aperçu des techniques développées par la protéomique pour l’enrichissement et l’analyse des protéines ou des peptides phosphorylés.
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Les peptides phosphorylés peuvent également être mis en évidence en utilisant le mode
“balayage de perte de neutre” lors d’une analyse ESI-MS/MS (Jaffe et al., 1998). Cette méthode
se sert de la fragmentation pour induire la perte du groupement neutre H3PO4 des phospho-
sérines ou des phospho-thréonines. Seuls les ions présentant une perte de masse de 98Da sont
sélectionnés pour être séquencés. Cependant les résidus phospho-tyrosines ne peuvent pas être
identifiés en mode de balayage par perte de neutre, à cause de la meilleure stabilité du
groupement phosphate sur ce résidu.
Le balayage des ions précurseurs ou “precursor ion scan” est aussi utilisé en spectrométrie de
masse en tandem en mode négatif pour identifier les phosphopeptides (Carr et al., 1996; Wilm et
al., 1996). Chaque ion parent libérant des ions négatifs à m/z=79 après la fragmentation est
sélectionné et analysé par MS/MS après un retour en mode positif. Le mode “precursor ion
scan” peut aussi être utilisé en mode positif pour identifier l’ion immonium caractéristique des
résidus phospho-tyrosines (m/z 216,04) (Mann et al., 2002).
III-3-B : Détermination des sites de phosphorylation par MS/MS.
Une fois le peptide phosphorylé identifié, il est possible de déterminer la position exacte de la
phosphorylation par MS/MS. Le phosphopeptide est sélectionné dans le premier analyseur du
spectromètre de masse et fragmenté. Les informations de séquences obtenues lors de la
fragmentation permettent de remonter la séquence du peptide. La phosphorylation est visible sur
le spectre de masse par un écart de masse de 80 ou de 98Da. Pour l’analyse de mélanges
complexes, il est nécessaire de procéder à une première séparation des peptides sur phase reverse
par HPLC.
III-3-C : Méthode d’enrichissement
Bien que les phosphopeptides puissent être identifiés à des niveaux de l’ordre de la
femtomole, l’identification du résidu modifié reste un challenge dû au niveau d’abondance
beaucoup plus faible du peptide phosphorylé par rapport au peptide non phosphorylé dans un
mélange de digestion peptidique. La grande sélectivité de la perte de neutre ou du “precursor ion
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scan” permet l’identification de phosphopeptides dans des mélanges complexes, cependant ces
approches nécessitent de très grandes quantités de matériel (de l’ordre de la micromole).
Ainsi d’autres approches ont été développées dont le but est d’enrichir le mélange peptidiques
en phosphopeptides. Cet enrichissement peut être réalisé par chromatographie d’affinité utilisant
des ions métalliques immobilisés (IMAC) sur une colonne d’acide imino-diacétique (IDA) ou
d’acide nitrilo-acétique (NTA). De nombreux ions métalliques peuvent être utilisés (fer, cuivre,
zinc, gallium…) et donnent des résultats différents qui sont parfois complémentaires (Posewitz
and Tempst, 1999). Mais la limite de cette chromatographie IMAC réside dans son manque de
spécificité puisque les peptides acides sont eux aussi fréquemment retenus. Néamoins la méthyl-
estérification préalable des groupements carboxyliques permet de réduire grandement le
phénomène de fixation non spécifique (Zheng et al., 2005). En revanche, il n’est pas exclu que
certains peptides phosphorylés ne soient pas retenus. Plus récemment les colonnes TiO2 ont
également été introduites pour l’enrichissement des phosphopeptides avant l’analyse par
spectrométrie de masse et semblent être prometteuses pour l’étude de la phosphoprotéomique
fonctionnelle (Pinkse et al., 2004). Les peptides phosphorylés sont séparés des peptides non
phosphorylés en étant retenus sur la colonne de TiO2 en condition acide.
Tableau 2 : Présentation des approches utilisées pour l’analyse des phosphopeptides
Source : (Mann and Jensen, 2003)
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RESULTATS
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Projet de thèse
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Projet de thèse
A- Situation du projet
Mes travaux de thèse, présentés ici, ont été réalisés dans le cadre d’une convention cifre
(Convention Industrielle de Formation par la Recherche) et sont le résultat d’une collaboration entre un
laboratoire industriel (l’Institut de Recherche SERVIER) et un laboratoire académique (le
LBCMCP).
Nous avons vu tout au long de l’introduction générale l’importance des modifications post-
traductionnelles et en particulier des phosphorylations dans les mécanismes de contrôle et de
régulation du cycle cellulaire. De plus, avec l’émergence de la recherche de nouvelles stratégies
pour la lutte contre le cancer, des stratégies utilisant des inhibiteurs des kinases Chk en
association avec un traitement génotoxique se développent dans le but de pousser les cellules
cancéreuses vers une mitose catastrophique les conduisant ainsi à la mort cellulaire.
La réalisation de ce projet de thèse s’est donc déroulée autour d’un objectif commun entre ces
deux laboratoires qui était d’étudier dans ce contexte la régulation de la phosphatase Cdc25C, lors
de la progression dans le cycle cellulaire ou à la suite de l’activation du point de contrôle G2/M, à
travers l’analyse de ses modifications post-traductionnelles.
Figure 24 : Présentation du projet
Projet de thèse
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Ainsi, les intérêts dégagés par la réalisation de ces travaux étaient doubles : (i) au sein de la
recherche académique la caractérisation fonctionnelle de ces modifications post-traductionnelles
permettra de comprendre les mécanismes impliqués et de proposer un modèle de régulation et
(ii) dans le cadre de la recherche en industrie pharmaceutique l’identification des enzymes
régulatrices responsables de ces modifications post-traductionnelles pourrait être à l’origine de la
mise en évidence de nouvelles cibles pharmacologiques (figure 24).
B- Présentation des travaux de thèses
La réalisation de ce projet s’est déroulée autour de trois thèmes principaux :
- Tout d’abord la mise au point de conditions de purification de Cdc25C compatibles avec
la spectrométrie de masse, d’un contrôle de la progression dans le cycle cellulaire et de
l’activation du point de contrôle G2/M.
- Ensuite l’identification et la caractérisation des modifications post-traductionnelles de
Cdc25C par spectrométrie de masse proprement dites.
- Et enfin l’analyse fonctionnelle des modifications post-traductionnelles mises en évidence,
ainsi que la caractérisation des enzymes régulatrices impliquées dans ces mécanismes.
Pour cela, le choix de la stratégie de purification, qui était le point de départ de notre projet,
était essentiel pour mener à bien la suite de ces travaux. Ainsi je décrirai dans un premier temps le
cheminement qui nous a conduit à choisir une stratégie de purification. Puis je présenterai le
principe de l’analyse protéomique globale que nous avons mis en place et qui nous a permis de
mettre en évidence de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la phosphatase Cdc25C,
en particulier la présence d’une phosphorylation sur le résidu sérine 168 et d’une phosphorylation
sur le résidu sérine 263. Enfin, avant de conclure ce mémoire de thèse sur une discussion
générale, la troisième partie de cette étude sera consacrée à la description des résultats
préliminaires que nous avons obtenus lors de la caractérisation de ces phosphorylations.
Résultats
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I- Construction des outils
La réalisation de ce projet a nécessité la génération d’outils biologiques permettant l’étude
pharmacologique de la phosphatase Cdc25C lors de l’activation du point de contrôle en phase G2
du cycle cellulaire tout en étant compatible avec une analyse protéomique de recherche de
modifications post-traductionnelles. Afin d’éviter les problèmes liés à la surexpression de
Cdc25C, nous avons choisi de construire une lignée cellulaire exprimant la phosphatase de façon
conditionnelle.
De nombreux systèmes inductibles permettant une expression régulée du gène d’intérêt dans
les cellules de mammifères ont été développés et la plupart d’entre eux reposent sur l’utilisation
de métaux lourds, d’hormones stéroïdes ou encore de chocs thermiques. Cependant la limite de
tels systèmes provient du fait que ces inducteurs peuvent générer des effets pléiotropiques (chocs
thermiques, glucocorticoïdes…). Ainsi d’autres systèmes d’expression inductible de gènes, qui
reposent sur des systèmes de régulation procaryotes adaptés aux cellules de mammifères, ont été
développés [le système Tet (tétracycline), le système RheoSwitch, le système Q-Mate…]. Parmi
toutes ces techniques, ce sont les systèmes inductibles Tet qui ont été le mieux décrit. Deux
versions ont été développées : le système Tet-on qui permet l’expression du gène d’intérêt en
présence de tétracycline (ou de doxycycline) et le système Tet-off en absence de tétracycline (voir
ci-après). Le système Tet-off est cependant mieux régulé que le système Tet-on, il a en effet été
décrit des fuites d’expression du gène d’intérêt en absence de tétracycline dans ce dernier. C’est
pourquoi nous avons choisi d’utiliser le système d’expression inductible Tet-off pour induire
l’expression de Cdc25C dans les cellules humaines.
D’autre part, pour faciliter la sélection des clones et la purification de Cdc25C, une étiquette
HA (hemagglutinin du virus Influenza A) en N-terminal et une queue poly-Histidine (His) en C-
terminal ont été ajoutés à la séquence de la phosphatase Cdc25C (HA-Cdc25C-His).
Afin de mieux comprendre ces choix, je décrirai tout d’abord les particularités de notre lignée
cellulaire et la stratégie de purification, puis je présenterai la construction, la validation et la
purification de notre modèle proprement dit.
Résultats
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I-1 : Description de la lignée cellulaire
Les U2OS sont des cellules épithéliales adhérentes issues d’un ostéosarcome humain. La lignée
cellulaire U2OS t-TA dérive de la lignée cellulaire U2OS parentale et permet l’expression
conditionnelle d’une protéine d’intérêt sous le contrôle du système inductible Tet-off (Theis-
Febvre et al., 2003; Triezenberg et al., 1988). Le système Tet off dérive du mécanisme de
régulation chez Escherichia coli de l’opéron résistance à la tétracycline (opéron Tet). Brièvement, chez
la bactérie la protéine Tet répresseur (TetR) régule négativement les gènes de l’opéron Tet sur le
transposon Tn10. Ainsi, en absence de tétracycline, TetR bloque la transcription de ces gènes en
se liant sur les séquences tet opérateur (tetO). Dans le système inductible Tet-off adaptés aux
eucaryotes, la protéine TetR est fusionnée avec le domaine d’activation VP16 (Virion protéine 16)
du virus Herpes simplex (Triezenberg et al., 1988). La protéine hybride qui en résulte, le
transactivateur contrôlé par la tétracycline (t-TA), devient alors “activateur” de transcription.
Cette protéine t-TA est exprimée de manière constitutive dans la lignée cellulaire U2OS-t-TA
(Baldin et al., 2003). Le deuxième élément du système Tet-off repose sur le plasmide “réponse”
(pUHD10) qui exprime un gène d’intérêt sous le contrôle de l’élément de réponse à la tétracycline
(TRE) (figure 25). Le TRE est constitué de sept éléments répétés d’une séquence de 42 paires de
bases contenant le tetO et localisé juste en amont du promoteur minimal du cytomégalovirus
(CMV), auquel il manque l’enhancer fort qui lui est traditionnellement associé. Cette dernière
particularité permet d’empêcher la fuite de l’expression du gène d’intérêt en absence de la liaison
avec TetR. Le principe du système Tet off consiste ensuite à créer une lignée cellulaire stable avec
le plasmide « réponse ». Les cellules exprimeront alors le gène d’intérêt par la liaison de t-TA sur
le TRE en absence de tétracycline dans le milieu de culture (Gossen and Bujard, 1992) (figure 25).
Figure 25 : Le système Tet off
La tétracycline empêche la liaison de t-TA sur le domaine TRE du promoteur PminCMV et bloque la transcription du gène d’intérêt. En absence de tétracycline la protéine de fusion se lie au domaine TRE et permet l’activation de la transcription du gène d’intérêt.
Résultats
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I-2 : Description de la stratégie de purification
Comme nous l’avons vu au cours de l’introduction générale, la protéomique nécessite des
conditions de purification et de préparation de l’échantillon spécifiques afin de ne pas perturber
l’ionisation des peptides. Notre étude reposant sur la recherche de nouvelles modifications post-
traductionnelles sur la séquence de la phosphatase Cdc25C, il était important de mettre au point
une stratégie de purification de la phosphatase adaptée à la recherche de modifications post-
traductionnelles par spectrométrie de masse. L’enjeu de cette purification est de conserver le
maximum de modifications sur la séquence de Cdc25C tout en respectant les conditions de faible
salinité et de basses forces ioniques requises pour la spectrométrie de masse.
Une stratégie de purification a été mise au point au laboratoire avec succès par le Docteur
Jean-Pierre Bouché pour l’étude par spectrométrie de masse de la phosphatase Cdc25B3
(manuscrit en préparation). Nous avons choisi de l’appliquer à notre modèle. Cette stratégie, en deux
étapes, repose dans un premier temps sur une purification par affinité sur une matrice de nickel-
nitrilotriacétique (Ni-NTA) dans des conditions très dénaturantes. La protéine est retenue par
son étiquette poly-histidine dans un tampon contenant de l’urée à très forte concentration et est
éluée par de l’imidazole. Ensuite, après une brève étape de renaturation (Baynes et al., 2005;
Tsumoto et al., 2004) (Cf. Matériels et méthodes) la protéine, ayant retrouvé sa forme native, est alors
immuno-précipitée sur des billes couplées à un anticorps anti-HA et éluée par du tampon de
charge (Laemmli) puis directement déposée sur un gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophresis) (figure 34a).
C’est donc le choix de cette stratégie de purification qui nous a conduit à ajouter les étiquettes
HA et His en N- et C-terminal de la protéine respectivement avant de cloner la phosphatase
Cdc25C dans le plasmide pUHD10.
I-3 : Construction et clonage de la phosphatase Cdc25C
I-3-A : Construction du plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His
Cdc25C avait préalablement été clonée dans un plasmide d’expression spécifique des cellules
humaines avec une étiquette HA en position amino-terminale : le plasmide pCDNA3 ::HA-
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Cdc25C. Sur ce plasmide nous avons ajouté une séquence streptomycine-6-histidines (His) par
synthèse d’un oligonucléotide inséré entre les sites de restriction BspI et pflMI en C-terminal de
Cdc25C. L’étiquette streptomycine avait été clonée à l’origine en aval de la séquence de Cdc25B3
afin de réaliser une première étape de purification par affinité avec des billes d’avidine. Cependant
cette étape n’avait pas permis la purification de Cdc25B3 pour des raisons inconnues et la
séquence 6-histidines avait été ajoutée à la suite de l’étiquette streptomycine. Cette construction
s’est révélée efficace. Présumant que la présence de l’étiquette streptomycine en amont de
l’étiquette poly-histidine pouvait jouer un rôle sur la conformation carboxi-terminale de Cdc25B3
et favoriser sa purification sur une matrice Ni-NTA, nous avons choisi d’utiliser la même
construction néanmoins nous ne mentionneront plus l’étiquette streptomycine durant le reste de
cette étude.
Le plasmide nouvellement construit a été nommé pCDN3 ::HA-Cdc25C-His. La suite de cette
construction consistait à cloner Cdc25C étiquetée dans le plasmide pUHD10. Afin d’optimiser la
construction et d’obtenir une bonne expression de Cdc25C, nous avons tout d’abord ajouté une
Figure 26 : Construction de pUHD10 HA-Cdc25C-His
La fraction 1 a été purifiée après une hydrolyse enzymatique du pcDNA3 HA-Cdc25C-His par les enzymes de restriction Not1 et EcoR1. La fraction 2 a été purifiée après une hydrolyse enzymatique du pcDNA3 HA-Cdc25C-His par les enzymes de restriction EcoR1 et Xba1. La cassette HA-Cdc25C-His a été cloné dans le plasmide pUHD10HA entre les sites Not1 et Xba1 par ligation ternaire des fractions 1 et 2.
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séquence consensus de Kozak CCACCATG par mutagenèse dirigée en aval du promoteur
minimal PminCMV du pUHD10. La cassette HA-Cdc25C-His a été sortie du plasmide
pCDNA3 ::HA-Cdc25C-His grâce à deux hydrolyses enzymatiques successives avec les enzymes
de restriction NotI et EcoRI, puis EcoRI et XbaI. Enfin, nous avons cloné la cassette HA-
Cdc25C-His par ligation ternaire entre les sites NotI (présent dans l’étiquette HA) et XbaI (site de
clonage multiple du pUHD10) dans le pUHD10. Ce dernier plasmide a été nommé
pUHD10 ::HA-Cdc25C-His (figure 26). La sélection des clones a été réalisée par hydrolyse
enzymatique puis séquençage. Le plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His nouvellement obtenu a
été transfecté de manière stable dans les U2OS-t-TA dans le système Tet off.
La construction de cette lignée cellulaire conditionnelle était une étape clé dans le
développement de ce projet. Il était donc important de s’assurer de la validité de cet outil.
I-3-B : Validation de la construction de HA-Cdc25C-His dans les U2OS
Les cellules U2OS t-TA ont été co-transfectées par le plasmide d’intérêt pUHD10 ::HA-
Cdc25C-His et le pREP ::Hygro en présence de Lipofectin Plus Reagent (Cf. Matériels et méthodes).
Le plasmide pREP ::Hygro confère aux cellules un gène de résistance eucaryote à l’hygromycine
et a été utilisé ici comme pression de sélection. La sélection des clones a été réalisée en présence
de 300µg/ml d’hygromycine, 100µg/ml de G418 (pression de sélection pour la lignée U2OS t-
TA) et 2µg/ml de tétracycline dans le milieu de culture. Vingt-deux clones ont été sélectionnés
par immunofluorescence (IF) et par western blot (WB) avec des anticorps dirigés contre
l’étiquette HA de la protéine après 20h d’induction par retrait de la tétracycline du milieu de
culture. Les trois clones U2OS C4, C9 et C16, présentés figure 27a montrent un exemple des
différents profils d’expression obtenus pour chacun des cas testés. L’analyse par WB anti-HA met
en évidence une bande contaminante classiquement décrite avec l’anticorps anti-HA (Roche) à
65kDa signalée par une étoile. Nous pouvons observer une deuxième bande inférieure
correspondant à la taille attendue de HA-Cdc25C-His (60kDa), la comparaison de ces trois clones
par rapport à la bande contaminante de l’anticorps anti-HA nous indique que le clone C9
n’exprime pas la phosphatase, les clones C4 et C16 expriment correctement la phosphatase HA-
Cdc25C-His, cependant le clone C16 présente le meilleur niveau d’expression de la phosphatase.
Afin de s’assurer de l’homogénéité du clone et de sa stabilité au fur et à mesure des passages, un
sous clonage par dilutions limites du clone U2OS C16 a été réalisé. Les “sous clones” ont été
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sélectionnés de la même manière par immuno-détection à l’aide d’un anticorps anti-HA et le
clone U2OS C16-5 a été retenu pour la suite des travaux. La figure 27b représente une expérience
d’immunofluorescence avec l’anticorps anti-HA sur le clone U2OS C16-5 induit pendant 20h par
retrait de la tétracycline. Nous pouvons observer une répartition de Cdc25C cytoplasmique avec
un marquage plus intense autour de la membrane nucléaire. Les cellules en mitose sont aussi
détectées avec une plus forte intensité dans toute la cellule. HA-Cdc25C-His est donc
correctement exprimé dans les cellules U2OS C16-5 avec la localisation intracellulaire attendue
(Cf. Introduction générale §I-3-B-b).
Dans le but de valider la construction de cette lignée cellulaire dans le système Tet-off, nous
nous sommes assurés dans un premier temps que le système était bien régulé et bloquait toute
expression de la phosphatase en absence d’induction. Le western blot anti-Cdc25C présenté
figure 28 montre qu’en absence de tétracycline dans le milieu de culture c'est-à-dire en présence
d’induction on peut observer une bande présentant un retard de migration par rapport à Cdc25C
endogène qui correspond à la taille attendue de HA-Cdc25C-His. Cette analyse confirme que la
Figure 27 : Validation de la lignée cellulaire
conditionnelle exprimant HA-Cdc25C-His
A. WB anti-HA. 3 clones issus de la transfection stable des cellules U2OS t-TA avec le plasmide pUHD10 HA-Cdc25C-His ont été analysés par WB après 20h d’induction par retrait de la tétracycline. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée à l’aide d’un anticorps anti-HA (Roche). * correspond à une bande non spécifique de l’anticorps anti-HA. B. IF anti-HA. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée par marquage avec un anticorps anti-HA dans les cellules U2OS C16-5 après 20h d’induction par retrait de la tétracycline.
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phosphatase HA-Cdc25C-His s’exprime bien à la taille attendue après induction des cellules par
retrait de la tétracycline et qu’il n’y a pas d’expression de HA-Cdc25C-His lorsque les cellules
sont cultivées en absence d’induction (-Tet). Nous avons ensuite cherché à caractériser quel était
le temps d’induction correspondant au meilleur niveau d’expression de la phosphatase. Pour cela
nous avons réalisé des cinétiques d’induction pour l’expression de HA-Cdc25C-His (figure 28a).
Nous pouvons observer que HA-Cdc25C-His est exprimée dans les cellules après le retrait de la
tétracycline dès 16h, son expression est maximale entre 20h et 24h et enfin à partir de 36h, il y a
une diminution de la quantité de HA-Cdc25C-His. L’induction de l’expression de la phosphatase
dans les cellules est donc assez précoce, mais atteint son maximum entre 20h et 24h d’induction.
Enfin pour vérifier que l’expression de Cdc25C ne perturbait pas la progression des cellules
U2OS C16-5 dans le cycle cellulaire, des expériences d’analyses du cycle cellulaire par cytométrie
en flux ont été réalisées (figure 28b). La répartition dans le cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5
est identique en présence ou en absence de tétracycline. Ainsi l’expression de HA-Cdc25C-His
n’a pas d’effet sur la progression du cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5.
Figure 28 : Caractérisation de la lignée cellulaire conditionnelle exprimant HA-Cdc25C-His
A. WB anti-HA Les cellules U2OS C16-5 ont été cultivées pendant 16h, 20h, 24h et 36h après le retrait de la tétracycline du milieu de culture. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée avec un anticorps anti-HA. B. WB anti-Cdc25C. Les cellules U2OS C16-5 ont été cultivées pendant 24h en présence ou en absence de tétracycline. La phosphatase Cdc25C est détéctée avec un anticorps anti-Cdc25C et la bande inférieure correspond à Cdc25C endogène et la bande supérieure à HA-Cdc25C-His. C. Analyse du cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5 par cytométrie en flux après 24h d’induction.
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I-4 : Activation du point de contrôle en G2/M
Pour la suite de ce projet il était important de mette en place des conditions d’activation
contrôlées du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire. En effet le but premier de ce projet
était l’analyse de la régulation de la phosphatase Cdc25C plus particulièrement lors de l’activation
du point de contrôle G2/M.
Dans ce but nous avons tout d’abord analysé la répartition des cellules U2OS C16-5,
exprimant la phosphatase HA-Cdc25C-His, dans le cycle cellulaire en réponse à différents
traitements génotoxiques afin de mettre au point une stratégie d’activation spécifique de ce point
de contrôle. Pour cela les cellules U2OS ont été traitées avec trois traitements génotoxiques
présentant chacun un mode d’action différent : l’étoposide (inhibiteur de la topo-isomérase II), la
bléomycine (radiomimétique qui créé des cassures doubles brins sur l’ADN) et la gemcitabine
(inhibiteur de la réplication). La répartition des cellules dans le cycle cellulaire a ensuite été analysé
24h après chaque traitement et est présentée figure 29. A la suite du traitement étoposide 81%
des cellules sont en phase G2/M du cycle cellulaire. En revanche après le traitement par la
bléomycine seulement 45% des cellules sont en phase G2/M après un traitement continu de 24h.
Enfin le traitement gemcitabine conduit à une répartition des cellules majoritairement en phase S
du cycle cellulaire (56%). D’après ces résultats seul le traitement étoposide induit une activation
spécifique du point de contrôle G2/M. En effet le traitement gemcitabine induit une
synchronisation des cellules en phases S et dans le cas du traitement bléomycine, le fait qu’il y ait
encore 38% des cellules en phase G1 après 24h de traitement nous permet de conclure que ce
traitement n’induit qu’une activation partielle du point de contrôle en G2 dans ces conditions.
Nous nous sommes ensuite demandés quel était l’effet de l’expression de HA-Cdc25C-His
dans les cellules U2OS C16-5 après l’activation du point de contrôle G2/M par l’étopside.
Les cellules U2OS C16-5 non induites ont été traitées pendant 1h par l’étoposide puis les
cellules ont été relâchées en présence ou en absence de tétracycline pendant 24h et la répartition
des cellules dans le cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux (figure 30a). Comme le
montre la figure 30b, 81% des cellules non induites sont en phase G2/M du cycle cellulaire 24h
après le traitement et 87% des cellules induites pour l’expression de la phosphatase HA-Cdc25C-
His. Ainsi l’expression de HA-Cdc25C-His dans les cellules U2OS C16-5 n’a pas d’effet sur la
répartition des cellules dans le cycle cellulaire et sur l’activation du point de contrôle G2/M du
cycle cellulaire.
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Figure 29 : Effet des agents génotoxiques
Les cellules ont été traitées 1h 40µM étoposide puis relâchée pendant 24h ou continuellement avec 50mM de gemcitabine et 7,5µM de bléomycine et analysées par cytométrie en flux 24h post-traitement à l’aide d’un marquage des noyaux à l’iodure de propidium (IP).
Figure 30 : Activation du point de contrôle G2/M
Pour activer le point de contrôle G2/M, les cellules ont été traitées 1h avec 40µM étoposide et le cycle cellulaire a été analysé 24h après le traitement par cytométrie en flux à l’aide d’un marquage des noyaux à l’iodure de propidium (IP). L’expression de HA-Cdc25C-His a été induite par élimination de la tétracycline (Tet).
A
B
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Pour aller plus loin, nous avons cherché à vérifier que l’activation spécifique du point de
contrôle G2/M était stable au cours du temps et que la surexpression de Cdc25C n’entrainait pas
une entrée prématurée des cellules en mitose. Pour cela des cellules U2OS C16-5 ont été traitées
par de l’étoposide puis induites pour l’expression de HA-Cdc25C-His et la répartition des cellules
dans le cycle cellulaire a été déterminée par cytométrie en flux suivant différents temps de
relâchement du traitement étoposide. Les résultats présentés figure 31 montrent, 38h post-
traitement, que 79% des cellules sont en phase G2/M du cycle cellulaire et le profil est identique
à celui du contrôle (24h post-traitement). Ainsi dans ces conditions le traitement étoposide
permet d’obtenir une activation spécifique et stable au cours du temps du point de contrôle
G2/M dans les cellules U2OS C16-5 exprimant HA-Cdc25C-His.
Au laboratoire, des expériences antérieures avaient permis de montrer que la phosphatase
Cdc25B, en surexpression dans les cellules U2OS, était capable d’outrepasser le point de contrôle
mis en place en phase G2 suite à un traitement étoposide (Bugler et al., 2006). Au vu de ces
résultats, et bien que Karlsson et ses collaborateurs aient montrés que la surexpression seule de
Cdc25C ne suffit pas à outrepasser le point de contrôle G2/M (Karlsson et al., 1999), nous avons
voulu nous assurer que dans notre modèle la surexpression de la phosphatase Cdc25C
n’entraînait pas une sortie prématurée du point de contrôle G2/M permettant ainsi aux cellules
d’entrer en mitose. Pour cela nous avons réalisé des expériences de piège mitotique dont le
principe consiste après 1h de traitement étoposide à remettre les cellules dans le cycle en présence
de nocoazole (inhibiteur de la polymérisation des microtubules) pendant 24h. Les cellules passant
outre le point de contrôle en G2/M sont alors piégées en mitose et dénombrées par
détermination de l’index mitotique de la population cellulaire (Roberge et al., 1998). La figure 32
représente la détermination de l’index mitotique à l’aide d’un marquage dirigé contre l’histone H3
phosphorylée par cytométrie en flux. Il faut ajouter l’inhibiteur de Chk1 “UCN01” pour observer
une sortie des cellules du point de contrôle G2/M, 24h après le traitement étoposide. Nous
pouvons donc conclure que le protocole d’activation spécifique du point de contrôle G2/M par
l’étoposide que nous avons mis au point sur les cellules U2OS C16-5 est stable au cours du temps
et irréversible sans ajout d’inhibiteurs de Chk1.
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Figure 32 : Effet des agents génotoxiques
Les cellules sont traitées avec 40µM d’etoposide 1h puis 250ng/ml de nocodazole et 100nM d’UCN01. L’index mitotique (M%) a été déterminé par cytométrie en flux avec un marquage anti-Histone H3 phosphorylé associé à un marquage IP de l’ADN.
Figure 31 : activation du point de contrôle G2/M par l’étoposide
Les cellules ont été traitées 1h 40µM etoposide puis relâchées en absence de tétrcycline. La répartition des cellules dans le cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux 24h ou 38h suivant le traitement.
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I-5 : Les Voies de signalisation en réponse au traitement étoposide
La réponse cellulaire aux agressions externes ou internes à la cellule passe par l’activation
d’une cascade de protéines kinases conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire. En fonction du stress,
de la phase du cycle cellulaire ou même de la lignée cellulaire, la réponse cellulaire aux dommages
induit une “voie de signalisation” spécifique (Cf. Introduction générale). Ainsi nous avons cherché à
déterminer quelles “voies” étaient activées par les cellules U2OS consécutivement au traitement
étoposide. Pour cela des cellules U2OS ont été traitées ou non par de l’étoposide et remises en
culture pendant 24h. Les résultats obtenus sont présentés figure 33. L’anticorps anti-p-Chk1
détecte une forme active de la kinase Chk1 suite au traitement étoposide, ce qui suggère que la
voie ATM/Chk1 des cellules U2OS C16-5 est activée dans ce contexte. De la même manière
l’anticorps anti-p-p42/p-p44 détecte les formes actives des kinases p42MAPK2 et p44MAPK1 dans les
extraits cellulaires ayant subis un traitement étoposide. Ainsi la voie p38/MAPK est elle aussi
impliquée dans la réponse des U2OS à l’étoposide. Il est d’autre part intéressant de noter que
l’ajout d’UCN01 qui a été développé comme un inhibiteur de Chk1, n’a aucun effet sur les
formes phosphorylées “actives” des kinases Chk1 et p42MAPK2 ou p44MAPK1 ce qui n’est pas
surprenant puisque l’UCN01 agit en bloquant le site actif de la kinase.
Figure 33 : Réponse des cellules U2OS C16-5 au traitement étoposide
Des cellules U2OS C16-5 non traitées, traitées 1h avec 40µM d’étoposide ou traitées 1h avec 40µM d’étoposide puis avec 100nM d’UCN01, ont été lysées après 24h. Les extraits cellulaires ont été déposés sur un gel SDS-PAGE et des westerns blot avec les anticorps anti-Cdc25C, anti-Chk1, anti-p-Chk1 (S345), anti-p42/p44 et anti-p-p42/p-p44 ont été réalisés.
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I-6 : Validation de la stratégie de purification de HA-Cdc25C-His
Les cellules U2OS C16-5 en phase exponentielle de croissance ont été cultivées en absence de
tétracycline afin de permettre l’expression de HA-Cdc25C-His. Après 20h d’induction de la
phosphatase, les cellules ont été lysées par lyse osmotique et les extraits cellulaires totaux repris
dans une solution de dénaturation contenant de l’urée 7,5M et de la thiourée 1,5M. Les
échantillons sont ainsi conservés dans des conditions très dénaturantes afin de s’affranchir des
contaminants protéiques qui pourraient agir sur les modifications post-traductionnelles de la
phosphatase avant son analyse par spectrométrie de masse, tels que les phosphatases.
Figure 34 : Stratégie de purification de HA-Cdc25C-His
A. Schéma représentant les différentes étapes de la stratégie de purification. B. WB anti-HA. Extraits cellulaires issus des U2OS C16-5 après 24h d’induction purifiés sur des billes Ni-NTA. L’anticorps anti-HA détecte la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les différentes fractions. C. WB anti-HA. La totalité des extraits purifiés après la renaturation arginine, ont été incubés sur la nuit avec des billes couplées à un anticorps anti-HA (Roche). L’anticorps anti-HA détecte la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les différentes fractions. (ET : extraits totaux, NL : non lié aux billes, L : fractions de lavages)
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Les extraits préparés ont été incubés avec des billes de Nickel-NTA, préalablement équilibrées
avec la solution de dénaturation contenant 5mM d’imidazole. La phosphatase HA-Cdc25C-His
est retenue par affinité entre sa queue poly-histidine et les billes de Nickel (figure 34a). Après
plusieurs lavages avec la solution de dénaturation contenant 5 mM d’imidazole, la phosphatase a
été éluée par une solution de dénaturation contenant 300mM d’imidazole. Le western blot avec
l’anticorps anti-HA présenté figure 34b montre un contrôle des différentes étapes de la
purification. On peut ainsi observer qu’en présence de 5mM imidazole la phosphatase est bien
liée aux billes et que celle-ci est correctement éluée en présence de 300mM imidazole. Les
fractions d’élutions ont été rassemblées et après concentration de l’échantillon par précipitation
acétone, la solution contenant HA-Cdc25C-His a été rapidement diluée dans une solution de
renaturation contenant 0,3M KCl et 0,5M arginine (Baynes et al., 2005) puis incubée en présence
des billes couplées aux anticorps anti-HA préalablement équilibrées avec la solution de
renaturation (figure 34a). Après trois lavages successifs avec la solution de renaturation, HA-
Cdc25C-His a été éluée dans le tampon de charge Laemmli chauffé à 95°C et déposé sur un gel
SDS-PAGE. La figure 34-C montre un WB anti-HA représentant les différentes étapes de la
purification de HA-Cdc25C-His sur les billes anti-HA. La phosphatase est bien retenue sur les
billes anti-HA et est éluée correctement avec le tampon de charge.
I-6 : Conclusion
Au cours de cette première partie de mes travaux de thèse, nous avons donc mis au point des
outils nécessaires à l’étude des modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase
Cdc25C lors de l’activation du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire.
- Pour cela nous avons construit une lignée cellulaire conditionnelle : la lignée U2OS C16-5
qui exprime Cdc25C étiquetée afin de faciliter sa purification.
- Nous avons validé la construction de cette lignée cellulaire : Cdc25C est correctement
exprimée dans les cellules U2OS C16-5, avec la localisation intracellulaire attendue
(majoritairement cytoplasmique) et un cycle cellulaire qui n’est pas perturbé par
l’expression de la phosphatase.
- Puis nous avons mis au point un protocole d’activation spécifique du point de contrôle
G2/M du cycle cellulaire. Nous sommes en effet en mesure d’activer le point de contrôle
G2/M de manière stable en présence de l’expression de HA-Cdc25C-His dans notre
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modèle cellulaire par l’intermédiaire de l’activation des protéines kinases Chk1 et P42MAPK2
et P44MAPK1.
Enfin nous avons mis au point et validé une stratégie de purification spécifique de HA-
Cdc25C-His qui est adaptée a une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
Nous allons maintenant pouvoir réaliser l’analyse proprement dite des modifications post-
traductionnelles jouant un rôle dans sa régulation lors de l’activation ou non du point de contrôle
G2/M du cycle cellulaire.
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II- Analyse protéomique
L’analyse protéomique a été réalisée dans le but de rechercher les modifications post-
traductionnelles présentes sur la phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M.
Nous avons ainsi cherché à identifier de nouvelles MPT mais aussi à caractériser des
modifications différentielles impliquées dans la régulation de la phosphatase plus particulièrement
lors de l’activation du point de contrôle G2/M.
Pour cela nous avons réalisé une analyse par spectrométrie de masse de recherche globale de
modifications post-traductionnelles sur la séquence de Cdc25C. En parallèle de ces travaux, nous
avons débuté la mise au point d’une analyse de séparation bidimensionnelle des isoformes
modifiés de la phosphatase dans le but d’accéder à une cartographie des différents isoformes de
la phosphatase Cdc25C en réponse aux stress.
II-1 : Spectrométrie de masse et recherche de MPT
Pour identifier de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la séquence de la
phosphatase Cdc25C impliquées dans la régulation du point de contrôle G2/M, nous avons
réalisé des analyses de spectrométrie de masse ESI-MS/MS en couplage HPLC après digestion
trypsique de la phosphatase purifiée. Pour cela, des purifications à grande échelle de HA-
Cdc25C-His ont été réalisées dans trois conditions différentes : tout d’abord à partir d’une
population de cellules asynchrones qui nous servira de témoin, d’une population de cellules dont
le point de contrôle G2/M a été activé par l’étoposide (Cf. ci-dessus) et enfin d’une population de
cellules synchronisées en mitose par un poison des microtubules. La phosphatase purifiée a
ensuite été soumise à une protéolyse par la trypsine et le mélange peptidique obtenu a été analysé
par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour une recherche globale des
modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase HA-Cdc25C-His dans chacune
des conditions testées.
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II-1-A : préparation des échantillons
Les purifications de HA-Cdc25C-His ont été réalisées à partir de 160 millions de cellules
U2OS-C16-5 en phase exponentielle de croissance, induites pendant 24h pour l’expression de la
phosphatase et subissant différentes conditions de traitement : (a) des cellules asynchrones non
traitées, (b) des cellules traitées étoposide 40µM par un pulse d’une heure et “relâchées” pendant
24h et (c) des cellules traitées par du nocodazole 250ng/ml pendant 24h (figure 35a). Les cellules
ont été lysées par choc osmotique et les purifications ont été réalisées suivant le protocole
précédemment décrit (Cf. § Résultats-I-2 et Matériel et méthodes). La totalité des échantillons élués a
été déposée sur gels SDS-PAGE et colorée au bleu de Coomassie colloïdal dans des conditions
adaptées à une analyse protéomique par spectrométrie de masse (blouse propre, port de gants et
masques, matériels à usage spécifiques…) afin de s’affranchir d’éventuels contaminants
protéiques tels que les kératines (figure 35b).
Figure 35 : Purification de HA-Cdc25C-His
A. Schéma du protocole expérimental. (a), (b) et (c) Les cellules U2OS C16-5 ont été induites pour l’expression de HA-Cdc25C-His par retrait de la tétracycline pendant 24h. (b) traitement pulsé d’1h avec 40µM étoposide. (c) traitement continu des cellules avec 250ng/ml de nocodazole. B. Gel SDS-PAGE. Dépôt de la totalité des échantillons purifiés sur un gel SDS-PAGE et détection au bleu de Coomassie colloïdal. Les bandes correspondantes à HA-Cdc25cC-His sont ensuites découpées du gel pour être soumises a une protéolyse in-gel par la trypsine.
Résultats
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La bande correspondant à la phosphatase HA-Cdc25C-His est représentée par une flèche
noire (figure 35). Nous pouvons remarquer qu’il reste de nombreux contaminants présents sur les
gels probablement dû aux faibles rendements de purification obtenus (le niveau d’expression de
HA-Cdc25C-His dans les U2OS C16-5 est peu supérieur à celui de la phosphatase endogène ce
qui explique notre difficulté à la purifier). De plus pour détecter le faible niveau de HA-Cdc25C-
His purifié, nous avons réalisé une coloration au bleu de Coomassie colloïdal très poussée (4
jours de coloration). Cette technique longue de coloration a également contribué à la détection de
bandes minoritaires non-spécifiques encore présentes sur le gel malgré les différentes étapes de
purification. Cependant la présence de contaminants protéiques sur le gel ne devrait pas perturber
l’analyse protéomique puisque d’une part le mode ESI-MS/MS permet l’analyse de mélanges de
protéines et d’autre part nous allons découper la bande spécifique correspondant à Cdc25C. En
revanche la recherche de PTM à partir des formes modifiées de Cdc25C pouvant présenter un
retard de migration sur le gel est rendu plus complexe. En effet ces bandes de plus haut poids
moléculaires sont en général plus faibles et sortiront avec des bandes non-spécifiques de la
purification qui s’ajouteront aux phénomènes de suppression dû à la présence des peptides non
modifiés. Ainsi les bandes observées pour les échantillons “non traité” et “étoposide” étaient
suffisantes pour réaliser une recherche de modifications par spectrométrie de masse, au contraire
de celle de l’échantillon “nocodazole” qui présente un rendement de purification beaucoup plus
faible (il est difficile de détecter la bande correspondante à la phosphatase HA-Cdc25C-His sur le
gel) (figure 35).
Les bandes correspondant à la taille attendue de HA-Cdc25C-His pour les trois analyses ont
été découpées du gel SDS-PAGE et après lavages, ont été réduites et alkylées avant d’être
soumises à une protéolyse en gel par la trypsine (Cf. Matériels et méthodes). Enfin les peptides ainsi
obtenus ont été extraits du gel et soumis à une analyse par spectrométrie de masse en tandem
pour la recherche de modifications post-traductionnelles.
II-1-B : Recherche des modifications par spectrométrie de masse
Les produits issus de la protéolyse trypsique ont été analysés par couplage nanoLC-MS/MS
sur un spectromètre de masse hybride : Q-TOF (QSTAR, Applied Biosystems). Les mélanges
peptidiques ont tout d’abord été séparés sur une colonne hydrophobe C18 selon un gradient de 0
à 50% de solvant B pendant 100 minutes (le solvant A est constitué de 0,2% d’acide formique
Résultats
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dans 5% d’acetonitrile et le solvant B de 0,2% d’acide formique dans 90% d’acetonitrile).
L’utilisation d’un gradient long au cours de la chromatographie a été réalisé dans le but de séparer
un maximum de peptides et ainsi d’obtenir un plus grand nombre de spectres MS/MS qui
augmenteront le recouvrement de séquence final. Les peptides ont ensuite été identifiés et
caractérisés en couplage LC-ESI-MS/MS. Les données MS et MS/MS ont été acquises
continuellement en mode IDA (Information-Dependant Acquisition) avec des cycles de 10 secondes.
Chaque cycle correspond à l’acquisition pendant 1 seconde d’un spectre MS, suivi de trois
MS/MS successives réalisées sur les trois pics les plus intenses du spectre MS. D’autre part, une
exclusion dynamique d’une durée de 60 secondes a été utilisée pour prévenir la sélection répétée
d’un même ion, (cela correspond a la durée d’élution d’un peptide au cours de la
chromatographie). La mise au point de ces conditions d’analyse avait préalablement été réalisée
pour l’étude des phosphorylations présentes sur la phosphatase Cdc25B (Jean-Pierre Bouché,
manuscrit en préparation). Ces conditions favorisent la sélection d’un plus grand nombre de peptides
pour lesquels seront générés des spectres MS/MS et permettent ainsi l’augmentation du taux de
couverture de séquence.
Les données obtenues ont été soumises au logiciel d’analyse MASCOT pour l’identification et
la caractérisation des modifications présentes sur ces peptides en comparant les spectres MS/MS
expérimentaux avec la banque de données Swiss-Prot à laquelle a été incrémentée la séquence de
la phosphatase HA-Cdc25C-His. Comme nous cherchions plus spécifiquement des modifications
post-traductionnelles, les recherches ont été réalisées en ajoutant de nouvelles contraintes dans
l’algorithme de recherche MASCOT prenant en compte la présence de phosphorylations sur les
résidus S, T et Y et de méthylations, di-méthylations et tri-méthylations sur les résidus R et K. Les
résultats obtenus sont représentés figure 36. Pour l’échantillon “non traités” 62% de la séquence
de la phosphatase a été recouverte par l’analyse, ce qui correspond à la couverture de 69% des
résidus sérines et thréonines susceptibles d’être phosphorylés. La séquence de la phosphatase
pour l’échantillon “étoposide” a été recouverte à 66% ce qui correspond ici aussi à la couverture
de 69% des résidus S/T. L’échantillon “nocodazole”, quant à lui, nous a permis d’obtenir 32% de
couverture de séquence de la phosphatase correspondant à seulement 11% du taux de S/T total.
Ainsi l’analyse par spectrométrie de masse des échantillons “non traité” et “étoposide” a conduit
à l’obtention des informations de séquence correspondant aux deux-tiers de la phosphatase HA-
Cdc25C-His grâce à la génération de spectres MS/MS.
L’hydrolyse enzymatique théorique de Cdc25C par la trypsine (PeptideCutter) indique que
89% de la séquence sera couverte par une analyse de spectrométrie de masse, les 11% restant
Résultats
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étant trop petits pour être analysés. Ainsi l’obtention du taux de 66% de recouvrement de
séquence pour cette analyse est globalement satisfaisante. Cependant il restera toujours des
domaines de la séquence de la phosphatase non couverts par l’analyse MS/MS du à la génération
de peptides de trop petites ou de trop grandes tailles suite à la protéolyse par la trypsine ou
encore au phénomène de suppression (Cf.Introduction générale). D’autre part, le faible taux de
couverture de séquence obtenu pour l’échantillon “nocodazole” n’est pas surprenant au regard
du faible rendement de purification observé sur le gel. C’est pourquoi nous n’avons pas été
étonnés de ne mettre en évidence aucune modification post-traductionnelle pour cette condition.
En effet l’identification de la phosphatase reposait sur des peptides déjà peu intenses au niveau de
la cartographie peptidique massique et l’intensité relative des ions correspondant aux peptides
phosphorylés sont souvent moins intenses d’une part par leur difficulté à être ionisés, dû à la
présence de la charge négative, et d’autre part parce qu’ils sont souvent les représentants de
formes minoritaires de la protéine.
Chaque spectre MS/MS présentant des phosphorylations ou d’autres modifications post-
traductionnelles a été vérifié manuellement. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3
et les spectres MS/MS correspondants sont en Annexes.
Nous avons tout d’abord mis en évidence des phosphorylations déjà connues :
- Le peptide 214-SPSMPENLNRPR-225 non phosphorylé a été identifié dans les trois
analyses et nous avons pu mettre en évidence la présence d’une phosphorylation sur la
S216 de la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les échantillons “non traité” ainsi qu’après
activation du point de contrôle G2/M par le traitement étoposide.
- Le peptide 165-YLGSPITTVPK-175 non phosphorylé a été identifié dans les trois
analyses. Mais il est intéressant de noter que seule l’analyse de l’échantillon “étoposide” met
en évidence la présence d’une phosphorylation sur la S168 (voir ci-après).
Résultats
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Séquence peptidique Modifications Non traité
Etoposide Nocodazole
28-MLNLLLERme-35 méthylation R35 x
165-YLGSpPITTVPK-175 phospho S168 x
214-SPSpMPENLNRPR-225 phospho S216 x x
261-TVSpLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 phospho S263 x x
261-TVSLCDITpITpQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 phospho T268 ou T270
x
Tableau 3: Modifications mises en évidence par l’analyse LC-MS/MS
Figure 36 : Résultats MASCOT de l’analyse LC-MS/MS
Les spectres MS/MS ont été acquis sur un QSTAR (Applied Biosystems) avec le logiciel d’acquisition Analyst Les données MS/MS ont été soumises au logiciel d’analyse MASCOT en prenant en compte la présence de phosphorylations sur les résidus S, T et Y et de méthylations, di-methylations et tri-méthylations sur les résidus R et K. A, B et C représentent le taux de couverture de séquence obtenu pour chaque échantillon. Les peptides identifiés et séquencés sont représentés en rouge.
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Nous avons d’autre part mis en évidence la présence de nouvelles modifications post-
traductionnelles sur la séquence de la phosphatase :
- Le peptide 261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 non phosphorylé a été
identifié dans les analyses des échantillons “non traité” et “étoposide”. Les analyses
manuelles des spectres MS/MS nous ont permis de mettre en évidence deux ions
parentaux tri-chargés mono-phosphorylés présentant des temps de rétention
chromatographique différents. Le premier ion, correspondant à la fraction
chromatographique éluée à 78,6 min, n’a été retrouvé que dans l’analyse de l’échantillon
“non traité” et l’analyse du spectre MS/MS ne nous permet pas de conclure sur la position
de la phosphorylation entre les résidus T268 ou T270 (Cf. annexe 2). Le deuxième ion,
correspondant à la fraction chromatographique éluée à 83,6 min de l’échantillon non
traité, a été identifié dans les deux échantillons “non traité” et “étoposide” et confirme la
présence d’une phosphorylation sur la séquence de la phosphatase HA-Cdc25C-His à la
position S263 (voir ci-après).
- Le peptide 28-MLNLLLER-35 non modifié a été identifié dans les trois analyses et seule
l’analyse de l’échantillon “non traité” nous permet de mettre en évidence une méthylation
sur le résidu R35 (Cf. annexe 1).
La découverte d’une méthylation sur la séquence de la phosphatase HA-Cdc25C-His comme
modification “non permanente” (nous retrouvons au cours de la même analyse le peptide ne
portant pas cette modification) est une perspective très excitante pour la compréhension des
mécanismes de régulation de la phosphatase au cours du cycle cellulaire. En effet jusqu’à présent
toute les données bibliographiques ne faisaient référence qu’à des mécanismes de
phosphorylations/déphosphorylations de la phosphatase et donc à une régulation de cette
dernière par un jeu interactif entre les kinases et les phosphatases. La présence de cette
méthylation semble suggérer qu’il existe d’autres mécanismes de régulation à l’image de celui
maintenant bien connu du “code des histones” (Hake et al., 2004). Cependant l’étude des
méthylations nécessite des outils ainsi qu’une expertise que nous ne possédions pas au
laboratoire, nous avons donc fait le choix d’aborder ultérieurement l’étude de cette modification
pour nous focaliser sur l’étude des phosphorylations sur les S263 et S168.
La figure 37 représente le spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé 165-
YLGSPITTVPK-175. Les ions fragments observés confirment la séquence du peptide et la
présence d’un groupement phosphate localisé sur le résidu S168. La série des ions y jusqu’à l’ion
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fragment y7 (m/z 779,4) indiquent que les T170 et T171 ne sont pas phosphorylées. De plus la
présence de l’ion fragment b2 (m/z 201,1) révèle que le résidu Y165 n’est pas, lui non plus,
phosphorylé, ce qui nous a permis de conclure que la phosphorylation était bien localisée sur le
résidu S168. Le fait d’avoir retrouvé le peptide correspondant à la S168 phosphorylée seulement
dans l’analyse de l’échantillon traité par l’étoposide nous porte à croire que cette sérine semble
être impliquée dans la réponse aux stress et dans l’activation du point de contrôle G2/M. Cette
hypothèse est renforcée par les travaux de Valérie Goss et collaborateurs qui ont montré une
inhibition de l’activité phosphatase de Cdc25C après la phosphorylation sur la S168 en réponse
aux UV (Goss et al., 2003). D’autre part, la séquence de la phosphatase Cdc25C 168-SPITTVP-
174 présente une forte homologie avec la séquence 364-SPITTSP-370 de la phosphatase MKP1
(MapKinase Phosphatase 1). La phosphorylation sur la S364 de MKP1 par les kinases p42 et p44 est
impliquée dans la stabilité de cette dernière (Brondello et al., 1999). Ceci nous amène à penser
que la phosphorylation sur la S168 de la phosphatase Cdc25C pourrait être impliquée dans un
mécanisme de régulation similaire.
Figure 37 : Identification de la phosphorylation sur la
S168
Spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé 165-YLGSPITTVPK-175 [Ion parental doublement chargé, (MH2)2+ à m/z 628,3]. Les séries d’ions y et b (en accord avec la nomenclature de Biemann (Biemann, 1990a) indiquent que la S168 est phosphorylée. * correspond à la perte de H3PO4.
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De la même manière la figure 38 représente le spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé
261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288. Les ions fragments observés confirment
la séquence du peptide ainsi que la présence d’un groupement phosphate sur la S263. En effet la
série des ions y et l’ion fragment b2 (m/z 201,13) montre que les résidus S277, S287 et T261 ne
portent pas de groupement phosphate. D’autre part, l’ion fragment b3 (m/z 368,12) confirme la
présence du groupement phosphate sur la S263. La phosphorylation sur la S263, quant à elle, est
une nouvelle phosphorylation qui n’a jamais été décrite dans la littérature. Cependant l’alignement
de séquence entre les phosphatases Cdc25C et Cdc25B montre que la S263 est localisée dans un
groupement d’acides-aminés conservés et le résidu équivalent chez Cdc25B correspond à la S375.
Il est intéressant de noter que les travaux du laboratoire ont montré que la S375 de Cdc25B est
phosphorylée dans les cellules en phase exponentielle de croissance (Bouché JP., en préparation) et
que c’est un site putatif de phosphorylation par les kinases Chk1, pEg3, Aurora A et PkB-Akt
(Baldin et al., 2003; Schmitt et al., 2006). Ces observations suggèrent qu’au moins une de ces
kinases pourrait aussi être impliquée dans la phosphorylation de Cdc25C sur la S263 (Voir § IV-
2).
Figure 38 : Identification de la phosphorylation sur la
S263
Spectre MS/MS du peptide mono-phophorylé 261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 [Ion parental triplement chargé, (MH3)3+ à m/z 1077,9]. Les séries d’ions y et b mettent en évidence que la S263 est phosphorylée. * correspond à la perte de H3PO4.
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II-2 : Séparation par gels bidimensionnels
L’autre volet de l’analyse protéomique sur l’étude des modifications de la phosphatase HA-
Cdc25C-His reposait sur la réalisation d’une analyse de protéomique différentielle. Le but premier
de cette analyse était de mettre en évidence des régulations positives ou négatives, dépendantes
des conditions de traitement, sur les différents isoformes de Cdc25C, à l’aide d’une cartographie
des isoformes de la phosphatase par séparation sur une électrophorèse bidimensionnelle. Ainsi le
ou les isoformes caractérisés auraient été soumis à une analyse par spectrométrie de masse dans le
but de rechercher les modifications post-traductionnelles à l’origine de ce changement de profil.
Cependant cette technique nécessite de déposer sur le gel bidimensionnel une très grande
quantité de Cdc25C purifiée, de manière à pouvoir réaliser une analyse par spectrométrie de
masse, de recherche de modifications post-traductionnelles à partir du spot découpé sur le gel.
Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, il a été difficile d’obtenir un bon
recouvrement de séquence et de réaliser une recherche globale satisfaisante des modifications
post-traductionnelles de la phosphatase à partir d’une bande correspondant à la totalité de la
quantité de Cdc25C déposé sur le gel. Ainsi il nous a paru impossible de réaliser une recherche de
PTM par LC-MS/MS sur un spot correspondant à une fraction de la quantité totale de Cdc25C
dans ces conditions.
Il a donc ensuite été décidé de réaliser simplement des cartographies des isoformes de Cdc25C
purifiée par gels bidimensionnels. La comparaison de ces cartographies, obtenues à partir
d’échantillons ayant subit préalablement différents traitements par des drogues activant le point
de contrôle G2/M, livrerait des informations sur l’abondance relative des isoformes modifiés de
Cdc25C en fonction des conditions de traitement.
II-2-A : Cartographie par électrophorèse en gel bidimensionnel
Cette analyse cartographique se voulait donc complémentaire de la spectrométrie de masse et
avait pour principal objectif la mise au point d’un modèle quantitatif d’analyse des différentes
formes phosphorylées de Cdc25C en fonction de sa régulation. Pour cela il nous a tout d’abord
fallu mettre en place un protocole reproductible de séparation des isoformes de la phosphatase
par électrophorèse bidimensionnelle. La technique d’électrophorèse en gel bidimensionnel
nécessite des conditions de préparation de l’échantillon compatibles avec la première dimension :
Résultats
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la séparation IEF. Les conditions d’extraction de la phosphatase HA-Cdc25C-His et de la
purification par affinité sur de billes de Nickel en présence d’urée et de thiourée étant très
proches des conditions standard de la séparation IEF des protéines, nous avons choisi d’enrichir
notre échantillon avec HA-Cdc25C-His en réalisant la première étape de la purification mise au
point pour l’analyse par spectrométrie de masse de HA-Cdc25C-His. Pour cela, les cellules U2OS
C16-5 ont été induites par retrait de la tétracycline pendant 24h puis lysées selon le protocole de
purification précédemment décrit et enfin purificatiés sur les billes de Nickel (Cf. § résultats I-2) les
échantillons ont été déposés sur un gel de première dimension IEF avec un gradient de pH 3 à 10
et la tension a été appliquée suivant une progression par palier (Cf. Matériels et méthodes). Le gel
d’IEF a ensuite été déposé sur un gel SDS-PAGE pour la deuxième dimension et les échantillons
ont été détectés à l’aide d’un western blot avec un anticorps anti-Cdc25C (figure 39). Nous
pouvons observer sur le gel plusieurs spots correspondant à la phosphatase HA-Cdc25C-His et à
la phosphatase Cdc25C endogène (par rapport à la bande contrôle de migration pour la deuxième
dimension).
Ces premiers résultats étaient encourageants car ils mettaient en évidence la séparation de
certains isoformes de Cdc25C. Nous pouvons ainsi remarquer sur ce gel bidimensionnel que
certains spots sont séparés uniquement selon leurs points isoélectriques et non pas selon leur
masse moléculaire, ce qui nous permet de penser que ces profils correspondent à différentes
Figure 39 : Séparation sur gels bidimensionnels
WB anti-Cdc25C. 100µg d’extrait cellulaire U2OS C16-5 induits pendant 24h, ont été déposés sur une strip 3-10 (Amersham). La strip a été déposée en sarcophage sur un IPGphore (Amersham) pour la première dimension puis déposée sur un gel SDS-PAGE 12% pour la deuxième dimension avec une piste contrôle contenant 20µg d’extraits totaux (à gauche). Après transfert, la membrane a été incubée avec un anticorps anti-Cdc25C (TC15) détectant les spots correspondant à Cdc25C endogène et HA-Cdc25C-His.
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formes phosphorylées de la phosphatase. Bien qu’il soit difficile d’imaginer que ces spots
correspondent à la totalité des formes modifiées de la phosphatase, nous avons cependant obtenu
dans ce contexte un profil cartographique d’au moins une partie des isoformes de Cdc25C.
II-2-B : Effet de l’étoposide sur la cartographie des isoformes de Cdc25C par gels
bidimensionnels
Nous avons ensuite cherché à déterminer si l’activation du point de contrôle G2/M
consécutive au traitement étoposide conduisait à un phénotype remarquable sur le profil
cartographique des isoformes de Cdc25C par électrophorèse bidimensionnelles. Pour cela des
cellules U2OS C16-5 ont été induites et traitées ou non par de l’étoposide dans les conditions
nécessaires à l’activation du point de contrôle G2/M, puis les extraits cellulaires ont été analysés
par électrophorèse sur gel bidimensionnel et Cdc25C a été révélée par western blot avec
l’anticorps anti-Cdc25C. Cependant, bien que cette expérience ait été réalisée plusieurs fois, nous
n’avons pas réussi à reproduire les résultats obtenus précédemment. En effet la figure 40a
représente la séparation des isoformes de Cdc25C à partir de l’échantillon contrôle non traité, et
nous pouvons observer une baisse de la résolution et de la sensibilité avec seulement trois spots
correspondant à HA-Cdc25C-His (indiqué par le cadre rouge) et un profil continu non résolu
pour Cdc25C endogène. De la même manière, les résultats obtenus à partir de l’échantillon traité
par l’étoposide sont très peu résolus et montrent ici aussi un problème de sensibilité (Figure 40b).
Néanmoins la comparaison des profils de chacun de ces gels bidimensionnels permet de mettre
en évidence une différence de profil de migration des isoformes de HA-Cdc25C-His entre
l’échantillon non traité et l’échantillon traité par l’étoposide. Mais le manque de sensibilité, la
faible résolution ainsi que le manque de reproductibilité d’une expérience à l’autre ne nous
permet pas de conclure quant à la différence de profil observé entre les deux gels.
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II-3 : Conclusion
En conclusion, la recherche de modifications post-traductionnelles de Cdc25C par
spectrométrie de masse nous a permis de mettre en évidence deux nouvelles modifications une
méthylation sur l’arginine 35 et une phosphorylation sur la sérine 263. De plus lors d’une
activation du point de contrôle G2/M consécutive à un traitement étoposide, nous avons montré
la présence d’une phosphorylation sur la sérine 216 comme le décrit la littérature ainsi qu’une
phosphorylation sur la sérine 168.
D’autre part, l’analyse cartographique des isoformes de Cdc25C par gels bidimensionnels était
un challenge qui aurait pu nous apporter des informations complémentaires de la spectrométrie
Figure 40 : Séparation sur gels bidimensionnels
WB anti-Cdc25C. 100µg d’extrait cellulaire U2OS C16-5, traités ou non par un pulse d’étoposide 1h et induits pendant 24h, ont été déposés sur des strips 3-10 (Amersham). Les strips ont été déposées en sarcophage sur un IPGphore (Amersham) pour la première dimension puis déposée sur un gel SDS-PAGE 12% pour la deuxième dimension. Après transfert, la membrane a été incubé avec un anticorps anti-Cdc25C (TC15) détectant les spots correspondant à Cdc25C endogène et HA-Cdc25C-His. A. Echantillon non traité. B. Echantillon traité avec 40µM d’étoposide pendant 1H puis « relaché » 24h Les encadrés rouges indiquent l’emplacement sur les gels des isoformes de HA-Cdc25C-His.
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de masse. Cependant la qualité du signal obtenu en western blot dans les conditions que nous
avons testées n’était malheureusement pas suffisante pour que nous puissions obtenir des
informations supplémentaires par rapport aux données de spectrométrie de masse.
Nous avons donc poursuivi notre projet avec l’analyse fonctionnelle des phosphorylations
présentes sur les sérines 168 et 263 de Cdc25C.
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III- Analyse fonctionnelle des phosphorylations S168p et S263p
Les phosphorylations du domaine amino-terminal des phosphatases Cdc25 sont des
évènements majeurs de régulation de ces dernières. Nous avons vu au cours de l’introduction
générale que ces évènements interviennent à plusieurs niveaux : soit sur la stabilité des Cdc25,
soit sur leur activité ou encore sur leurs localisations et font intervenir de nombreuses protéines
kinases. Il parait donc essentiel pour comprendre les phénomènes de régulation de connaître le
rôle exact de chaque phosphorylation intervenant sur les phosphatases.
La phosphorylation sur la sérine 263 n’avait encore jamais été décrite. Ainsi, suite à la
découverte de ce nouvel évènement de phosphorylation, de nombreuses questions ont été
posées : quel est son rôle ? Mais aussi quelles sont les voies de régulation qui sont impliquées
dans la phosphorylation de ce résidu et quels acteurs font-elles intervenir ?
D’autre part, bien que la phosphorylation de la sérine 168 ait déjà été décrite dans la littérature,
les mécanismes intervenant dans cet évènement de phosphorylation sont mal connus. En effet,
au moins deux kinases ont été identifiées comme phosphorylant le résidu sérine 168 de Cdc25C
en réponse à deux mécanismes de régulation différents : CDK1-Cycline B active Cdc25C lors de
la boucle d’auto-amplification et SAPKJNK inhibe l’activité de la phosphatase en réponse au stress
(Goss et al., 2003). Ainsi nous avons donc cherché à mieux comprendre quels mécanismes
étaient impliqués dans la phosphorylation de la sérine 168 et quels étaient leurs rôles.
Afin de répondre à ces questions nous avons donc choisi deux approches qui pourront nous
apporter des informations complémentaires : l’analyse des mutants de Cdc25C sur ces sites de
phosphorylation et le développement d’anticorps spécifiques de ces sites de phosphorylation.
III-1 : Le développement des outils
III-1-A : Construction des mutants
La construction de mutants non-phosphorylables ou phospho-mimétiques est classiquement
utilisée pour l’étude des phosphorylations. L’utilisation des mutants permet de mettre en évidence
Résultats
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le rôle de la phosphorylation sur la régulation des protéines grâce à l’apparition de phénotypes de
perte ou de gain de fonction par rapport à la protéine sauvage. De plus, l’utilisation des mutants
peut aussi fournir des informations sur les protéines kinases régulatrices impliquées dans la
phosphorylation des ces résidus à travers la réalisation d’essais kinases in vitro.
Ainsi dans le cadre de l’analyse fonctionnelle des phosphorylations sur les sérines 168 et 263
de Cdc25C, des mutants non-phosphorylables par mutations des sérines 168 et 263 en alanine
(S168A et S263A) et des mutants mimant la phosphorylation, “phospho-mimétique”, par
mutation des sérines 168 et 263 en aspartate (S168D et S263D) ou en glutamate (S168E et S263E)
ont été générés. Chacune de ces mutations a été réalisée dans le plasmide pUHD10 ::HA-
Cdc25C-His (Cf. Matériel et méthodes). Et les plasmides ont été transféctés transitoirement dans la
lignée cellulaire U2OS t-TA en absence de tétracycline, afin de permettre l’expression de ces
Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Elles ont été transféctés 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.
Résultats
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doute de la stratégie de purification employée. En effet, seulement un passage a été réalisé contre
les peptides non phosphorylés dans le but de retenir préférentiellement les anticorps non
spécifiques de la phosphorylation après la première purification contre le peptide qui a servi à
immuniser les lapins. Dans ce cas précis, peut être que ce seul passage n’a pas suffit à épuiser la
totalité des formes non spécifiques de la phosphorylation, ainsi nos échantillons d’anticorps
“purifiés” regroupe un mélange d’anticorps anti-Cdc25C spécifiques ou non de la forme
phosphorylée.
III-2 : Effet des mutants de Cdc25C
Les cellules U2OS parentales ont été transféctées de manière transitoire en absence de
tétracycline avec les plasmides codant soit pour la forme sauvage de Cdc25C, soit pour les
différentes formes mutées en absence de tétracycline pendant 24h. Dans un premier temps, nous
nous sommes tout d’abord assurés que chacun des plasmides étaient correctement exprimés dans
Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Les cellules ont été transféctés 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.
Résultats
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la lignée cellulaire U2OS t-TA. La figure 43a montre un western blot avec un anticorps anti-
Cdc25C sur les différentes formes mutées de la phosphatase HA-Cdc25C-His. Malgré un dépôt
des échantillons non homogène (par rapport à la bande contrôle représentant la forme endogène
de Cdc25C), chaque mutant est exprimé correctement dans la cellule et migre à la taille attendue.
Nous avons ensuite affiné cette analyse en déterminant quelle était la meilleure cinétique
d’expression des mutants de Cdc25C en transfection transitoire. Pour cela les mutants ont été
transféctés dans les cellules U2OS t-TA et les extraits cellulaires totaux ont été analysés par
western blot 24h, 48h ou 72h après la transfection. La figure 43b montre les résultats obtenus
pour la forme sauvage et le mutant S263A de HA-Cdc25C-His. L’expression de HA-Cdc25C-His
24h après la transfection est identique au niveau de la phosphatase endogène, mais ce niveau
diminue très fortement après 48h pour disparaître complètement après 72h de transfection. Ces
résultats indiquent que le plasmide n’est pas stable dans les cellules U2OS et doit être rapidement
dégradé, expliquant la chute brutale du niveau de HA-Cdc25C-His dans la cellule dès le temps
48h. C’est pourquoi pour s’assurer une bonne homogénéité ainsi qu’un niveau suffisant
d’expression des mutants de Cdc25C, toutes les transfections transitoires ont ensuite été réalisées
durant 24h. Enfin nous avons regardé la localisation intracellulaire de chacun des mutants par
immunofluorescence avec des anticorps anti-HA. HA-Cdc25C-His, comme précédemment
décrit, est majoritairement localisée dans le cytoplasme avec une exclusion nucléaire. Les mutants
S168A et S168E sont eux aussi majoritairement localisés dans le cytoplasme. Bien qu’il semble
qu’il y ait une légère relocalisation nucléaire par rapport à la forme sauvage, celle-ci est
insuffisante pour justifier que la phosphorylation sur la S168 puisse avoir un rôle dans la
localisation de la phosphatase. En revanche les mutants S263A, S263D et S263E présentent,
quant à eux, un phénotype de relocalisation nucléaire de la phosphatase par rapport au phénotype
de la forme sauvage. D’autre part, le phénotype est identique pour les trois formes mutées de la
S263 ce qui suggère que les mutants S263D et S263E ne jouent pas leurs rôles de phospho-
mimétique (figure 43c) (Law et al., 2006) (Esteban et al., 2003).
En conclusion la phosphorylation de la S168 de la phosphatase Cdc25C ne semble donc pas
intervenir dans les phénomènes de régulation intracellulaire de la phosphatase. Par contre, le
phénotype de relocalisation nucléaire des mutants S263A/D/E montre un rôle de la
phosphorylation de ce résidu impliqué dans les mécanismes d’export cellulaire de la phosphatase.
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IV-1-A : Etude de la phosphorylation de la S263
La localisation intracellulaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His par immunofluorescence à
l’aide d’un anticorps anti-HA est représentée figure 44a Nous pouvons observer une répartition
strictement cytoplasmique de la phosphatase HA-Cdc25C-His, comme décrit précédemment,
alors que la forme mutée S263A est localisée aussi bien dans le noyau de la cellule que dans le
cytoplasme (marquage “pan cellulaire”).
Dans le but de déterminer quel était le mécanisme impliqué dans le phénotype de
relocalisation nucléaire des mutants de la sérine 263, les cellules U2OS ont été traitées avec
20ng/ml de leptomycine B (LMB) qui est un inhibiteur de l’export nucléaire des protéines via
Figure 43 : Effet des mutants S168A et S263A de Cdc25C
A. WB anti-Cdc25C. Transfection transitoire des différents mutants de HA-Cdc25C-HIs dns les U2OS t-TA pendant 24h en absence de tétracycline. La bande inférieure correspond à la Cdc25C endogène et la bande supérieur aux mutants HA-Cdc25C-His. B. Cinétique de transfection. La forme sauvage et le mutant S263A ont été transfecté dans les U2OS t-TA et les extraits cellulaires ont été réalisés 24h, 48h et 72h post-transfection et détecté par WB anti-Cdc25C. C. Localisation des mutants. Les cellules U2OS t-TA ont été transfectées par les différents mutants HA-Cdc25C-His et leur localisation a été détectée par IF anti-HA sur un microscope Leica. Pour chaque analyse au moins 100 cellules ont été comptées.
A
B
C
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l’inhibition du facteur d’export nucléaire, exportin1 (Crm1) (Ossareh-Nazari et al., 1997). Les
résultats présentés figure 44b montrent la relocalisation nucléaire de la forme sauvage de HA-
Cdc25C-His, 85% des cellules présentent un marquage de type nucléaire après le traitement des
cellules par la LMB. La forme mutante de la phosphatase S263A présente un marquage
majoritairement “pan-cellulaire” avec néanmoins 32% des cellules marquées strictement dans le
cytoplasme dans la population non traitée. Lorsque l’on ajoute de la LMB, on observe un effet
additif de la relocalisation nucléaire de HA-Cdc25C-His S263A avec un marquage “pan-
cellulaire” qui devient strictement nucléaire (plus que 3% des cellules présentent un marquage
cytoplasmique strict alors qu’on observe 42% de cellules avec un marquage strictement
nucléaire). Cette expérience confirme donc le rôle joué par la phosphorylation sur la S263 dans la
localisation cellulaire de la phosphatase Cdc25C et suggère que cette dernière soit impliquée dans
les mécanismes de régulation de l’export nucléaire de la phosphatase de manière indépendante au
facteur d’export nucléaire Crm1, puisque l’ajout de LMB renforce l’accumulation nucléaire de
Cdc25C.
Figure 44 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire
A et B. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. A. IF anti-HA. Les cellules sont observées sur un microscope Leica au grossissement X100. HA-Cdc25C-His est immuno-détectée par un anticorps anti-HA couplé à un anticorps secondaire Alexa 488 et l’ADN est marqué au dapi. B. Effet de S263A sur la localisation de Cdc25C. Les cellules ont été transféctés 24h et traitées 3h avant fixation par 20ng/ml de LMB. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA. Les barres d’erreurs représentent la déviation standard obenues à partir de 3 analyses différentes.
B
A
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Ensuite, afin de déterminer si cette phosphorylation était aussi impliquée dans la réponse au
stress, nous avons analysé l’effet de différents stress sur la localisation cellulaire du mutant S263A
par rapport à la phosphatase sauvage. Comme chaque stress conduit à l’activation d’une voie de
régulation particulière, aboutissant à la régulation de différents effecteurs, nous avons choisi de
traiter les cellules soit avec un stress oxydatif : H2O2, soit en activant directement la voie p38 avec
l’anisomycine. Les cellules ont donc été traitées 24h après la transfection par 0,4mM d’H2O2, ou
1µg/ml d’anisomycine. Les résultats sont présentés figure 45. La forme sauvage de HA-Cdc25C-
His est relocalisée dans le noyau lors du traitement H2O2, on observe un marquage “pan-
cellulaire” de la phosphatase pour 40% des cellules. Après le traitement des cellules par
l’anisomycine la forme sauvage reste majoritairement cytoplasmique, bien qu’on observe ici aussi
une légère relocalisation de nucléaire de HA-Cdc25C-His (25% de marquage “pan-cellulaire” au
lieu de 10% pour le contrôle non traité). En revanche les résultats obtenus avec le mutant S263A
ne montrent aucune différence de localisation de la phosphatase après les différents stress par
rapport au contrôle non traité. Ces expériences nous permettent donc de conclure que la
phosphorylation de la S263 ne semble pas être impliquée dans les mécanismes de régulation en
réponse aux stress mais uniquement dans la régulation de la localisation à travers l’export
nucléaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His.
Figure 45 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire
Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Les cellules ont été transféctées 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.
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D’autre part, nous avons vu au cours de l’introduction générale que la séquestration nucléaire
de Cdc25C par la mutation en alanine de la sérine 216 conduisait à une entrée prématurée des
cellules en mitose (Graves et al., 2001). Nous nous sommes donc demandés si le phénotype de
relocalisation nucléaire du mutant S263A induisait une entrée prématurée des cellules en mitose
comme c’est le cas pour les mutants de la S216.
Afin de pouvoir répondre à cette question nous avons observé la localisation intracellulaire de
Cdc25C par un marquage direct des noyaux. Cette technique présente l’avantage de ne pas perdre
les cellules en mitose ou en apoptose au cours des lavages, ce qui permet de dénombrer les
cellules entrées prématurément en mitose ou présentant une condensation anormale de la
chromatine. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne permet pas de réaliser de marquages
par immunofluorescence. Nous avons donc utilisé les plasmides pEGFP ::Cdc25C et
pEGFP ::Cdc25C-S216A, codant pour l’expression de la phosphatase Cdc25C en fusion avec la
GFP (Green Fluorescent Protein) et nous avons construit le plasmide pEGFP ::Cdc25C-S263A par
mutagénèse dirigés. Les cellules U2OS ont été transféctées par ces plasmides et analysées par
marquage des noyaux au dapi direct et seules les cellules positives pour la GFP ont été
dénombrées. Ainsi la fluorescence de la GFP a permis de déterminer la localisation intracellulaire
de Cdc25C sauvage et des mutants et le marquage des noyaux a permis de différencier les cellules
mitotiques de celles présentant une condensation prématurée de la chromatine (PCC). De la
même manière que pour HA-Cdc25C-His, la phosphatase GFP-Cdc25C sauvage est localisée
strictement dans le cytoplasme. Le mutant S216A présente une relocalisation nucléaire (50% de
marquage nucléaire) avec une augmentation significative (15%) du nombre de cellules présentant
condensation prématurée de la chromatine. Ces résultats sont en accord avec ceux de la
littérature (Graves et al., 2001). Le mutant GFP-Cdc25C-S263A présente lui aussi une
relocalisation nucléaire de la phosphatase qui est ici aussi accompagnée d’une augmentation de
23% du nombre de cellules entrant prématurément en mitose (figure 46).
Ces résultats confirment dans un premier temps que la localisation observée de Cdc25C
sauvage et des mutants n’est pas un artéfact provenant de l’étiquette anti-HA puisque nous
observons des phénotypes de localisation intracellulaire de la forme sauvage et du mutant S263A
de Cdc25C identiques à ceux observés en immunofluorescence avec l’anticorps anti-HA. Enfin,
la rétention nucléaire de Cdc25C-S263A est accompagnée d’une augmentation du nombre de
cellules entrant prématurément en mitose au même titre que le mutant Cdc25C-S216A, ce qui
suggère un rôle dans les mécanismes de la régulation de l’entrée des cellules en mitose peut-être
ici aussi par l’intermédiaire de la liaison avec les protéines 14-3-3 ?
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IV-1-B : Etude de la phosphorylation de la S168
Dans le cadre de l’analyse de la phosphorylation de la sérine 168 de Cdc25C en réponse à un
traitement étoposide, nous avons cherché à comprendre quel était le rôle de cette
phosphorylation sur la régulation de la phosphatase et quelles étaient les voies métaboliques de
réponse aux stress qui étaient impliquées.
Pour cela les effets de différents stress génotoxiques ont été analysés par des expériences
d’immunofluorescence avec l’anti-HA sur les mutants S168A et S168E de Cdc25C. Les résultats
obtenus sont présentés figure 47.
La forme mutante S168A est localisée majoritairement dans le cytoplasme. Lorsque les cellules
sont traitées avec de l’H2O2, on n’observe plus le phénotype de relocalisation nucléaire de la
phosphatase que nous avions observé avec la forme sauvage de HA-Cdc25C-His . Lorsque les
cellules sont traitées avec de l’anisomycine, on observe une relocalisation nucléaire de la
phosphatase au contraire du phénotype observé avec la forme sauvage. De la même manière,
alors que la forme mutante S168E est majoritairement cytoplasmique en condition normale, celle-
Figure 46 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire
Effet de S263A sur l’entrée prématurée des cellules en mitose. Les cellules ont été transféctés 24h avec Cdc25C étiquetée GFP. L’ADN a été marqué au DAPI et seul les cellules GFP positive ont été comptée.détectées Pour chaque expériences au moins 100 cellules ont été comptées
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ci se relocalise dans le noyau suite au traitement H2O2. Elle reste majoritairement cytoplasmique
après le traitement par l’anisomycine bien que dans ce cas là, il y ait une forte relocalisation
nucléaire de la phosphatase par rapport au contrôle non traité. Ceci nous permet de conclure qu’il
semble que le mutant S168E joue bien le rôle de phospho-mimétique et contrebalance l’effet
observé avec le mutant S168A. D’autre part cette expérience suggère que la phosphorylation sur
la sérine 168 de la phosphatase HA-Cc25C-His semble être impliquée dans la régulation de la
phosphatase lors de la réponse aux stress.
Figure 47 : Effet des stress génotoxiques sur le mutant S168A
A. IF anti-HA : Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA et observées sur un microscope Leica grossissement X100.
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III-3 : Recherche des kinases impliquées dans la phosphorylation de S168 et S263
Pour terminer, nous avons recherché quelles kinases étaient potentiellement responsables de
ces phosphorylations. Pour cela, nous avons réalisé des essais kinases in vitro en présence de
phosphate radiomarqué, 33p. Les résultats de l’autoradiographie sont présenté figure 48a. Nous
avons ainsi mis en évidence que les kinases candidates Chk1, MK2, Aurora A, Cdk1/cycline B,
p42 et p44 étaient capable de phosphoryler la phosphatase Cdc25C in vitro. Afin de déterminer
spécifiquement si au moins une de ces kinases était impliquée dans la phosphorylation spécifique
su résidu sérine 263, ces mêmes essais kinases ont été réalisés à froid et la phosphatase a été
détectée par Western blot, en utilisant l’anticorps anti-phosphospécifiques dirigé contre le site
S263 qui semblait être spécifique (voir § III-1-B). Cependant, comme l’illustre le Western blot
anti-S263p réalisé sur l’essai kinase Cdk1/Cycline B présenté figure 48b, cet anticorps n’est pas
spécifique de la phosphorylation et détecte la forme non phosphorylé de la phosphatase MBP-
Cdc25C purifiée chez E. coli.
Figure 48 : Essais kinases in vitro
Autoradiographie représentant les essais kinases réalisés sur MBP-Cdc5C purifiée chez E.coli. La bande correspondante à MBP-Cdc25C est indiquée par une flèche. Essais kinases réalisés in vitro avec la kinase Cdk1/cycline B. Détection par WB avec un anticorps phosphospécifique anti-S263p et comme contrôle anti-Cdc25C (clone TC15).
A
B
Résultats
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Ainsi bien que nous ayons mis en évidence de nombreuses kinases candidates pour la
phosphorylation de ces résidus particuliers. Nous ne pouvons pas encore déterminer précisément
quelles kinases sont impliquées dans ces phénomènes de phosphorylation.
III-4 : Conclusion
Cette dernière partie était consacrée à l’étude du rôle fonctionnel des phosphorylations des
sérines 168 et 263 sur la régulation de Cdc25C.
Les résultats obtenus avec les mutants de la sérine 263 ont montré que cette phosphorylation
est impliquée dans un mécanisme qui retient Cdc25C dans le cytoplasme et prévient sa
relocalisation nucléaire. En effet la mutation de la sérine 263 en alanine conduit à augmenter
l’accumulation nucléaire de Cdc25C, cela de manière indépendante du facteur d’export nucléaire
Crm1 puisque l’inhibition de l’exportine par la LMB renforce son accumulation nucléaire (figure
49). La S263 est localisée dans un domaine proche de la NLS de Cdc25C, il est donc tentant de
supposer que la mutation de la S263 peut affecter la disponibilité de la NLS lors de son
interaction avec les importines. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans le
cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C. La T236 est située juste en amont de la NLS et
lorsqu’elle est phosphorylée par la protéine kinase CK2, sa translocation nucléaire est augmentée
et Cdc25C s’accumule dans le noyau (Schwindling et al., 2004).
De plus, l’accumulation nucléaire de Cdc25C est accompagnée d’une entrée prématurée de
cellules en mitose similaire à celle provoquée par la forme non-phosphorylable de la S216 (Dalal
et al., 1999). Nous pouvons donc imaginer que la phosphorylation sur la S263 intervient dans un
mécanisme de régulation négatif de Cdc25C en maintenant la phosphatase dans le cytoplasme
afin d’empêcher son interaction avec son substrat CDK1 et ainsi maintenir la cellule en phase G2
tant qu’elle n’est pas prête à entrer en mitose.
La phosphorylation de la sérine 168, quant à elle, ne semble pas être impliquée dans les
phénomènes de régulation de la localisation, la forme non-phosphorylable de la S168 ne perturbe
pas la localisation intracellulaire de Cdc25C. Néanmoins en réponse à des stress genotoxiques
nous pouvons observer un changement de comportement sur la localisation intracellulaire de
Cdc25C qui semble être contrebalancée par les mutants phospho-mimétiques de la S168. Il avait
déjà été montré que le résidu S168 de Cdc25C pouvait être phosphorylé en réponse aux stress
Résultats
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(Goss et al., 2003). La phosphorylation sur la S364 de la phosphatase MKP1 par les protéines
kinases p42MAPK et p44MAPK n’agit pas sur son activité mais conduit à la dégradation de la
phosphatase (Brondello et al., 1999). Dans le cas de la réponse aux stress on pourrait imaginer un
mécanisme similaire qui conduirait à l’activation rapide du point de contrôle G2/M par
l’intermédiaire de la dégradation de Cdc25C.
Figure 49 : Rôle de la phosphorylation sur la S263 – présentation d’un modèle
La phosphorylation de Cdc25C contrôle négativement la translocation du cytoplasme vers le noyau. La mutation de la S263 en alanine conduit à son accumulation nucléaire par un mécanisme indépendant de Crm1.
DISCUSSION
Discussion
134
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Nous avons vu au cours de l’introduction générale de ce manuscrit que la phosphatase
Cdc25C était contrôlée par de nombreux évènements de phosphorylations/déphosphorylations
qui régulent la phosphatase aussi bien au niveau de sa localisation intracellulaire que de son
activité. Il a également été proposé récemment que la stabilité de Cdc25C soit contrôlée par des
évènements de phosphorylation (Eymin et al., 2006). Par ailleurs, une même phosphorylation
semble pouvoir être impliquée dans plusieurs mécanismes de régulation différents. C’est le cas
par exemple de la S168 qui est impliquée dans l’activation de Cdc25C à la suite de sa
phosphorylation par CDK1 (Izumi and Maller, 1993), mais que nous avons identifiée lors de
l’activation du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire en réponse à un traitement étoposide
et qui semble être impliquée dans un phénomène d’inhibition de Cdc25C (Goss et al., 2003).
Lorsque nous avions débuté ce projet de thèse, nous cherchions à comprendre les mécanismes de
régulation post-traductionnelle de la phosphatase Cdc25C et à identifier de nouveaux régulateurs
qui puissent constituer éventuellemnt de nouvelles cibles pharmacologiques. Nous avions donc
développé dans ce but une analyse protéomique globale de recherche de MPT sur Cdc25C. Ainsi,
notre projet s’est déroulé autour de deux grands axes qui étaient le développement d’un modèle
d’étude et la mise en place de l’analyse protéomique pour la recherche de MPT sur Cdc25C. Puis,
à la suite de la mise en évidence de plusieurs modifications, nous avons cherché à déterminer
quelles étaient les fonctions jouées par les phosphorylations sur les S263 et S168.
I- Validation du modèle d’étude
La recherche globale des MPT de la phosphatase Cdc25C par spectrométrie de masse reposait
sur la purification de quantité de protéine de l’ordre du microgramme de Cdc25C dans un
contexte naturel. Du point de vue industriel, dans le cadre de la recherche de nouvelles thérapies
basée sur des approches conduisant à l’inhibition du point de contrôle G2/M (Cf. Introduction
générale, §II-3), il était important d’analyser les mécanismes impliqués dans la régulation de la
phosphatase lors de l’activation spécifique du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire par des
agents génotoxiques. C’est pourquoi nous nous sommes également appliqués à valider, dans le
modèle cellulaire que nous avions construit pour cette étude, la mise en place spécifique du point
de contrôle G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN.
Discussion
136
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I-1 : La stratégie de purification
Ainsi la première étape de ce projet consistait à purifier Cdc25C. Pour cela nous avons
construit un modèle cellulaire où la phosphatase Cdc25C étiquetée était surexprimée de manière
conditionnelle dans des cellules humaines : les U2OS. Les cellules U2OS sont des cellules
adhérentes humaines issues d’un ostéosarcome. Elles ont l’avantage d’avoir un temps de
doublement relativement rapide (20h), et de se prêter facilement aux synchronisations (ce qui
facilite l’étude du cycle cellulaire). Pour la purification de la phosphatase, nous avons adapté le
protocole de purification mis au point dans notre laboratoire par le Dr Jean-Pierre Bouché pour
l’étude par spectrométrie de masse des modifications de la phosphatase Cdc25B (Bouché JP, en
préparation). Cette stratégie est basée sur la reconnaissance de deux étiquettes : l’étiquette HA et
l’étiquette poly-histidines. La première étape de purification sur une matrice d’affinité de Nickel-
NTA a été choisie car elle supporte les conditions de dénaturations très stringentes utilisées lors
de l’extraction de Cdc25C. Mais cette étape ne permettait pas d’obtenir un très bon rendement de
purification. Ainsi la seconde étape de purification sur une matrice d’immunoaffinité porteuse
d’anticorps anti-HA était nécessaire. Cette étape nécessitait la renaturation préalable de protéines
purifiées dans des conditions dénaturantes. Elle n’aurait pas pu être réalisée sans les résultats
récents de Tsumoto et ses collaborateurs qui ont montré que l’ajout de d’arginine dans les
tampons jouait un rôle dans le repliement des protéines, leur solubilisation et leur purification
(Tsumoto et al., 2004). Le rôle exact de l’arginine lors des phénomènes de repliement et de
renaturation des protéines est encore mal connu, cependant il semblerait qu’elle agisse en
induisant un ralentissement des interactions protéine-protéine, conduisant à une stabilisation des
protéines avec un effet concomitant au niveau du repliement des protéines (Baynes et al., 2005).
Ainsi la renaturation rapide de Cdc25C après la purification par affinité Ni-NTA permettait de
réaliser des expériences d’immuno-purifications avec des anticorps anti-HA, augmentant
significativement le rendement.
Le clone U2OS C16-5 a été sélectionné pour le niveau et l’homogénéité de l’expression de
HA-Cdc25C-His dans les cellules U2OS grâce à des expériences de western blot et
d’immunofluorescence à l’aide d’anticorps dirigés contre l’étiquette HA de la phosphatase.
Néanmoins nous avons rencontré des limitations au niveau des rendements de purification
obtenus, ce qui a compliqué l’analyse par spectrométrie de masse (voir ci-après). Nous pensons que
ces limitations proviennent en partie du faible niveau d’expression de HA-Cdc25C-His dans les
cellules U2OS. En effet les expériences de western blot réalisées à l’aide d’un anticorps dirigé
Discussion
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contre Cdc25C avaient mis en évidence que la quantité de HA-Cdc25C-His présente dans les
extraits cellulaires n’était que légèrement supérieure à celle de Cdc25C endogène. Ceci constituait
un avantage à nos yeux car la purification était réalisée à partir de cellules exprimant des taux de
Cdc25C relativement proche d’un taux physiologique et dont la biologie était ainsi perturbée à
minima. Cependant, l’inconvénient évident auquel nous nous sommes retrouvés confrontés est la
faible quantité de protéine purifiable.
Afin d’améliorer la quantité finale de la phosphatase Cdc25C obtenue à partir de ce modèle
cellulaire, l’augmentation du nombre de cellules en culture auraient peut-être suffit. Cependant,
les cellules U2OS étant des cellules adhérentes, l’augmentation du nombre de cellules implique
l’utilisation d’un matériel beaucoup plus important et une manipulation plus lourde et présente
donc un risque pour la reproductibilité des expériences. Afin de contourner ces problèmes, il
serait envisageable de cultiver les cellules dans un système CellCube par exemple qui permet de
cultiver les cellules adhérentes en “spinner” et d’augmenter significativement le nombre de
cellules en culture.
I-2 : Le contrôle du cycle cellulaire
Le contrôle de l’activation dans des conditions normales du point de contrôle G2/M,
représentait un aspect important de la validation de notre modèle cellulaire. Parmi les différents
agents génotoxiques qui ont été testés (dommages à l’ADN par la bléomycine, inhibition de la
réplication par la gemcitabine…), seul un traitement par l’étoposide a permis d’obtenir une
activation spécifique et irréversible du point de contrôle G2/M sur les cellules U2OS C16-5.
L’étoposide génère des cassures simples et doubles brins de l’ADN en formant un complexe
ternaire avec la topoisomérase de type II, conduisant à une inactivation de la kinase CDK1 et a
un blocage irréversible des cellules en phase G2. Nous avons aussi montré que l’activation du
point de contrôle G2/M par l’étoposide dans ces conditions était accompagnée d’une activation
des kinases Chk1, p42/Erk2MAPK2 et p44/Erk1MAPK1.
Chk1 est une kinase distale de la transduction du signal, activée par ATM ou ATR en réponse
aux cassures doubles brins et simple brin de l’ADN, qui phosphoryle Cdc25C sur la S216 et
inhibe son activité, empêchant alors la déphosphorylation activatrice de CDK1 et conduisant au
blocage des cellules au point de contrôle G2/M (Cf. Introduction générale §II-1). p42/Erk2 et
p44/Erk1 font parties de la grande famille des MAP kinases et appartiennent à la cascade de
signalisation ERK. De nombreuses études ont montré que l’exposition des cellules aux radiations
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ionisantes ou à une variété d’autres stress toxiques conduisait à une activation compensatrice
simultanée des voies de signalisation MAPK (Dent et al., 2003) (Cf. Introduction générale § II-1-B).
La voie Raf/MEK/Erk est classiquement impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire
et la différentiation est activée par des stimuli externes comme les facteurs de croissance. Une
récente étude a montré que p42MAPK était directement impliquée dans l’activation de Cdc25C chez
le xénope durant la transition G2/M, suggérant ainsi un rôle de la voie ERK dans le contrôle du
cycle cellulaire (Wang et al., 2007). Cependant il a été montré que cette voie était également
impliquée dans la réponse cellulaire aux stress provoqués par les radiations ionisantes ou bien les
traitements génotoxiques (Abbott and Holt, 1999; Dent et al., 2003; Tang et al., 2002). Tang et
ses collaborateurs ont montré dans les cellules humaines que p42 et p44/MAPK étaient activées
suite à un traitement étoposide conduisant à un arrêt du cycle cellulaire de manière indépendante
de p53 et ATM (Tang et al., 2002). Enfin une étude plus récente a montré que p42 et p44 était
directement impliquées dans la phosphorylation inhibitrice de Cdc25C sur la S216 et conduisait à
sa dégradation lors du point de contrôle G2/M (Eymin et al., 2006).
Ainsi, nos résultats concordent avec les données bibliographiques décrivant la régulation du
point de contrôle G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN. Nous pouvons donc présenter ici
un résumé général exposant les évènements qui semblent être impliqués dans les cellules U2OS
en réponse à un traitement étoposide.
L’étoposide par l’inhibition de la topoisomérase II, va conduire à la création de cassures
simples et doubles brins sur l’ADN qui vont être reconnues par les complexes MRN et RPA et
ainsi recruter et activer les kinases ATM et/ou ATR conduisant à l’activation de Chk1. La forme
active de Chk1 va alors bloquer la progression cellulaire à la transition G2/M en phosphorylant
ses substrats dont la S216 de Cdc25C, conduisant à une inhibition de la phosphatase empêchant
la déphosphorylation activatrice de CDK1, nécessaire à l’entrée en mitose. En parallèle de cette
cascade de signalisation qui est bien connue, a lieu l’activation de la voie Raf/MEK/Erk et les
kinases Ek1/p44 et Erk2/p42 vont stabiliser l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 par la
phosphorylation inhibitrice de Cdc25C sur la S216 conduisant à sa dégradation et par
l’inactivation directe de CDK1. Ces deux voies semblent être additives puisque l’ajout d’UCN01
n’entraîne qu’une sortie partielle du point de contrôle G2/M.
II- Analyse protéomique
Discussion
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L’analyse par spectrométrie de masse de Cdc25C a été réalisée dans le but d’identifier des
modifications post-traductionnelles présentes in vivo sur la phosphatase Cdc25C purifiée de
cellules en culture.
Cette analyse a ainsi été réalisée par nano-LC-MS/MS sur trois échantillons de populations
cellulaires ayant subi différentes conditions de traitement : des cellules asynchrones (cellules ayant
un cycle cellulaire normal), des cellules traitées par l’étoposide (activation du point de contrôle
G2/M) et des cellules ayant subi un traitement par du nocodazole (les cellules sont synchronisées
en début de mitose). Ces trois conditions avaient été choisies dans le but d’obtenir des
informations sur les MPT régulant les différents “états” de Cdc25C au cours du cycle cellulaire.
En effet Cdc25C est régulée négativement au cours d’un cycle cellulaire normal pour empêcher
les cellules d’entrer précocement en mitose ; Cdc25C est également la cible d’une régulation
négative par les transducteurs lors de l’activation du point de contrôle G2/M ; enfin Cdc25C est
activée lors de l’entrée en mitose.
II-1 : La préparation de HA-Cdc25C-His pour la LC-MS/MS
La première étape consistait donc à purifier la phosphatase Cdc25C dans ces trois conditions
avec le meilleur rendement possible. Nous avons cependant obtenu une quantité de Cdc25C
relativement modeste pour les échantillons “non traité” et “étoposide”, en effet de nombreuses
bandes contaminantes sont encore présentes sur le gel. La purification de l’échantillon
“nocodazole” était de mauvaise qualité et il était, dans ce cas, difficile de détecter la bande
correspondant à HA-Cdc25C-His sur le gel (voir ci-dessous).
Comme la préparation des échantillons avait pour but final de réaliser une analyse par
spectrométrie de masse en mode electrospray, il était nécessaire de détecter sur le gel la bande
correspondant à Cdc25C avec un colorant compatible. Nous avons ainsi choisi le bleu de
coomassie colloïdal qui représente un compromis entre le bleu de coomassie classique, peu
sensible, et la coloration à l’argent, la technique de coloration la plus sensible mais qui est
moyennement compatible avec la spectrométrie de masse. Néanmoins, même si l’ajout du réactif
colloïdal a permis d’augmenter la sensibilité de la détection des protéines, celle-ci reste limitée par
une sensibilité moyenne et une faible linéarité (Neuhoff et al., 1988). Ainsi la coloration poussée
pour permettre la détection de Cdc25C a été accompagnée d’un marquage non spécifique des
protéines minoritaires encore présentes après les étapes de purification. A cause du relativement
faible niveau d’expression de la phosphatase dans les cellules U2OS C16-5 et de la lourdeur de la
Discussion
140
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stratégie de purification, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir suffisamment de matériel pour
mettre au point de meilleures conditions de purification et de détection des protéines sur le gel.
Par ailleurs l’approche de spectrométrie de masse “bottum up” permettait de s’affranchir d’une
grande partie de ces contaminants puisque nous avons découpé dans le gel la bande
correspondant spécifiquement à Cdc25C. La phosphatase a ensuite été hydrolysée par la trypsine
et le mélange peptidique obtenu a été analysé par LC-MS/MS.
II-2 : Le taux de couverture de séquence
Nous avons néanmoins pu réaliser une analyse par spectrométrie de masse sur ces
échantillons. Comme nous recherchions de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la
séquence de Cdc25C, nous avons choisi de réaliser une recherche “globale” de modifications. De
plus, étant limités par la quantité de matériel, il était essentiel d’obtenir le maximum d’information
de séquence à partir d’une seule analyse. Pour cela nous avions choisi une approche nanoLC-
MS/MS sur un appareil hybride de type Q-TOF (QSTAR, Applied Biosystems). En effet le
couplage de l’analyseur temps de vol avec l’ionisation electrospray permet en plus d’un couplage
chromatographique simplifiant le mélange peptidique, d’obtenir une meilleure résolution
augmentant ainsi la qualité des spectres MS/MS. Plus la qualité des spectres MS/MS est grande et
meilleures seront les informations de séquences. Au niveau du gradient de chromatographie, nous
avons choisi un gradient long dans le but de séparer le maximum de peptides. Ainsi au cours de
l’analyse MS un plus grand nombre d’ions parents pourront être sélectionnés pour l’analyse
MS/MS, augmentant à la fois le taux de couverture de séquence analysée et les chances d’obtenir
des informations de séquences sur les peptides modifiés.
Pour chaque échantillon, nous avons appliqué les mêmes conditions d’analyse, mais nous
avons cependant obtenu des taux de couverture de séquence différents. En effet, pour
l’échantillon “non traité” représentant une population cellulaire asynchrone, comme pour
l’échantillon “étoposide” représentant une population de cellules arrêtées en G2/M du cycle
cellulaire par l’activation du point de contrôle, nous avons obtenu un taux de recouvrement de
séquence de 62% et 66% respectivement. En revanche dans le cas de l’échantillon “nocodazole”
représentant les cellules synchronisées en mitose, nous n’avons obtenu que 32% de recouvrement
de séquence.
Discussion
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La faible quantité de Cdc25C purifiée, obtenue avec l’échantillon “nocodazole” peut expliquer
les mauvais résultats acquis au cours de l’analyse par spectrométrie de masse. Le fait que chaque
échantillon ait subi les mêmes conditions de préparation, nous permet d’envisager que la
synchronisation des cellules en mitose pourrait aussi être une cause du mauvais rendement de
purification et du taux de couverture de séquence dérisoire obtenus. Nous proposons ainsi
comme hypothèse que les cellules en mitose, qui sont relativement fragiles puisque leur forme
arrondie leur confère une adhérence limitée, ont été en grande partie perdues au cours de la
manipulation. Cela pourrait expliquer la faible quantité de Cdc25C obtenue dans ces conditions.
Finalement les mauvais résultats obtenus dans ces conditions ne nous ont pas permis de mener
plus loin l’études des MPTs de Cdc25C en mitose.
Par ailleurs, au premier abord les taux de recouvrement de séquence obtenus pour les
échantillons “non traité” et “étoposide” paraissaient suffisants. Nous avions en effet séquencé
plus de la moitié de la séquence de la phosphatase, ce qui correspondait à l’obtention de
séquences peptidiques couvrant environ 70% des résidus sérines et thréonines potentiellement
phosphorylables. Mais nous avions suivi cette approche globale de recherche de MPT dans
l’espoir in fine d’obtenir des informations d’identification et de caractérisation exhaustives des
modifications pouvant être impliquées dans la régulation de Cdc25C. Les couvertures de
séquence obtenues au cours de cette analyse sont ainsi largement insuffisantes pour répondre à
cette question puisque au terme de l’analyse il manque encore 40% d’information de séquence.
L’objectif de l’analyse de Cdc25C par spectrométrie de masse, qui était de développer un outil
puissant permettant d’identifier le maximum de MPT présentes sur la séquence de la
phosphatase, n’a donc pas pu être atteint. L’hydrolyse de Cdc25C avec une autre protéase de
manière conjointe à la trypsine pourrait permettre d’améliorer le taux de couverture de séquence.
Ainsi la double hydrolyse de Cdc25C avec la trypsine et l’endoprotéase Glu C qui réalise des
hydrolyses en carboxy-terminal des résidus acide glutamique et acide aspartique permet d’obtenir
in silico une fragmentation peptidique dont les peptides identifiables par MS/MS correspondent à
93% de la séquence de la phosphatase (d’après PeptideCutter). Ce taux peut encore être augmenté
jusqu’à la totalité de la séquence de la phosphatase si on estime que l’une ou l’autre des enzymes
conduisent à des clivages manqués. Cependant la principale difficulté à laquelle nous avons été
confrontés lors de la mise au point de cette approche résidait dans la complexité d’analyse des
spectres MS/MS obtenus (résultats non montrés). En effet la fragmentation résultante des peptides
obtenus après une hydrolyse par Glu C est aléatoire contrairement aux peptides tryptiques, plus
facile à analyser car par la charge porté par le résidu carboxy-terminal permet plus généralement
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d’obtenir une fragmentation suivant la série des ions y. L’augmentation de la quantité de Cdc25C
purifiée permettra également d’améliorer la couverture de séquence. En effet le mauvais
rendement de purification que nous avons obtenu lors de la préparation des échantillons est
probablement très certainement à l’origine des mauvais résultats obtenus par spectrométrie de
masse. Enfin l’utilisation d’appareils plus performants comme par exemple le LTQ-OrbiTrap, qui
offre une résolution bien supérieure à celle du Q-TOF, permettrait également d’augmenter
significativement les taux de couverture de séquence. En effet la précisons de masse pour cet
appareil est inférieure à 5 ppm, ce qui conduit à une grande précision lors de l’interrogation dans
les banques de données.
L’analyse des spectres MS/MS a néanmoins permis de mettre en évidence deux nouvelles
phosphorylations sur la S263 et sur le résidu S268/ou T270. Il semblerait également que Cdc25C
soit méthylée sur le résidu R35. Il est toutefois surprenant que ce site méthylé soit un site de
clivage par la trypsine, puisqu’en général la trypsine ne reconnaît pas comme site de clivage les
résidus portant des modifications. L’analyse du spectre MS/MS correspondant semble cependant
présenter clairement une méthylation qui ne peut être que sur le résidu R35 (Cf.annexe 1). Enfin,
deux autres phosphorylations, qui avaient déjà été décrites dans la littérature, ont été identifiées,
elles sont localisées sur la S216 et la S168. Il est intéressant de noter que la S168 n’a été retrouvée
phosphorylée que dans le cas de l’analyse de l’échantillon traité par l’étoposide, alors que le
peptide non phosphorylé correspondant à ce site de phosphorylation a été identifié dans les
analyses de l’échantillon non traité et celle de l’échantillon traité par l’étoposide. Le fait que le
peptide non phosphorylé ait été mis en évidence dans les deux analyses nous permet de penser
que ce résidu est phosphorylé en réponse au traitement génotoxique et pourrait être impliqué
dans la régulation du point de contrôle G2/M. De la même manière la phosphorylation de la
S216 a été mise en évidence dans les deux analyses, ce qui nous permet de confirmer le rôle de
cette phosphorylation dans la régulation du cycle cellulaire et dans la réponse aux dommages sur
l’ADN. Il est par ailleurs important de noter que le peptide non phosphorylé correspondant au
site de phosphorylation de la S216 a été mis en évidence dans les deux analyses.
Finalement, les résultats obtenus à partir de l’analyse des spectres MS/MS ont permis de
mettre en évidence quelques modifications post-traductionnelles sur la séquence de Cdc25C, et
en particulier des nouvelles modifications. Cependant ces résultats sont loin d’être satisfaisants
puisque nous n’avons pas été en mesure d’identifier de nombreuses phosphorylations pourtant
décrites dans la littérature. Comment se fait-il que nous n’ayons pas été en mesure de mettre ces
phosphorylations en évidence alors que les peptides non phosphorylés correspondant à ces sites
Discussion
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Charlotte Mailhat�Esmenjaud – Thèse Biologie moléculaire et cellulaire – 31 Octobre 2007
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étaient présents et détectés ? Plusieurs hypothèses qui sont peut être indépendantes les unes des
autres peuvent être proposées :
Tout d’abord nous ne détectons aucune phosphorylation sur les sites S/TP, phosphorylés lors
de la boucle d’activation de Cdc25C : S48, T67, T130 et S214 [la S168 est un cas particulier
puisque nous avons montré qu’elle était également impliquée dans des mécanismes d’inactivation
de la phosphatase (voir plus loin et Cf. partie résultat §IV-1-B)], ni les sites phosphorylés par les
kinases Plk lors de la translocation nucléaire conduisant à l’activation de la phosphatase : la S191
et la S198. Tous ces sites de phosphorylation sont impliqués dans les mécanismes d’activation de
la phosphatase Cdc25C lors de la progression de la cellule en mitose. Il paraît donc normal que
ces sites ne soient pas phosphorylés dans l’échantillon étoposide où le point de contrôle G2/M
est activé. Dans le cas des cellules asynchrones nous proposons que ces formes actives de
Cdc25C soient minoritaires par rapport aux formes inactives de la phosphatase.
D’autre part, il est très probable qu’à l’image du faible taux de couverture de séquence obtenu
au cours de ces analyses, la qualité du signal ait été trop faible pour permettre la réalisation d’une
bonne analyse des spectres correspondant aux peptides phosphorylés minoritaires.
Une autre alternative pour étudier les phosphorylations de Cdc25C en spectrométrie de masse
serait de réaliser une analyse sur la protéine entière (stratégie “Top Down”, Cf. Introduction
générale). Cependant la taille moyenne de Cdc25C rendra son extraction du gel difficile et l’analyse
en solution (approche “hors gel”) de Cdc25C est compliquée puisqu’elle nécessite de trouver des
conditions d’élution de la phosphatase à partir du gel, qui soient adaptées à la spectrométrie de
masse.
Pour conclure sur cette partie nous n’avons globalement pas été satisfaits des résultats obtenus
à la suite de cette analyse par spectrométrie de masse. Mais la lourdeur de l’expérimentation qui
nécessite la manipulation d’un très grand nombre de cellules, une stratégie de purification
complexe et la préparation de l’échantillon pour l’analyse bottom-up ne nous a pas permis
d’améliorer chacune de ces étapes pour aboutir à une analyse globale et définitive des
modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase Cdc25C. Nous avons
néanmoins pointé du doigt deux sites de phosphorylations, la S168 et la S263 qui semblent être
impliquées dans les mécanismes de régulation de la phosphatase Cdc25C. La compréhension du
rôle fonctionnel de ces phosphorylations pourrait alors éclairer une partie des mécanismes
impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et des points de contrôle à travers l’activation ou
l’inactivation de la phosphatase Cdc25C. La présence d’une méthylation sur le résidu R35 était
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également une découverte très intéressante puisqu’elle ouvre des perspectives nouvelles sur les
mécanismes de régulation du cycle cellulaire. Nous regrettons cependant de ne pas avoir pu aller
plus loin et chercher à comprendre quelles étaient ses rôles à cause du manque combiné de temps
et d’expérience dans ce domaine.
III- Caractérisation fonctionnelle des phosphorylations identifiées
La troisième partie de notre projet était donc consacrée à l’étude du rôle fonctionnel des
phosphorylations sur la sérine 168 et sur la sérine 263 de la phosphatase Cdc25C.
Nous avons montré au cours de cette étude que la sérine 263 de Cdc25C était phosphorylée,
aussi bien dans les cellules asynchrones que dans les cellules bloquées au point de contrôle G2/M
par un traitement étoposide.
Nous avons montré avec des expériences d’immunofluorescences avec le mutant non
phosphorylable de la S263 que la phosphorylation de la S263 était impliquée dans un mécanisme
de prévention de la translocation nucléo-cytoplasmique de Cdc25C. En effet, la mutation de la
S263 en alanine conduit à une augmentation de l’abondance nucléaire de Cdc25C. Nous avons
également mis en évidence que ce mécanisme était indépendant du facteur d’export nucléaire
Crm 1, puisque l’inhibition de celui-ci par la leptomycine B renforce l’accumulation nucléaire de
Cdc25C. De plus nous n’avons pas observé de phénotype différent entre la forme sauvage et les
différents mutants en réponse à différents stress cellulaires, ce qui suggère un rôle de la
phosphorylation sur le résidu S263 lors de la régulation de la phosphatase Cdc25C au cours d’un
cycle cellulaire normal, mais pas lors de l’activation du point de contrôle en réponse aux
dommages sur l’ADN.
La S263 est située juste en aval de la NLS, il est alors tentant de proposer que la
phosphorylation de la S263 affecte la disponibilité de la NLS pour les importines, et bloque ainsi
l’import nucléaire de la phosphatase. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans
le cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C qui est située juste en amont de la NLS. Les
auteurs de ce travail ont montré que l’import nucléaire de Cdc25C était régulé par son interaction
avec l’importine β et/ou l’importine α/β. La phosphorylation de la T236 par la kinase CK2
diminue fortement l’interaction de Cdc25C avec les importines et conduit à une rétention
cytoplasmique de Cdc25C mais n’a aucune influence sur l’activité enzymatique de la phosphatase
(Schwindling et al., 2004). Les auteurs avaient alors proposé que la rétention cytoplasmique de
Cdc25C ne fût pas uniquement due à l’interaction de la phosphatase avec les protéines 14-3-3
Discussion
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suite à la phosphorylation de la S216. Ce modèle était d’ailleurs renforcé par les études montrant
que la mutation de la S216 en un résidu non phosphorylable ne conduisait qu’à une accumulation
partielle de Cdc25C dans le noyau (Dalal et al., 1999; Graves et al., 2001). Nous proposons à
notre tour que la rétention cytoplasmique de Cdc25C soit contrôlée par plusieurs événements de
phosphorylation qui semblent être indépendants les uns des autres puisque l’invalidation d’un
seul de ces sites de phosphorylation conduit à une translocation nucléaire partielle de la
phosphatase.
Nous avons également montré que l’accumulation nucléaire du mutant S263A était
accompagnée d’une augmentation du nombre de cellules présentant une condensation
prématurée de la chromatine (PCC) similaire à celle observée lors de l’expression du mutant
S216A de Cdc25C. Il avait par ailleurs été montré que l’induction de PCC par Cdc25C nécessitait
la présence de la Cycline B1 accompagnée d’une déficience de la liaison aux 14-3-3 (Dalal et al.,
1999). De plus une étude structurale avait permis de proposer un modèle où la régulation de
Cdc25C serait dépendante de la compétition entre l’interaction avec les 14-3-3 ou la Cycline B.
L’interaction entre la boite P de la Cycline B et Cdc25C est nécessaire pour l’activation de
Cdc25C et la déphosphorylation de CDK1 lors de la transition G2/M. Ainsi en interphase les 14-
3-3 ont plus d’affinité pour la forme phosphorylée de la S216 et inactive la phosphatase de deux
manières : en masquant la NLS conduisant à sa séquestration cytoplasmique et en empêchant
l’interaction avec la Cycline B. Les auteurs proposaient alors que la dissociation entre 14-3-3 et
Cdc25C soit préliminaire à la déphosphorylation de la S216 (Morris et al., 2000).
Ces données bibliographiques ainsi que les résultats obtenus, nous conduisent à formuler les
questions suivantes : (i) les 14-3-3 interagissent-elle toujours avec Cdc25C(S263A) ? (ii) la
translocation nucléaire de Cdc25C(S263A) est-elle accompagnée d’une dissociation des 14-3-3,
comme dans le cas du mutant S216A ?
La réponse à ces questions permettrait d’appréhender le rôle de cet évènement de
phosphorylation lors de la régulation d’un cycle cellulaire normal. En effet, deux hypothèses
peuvent être envisagées. Tout d’abord la liaison avec les 14-3-3 est maintenue lors de la
relocalisation nucléaire de Cdc25C(S263A). La régulation de la localisation de Cdc25C par
l’intermédiaire de la phosphorylation de la S263 permet d’empêcher l’entrée prématurée des
cellules en mitose de manière indépendante de la liaison aux 14-3-3. Cette hypothèse mettrait
ainsi en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la phosphatase dépendant uniquement
de sa localisation intracellulaire. En revanche si la liaison aux 14-3-3 est dissociée, nous pourrions
alors proposer un mécanisme de régulation similaire à celui de la S216. Dans ce cas la
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phosphorylation de la S263 conduirait à la rétention cytoplasmique de Cdc25C et l’interaction
avec les 14-3-3 dans le cytoplasme permettrait de maintenir Cdc25C sous une forme inactive. Il
serait pour cela important d’analyser les activités catalytiques de la phosphatase phosphorylée sur
la S263 et du mutant S263A. Nous nous proposons également de réaliser des expériences de
“pull down” en utilisant des isoformes de 14-3-3 purifiés, sur lesquels on ferait passer des extraits
cellulaires transfectés par Cdc25C ou ses formes mutées non phosphorylables.
Tous ces résultats permettent de mettre en évidence une régulation complexe de la
phosphatase Cdc25C au cours d’un cycle cellulaire normal par un jeu de
phosphorylation/déphosphorylation.
Un alignement de séquence entre Cdc25B et Cdc25C a permis de montrer que la S263 est
située au niveau d’un des groupements d’acides aminés conservés entre ces deux protéines. Le
résidu équivalent chez Cdc25B est la S375 qui a été identifiée comme étant phosphorylée dans les
cellules en phase exponentielle de croissance (Bouché JP, en préparation). La S375 peut être
phosphorylée par de nombreuses kinases comme Chk1, pEg3, Aurora A et PKB/Akt (Baldin et
al., 2003; Dutertre et al., 2004; Mirey et al., 2005; Schmitt et al., 2006). Ces observations suggèrent
qu’au moins une de ces kinases pourraient phosphoryler la S263 de Cdc25C. Les essais de
phosphorylation in vitro par des kinases recombinantes que nous avons réalisé, nous ont permis
de confirmer que Cdc25C était phosphorylée par Chk1, CDK1-Cycline B, p42 et p44, MK-2 et
AuroraA. Cependant, nous n’avons pas encore été en mesure de déterminer quelles kinases
étaient impliquées spécifiquement dans la phosphorylation de la S263. Pour le savoir, les
anticorps anti-phosphospécifiques auraient été un bon outil. Afin d’appréhender le rôle de cette
phosphorylation dans la régulation de Cdc25C des lapins ont été immunisés avec un peptide de
synthèse présentant le site de phosphorylation de la S263. Cependant, malgré les différentes
étapes de purification à partir du sérum des lapins, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des
anticorps dont la spécificité puisse permettre la réalisation de ces expériences (Cf. Partie résultats
§III-1-B). Ainsi en attendant l’immunisation de nouveaux lapins, nous pourrions envisager de
réaliser des essais kinases in vitro sur une forme mutante non phosphorylable de la S263.
Nous avons également mis en évidence une phosphorylation de sur la S168 de Cdc25C en
réponse à un traitement génotoxique par l’étoposide. Les expériences d’immunofluorescence avec
des mutants de la S168 ne montrent aucun phénotype particulier au cours d’un cycle cellulaire
normal. Cependant en réponse à différents stress génotoxiques, un traitement H2O2 ou par
l’activation de la voie p38, nous avons pu observer un changement de comportement du mutant
Discussion
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S168A sur la localisation intracellulaire de Cdc25C, qui semble être contrebalancé par le mutant
phospho-mimétique (S168E). Ces résultats nous permettent donc de proposer un rôle pour la
phosphorylation de la S168 dans la réponse cellulaire aux dommages et l’activation des points de
contrôle.
Cette hypothèse est renforcée par une étude antérieure qui avait déjà permis de mettre en
évidence que Cdc25C était phosphorylée sur la S168 en réponse aux rayonnements UV. Au cours
de cette analyse les auteurs ont montré que ce résidu était phosphorylé dans la cellule en réponse
aux dommages sur l’ADN et conduisait à une diminution de l’activité phosphatase de Cdc25C
liée a une activation du point de contrôle G2/M. Des études in vitro ont permis de proposer un
rôle de la kinase SAPK/JNK dans la phosphorylation de la S168 (Goss et al., 2003).
Une recherche dans les banques de données a aussi permis de mettre en évidence une forte
homologie de séquence entre les résidus du site consensus de la S168 de Cdc25C : pSPITTVP et
les résidus d’un site de phosphorylation sur la S364 de la MAP kinase phosphatase 1 (MKP1) :
pSPITTSPS. La phosphatase MKP1 est impliquée dans l’inhibition de la voie des MAPK, il a été
montré que les kinases p42MAPK et p44MAPK était impliquées dans cet évènement de
phosphorylation conduisant à la dégradation de MKP1 dépendante du protéasome (Brondello et
al., 1999). Les auteurs ont proposé à partir de ces résultats l’existence d’un mécanisme de contrôle
complexe de la voie ERK où, afin d’éviter une activation trop longue et non désirée des kinases
p42 et p44 (qui conduit à une inhibition de la progression cellulaire en réponse aux dommages)
celles-ci activent les phosphatases MKP1 qui entraînent leur dégradation. Ainsi, bien que nos
résultats aient été obtenus dans un contexte très différent, la régulation du point de contrôle
G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN, nous proposons que les kinases p42 et p44, lors de
l’activation du point de contrôle G2/M, puissent être impliquées dans la phosphorylation
inhibitrice de la S168. En effet, nous avons montré que la voie ERK était activée par l’étoposide,
que la S168 de Cdc25C est phosphorylée en réponse au traitement par l’étoposide et semble être
impliquée dans l’inhibition de la phosphatase en réponse aux stress et enfin que le site de la S168
est homologue d’un site de phosphorylation par les kinases p42 et p44. Pour aller plus loin nous
proposons un modèle similaire à celui de la régulation des phosphatases MKP1. En réponse aux
dommages sur l’ADN, les cascades de signalisation sont activées et en particulier la voie ERK. Ce
qui conduit à une activation prolongée des kinases p42 et p44 inhibant la progression du cycle
cellulaire, entre notament par la phosphorylation de la S168 de Cdc25C entraînant ainsi sa
dégradation. Pour renforcer cette hypothèse, nous pourrions envisager de co-traiter ou non les
cellules, transfectées par les différents mutants de la S168, avec un agent génotoxique et un
Discussion
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inhibiteur spécifique de la voie des MAPK comme le PD98059. Nous pourrions également
étudier la stabilité de Cdc25C en réalisant des cinétiques à la suite d’un traitement génotoxique en
présence d’un inhibiteur de la synthèse protéique comme le cyclohéximide ou l’émétine.
Il serait également essentiel d’identifier les kinases responsables de cette phosphorylation dans
la cellule en réponse aux stress et de mieux comprendre quels sont les mécanismes d’inhibition de
la phosphatase en réponse aux stress. Nous pouvons bien sûr imaginer qu’à l’image de la
régulation de la phosphatase lors d’un cycle cellulaire normal, de nombreux mécanismes de
régulation coexistent. Pour cela la génération de lignées cellulaires stables conditionnelles
exprimant Cdc25C(S168A) ou Cdc25C(S168E) soumises a différent stress en présence des
inhibiteurs des principales voies de signalisation nous permettrait de mieux comprendre le rôle de
cette phosphorylation. D’autre part, l’utilisation d’anticorps spécifiques de cette phosphorylation
serait un atout considérable.
CONCLUSION GENERALE
Conclusion générale
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Conclusion générale
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Au cours des dernières années, les progrès dans la compréhension du cycle cellulaire et des
points de contrôle a permis de mettre en évidence le rôle critique joué par les modifications post-
traductionnelles dans la régulation des protéines. La multiplicité et la diversité du nombre de
MPT rendent cependant complexe l’étude de la régulation post-traductionnelle des régulateurs du
cycle cellulaire. Face à ce nouveau défi, le développement de la protéomique a permis de
proposer des approches alternatives et puissantes pour la détection et la caractérisation des MPT.
Ainsi l’utilisation appliquée de la protéomique pour l’étude des MPT semble être devenue une
technique de choix pour répondre aux enjeux actuels de l’étude et de la compréhension des
mécanismes régulant le cycle cellulaire.
Cependant, les résultats que nous avons obtenus au cours de cette étude à l’aide d’une
approche de protéomique globale de recherche sont loin d’être satisfaisants. Dans le but
d’atteindre notre premier objectif, c'est-à-dire l’identification de manière exhaustive tous les
évènements de phosphorylation ou de modification post-traductionnelle présents sur la
phosphatase Cdc25C, il sera important d’améliorer notre approche protéomique. Nous avons
pour cela proposé d’augmenter la quantité de protéine, de réaliser des hydrolyses enzymatiques
avec différentes protéases et d’utiliser des appareils plus performants afin d’améliorer le
recouvrement de séquence et d’augmenter le nombre de MPT identifiés. Il est également
envisageable de changer de stratégie et de préférer une combinaison d’approches spécifiques à
l’approche protéomique globale. Nous pourrions ainsi mettre en oeuvre des techniques
d’enrichissements par affinité, par exemple les colonnes IMAC ou TiO2 pour la recherche
spécifique des phosphorylations. Ces approches spécifiques présentent l’avantage d’être mieux
adaptées à l’identification et à la caractérisation des MPT. Elles nécessitent cependant de grandes
quantités de matériel et des traitements de l’échantillon qui peuvent être lourdes à mettre en
place. Ainsi il devra également être envisagé de changer de système d’expression de la protéine
pour améliorer le rendement de purification. Néanmoins le développement constant de nouveaux
spectromètres de masse accompagné de nouvelles stratégies d’analyse des MPT, fait de la
protéomique un outil de choix pour décoder des patrons de modifications et ainsi mieux
comprendre la régulation du cycle cellulaire.
Nous avons vu en effet au travers de l’analyse des phosphorylations de Cdc25C que plusieurs
kinases sont responsables de la phosphorylation de plusieurs sites et chaque site peut être
phosphorylé par des kinases différentes. Nous proposons une régulation complexe de la
phosphatase à travers la mise en place de patrons de phosphorylation ou de modification post-
traductionnelles. Nous pouvons en effet imaginer qu’une modification (phosphorylation ou
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méthylation) à un moment donné puisse être à l’origine d’un changement conformationnel de
Cdc25C, permettant alors l’exposition d’autres sites de modification à d’autres enzymes actives à
ce moment précis du cycle cellulaire. Un aspect important dans l’analyse de la régulation de
Cdc25C au cours du cycle cellulaire et lors de l’activation des points de contrôle sera d’identifier
ces différents patrons, puis de comprendre l’information biologique qu’ils transmettent. C’est
pourquoi l’enjeu majeur de cette recherche sera de développer les outils nécessaire à l’analyse de
ces modifications, afin d’accéder à la compréhension de ces différents profils.
Au cours de cette étude, il est également ressorti que de multiples voies de signalisation
pouvaient être activées en réponse aux différents stress et que chaque stress pouvait activer une
ou plusieurs voies de signalisation. Ainsi, de nombreuses cascades de signalisation ont été mises
en évidence lors de l’activation du point de contrôle G2/M et contrôlant l’activité de Cdc25C,
comme par exemple les voies dépendantes des MAP kinases ou encore les voies dépendantes des
kinases ATM ou ATR. Un aspect important sur l’étude de la régulation des points de contrôle en
réponse aux dommages sur l’ADN serait de déterminer spécifiquement quelles cascades de
signalisation sont activées lors de la réponse cellulaire aux endommagements de l’ADN. En effet
l’activation spécifique d’une voie à la suite d’un traitement particulier parallèlement à la mise en
évidence d’un patron de modifications sur Cdc25 pourrait nous mener vers une meilleure
compréhension de la régulation des points de contrôle du cycle cellulaire.
Ainsi après la mise en évidence des différentes modifications impliquées dans la régulation
d’un acteur du cycle cellulaire, le développement d’outils spécifiques pour l’analyse de ces
modifications, comme l’utilisation d’anticorps dirigés spécifiquement contre les sites
phosphorylés, permettrait d’appréhender leur fonction. L’utilisation de ces outils permettra alors
de caractériser spécifiquement les éléments de modification impliqués dans les mécanismes de
régulation du cycle cellulaire et leurs interconnexions. Le décodage des modifications et de leurs
interconnexions permettra alors de décrypter les cascades de signalisation aboutissant aux patrons
spécifiques de phosphorylation sur les protéines effectrices. Une meilleure connaissance des
acteurs et de leurs rôles au cours de la régulation du cycle cellulaire permettra de mettre en
évidence de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement contre les cancers. En effet, les
enzymes régulatrices responsables de ces modifications post-traductionnelles pourrait être ciblées
par la recherche en industrie pharmaceutique dans le cadre du développement de nouvelles
thérapies contre le cancer.
MATERIELS ET METHODES
Matériel et méthodes
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Matériel et méthodes
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I- Analyse des protéines
I-1 : Western blot
Les extraits protéiques sont séparés par migration électrophorètique dans des gels précoulés 4-
12% Bis-Tris NuPAGE (invitrogen). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de
nitrocellulose en milieu semi-sec. Après 1h de saturation de la membrane dans un tampon TBS
0,2%Tween 5% lait , la membrane est incubée à température ambiante pendant 1h avec les
anticorps primaires dilués dans le tampon de saturation : Anti-HA monoclonal (Roche) au
Solution de renaturation SR : Tris 20mM (pH 8,0) ; KCl 0,3M ; Arginine 0,5M (pH 8,0) ;
DTT 10mM.
IV- Protéomique
IV-1 : spectrométrie de masse
La bande colorée au bleu de coomassie colloïdal a été découpée du gel et soumise à une
digestion dans le gel par la trypsine (Promega). Les digestats tryptiques obtenu a été analysé par
un capillaire HPLC (LC Packings) couplé à un spectromètre de masse Qq-TOF nanospray
(QSTAR Pulsar, Applied Biosystems). Les peptides ont été séparés sur une colonne C18 Pep-
MapTM (75µm x 15cm) , après une pré-concentration sur une pré-colonne C18 (5mm x 3cm)
(LC Packings, Dionex) avce un débit de 200nl/min. Les peptides sont élués avec un gradient
linéaire 0-50% de solvant B pendant 100 min (solvant A : 0,2% d’acide formique dans 5%
d’acétonitrile et solvant B : 0,2% d’acide formique dans 5% d’acétonitrile). Le spectromètre de
masse est utilisé en mode positif avec une tension appliquée à l’aiguille de 2,1kV. Les données MS
et MS/MS sont acquises continuellement en mode IDA (information-dependant acquisition) avec des
cycles de 10 secondes. A chaque cycle, un spectre MS est accumulé pendant 1 seconde sur la
plage de masse 300-2000 m/z suivi de trois acquisitions MS/MS de 3 secondes chacune sur les
trois ions les plus abondant du spectre MS. Une exclusion dynamique de 60 secondes est utilisée
pour prévenir la sélection répétée d’un même ion. Les données MS/MS sont acquises avec une
fenêtre d’isolement de 3 m/z. L’énergie de collision est ajustée automatiquement en fonction de
l’état de charge et de la masse de l’ion précurseur et le gaz de collision est N2. Le moteur de
recherche MASCOT (Matrix Science, London) a été utilisé pour l’identification de la protéine et
des peptides modifiés.
Matériel et méthodes
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IV-2 : Electrophorèse bidimensionnelle
La première dimension est établie sur le système IPGphor. Les IPG strips (pH 3-10 NL) sont
réhydratés par l’échantillon pendant 12h sous 50V à 20°C. L’échantillon est ensuite focalisé par
gradient de 50V à 500V en 1h, 500-1000V en 1h, 1000-8000V 3h suivi d’un pallier 8000V 1h.
Immédiatement avant la deuxième dimension, l’IPG strip est incubée dans 5ml de 50mM Tris-
HCl, 6M urée, 2% SDS, 30% glycérol et 65mM DTT pendant 15 minutes sous agitation
continue, suivie de 15 minutes dans le même tampon où le DTT est remplacé par 2,5%
d’iodoacétamide. Les protéines sont ensuite séparées dans une deuxième dimension SDS-PAGE
au moyen du système SE600 (Pharmacia).sur des gels d’acrylamide 12%. La migration est arrêté
après 4h à 160V et les protéines sont détéctées par western blot.
ANNEXES
Annexes
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Annexe 1 : Spèctre de MS/MS de l’arginine 35 méthylée
L’annexe 1 représente le spectre MS/MS du peptide 28-MLNLLLER-35 portant une
méthylation [ions parental doublement chargé (MH2)2+ à m/z 508,3]. Les ions fragments observés
confirment la séquence du peptide et la présence d’un groupement méthyl. Localisé. L’ion y2
(m/z 318,2) confirme la présence d’une méthylation sur le résidu R35.
Annexes
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Annexe 2 : Spèctre MS/MS de la phosphorylation sur la T268 ou T270
L’annexe 2 représente le spectre MS/MS du peptide monophosphorylé 261-
TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 [Ion parental triplement chargé, (MH3)3+ à
m/z 1083,2]. Les ions fragments observés confirment la séquence du peptide ainsi que la
présence d’un groupement phosphate sur le peptide. La série des ions y et l’ion fragment b4 (m/z
401,24) montrent que les résidus S277, S287, T261 et S263 ne portent pas de groupement
phosphate. Le spectre MS/MS ne nous permet pas de conclure sur la position de la
phosphorylation entre les résidus T268 et T270.
Annexes
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Annexe 3 : Article
Annexes
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Charlotte Mailhat�Esmenjaud – Thèse Biologie moléculaire et cellulaire – 31 Octobre 2007
Université Paul Sabatier Toulouse III – Ecole doctorale Biologie, Santé, Biotechnologie
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Charlotte Mailhat-Esmenjaud
Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M du cycle
cellulaire
Directeur de thèse : Bernard Ducommun
Résumé :
La phosphatase Cdc25C est un acteur critique de la progression du cycle cellulaire par son rôle
jouée dans le contrôle de l’activation du complexe CDK1-Cycline B lors de l’entrée en mitose et
de la mise en place des mécanismes de surveillance. Son activité est régulée par de nombreuses
kinases impliquées dans les cascades de signalisation cellulaire résultant dans la phosphorylation
de nombreux résidus. Au cours de cette étude, nous avons purifié Cdc25C à partir de cellules
humaines et réalisé une approche protéomique globale dans le but d’identifier de nouvelles
modifications régulatrices. Nous présentons dans ce manuscrit la mise au point des conditions de
purification de la phosphatase et les différentes modifications post-traductionnelles que nous
avons identifiées par spectrométrie de masse, en particulier deux phosphorylations sur les résidus
S168 et S263 et une méthylation sur le résidu R35. Pour terminer nous avons réalisé une analyse
fonctionnelle des phosphorylations sur les S168 et S263. Nous avons montré par imagerie
cellulaire que la mutation de la S263 en alanine conduisait à l’accumulation nucléaire de Cdc25C.
Nous proposons ainsi que la phosphorylation de la S263 soit impliquée dans un mécanisme de
régulation qui module l’import nucléaire de Cdc25C.
Mots clés :
Cycle cellulaire, points de contrôle, Cdc25C, phosphatase, modification post-traductionnelle, localisation.
Discipline administrative :
Biologie Cellulaire et Moléculaire
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération
Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109 118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1