Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin, dem Institut für Pathologie und der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach Insemination INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Anke Döhring aus Lüneburg Hannover 2004
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Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin, dem Institut für
Pathologie und der Arbeitsgruppe Immunologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung
der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach
Insemination
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Anke Döhring
aus Lüneburg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. D. Waberski
Prof. Dr. M. Hewicker- Trautwein
PD Dr. H.-J. Schuberth
1. Gutachterin: Prof. Dr. D. Waberski
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004
Diese Arbeit wurde gefördert von der Dr. Dr. h.c. Karl Eib l Stiftung, der Deutschen
Forschungsgemeinschaft und dem Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion.
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden auf der 37. Jahrestagung über Physiologie und
Pathologie und 29. Veterinär- Humanmedizinischen Gemeinschaftstagung unter dem Titel
„Establishment of an in vivo model for characterisation of leukocyte immigration into the
uterus of gilts after insemination“ (A. DÖHRING, F. ARDON, N. RITTER, H.J. SCHUBERTH,
H. ZERBE, M. HEWICKER- TRAUTWEIN, D. WABERSKI, R.H.F. HUNTER) präsentiert.
2.1 HISTOLOGISCHE MORPHOLOGIE DES ENDOMETRIUMS.............................................. 10 2.1.1 Veränderungen im porcinen Endometrium während des Zyklus ......................... 10
2.2 LEUKOZYTEN IM PORCINEN UTERUS ......................................................................... 12 2.3 IMMUNREAKTION DES PORCINEN UTERUS NACH INSEMINATION ............................... 15 2.4 MORPHOLOGIE DER UTEROTUBALEN VERBINDUNG DES SCHWEINS .......................... 16 2.5 LYMPHGEFÄßSYSTEM ................................................................................................ 18
2.5.1 Lymphgefäßsystem des porcinen Uterus.............................................................. 20 2.5.2 Technik der Lymphgewinnung ............................................................................. 22 2.5.3 Zellen in der Lymphe............................................................................................ 24 2.5.4 Lymphfluss............................................................................................................ 26
3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 27
4.1 GEWINNUNG UTERINER LYMPHE............................................................................... 47 4.1.1 Lymphfluss........................................................................................................... 48 4.1.2 Zellzahlen in der Lymphe ..................................................................................... 49
4.2 IMMUNPHÄNOTYPISCHE EIGENSCHAFTEN VON LEUKOZYTEN AUS UTERUSVENE, OVARARTERIE UND PERIPHEREM BLUT .................................................................... 51 4.3 IMMUNPHÄNOTYPISCHE EIGENSCHAFTEN VON LEUKOZYTEN AUS DEN LNN. UTERINI ............................................................................................................ 53 4.4 ERGEBNISSE DER IMMUNHISTOCHEMISCHEN UNTERSUCHUNGEN .............................. 55
4.4.1 Immunhistochemischer Nachweis von MHCII Oberflächenantigen .................... 56 4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von CD4 Oberflächenantigen ........................ 58
4. 5 NACHWEIS VON MASTZELLEN IM ENDOMETRIUM ..................................................... 60
5.1 ETABLIERUNG DES TIERMODELLS ZUR CHARAKTERISIERUNG DER IMMUNREAKTION DES PORCINEN UTERUS NACH INSEMINATION............................................................ 61 5.2 GEWINNUNG VON LYMPHE DES PORCINEN UTERUS .................................................. 62 5.3 DIFFERENZIERUNG DER LEUKOZYTENPOPULATION DES LOKALEN UTERINEN BLUTGEFÄßSYSTEMS UND DER UTERINEN LYMPHKNOTEN ........................................ 64 5.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN UND MASTZELLNACHWEIS................. 66
Gesichtfelder wurden nahe des Oberflächenepithels für die Beurteilung von
Oberflächenepithel und oberflächlichem Stroma sowie 7 Gesichtsfelder im Bereich der
uterinen Drüsen für die Beurteilung von tiefem Stroma und Drüsenepithel zufällig
ausgewählt. Für die Auswertung der Mastzellfärbung wurden 10 epithelnahe Gesichtsfelder
ausgezählt, da im tiefen Stroma keine Mastzellen nachweisbar waren.
46
3.3.8 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung aus Blut und
Lymphknoten
Die Leukozytendifferenzierung erfolgte mittels indirekter Membranfluoreszenz und
durchflusszytometrischer Analyse. Dabei wurde zuerst ein primärer Antikörper, der gegen
bestimmte Oberflächenantigene (s. 3.2.6) gerichtet ist, eingesetzt. Der nachfolgend
verwendete Antikörper ist fluorochromkonjugiert und bindet an den primären Antikörper.
Im Durchflusszytometer wurden die Fluoreszenzintensität der markierten Zellen und der
prozentuale Anteil Fluoreszenz- positiver Zellen ermittelt. Die mittleren
Fluoreszenzintensitäten wurden als Prozente der Expressionsdichte definiert. Diese
Untersuchungen wurden freundlicherweise von Frau Nadine Ritter aus der Arbeitsgruppe
Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.3.9 Zellzahlbestimmung der Lymphe
Die Untersuchung der gewonnenen Lymphproben übernahm freundlicherweise Frau Nadine
Ritter aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Nach
Bestimmung des Volumens wurde die Lymphe mittels einer Zählkammer nach Thoma auf die
Gesamtzahl von Zellen sowie die Anzahl kernhaltiger Zellen untersucht.
3.3.10 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Statistikprogramms SAS®. Bei
Normalverteilung (Shapiro- Wilks- Test) wurde der gepaarte T- Test durchgeführt. Für nicht
normalverteilte Werte wurde der Wilcoxon signed rank Test verwendet. Als signifikant galten
Werte mit p= 0,05.
47
4 Ergebnisse
4.1 Gewinnung uteriner Lymphe
Nach subseröser Injektion von Evans Blue wurde der Farbstoff innerhalb von Sekunden in die
uterinen Lymphgefäße aufgenommen, die sich dadurch deutlich darstellten. Viele feine
Lymphgefäße, die im Lig. latum uteri vom Uterushorn zum regionären Lymphknoten ziehen,
waren zu erkennen (s. Abb.1). Die Gewinnung uteriner Lymphe erwies sich jedoch als äußerst
schwierig (siehe 3.3.3.). Bei der Präparation kam es leicht zu Beschädigungen der
Lymphgefäße, die dann kollabierten. Auch stellten sich häufig vor Beginn der Präparation
relativ stark erscheinende Lymphgefäße während der Präparation als ein Bündel feinster
Gefäße dar. Mit Methode I und II kam es durch das vollständige Freipräparieren eines
Lymphgefäßes zu relativ starken Blutungen. In den verwendeten englumigen Kanülen
koagulierte die Lymphe leicht. Durch die Verwendung eines mit Heparin gefüllten
Polyethylenschlauchs mit größerem Durchmesser (Methode III und IV) konnte dieses
Problem gelöst werden. Auch konnten Blutungen durch oberflächliche stumpfe Präparation
eingeschränkt werden (s. Abb.2). Da es bei Methode III und IV beim Einschneiden mit einer
Irisschere unvermeidlich zum Kollabieren des Lymphgefäßes kam, wurde eine Lupenbrille
verwendet, um das Einführen des Polyethylenschlauchs unter visueller Kontrolle zu
ermöglichen.
Mit Methode I (Tier 1 bis 3) konnten bei 2 von 3 Tieren geringe Mengen Lymphe gewonnen
werden, mit Methode II (Tier 4 bis 7) bei 3 von 4 Tieren jeweils eine Lymphprobe. Methode
III (Tier 8 bis 11) ermöglichte die Lymphgewinnung bei 3 von 4 Tieren, Methode IV (Tier 12
bis 17) bei 5 von 6 Tieren. Da mittels Methode III relativ gute Erfolge bei der
Lymphgewinnung erzielt wurden, wurde diese durch Modifikationen des zeitlichen Ablaufs
zu Methode IV, die zur Probengewinnung für weitere Analysen genutzt wurde.
48
4.1.1 Lymphfluss
Der Lymphfluss wurde aus dem gewonnenen Lymphvolumen und der Sammeldauer der
einzelnen mittels Methode IV gewonnenen Proben berechnet. Es gab starke Schwankungen
sowohl zwischen den Tieren als auch zwischen den Einzelproben innerhalb eines Tieres (s.
Abb.4). Der durchschnittliche Lymphfluss lag bei 42 µl/min bzw. 2,5 ml/h und variierte in
den Einzelproben zwischen 14,3 und 83,3 µl/min bzw. 0,9 und 5,0 ml/h. Ein Einfluss der
Insemination auf den Lymphfluss konnte nicht beobachtet werden.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60
Sammeldauer (min)
Lym
phflu
ss (
µl/m
in)
Tier 12 S
Tier 14 K
Tier14 S
Tier 15 K
Tier 15 S
Tier 16 K
Tier 16 S
Abb. 4: Lymphfluss im Verlauf der Lymphgewinnung S: Lymphe des mit Samen behandelten Uterushorns K: Lymphe des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
49
4.1.2 Zellzahlen in der Lymphe
Von 17 operierten Tieren wurde bei 13 Tieren Lymphe gewonnen. Die gewonnenen
Lymphproben der ersten 7 Tiere wurden nur qualitativ auf das Vorkommen von kernlosen
(Erythrozyten) und kernhaltigen (Leukozyten) Zellen untersucht. Von allen weiteren
gewonnenen Lymphproben wurden neben dem Volumen auch Gesamtzellzahl und Anzahl
kernhaltiger Zellen bestimmt.
Bei den Zellen in der mit Methode I gewonnenen Lymphe handelte es sich fast ausschließlich
um Erythrozyten oder Zelltrümmer. Auch die mittels Methode II gewonnenen Proben
enthielten große Mengen an Erythrozyten. Bei der Lymphgewinnung mit Methode III lag das
Verhältnis von Gesamtzellzahl zu Anzahl kernhaltiger Zellen durchschnittlich bei 1 zu 26,4.
Mit Methode IV ermittelte Volumina und Zellzahlen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Durchschnittlich lag hier das Verhältnis Gesamtzellzahl zu kernhaltigen Zellen bei 1 zu 25.
Bei zunehmender Dauer der Lymphgewinnung verschob sich das Verhältnis von kernhaltigen
zu kernlosen Zellen durchschnittlich zugunsten der kernhaltigen Zellen. Bei zwei Tieren kam
es in der zweiten Lymphprobe zu einem Anstieg des Erythrozytenanteils, der dann wieder
abnehmend war (s. Abb. 5). In allen Proben waren jedoch Erythrozyten nachweisbar. Da eine
Kontamination der Lymphproben mit Blut nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde keine
Differenzierung der Leukozytenpopulationen durchgeführt.
Durchschnittlich verringerte sich vor allem der Anteil an Erythrozyten in der Lymphe. Die
Anzahl kernhaltiger Zellen zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Tieren und lag dabei
zwischen 20 und 600 Leukozyten/µl. Bei 3 Proben (Tier 12, S1- S4; Tier 14, K1- K4; Tier 15
S1- S4) erhöhte sich im Verlauf der Lymphgewinnung die Anzahl Leukozyten (s. Tab.1).
50
Tabelle 1: Volumina und Zellzahlen der gewonnenen Lymphe mit Methode IV
Tier- nr.
Probe *
Sammel-dauer
(min) je Probe
Gesamt-sammel-
dauer (min)
additiv
Volumen (µl)
Lymph-fluss
(µl/min)
Gesamt-zellzahl/µl
Kern-haltige Zellen
/µl
Gesamte/ kern-
haltige Zellen
12 S 1 14 14 500 35,7 3620 60 60,3 12 S 2 16 30 <5 n.e. n.e. n.e. n.e. 12 S 3 16 46 800 50,0 5240 200 26,2 12 S 4 9 55 500 55,6 7220 260 27,8 14 K 1 12 12 250 20,8 3120 60 52,0 14 K 2 15 27 280 18,7 1200 160 7,5 14 K 3 15 42 250 16,7 720 200 3,6 14 K 4 15 57 400 26,7 2480 600 3,9 14 S 1 11 11 520 47,3 1120 400 2,8 14 S 2 15 26 500 33,3 n.e. n.e. n.e. 14 S 3 15 41 900 60,0 1000 360 2,8 14 S 4 15 56 480 32,0 440 160 2,7 15 K 1 10 10 500 50,0 920 480 1,9 15 K 2 15 25 500 33,3 1280 40 32,0 15 K 3 15 40 480 32,0 500 40 12,6 15 K 4 15 55 650 43,3 480 40 12,0 15 S 1 7 7 100 14,3 1420 60 23,7 15 S 2 15 22 800 53,3 540 100 5,4 15 S 3 15 37 480 32,0 580 240 2,4 15 S 4 15 52 500 33,3 920 480 1,9 16 K 1 11 11 450 40,9 2540 60 42,3 16 K 2 15 26 1100 73,3 5180 60 86,4 16 K 3 15 41 1250 83,3 3300 40 82,5 16 K 4 15 56 900 60,0 1380 20 68,9 16 S 1 10 10 500 50,0 1660 60 27,6 16 S 2 15 25 800 53,3 580 60 9,6
* Probe S kennzeichnet die gewonnene Lymphe der inseminierten Seite, Probe K die der Kontrollseite; 1-4: aufeinander folgende Lymphproben aus einem Lymphgefäß; n.e.: nicht ermittelt
51
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60
Gesamtsammeldauer (min)
Ges
amtz
ellz
ahl/k
ern
hal
tig
e Z
elle
n
Tier 10 K
Tier 12 S
Tier 14 K
Tier14 S
Tier15 K
Tier 15 S
Tier 16 K
Tier 16 S
Mittelwert
Abb. 5: Verhältnis Gesamtzellzahl zu Anzahl kernhaltiger Zellen im Verlauf der Lymphgewinnung
S: Lymphe des mit Samen behandelten Uterushorns K: Lymphe des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
4.2 Immunphänotypische Eigenschaften von Leukozyten aus
Uterusvene, Ovararterie und peripherem Blut
Es erfolgte ein Vergleich der immunphänotypischen Eigenschaften von Leukozyten aus dem
Blut von Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene (peripheres Blut) nach intrauteriner
Applikation von Kochsalzlösung in ein Uterushorn und Samen in das contralaterale Horn. Bei
gleicher Behandlung wurden die Blutproben auch untereinander verglichen.
Für CD18 positive Zellen konnte durchflusszytometrisch eine schwach oder intermediär
positive Zellpopulation ermittelt werden (CD18 int.). Daneben wurden Zellen nachgewiesen,
52
die das CD18 Molekül stark exprimieren (CD18 high). Vergleichbares wurde für das CD8
Molekül ermittelt. Hier wurde zwischen CD8 high und der Gesamtfraktion CD8 positiver
Zellen (CD8 total) differenziert. In den Blutproben aus der Ovararterie konnten im Vergleich zum peripheren Blut aus der
Ohrvene signifikant weniger CD8 high exprimierende Zellen nach Behandlung mit Samen
beobachtet werden. Für CD4 war nach Kochsalzbehandlung ein signifikanter Anstieg in den
Blutproben aus der Uterusvene im Vergleich zur Ohrvene zu beobachten (s. Tab. 2).
Zwischen den Behandlungen mit Samen und Kochsalzlösung konnten keine signifikanten
Unterschiede festgestellt werden.
Tab. 2 : Prozentuale Reaktivität monoklonaler Antikörper mit Leukozyten aus
Ovararterie, Uterusvene und peripherem Blut (Mittelwerte und Standardabweichungen)
Probe
CD18 int. MW±SD
CD18 high
MW±SD
CD4 MW±SD
CD8 high MW±SD
CD8 total
MW±SD
MHCII-DR
MW±SD
MHCII-DQ
MW±SD
A. ovarica S
77,9±8,1 n=6
22,2±7,9 n=6
35,8±8,1
n=5 15,5±5,0a
n=5 39,5±4,7
n=5 42,9±15,7
n=5 41,6±6,4
n=5
V. uterina S
80,4±8,2 n=6
19,7±8,2 n=6
32,8±10,6 n=5
15,8±4,2 n=5
40,6±3,9 n=5
47,0±10,8 n=6
45,2±11,3 n=6
Peripheres Blut S*
84,2±5,3 n=5
15,8±5,3 n=5
37,8±4,7 n=3
16,6±2,7b n=3
37,3±9,3 n=4
40,8±5,3 n=4
39,1±5,9 n=4
A. ovarica K
82,3±6,0 n=6
17,8±6,1 n=6
36,2±4,7 n=5
15,8±6,0 n=5
39,8±4,8 n=5
42,5±4,2 n=6
41,6±2,7 n=6
V. uterina K
77,6±11,9 n=6
22,4±11,9 n=6
35,9±4,4a n=5
15,7±6,8 n=5
42,1±5,5 n=5
47,5±8,7 n=6
43,1±6,7 n=6
Peripheres Blut K*
77,5±17,2 n=6
22,5±17,2 n=6
32,4±5,7b n=4
17,2±6,3 n=5
43,4±9,4 n=5
48,4±14,1 n=6
45,4±14,4 n=6
*: Blut aus der Ohrvene wurde zeitgleich mit den Blutproben aus Ovararterie und Uterusvene auf der mit Samen (Peripheres Blut S) bzw. mit Kochsalzlösung (Peripheres Blut K) behandelten Seite entnommen. a, b: signifikanter Unterschied zwischen Werten in einer Spalte (p=0,05); K: Blutprobe der Kontrollseite; S: Blutprobe der inseminierten Seite
53
4.3 Immunphänotypische Eigenschaften von Leukozyten aus den
Lnn. uterini
Nach Beenden von Lymph- und Blutgewinnung wurden die Lnn. uterini entnommen, die bei
7 von 10 Tieren auf beiden Seiten und bei 2 Tieren einseitig vorhanden waren. Bei der
Entnahme der Lymphknoten kam es aufgrund des Versuchsaufbaus zu unterschiedlichen
Zeitintervallen zwischen Behandlung und Probenentnahme für das inseminierte Uterushorn
und das Kontrollhorn (s. 3.3.3.4.). Aus diesem Grund wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und
bei weiteren Tieren zuerst physiologische Kochsalzlösung appliziert. Ein Einfluss der
unterschiedlichen Zeitintervalle auf die Untersuchungsergebnisse konnte nicht beobachtet
werden (Daten nicht dargestellt). Die entnommenen Lymphknoten wurden homogenisiert und
die Leukozyten durchflusszytometrisch untersucht. Dabei wurde die Expressionsdichte von
CD4, CD8, CD18, MHCII-DR und MHCII-DQ Oberflächenmolekülen bestimmt.
0
20
40
60
80
CD18int CD18high CD4 CD8high CD8total DR DQ
Ln. SLn. K
Abb. 6: Mittelwerte der prozentualen Reaktivität monoklonaler Antikörper mit
Leukozyten aus den Lnn. uterini von 6 Tieren Ln. S: Ln. uterinus des mit Samen behandelten Uterushorns Ln. K: Ln. uterinus des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
54
Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Leukozytenpopulationen der
untersuchten Lymphknoten der inseminierten Seite und der Kontrollseite. Allerdings zeigte
die Auswertung für 3 von 6 Tieren zahlenmäßig höhere Werte für MHCII-DR sowie für 3 von
4 Tieren zahlenmäßig niedrigere Werte für CD4 in den Lymphknoten des mit Samen
behandelten Uterushorns (s. Tab. 3 und Abb. 6).
Tabelle 3: Prozentuale Reaktivität monoklonaler Antikörper mit Leukozyten aus den
Lnn. uterini
Tier-
nummer
Probe CD18
int.
CD18
high
CD4 CD8
high
CD8
total
MHCII-
DR
MHCII-
DQ
11 Ln. S 66,2 33,8 16,7 4,0 24,0 60,3 47,3
11 Ln. K 75,5 24,5 17,7 5,1 19,4 59,9 52,2
13 Ln. S 83,6 16,3 36,9 15,4 24,8 45,5 37,7
13 Ln. K 71,3 28,7 45,3 13 24,1 37 35,8
14 Ln. S 55,6 44,4 53,5 12,9 40,4 47,6 40,8
14 Ln. K 66,6 33,4 59,7 11,2 40,4 39,2 32,6
15 Ln. S 100,0 0,1 21,4 8,9 n.e. 44,1 0,5
15 Ln. K 99,5 0,5 32,7 9,1 n.e. 44,9 0,3
16 Ln. S 62,8 37,2 n.e. n.e. 16,8 59,3 0,5
16 Ln. K 60,8 39,2 n.e. n.e. 19,0 60,1 0,7
17 Ln. S 99,1 n.e. n.e. n.e. n.e. 76,9 67,9
17 Ln. K 63,9 n.e. n.e. n.e. n.e. 39 61,8
Ln. S: Ln. uterinus des mit Samen behandelten Uterushorns Ln. K: Ln. uterinus des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
55
4.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen
Für die immunhistochemische Untersuchung der uterinen Gewebeproben stellte sich zum
einen die Frage, ob es Unterschiede in der Expression von Oberflächenmolekülen zwischen
inseminiertem Uterushorn und Kontrollhorn gab. Zum anderen sollten mögliche Unterschiede
zwischen Uterus und uterotubaler Verbindung näher beleuchtet werden. Weiterhin wurde bei
der mikroskopischen Auswertung der immunhistochemischen Schnitte das Endometrium in 4
verschiedene Abschnitte unterteilt und bewertet. Es erfolgte die Einteilung in
Oberflächenepithel, oberflächliches und tiefes Stroma sowie Drüsenepithel. Alle mit in die
Auswertung einbezogenen Tiere befanden sich im Östrus. Ein im Interöstus (Tag 10)
operiertes Tier wurde gesondert betrachtet.
Bei der Entnahme der Gewebeproben kam es, wie auch bei den Lymphknoten, aufgrund des
Versuchsaufbaus zu unterschiedlichen Zeitintervallen zwischen Behandlung und
Probenentnahme für das inseminierte Uterushorn und das Kontrollhorn (s. 3.3.3.4.). Aus
diesem Grund wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und bei weiteren Tieren zuerst physiologische
Kochsalzlösung appliziert. Ein Einfluss der unterschiedlichen Zeitintervalle auf die
Untersuchungsergebnisse konnte nicht beobachtet werden (Daten nicht dargestellt).
Als positiv, also reaktiv mit dem verwendeten Antikörper, wurden Zellen gewertet, die an
ihrer Oberfläche eine braune Färbung aufwiesen.
Die bei allen immunhistochemischen Färbungen mitgeführte Negativkontrolle zeigte in
keinem Fall eine positive Braunfärbung. Als positive Kontrolle dienende
Lymphknotenschnitte färbten sich in jedem Fall entsprechend dem jeweiligen Antikörper.
Bei allen untersuchten Proben östrischer Tiere war eine starke Infiltration von neutrophilen
Granulozyten im Endometrium zu beobachten. Diese waren vor allem im oberflächlichen
Stroma unter dem Oberflächenepithel sowie in der Umgebung von Blutgefäßen anzutreffen.
56
4.4.1 Immunhistochemischer Nachweis von MHCII Oberflächenantigen
MHCII Oberflächenantigen wird von verschiedenen Zellen exprimiert, zum einen von
antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und Makrophagen, zum anderen auch
von Lymphozyten und Endothelzellen.
Bei der durchgeführten immunhistochemischen Färbung zeigten alle beobachteten
Endothelzellen eine positive Reaktion mit dem verwendeten monoklonalen Antikörper. Sie
wurden nicht mit in die Auswertung einbezogen. Da eine eindeutige Differenzierung
zwischen dendritischen Zellen und Makrophagen im lichtmikroskopischen Bild nicht möglich
war, wurden diese als MHCII positive Zellen gemeinsam bewertet (siehe Abb.7).
Die morphometrische Auswertung der mittleren Anzahl MHCII positiver Zellen in der
immunhistochemischen Färbung ergab signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen
mit Samen und Kochsalzlösung (s. Tab. 5). In der Gesamtsumme positiver Zellen waren im
inseminierten Uterushorn (Uterus S) signifikant mehr MHCII positive Zellen nachweisbar als
im Kontrollhorn (Uterus K). Ein gleichgerichteter signifikanter Unterschied fand sich auch
zwischen inseminierter uterotubaler Verbindung (UTJ S) und mit Kochsalzlösung infundierter
uterotubaler Verbindung (UTJ K) in der Gesamtsumme MHCII positiver Zellen.
Auch für die verschiedenen Abschnitte des Endometriums waren signifikante Unterschiede
zu verzeichnen. Im Oberflächenepithel der uterotubalen Verbindung waren nach Applikation
von Samen signifikant mehr MHCII positive Zellen als nach Kochsalzapplikation
nachweisbar.
Zwischen den Lokalisationen Uterus und uterotubale Verbindung konnten nach
Samenapplikation signifikante Unterschiede verzeichnet werden. In der uterotubalen
Verbindung waren in der Summe sowie im Drüsenepithel signifikant mehr MHCII positive
Zellen als im Uterus nachweisbar.
Das im Interöstus operierte Tier wies im Vergleich zu den östrischen Tieren zahlenmäßig
weniger MHCII positive Zellen auf. Die Summe der MHCII positiven Zellen (Mittelwerte aus
7 epithelnahen und 7 epithelfernen Gesichtsfeldern) betrug nach Applikation physiologischer
Kochsalzlösung im Uterus 11,4 und in der uterotubalen Verbindung 17,4. Nach
57
Abb.7: MHCII positive Zellen im tiefen Stroma der UTJ. 400x
Abb. 8: CD4 positive Zellen im oberflächlichen Stroma der UTJ. 400x
Abb. 9: Tryptasepositive Mastzellen im oberflächlichen Stroma der UTJ. 630x
Pfeilrichtung rechts: MHCII positive Zellen im tiefen Stoma Pfeilrichtung links: MHCII positive Zellen im Drüsenepithel Nicht markierte braun gefärbte Zellen: Endothelzellen
Bereich mit starker Infiltration CD4 positiver Zellen (braun gefärbte Zellen)
Pfeile: Mastzellen
58
Samenapplikation betrug die Summe im Uterus 15,0 und in der uterotubalen Verbindung
22,4. Vor allem in Oberflächen- und Drüsenepithel waren zahlenmäßig weniger MHCII
positive Zellen als bei östrischen Tieren nachzuweisen.
Tabelle 5: MHC II positive Zellen im Endometrium. Mittelwerte und
Standardabweichungen aus je 7 epithelnahen und epithelfernen Gesichtsfeldern*.
MHCII positive Zellen. Mittelwerte und Standardabweichungen
Lokalisation Oberflächen-epithel
Oberflächliches Stroma
Tiefes Stroma
Drüsen-epithel Summe
Uterus K (n=5)
1,7±1,4 9,4±3,1 7,7±1,9 0,7±0,4 19,5±6,0a
Uterus S (n=5) 2,5±2,1 10,9±1,0 9,3±2,3 1,0±0,7x 23,7±4,5b, x
UTJ K (n=4)
2,5±1,2a 12,4±4,5 8,4±2,5 1,1±0,2 24,3±7,2a
UTJ S (n=5) 4,0±1,1b 16,2±0,9 11,1±3,1 2,2±0,2y 33,5±4,4b,y
a,b: signifikanter Unterschied innerhalb gleicher Lokalisationen zwischen unterschiedlichen Behandlungen (p= 0,05)
x,y : signifikanter Unterschied zwischen unterschiedlichen Lokalisationen bei gleicher Behandlung (p= 0,05) K: Kontrolle; S: inseminiert * : Oberflächliches Stroma und Oberflächenepithel in epithelnahen, tiefes Stroma und Drüsenepithel in epithelfernen Gesichtsfeldern bewertet
4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von CD4 Oberflächenantigen
CD4 Oberflächenantigen wird von Lymphozyten (T- Helferzellen und inflammatorische T-
Zellen) sowie von Monozyten und Makrophagen exprimiert.
Bei der lichtmikroskopischen Beurteilung der immunhistochemischen Färbung zeigte sich
eine sehr ungleichmäßige Verteilung der CD4 positiven Zellen. In einigen Bereichen des
Endometriums waren sie nur vereinzelt, in anderen Bereichen dagegen äußerst zahreich
nachzuweisen (s. Abb.8). Vor allem in der Umgebung von Blutgefäßen zeigte sich teilweise
eine starke Emigration dieser Zellen.
59
Die morphometrische Auswertung CD4 positiver Zellen in der immunhistochemischen
Auswertung ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen Behandlungen oder
Lokalisationen (s. Tab.6).
Bei dem im Interöstrus operierten Tier waren bezüglich der CD4 positiven Zellen keine
deutlichen Unterschiede zu östrischen Tieren zu beobachten. Die Summe der CD4 positiven
Zellen (Mittelwerte aus 7 epithelnahen und 7 epithelfernen Gesichtsfeldern) betrug nach
Applikation von physiologischer Kochsalzlösung im Uterus 9,0 und in der uterotubalen
Verbindung 21,6. Nach Samenapplikation betrug die Summe im Uterus 8,6 und in der
uterotubalen Verbindung 13,0.
Tabelle 6: CD4 positive Zellen im Endometrium. Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 7 epithelnahen und epithelfernen Gesichtsfeldern*.
CD4 positive Zellen. Mittelwerte und Standardabweichungen
Lokalisation
Oberflächen-epithel
MW±SD
Oberflächliches Stroma
MW±SD
Tiefes Stroma
MW±SD
Drüsen-epithel
MW±SD
Summe
MW±SD Uterus K
(n=5) 0,5±0,4 9,8±5,8 5,2±2,3 0,1±0,3 15,7±6,5
Uterus S (n=5) 0,3±0,2 9,7±5,4 5,0±1,8 0,0±0,0 15,1±5,9
UTJ K (n=4)
0,9±0,4 13,0±7,8 4,6±0,69 0,1±0,1 18,6±7,8
UTJ S (n=5) 0,5±0,4 10,3±5,2 4,1±1,6 0,0±0,0 15,0±6,6
K: Kontrolle; S: inseminiert * : Oberflächliches Stroma und Oberflächenepithel in epithelnahen, tiefes Stroma und Drüsenepithel in epithelfernen Gesichtsfeldern bewertet
60
4. 5 Nachweis von Mastzellen im Endometrium
Alle Mastzellfärbungen wurden an Paraffinschnitten durchgeführt, da Vorversuche an
Kryostatschnitten keine positiven Färbeergebnisse erbrachten. Alle morphometrisch erfassten
Mastzellen befanden sich im oberflächlichen Stroma des Endometriums, in Oberflächen- und
Drüsenepithel sowie im tiefen Stroma konnten keine Mastzellen nachgewiesen werden.
Die Anzahl der Mastzellen in den untersuchten Proben aus Uterus und uterotubaler
Verbindung war mit durchschnittlich 1,6 Mastzellen nach Tryptasenachweis bzw. 1,3
Mastzellen nach Toluidinblaufärbung in 10 Gesichtfeldern gering. Abb.9 zeigt 2
tryptasepositive Mastzellen im oberflächlichen Stroma des Endometriums.
Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen inseminiertem Uterushorn bzw.
inseminierter uterotubaler Verbindung und Kontrolle oder zwischen Uterus und uterotubaler
Verbindung. Auch zwischen Mastzellnachweis mittels Toluidinblau und
immunhistochemischem Tryptasenachweis waren keine signifikanten Unterschiede zu
beobachten (siehe Tab.7).
Bei dem interöstrischen Tier waren mittels Toluidinblaufärbung keine Mastzellen
nachweisbar. Die Summe der tryptasepositiven Mastzellen betrug in 10 Gesichtsfeldern nach
Applikation von physiologischer Kochsalzlösung im Uterus 1 und in der uterotubalen
Verbindung 3. Nach Samenapplikation betrug die Summe im Uterus 1, in der uterotubalen
Verbindung waren keine Mastzellen nachweisbar.
Tabelle 7: Mastzellen im oberflächlichen Stroma des Endometriums. Mittelwerte und Standardabweichungen aus 10 Gesichtsfeldern im oberflächlichen Stroma des Endometriums nach Färbumg mit Toluidinblau bzw. immunhistochemischem Tryptasenachweis
5.1 Etablierung des Tiermodells zur Charakterisierung der
Immunreaktion des porcinen Uterus nach Insemination
Das entwickelte Tiermodell erlaubte es, die uterine Immunreaktion in einem kurzen Zeitraum
nach intrauteriner Applikation von Samen bei Jungsauen zu untersuchen. Es war möglich,
Proben des lokalen Blutgefäßsystems, des lokalen lymphatischen Systems sowie des
endometrialen Gewebes und der uterotubalen Verbindung zu entnehmen. Die chirurgische
transmurale Applikation in separate Uterushörner eines Tieres ermöglichte es, ein Uterushorn
mit Samen und das andere mit physiologischer Kochsalzlösung zu behandeln. Durch diese
Vorgehensweise war es möglich, die teilweise starken interindividuellen Schwankungen, die
im Verlauf der Untersuchungen deutlich wurden, einzugrenzen. Als Nachteil des entwickelten
Modells ist zum einen der mögliche Einfluss der Narkose zu sehen. Ketamin und Thiamylal,
die zur Narkoseeinleitung verwendet wurden, führen durch Vasokonstriktion zu
Blutdruckanstieg, während Isofluran zu einer Kreislaufdepression führt. Diese Veränderungen
der physiologischen Kreislaufsituation können durchaus auch auf die uterine Blutversorgung
einwirken und so Untersuchungsergebnisse beeinflussen. Der mögliche Einfluss dieser
unvermeidlichen Faktoren auf Untersuchungsergebnisse ist für beide Uterushörner gegeben
und so durch den Vergleich innerhalb eines Tieres einzugrenzen. Die Anwendung von
Isofluran mittels Inhalationsnarkose ermöglichte im Vergleich zur Injektionsnarkose eine
besondere Feinsteuerung der Narkosetiefe. Durch Anfeuchten des Uterus mit steriler
körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung wurde versucht, ein Austrocknen der
Oberfläche und Abkühlen des Organs während der Präparation der Lymphgefäße und der
Lymphgewinnung zu verhindern. Das jeweils nicht zur Probengewinnung genutzte
Uterushorn wurde in die Bauchhöhle zurückgelagert. Vor allem bei der Darstellung und
Präparation der uterinen Lymphgefäße ließ sich aber eine manuelle Beeinflussung des Uterus
nicht vermeiden.
62
Viele Untersuchungen der uterinen Immunantwort nach Insemination wurden an
Schlachtorganen erhoben (PURSEL et al. 1978; BISCHOF et al. 1994a, b; KAEOKET et al.
2002b, 2003a, b). Durch den Schlachtvorgang und die Entblutung kann es zu Veränderungen
des Gewebes kommen. Durch Transport und Wartezeiten sowie die zeitlich recht
aufwendigen Vorgänge am Schlachthof ist eine Probenentnahme innerhalb kürzester Zeit
nach Insemination nicht möglich. Da es sich bei dem entwickelten Tiermodell um ein in vivo
Modell handelt, war es möglich, Daten in einem relativ kurzen Zeitraum nach Besamung zu
erheben.
Ein Ziel des entwickelten Tiermodells war die Gewinnung von uteriner Lymphe sowie
uterinen Bluts. Es stellte sich die Frage, ob die inseminationsbedingte inflammatorische
Reaktion des Uterus (BISCHOF et al. 1994b; KAEOKET et al. 2003a, b; LOVELL u.
GETTY 1968; PURSEL et al. 1978) auch zu Veränderungen der Leukozytenpopulation in der
uterinen Lymphe und im lokalen Blutgefäßsystem führt. Diese Fragestellung erforderte den
Einsatz eines in-vivo-Modells.
5.2 Gewinnung von Lymphe des porcinen Uterus
Aufgrund des Anteils an Erythrozyten in der Lymphe konnte nicht geklärt werden, ob die in
den Lymphproben nachgewiesenen Leukozyten aus Blut oder Lymphe stammten.. Aus
diesem Grund wurde keine Differenzierung der Leukozytenpopulation vorgenommen.
Die durchschnittliche Lymphflussrate betrug 2,5 ml/h. Dieser Wert stimmt in etwa mit
Angaben für uterine und utero- ovarielle Lymphe des Schafs, die zwischen 0,2 und 13,9 ml/h
liegen, überein. Der Lymphfluss unterlag deutlichen Schwankungen und zeigte keine
Beeinflussung durch das Inseminat. Diese Schwankungen können zum einen durch
Kontraktionen des Uterus, die im Östrus besonders ausgeprägt sind, bedingt sein. Zum
anderen können auch die extraabdominelle Lagerung sowie die manuelle Beeinflussung des
Uterus eine Rolle spielen.
63
Daten über Zellzahlen in porciner uteriner Lymphe liegen nach Wissen der Autorin nicht vor.
Für das Schaf, das häufig als Versuchstier zur Lymphgewinnung genutzt wird, gibt es
unterschiedliche Angaben. STAPLES et al. (1982) nennen für utero- ovarielle Lymphe beim
Schaf nur Zahlen für Leukozyten in der Lymphe. Es bleibt unklar, ob keine Erythrozyten
nachweisbar waren oder ob keine Bestimmung ihrer Anzahl vorgenommen wurde. Es wird
jedoch der Hinweis gegeben, dass der Uterus bei der Lymphgewinnung so wenig wie möglich
manuell manipuliert wurde, um den Eintritt von Erythrozyten in die Lymphe zu vermeiden.
ALDERS und PRESS (1990) finden in utero- ovarieller Lymphe des Schafs durchschnittlich
300 Erythrozyten/µl in der Follikelphase und 60 Erythrozyten/µl in der Lutealphase. Die in
der vorliegenden Arbeit ermittelten Werte für Erythrozyten in der porcinen uterinen Lymphe
liegen mit etwa 400 bis zu 7000 Erythrozyten/µl weit über diesen Werten. Die ermittelten
Werte für Leukozyten in der porcinen uterinen Lymphe stimmen mit 20 bis 600 Zellen/µl mit
den Angaben für das Schaf, bei dem 20 bis 400 Zellen/µl ermittelt wurden (ALDERS u.
PRESS 1990; STAPLES et al. 1982), in etwa überein.
Es stellte sich die Frage nach der Herkunft der Erythrozyten in der Lymphe. Auch bei
stumpfer Präparation der Lymphgefäße kam es zu leichten Blutungen. Dadurch war zu
Beginn der Lymphgewinnung eine Kontamination des verwendeten Polyethylenschlauchs mit
Blut möglich. Die Anzahl der Erythrozyten in der Lymphe sollte dann aber im Verlauf der
Lymphgewinnung schnell abnehmen und, bedingt durch den Wechsel des Auffanggefäßes,
gegen Null gehen. Die Lymphgefäße des subovariellen Plexus werden als dünnwandigste der
uterinen Lymphgefäße beschrieben. Sie bestehen fast ausschließlich aus Endothel mit
teilweise offenen interendothelialen Verbindungen und „baden“, wie auch benachbarte
Blutgefäße, in subepithelialer Flüssigkeit (DOBROSZINSKA et al. 1996b). Aufgrund dieser
Verhältnisse erscheint der Eintritt von Blut in das Lymphgefäßsystem durchaus möglich. Da
Erythrozyten im Gegensatz zu Leukozyten keine amöboide Bewegungsfähigkeit besitzen,
können sie allerdings nicht aktiv in Gefäße einwandern. Ein passiver Transport der äußerst
formflexiblen Erythrozyten durch die offenen interendothelialen Verbindungen wäre denkbar.
Lymphgefäße im Ligamentum latum uteri des Schweins sind von einem dichten Netzwerk
sehr kleiner Arterien umhüllt, welche die Vasa vasorum oder Vasa lymphaticorum bilden
(GAWRONKA et al. 1992, 1997). Eine Verletzung dieser Blutgefäße bei der
64
Lymphgewinnung war unvermeidlich und konnte möglicherweise zu Bluteintritt in das
präparierte Lymphgefäß führen. Da durch die Verwendung von Heparin als Antikoagulanz im
Lymphgewinnungsschlauch die Blutgerinnung beeinträchtigt wird, kann eine so entstandene
Blutkontamination auch länger anhalten.
Der Anteil an Erythrozyten in der gewonnenen Lymphe war zwar durchschnittlich im Verlauf
der Gewinnung abnehmend, es wurden aber keine konstanten Werte erreicht. Da das
entwickelte Tiermodell die Probengewinnung von Behandlung und Kontrolle innerhalb eines
Tieres ermöglicht, könnten bei konstantem Erythrozytenanteil in den Lymphproben
eventuelle Unterschiede der Leukozytenpopulationen ermittelt werden. Die Aussagekraft
solcher Ergebnisse kann durch parallel durchgeführte vergleichende Untersuchungen von
Leukozytenpopulationen in Blutproben des lokalen Blutgefäßsystems abgesichert werden.
Die Herkunft der Erythrozyten, die in allen Lymphproben nachweisbar waren, konnte in
dieser Arbeit nicht geklärt werden. Eine Langzeitgewinnung von Lymphe über einen aus der
Bauchhöhle geführten Sammelschlauch würde klären, ob nach mehreren Tagen der Anteil an
Erythrozyten ein konstantes Niveau erreicht oder sogar gegen Null geht.
5.3 Differenzierung der Leukozytenpopulation des lokalen uterinen
Blutgefäßsystems und der uterinen Lymphknoten
Die Differenzierung der Leukozytenpopulationen der Blutproben aus Ovararterie, Uterusvene
und Ohrvene ergab relativ konstante Werte für die untersuchten Oberflächenantigene. In den
Blutproben aus der Ohrvene wurden nach Behandlung mit Samen für CD8 high
exprimierende Zellen signifikant höhere Werte erreicht als in Blutproben aus der Ovararterie.
Weiterhin wurden nach Kochsalzbehandlung für CD4 positive Zellen in den Blutproben aus
der Uterusvene signifikant höhere Werte als in der Ohrvene gemessen. Untersuchungen der
Leukozytenpopulationen des lokalen uterinen Blutgefäßsystems nach Insemination liegen der
Autorin nicht vor. Beim tragenden Schaf sind im Blut aus der Uterusvene mehr CD4 positive
65
Zellen nachzuweisen als im peripheren venösen Blut (ALDERS u. SHELTON 1990).
OTSUKI et al. (1991) weisen beim tragenden Schaf in der uterinen Lymphe einen hohen
Prozentsatz an CD8 positiven Zellen nach. Beim Schwein lassen sich durchflusszytometrisch
zwei Subtypen CD8 positiver Zellen einteilen: CD8 high mit starker und CD8 low mit
geringerer Expressionsdichte von CD8 Oberflächenmolekülen. Cytotoxische T-Zellen
exprimieren CD8 in hoher Dichte (CD8 high), T- Helferzellen sind CD4 positiv. Natürliche
Killerzellen exprimieren CD8 in geringer Dichte, sie sind bei der durchflusszytometrischen
Untersuchung CD8 low (PESKOVITZ et al. 1985, 1988). Die verstärkte Expression von CD8
high weist auf eine Zunahme von cytotoxischen T- Zellen, der Anstieg an CD4 positiven
Zellen auf eine Zunahme der T- Helferzellen hin. Die unterschiedliche Expression der
Oberflächenmoleküle CD4 und CD8 in den Blutproben aus Ovararterie und Uterusvene im
Vergleich zum peripheren Blut weist auf eine lokale Immunmodulation nach Insemination
hin, wobei ein unspezifischer Volumeneffekt beteiligt zu sein scheint. Aus diesem Grund sind
die vorliegenden Ergebnisse vorsichtig zu beurteilen und bedürfen weiterer Untersuchung.
Vor allem im Blutgefäßsystem können Veränderungen der Leukozytenpopulationen innerhalb
eines sehr kurzen Zeitfensters geschehen. Um hier eine zeitliche Dynamik zu erkennen, wäre
die Entnahme von Proben des lokalen Blutgefäßsystems in kurzen Abständen über einen
längeren Zeitraum erforderlich. Zusätzlich könnten Doppelfärbungen die Identifizierung
doppelt positiver Zellen ermöglichen.
Die uterinen Lymphknoten waren bei sieben von zehn Tieren beidseitig vorhanden, bei zwei
Tieren einseitig. DOBROSZYNSKA (2002) beschreibt am Uterus von geschlachteten
Schweinen je einen großen, zentralen Lymphknoten im linken und rechten Ligamentum latum
uteri nahe der A. uterina. Dieser Lymphknoten ist von drei bis sieben normalen und null bis
zwei hämalen kleinen Lymphknoten benachbart. HABERMEHL et al. (1996) beschreiben im
hinteren Abschnitt des Ligamentum latum uteri einen bisweilen auch unpaaren Lymphknoten,
der nicht regelmäßig auftritt. MOSKOV und SCHIVATSCHEVA (1972) finden ein oder zwei
uterine Lymphknoten an der Basis des Ligamentum latum uteri. Hämale und kleine
Lymphknoten konnten im Verlauf der durchgeführten Operationen nicht entdeckt werden. Da
diese Lymphknoten eine Größe von drei bis sechzehn Millimeter haben (DOBROSZYNSKA
2002), erscheint ein Auffinden im recht festen Ligamentum latum uteri schwierig.
66
Die Differenzierung der Subpopulationen von Leukozyten aus den Lnn. uterini zeigte
teilweise starke interindividuelle Schwankungen. Zwischen Behandlung mit Samen und
Kochsalzlösung waren keine signifikanten Unterschiede zu beobachten. BISCHOF et al.
(1994b) können zwei bis vier Tage nach Insemination mit Seminalplasma eine signifikante
Zunahme der CD8 positiven Zellen mit niedriger Fluoreszenzintensität (CD8 low) sowie eine
verstärkte Expression von MHCII Oberflächenmolekülen messen. Im Gegensatz dazu erfolgte
die Entnahme der uterinen Lymphknoten in der vorliegenden Arbeit 130 bzw. 210 min nach
transmuraler Applikation von Samen bzw. physiologischer Kochsalzlösung. Dieses
vergleichsweise kurze Intervall zwischen Insemination und Probenentnahme könnte eine
Ursache für das Fehlen von Veränderungen der Leukozytenpopulationen nach Insemination
sein.
5.4 Immunhistochemische Untersuchungen und Mastzellnachweis
Die morphometrische Auswertung der immunhistochemischen Färbungen ergab keine
signifikanten Unterschiede für die Anzahl und Verteilung CD4 positiver Zellen, für MHCII
positive Zellen waren signifikante Unterschiede nachweisbar. Zum einen waren für die
Gesamtsumme im Endometrium im inseminiertem Uterushorn signifikant mehr MHCII
positive Zellen nachweisbar als im Kontrollhorn. Im inseminierten uterinen Teil der
uterotubalen Verbindung waren im Oberflächenepithel sowie in der Gesamtsumme
signifikant mehr MHCII positive Zellen nachweisbar als im mit Kochsalzlösung behandelten
uterinen Teil der uterotubalen Verbindung. Bei immunhistochemischen Untersuchungen am
Endometrium von Sauen ermitteln KAEOKET et al. (2002b, 2003b) die Anzahl MHCII
positiver Zellen in verschiedenen Zyklusphasen sowie nach präovulatorischer Insemination
bei Sauen. Diese Werte werden jedoch nicht miteinander verglichen. Es zeigen sich bei
östrischen Tieren ohne Insemination im Oberflächen- und Drüsenepithel jedoch höhere, im
oberflächlichen und tiefen Stroma niedrigere Werte für MHCII positive Zellen als fünf bis
sechs Stunden nach Insemination, ohne dass dies statistisch abgesichert ist. Dieser Gegensatz
zu den eigenen Ergebnissen ist möglicherweise in der Verwendung von Jungsauen statt Sauen
67
wie in den Versuchen von KAEOKET et al. (2002b, c) begründet. BISCHOF et al. (1994b)
beobachten im Endometrium von Jungsauen zwei bis vier Tage nach Insemination mit
Seminalplasma eine Zunahme von MHCII positiven Zellen in der Umgebung der uterinen
Drüsen sowie eine Zunahme der Färbeintensität im Vergleich zu nicht inseminierten
östrischen Tieren. Die Anzahl CD4 positiver Zellen nimmt in diesem Zeitraum signifikant ab.
Obwohl KAEOKET et al. (2002b) keinen zyklusabhängigen Einfluss auf die Anzahl MHC
Klasse II positiver Zellen im porcinen Endometrium finden, steigt bei anderen
Uterusbesamern wie Pferd (FRAYNE u. STOKES 1994) und Ratte (HEAD u. GAEDE 1986;
ZHENG et al. 1988) die Anzahl MHCII positiver Zellen im Östrus an, während dieser
Anstieg bei Scheidenbesamern wie Mensch (BULMER et al. 1988) und Schaf (LEE et al.
1988) nicht zu beobachten ist.
MHCII Oberflächenmoleküle werden von dendritischen Zellen und Makrophagen sowie von
Lymphozyten und Endothelzellen exprimiert. Im lichtmikroskopischen Bild konnte eine
Differenzierung von dendritischen Zellen und Makrophagen, die als häufigste MHCII positive
Zellen zu beobachten waren, nicht eindeutig vorgenommen werden. Bei diesen Zellen handelt
es sich um antigenpräsentierenden Zellen. Sie sind für die Aktivierung von CD4 positiven T-
Zellen verantwortlich. Makrophagen sind zusätzlich zur Phagozytose befähigt und spielen
durch Ausschüttung von Cytokinen bei Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle. Bei der
Maus kommt es nach der Paarung zu einer verstärkten Produktion von Granulozyten-
Makrophagen- Wachstumsfaktor (GM-CSF) in uterinen Epithelzellen (ROBERTSON u.
SEAMARK 1994). Dieses Cytokin führt zu einer Aktivierung von Makrophagen und zu einer
verstärkten Bildung von Granulozyten und Makrophagen.
Die inflammatorische Reaktion des Uterus nach Insemination hat verschiedene Bedeutungen.
Zum einen dient sie der Eliminierung von Spermien und antigenen Komponenten, die bei der
Insemination in den Uterus gelangen können (PURSEL et al. 1978; RODRIGUEZ-
MARTINEZ et al. 1990; ENGELHARDT et al. 1997; MATTHIJS et al. 2000). Diese
Vorgänge dienen der Vorbereitung des Uterus auf den Konzeptus. Die Stimulation lokaler
Immunantworten mittels intrauteriner Applikation von toten Spermien vor der Paarung
(MURRAY et al. 1983, 1986) oder Zusatz von Bullenleukozyten zum Inseminat (AMLID
1981) kann fruchbarkeitsfördernde Effekte haben. Andere Studien, in denen dem Inseminat
verschiedene antigene Komponenten zugefügt wurden (BLICHFELDT 1984;
68
RAMSOONDAR u. CHRISTOPHERSON 1998), konnten solche Effekte nicht bestätigen.
Auch bei der Ovulationsinduktion durch Seminalplasma beim Schwein ist die Beteiligung
lokaler immunologischer Signaltransduktion zwischen Uterus, uterotubaler Verbindung und
Ovar vorstellbar (WABERSKI et al. 2000). Die Bedeutung der in der vorliegenden Arbeit
ermittelten Zunahme von MHCII positiven Zellen im Endometrium nach Samenapplikation in
diesen Zusammenhängen bedarf weiterer Klärung. Dabei wäre eine Differenzierung von
dendritischen Zellen und Makrophagen wünschenswert.
Es stellte sich die Frage, ob der Ebersamen oder eventuelle bakterielle Kontamination
desselben die Immunreaktion auslösen. Als Kontrolle wurde sterile physiologische
Kochsalzlösung verwendet. Ebersamen enthält unvermeidlich Bakterien, die bei der
Gewinnung in das Ejakulat gelangen (WALZ et al. 1968; PANDEY u. SINGH 1997;
ALTHOUSE et al. 2000). ROZEBOOM et al. (1998) finden nach instrumenteller
Insemination mit verdünntem Ebersamen oder nur Verdünner bei Spülung des Uterus
vergleichbare Bakterienzahlen. Die Anzahl neutrophiler Granulozyten in der Spülflüssigkeit
ist jedoch zwölf Stunden nach Samenapplikation signifikant höher als nach
Verdünnerapplikation. Erhöhte Werte für Leukozyten sind auch im Endometrium achtzehn
Stunden nach Samenapplikation im Vergleich zu Verdünnerapplikation zu beobachten
(ENGELHARDT et al. 1997). Vier bis sechs Stunden nach Applikation von verdünntem
Samen oder Verdünner sind keine Unterschiede zwischen Behandlung mit Samen und
Verdünner zu beobachten (ROZEBOOM et al. 1998; MATTHIJS et al. 2003).
ARMSTRONG et al. (2000) beobachten 36 Stunden nach Applikation von Seminalplasma im
Vergleich zu PBS eine Zunahme der Gesamtzahl an Leukozyten sowie MHCII positiven
Zellen im porcinen Endometrium. Anhand dieser Studien scheint die mögliche Beteiligung
bakterieller Kontamination des Inseminats an der Immunreaktion des Uterus gering zu sein.
In den eigenen Untersuchungen ließen sich nach Insemination im uterinen Teil der
uterotubalen Verbindung signifikant mehr MHCII positive Zellen im Drüsenepithel und der
Gesamtsumme als in dem besamten Uterushorn nachweisen. Elektronenmikroskopische
Untersuchungen der uterotubalen Verbindung des Schweins zeigen hier keine auffälligen
69
Veränderungen der Leukozyten in der Mukosa nach Insemination. Im Epithel und im Lumen
der uterotubalen Verbindung sind, im Gegensatz zum Uterus nahe der uterotubalen
Verbindung, keine Leukozyten nachzuweisen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990).
HUNTER et al. (1987) finden auf dem luminalen Oberflächenepithel des uterinen Teils der
uterotubalen Verbindung bei fast allen untersuchten Jungsauen nach Besamung Leukozyten.
Im tubalen Anteil der uterotubalen Verbindung können dagegen nur in der Tiefe der
terminalen Falten vereinzelt Leukozyten beobachtet werden. Der tubale Teil der uterotubalen
Verbindung ist in Zusammenhang mit der Funktion als Spermienreservoir weitreichend
untersucht (RIGBY 1966; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990; WU et al. 1996; MBURU
et al. 1997). Immunhistochemische Untersuchungen wurden jedoch nicht durchgeführt. Die
nach Insemination im uterinen Teil der uterotubalen Verbindung beobachtete Zunahme an
MHCII positiven Zellen im Vergleich zum Uterus lässt auf eine besondere Funktion dieser
Struktur bei der inflammatorischen Reaktion des Uterus nach Insemination schließen. Die
Lymphgefäße der uterotubalen Verbindung des Schweins bilden gemeinsam mit
Lymphgefäßen des Ovars in der Nähe des Ligamentum ovarii proprium ein komplexes
Netzwerk, den so genannten paraovariellen lymphatischen Plexus (GAWROSKA et al. 1997).
Dieser Plexus ist von einem dichten Geflecht von Blutgefäßen umgeben, die in Verbindung
mit Uterus, Ovar und Ovidukt stehen. Die anatomischen Gegebenheiten ermöglichen einen
lokalen Transfer von Molekülen zwischen Uterus, Ovar und Ovidukt über Blut- und
Lymphgefäßsystem (KOTWICA 1980; KOTWICA et al. 1981; KRZYMOWSKI et al. 1982,
1986, 1990; MAGNESS u. FORD 1982, 1983). Diese Untersuchungen lassen im
Zusammenhang mit den eigenen Untersuchungsergebnissen einen Einfluss von
Immunreaktionen der uterotubalen Verbindung auf Uterus, Ovar und Ovidukt möglich
erscheinen. Die exakte Bedeutung der Veränderungen der Leukozytenpopulationen nach
Insemination konnte in dieser Arbeit nicht geklärt werden. Nähere Untersuchungen über
eventuelle Veränderungen nicht nur der Leukozytenpopulationen sondern auch von
Proteinfraktionen und Cytokinen in Blut- und Lymphgefäßsystem speziell der uterotubalen
Verbindung wären wünschenswert.
Die Ergebnisse des Mastzellnachweises zeigen, dass diese Zellen im porcinen Endometrium
nur in sehr geringer Zahl vorliegen. Auch KAEOKET et al. (2002a) können nach
70
Toluidinblaufärbung nur wenige Mastzellen nachweisen. Mastzellen aus der Mukosa des
Darms können beim Schwein nach Fixierung in Carnoyscher Lösung oder Basic Lead Acetat
mit Toluidinblau angefärbt werden, nach Formalinfixierung jedoch wenig bis nicht (PABST
u. BEIL 1989; XU et al. 1993). Aufgrund dieser Formalinsensibilität, die auch von anderen
Spezies bekannt ist, wurde ein immunhistochemischer Tryptasenachweis durchgeführt. Ein
histochemischer Tryptasenachweis ist für Mastzellen aus dem Darm des Schweins auch nach
Formalinfixierung möglich (XU et al. 1993). Der immunhistochemische Nachweis von
Tryptase in Mastzellen im Uterus von Rind (KÜTHER et al. 1998) und Hund (KUBE et al.
1998) wird durch die Fixierung beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit gab es keine
Unterschiede zwischen der Mastzellzahl im porcinen Endometrium nach Toluidinblaufärbung
und immunhistochemischem Tryptasenachweis. Die geringe Anzahl der nachgewiesenen
Mastzellen lässt eine Beeinflussung der Ergebnisse durch die Formalinfixierung durchaus
möglich erscheinen.
5.5 Schlussfolgerungen und Ausblick
Ein Tiermodell zur Untersuchung lokaler Immunreaktionen des Endometriums, der uterinen
Lymphknoten und des lokalen Blutgefäßsystems nach Insemination bei der Jungsau wurde
entwickelt.
Lymphe konnte innerhalb der relativ kurzen Sammeldauer nur mit Anteilen an Erythrozyten
unbekannter Herkunft gewonnen werden. Da bei einer nicht auszuschließenden
Blutkontamination auch Leukozyten aus dem Blut in die Lymphproben gelangen, wurde eine
Differenzierung der Leukozytenpopulation in der gewonnenen Lymphe für nicht
aussagekräftig erachtet. Dennoch sind weitere Arbeiten im Bereich der Gewinnung uteriner
Lymphe beim Schwein wünschenswert, da bei der Signaltransduktion zwischen Uterus, Ovar
und Ovidukt dem Lymphgefäßsytem eine wichtige Rolle zugeschrieben wird. Modifikationen
des Tiermodells, z. B. in Form von Lymphgewinnung über mehrere Tage, könnten
möglicherweise klären, ob nach mehreren Tagen der Anteil an Erythrozyten ein konstantes
71
Niveau erreicht oder sogar gegen Null geht und so weitere Untersuchungen von
Lymphproben ermöglichen.
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen mittels monoklonaler Antikörper
gegen MHCII Oberflächenmoleküle, die einen signifikanten Anstieg MHCII positiver Zellen
nach Insemination ergaben, weisen auf eine Rolle antigenpräsentierender Zellen bei der
uterinen Immunantwort auf Insemination hin. Um diese Rolle näher zu beleuchten, wäre eine
Differenzierung dieser Zellen in Makrophagen und dendritische Zellen hilfreich. Dies könnte
beispielsweise mittels Elektronenmikroskopie geschehen.
Die immunhistochemisch nachgewiesene Zunahme MHCII positiver Zellen im uterinen Teil
der uterotubalen Verbindung im Vergleich zum Uterus nach Insemination deutet eine
besondere Funktion dieser Struktur bei der lokalen postinseminatorischen Immunreaktion an.
Inwiefern sich diese Immunreaktion auf benachbarte Organe wie Uterus, Ovidukt und Ovar
auswirkt, bedarf weiterer Untersuchungen. Da aufgrund der anatomischen Verhältnisse eine
enge Verbindung zwischen Blut- und Lymphgefäßsystem von uterotubaler Verbindung und
Uterus, Ovidukt und Ovar besteht, sollte dem Gefäßsystem der uterotubalen Verbindung
besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Dabei wären Untersuchungen nicht nur der
Leukozytenpopulationen sondern auch von Proteinfraktionen und Cytokinen in Blut- und
Lymphgefäßsystem speziell der uterotubalen Verbindung hilfreich.
72
6 Zusammenfassung
Anke Döhring: Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach Insemination Insemination führt zu einer Entzündungsreaktion mit Immigration von Leukozyten in das
Lumen und Gewebe des Uterus. Bei den immigrierenden Zellen handelt es sich vor allem um
neutrophile Granulozyten, aber auch um andere Zellen der adaptiven und nicht adaptiven
Immunantwort. Ein Tiermodell sollte entwickelt werde, das eine Charakterisierung der
lokalen Immunantwort des Uterus nach Insemination bei Jungsauen im Östrus erlaubt.
Bei anästhesierten Jungsauen wurde der Uterus nach einem Medianschnitt in der Linea alba
vorgelagert. Etwa 25 cm distal der uterotubalen Verbindung wurde eine Ligatur angelegt. Im
ligierten Bereich wurden transmural in ein Uterushorn 20 ml frisch gewonnener Ebersamen
appliziert, in das contralaterale Horn erfolgte die Applikation von 20 ml steriler
physiologischer Kochsalzlösung als Kontrolle. Uterine Lymphgefäße wurden durch subseröse
Injektion von Evans Blue dargestellt. Nahe der Lnn. uterini wurde ein prominentes
Lymphgefäß stumpf freipräpariert und distal des präparierten Bereichs ligiert. Das
Lymphgefäß wurde mit einer Irisschere eingeschnitten und ein Polyethylenschlauch
eingeführt. Die spontan fließende Lymphe wurde in einem EDTA- Röhrchen aufgefangen.
Die Lymphgewinnung begann 60 min nach Applikation von Kochsalzlösung bzw. Samen und
dauerte 45 min. Alle 15 min wurde das Auffanggefäß gewechselt. Nach Beenden der
Lymphgewinnung wurden zum einen Blutproben aus Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene
gewonnen. Zum anderen wurden die uterinen Lymphknoten entfernt und Gewebeproben aus
Uterus und uterinem Teil der uterotubalen Verbindung gewonnen.
Nach Bestimmung des Volumens wurde die Lymphe mittels einer Zählkammer nach Thoma
auf die Gesamtzahl von Zellen sowie die Anzahl kernhaltiger Zellen untersucht. Die
Lymphknoten wurden homogenisiert und mittels Flowzytometrie wurde die Reaktivität mit
monoklonalen Antikörpern gegen CD4, CD8, CD18, MHCII-DR und MHCII-DQ bestimmt.
Diese Antikörper wurden auch bei der flowzytometrischen Ana lyse der Blutproben
verwendet. Die Gewebeproben wurden schockgefroren oder nach Fixierung in Formalin in
73
Paraffin eingebettet. Der immunhistochemische Nachweis von MHCII und CD4
Oberflächenantigenen erfolgte an Kryostatschnitten. Mastzellen wurden mittels
metachromatischer Toluidinblaufärbung und immunhistochemischem Tryptasenachweis an
Paraffinschnitten dargestellt.
Der Anteil kernloser Zellen in der Lymphe verringerte sich mit zunehmender Sammeldauer.
In allen Lymphproben waren jedoch Anteile an Erythrozyten nachweisbar, was eine
Blutkontamination vermuten ließ. Da nicht geklärt werden konnte, ob die Leukozyten in den
Lymphproben aus Blut oder Lymphe stammten, wurde keine Differenzierung der
Leukozytenpopulation durchgeführt. Die durchflusszytometrische Untersuchung der
Lymphknoten ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen der inseminierten Seite und
der Kontrollseite. Allerdings zeigte die Auswertung für drei von sechs Tieren höhere Werte
für MHCII-DR sowie für drei von vier Tieren niedrigere Werte für CD4 in den Lymphknoten
des mit Samen behandelten Uterushorns. In den Blutproben aus der Ohrvene konnten nach
Behandlung mit Samen signifikant höhere Werte für CD8 high gemessen werden als in denen
der Ovararterie. Für CD4 konnten nach Kochsalzbehandlung signifikant höhere Werte in den
Proben aus der Uterusvene als in denen aus der Ohrvene gemessen werden. Zwischen den
Behandlungen mit Samen und Kochsalzlösung gab es keine signifikanten Unterschiede. Die
immunhistochemische Untersuchung ergab signifikant höhere Werte für MHCII positive
Zellen nach intrauteriner Applikation von Samen im Vergleich zu Kochsalzlösung. In den
Gewebeproben der uterotubalen Verbindung waren nach Samenapplikation signifikant mehr
MHCII positive Zellen als in denen des Uterus nachweisbar. Der immunhistochemische CD4
Nachweis ergab keine signifikanten Unterschiede.
Ein Tiermodell zur Untersuchung lokaler Immunreaktionen des Endometriums, der uterinen
Lymphknoten und des lokalen Blutgefäßsystems nach Insemination bei der Jungsau wurde
entwickelt. Lymphe konnte innerhalb der relativ kurzen Sammeldauer nur mit Anteilen an
Erythrozyten ungeklärter Herkunft gewonnen werden. Die Ergebnisse der
immunhistochemischen Untersuchungen weisen auf eine Rolle antigenpräsentierender Zellen
bei der uterinen Immunantwort auf Insemination hin. Die uterotubale Verbindung könnte in
diesem Zusammenhang eine spezifische Funktion haben.
74
7 Summary
Anke Döhring: Establishment of an in vivo model for characterisation of leukocyte
immigration into the uterus of gilts after insemination
Insemination induces an inflammatory reaction causing immigration of leukocytes into the
lumen and tissue of the uterus. These immigrated cells are mostly neutrophils, though other
cells from the non-adaptive and adaptive immune response are also present. The aim of the
study was to establish an animal model that would characterise the local uterine immune
response after insemination in estrous gilts.
Under general anaesthesia, the uterus was exposed through mid-ventral laparotomy. Ligation
of both uterine horns approx. 25 cm distal of the uterotubal junction was followed by
transmural application of 20 ml of fresh boar semen cranial of the ligature in one uterine horn.
As control, the contralateral horn was infused with the same amount of sterile saline. Uterine
lymphatic vessels were made visible by injecting Evan’s blue under the serosa. Close to the
Lnn. uterini, which were present on both sides in 7 of 10 gilts, a prominent lymphatic vessel
was bluntly dissected and ligated distal of the dissected part. After cutting the vessel with iris
scissors, a polyethylene tube was inserted into the vessel and the spontaneously-flowing
lymph was collected in an EDTA vial. The sampling started 60 min after uterine infusion and
lasted for 45 min. Every 15 min the vial was changed. After finishing the lymph sampling,
blood samples of the uterine vein, the ovarian artery and the ear ve in were collected. Also the
Lnn. uterini and tissue samples of the uterus and the uterine side of uterotubal junction were
removed.
From the lymph samples, total and nucleated cell numbers were counted with a
haemocytometer. Using flowcytometry, the lymph nodes were analysed for reactivity with
monoclonal antibodies against CD4, CD8, CD18 MHCII-DR and MHCII-DQ markers. The
same antibodies were used for the blood samples. The tissue samples were snap-frozen in
liquid nitrogen or fixed in formaldehyde and embedded in paraffin. For
75
immunohistochemical analysis, cryostat sections were prepared and examined for occurrence
and distribution of MHCII- and CD4-expressing cells. For analysis of mast cell distribution
and occurrence, paraffin sections were prepared. Immunohistochemical analysis of mast cell
tryptase and metachromatical staining with toluidin blue were done.
The percentage of non-nucleated cells in the lymphatic fluid decreased as the collection
period lengthened, but contained erythrocytes in all cases, indicating the ingress of blood into
the lymph collection vial. For this reason, a differentiation of leukocytes was not performed.
For the Lnn. uterini, 3 of 4 gilts showed lower values for CD4 and 3 of 6 gilts higher values
for MHCII markers on the semen side than on the control side. For the blood samples,
significantly higher values for CD8 high were measured in the ear vein than in the ovarian
artery after semen treatment. After saline treatment significantly higher values for CD4 were
found in the uterine vein than in the ear vein. Immunohistochemical analysis of uterine tissue
samples for MHCII positive cells resulted in significant ly higher values for the semen treated
uterus horn than the control horn. After semen infusion significantly higher values for MHCII
expressing cells in the uterotubal junction than in the uterus were found. There were no
significant differences for CD4 positive cells.
In conclusion, an animal model was established to study the local immune response of uterine
tissue and associated lymph nodes. However, it was impossible to obtain lymph without signs
of blood contamination appearing within a short-term sampling period. The significant
difference between the treated and the control side for MHCII positive cells in the uterine
tissue indicates a role of antigen presenting cells in the post insemination immune response.
The significant differences between the semen-treated uterus and the uterotubal junction
suggest a specific function of the uterotubal junction in this context.
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Danksagung
Bei meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Waberski bedanke ich mich für die Überlassung des Themas,
die jederzeit gewährte Unterstützung und die sehr nette Zusammenarbeit.
Frau Prof. Dr. Hewicker- Trautwein möchte ich für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe
Immunpathologie des Instituts für Pathologie sowie ihre stets gern gewährte Hilfe danken.
Herrn PD Dr. Schuberth danke ich für seine jederzeit bereitgestellte fachliche Unterstützung.
Herrn Prof. Hunter danke ich für Rat und Tat bei der Durchführung der Operationen sowie seinen
Wissensschatz, den er gerne weitergegeben hat.
Meiner Mitdoktorandin und Freundin Florencia Ardon Martinez danke ich ganz besonders herzlich für
die gute Zusammenarbeit in Stall, Labor und OP. Muchos besos!
Den Tierpflegern aus dem Institut für Reproduktionsmedizin ein herzliches Dankeschön für die
tatkräftige Unterstützung im Stall.
Bei Nadine Ritter bedankte ich mich für die Untersuchung der Proben im Labor der Arbeitsgruppe
Immunologie.
Klaus Kuhlmann und der Arbeitsgruppe Immunpathologie des Instituts für Pathologie danke ich für
die freundliche Aufnahme und Unterstützung im Labor.
Bei der Dr. Dr. h.c. Karl Eibl Stiftung, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem
Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion bedanke ich mich für die finanzielle
Unterstützung.
Meinen Eltern ein besonders herzliches Dankeschön für die materielle und ideelle Unterstützung.
Last but not least danke ich Arne für seine Liebe, Geduld und Unterstützung bei meiner Doktorarbeit.