PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB. Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida Manaus – AM Julho, 2016
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA
COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO
LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.
Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida
Manaus – AM
Julho, 2016
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Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.
Orientador(a): Dra. Cecilia Veronica Nunez
Dissertação apresentada à
Coordenação do Programa
Integrado de Pós-Graduação em
Botânica do INPA, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Botânica.
Manaus - AM
Julho, 2016
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À minha amada família, meus pais Eneida e Lauro, e meu irmão Igor, por serem os eternos pilares da minha vida, e aos verdadeiros e preciosos amigos que fiz nesta longa caminhada chamada vida, dedico esta dissertação.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à DEUS, pelas inúmeras coisas boas que possuo em
minha vida e por sempre contar com sua força na hora dos mais diversos desafios.
Agradeço à minha família, em especial aos meus pais e meu irmão. À minha
mãe Eneida, eterna companheira e apoiadora, por nunca me deixar faltar nada e sempre
me incentivar a crescer na vida, a ela devo uma gratidão eterna. Ao meu pai Lauro, que
mesmo longe atualmente, me apoiou e me deu amor, e me ensinou que, na vida,
pensamento positivo é tudo, e que no fim tudo dá certo. Ao meu irmão Igor, que sempre
me estendeu a mão sem questionar, que sempre esteve lá quando eu mais precisei, um
segundo pai, uma pessoa que sei que posso contar pelo resto de minha vida.
Aos meus amigos, pelos momentos felizes, aventuras e companheirismo, que me
ajudavam a desligar dos problemas, nas horas boas e ruins, em especial à Alan Soares,
Alan Almeida, Bruno da Mata Tio, Daniel Martini, Dennis Rafael, Maximiliano
Moraes, Marcos Deilson, Rafael Ribeiro e Thales Filizola.
Aos meus amigos da faculdade e da Botânica, pela amizade, pelos inúmeros
momentos hilários e aventuras que passamos, e pelo grande conhecimento científico que
adquiri com os mesmos ao longo deste mestrado, em especial à Alysson, Diana,
Gabriel, Jhenny, Lincoln, Marcos Melo, Rodrigo e Wellison.
Aos eternos companheiros e amigos de Laboratório, obrigado pela imensa e
indispensável ajuda que me deram, tudo foi possível graças a vocês, nos momentos
felizes e difíceis dessa jornada, vocês estavam lá. Agradeço à minha querida e amada
Fabiele Cruz, sempre prestativa e pronta a ajudar, companheira de fracionamentos nas
madrugadas de finais de semana, pelo amor, amizade, conhecimento e pela ajuda nos
ensaios biológicos e diversos experimentos. Aos valiosíssimos amigos, pelos inúmeros
momentos descontraídos no Laboratório, pelos vários momentos felizes fora do
ambiente de trabalho, por serem incrivelmente prestativos e sempre terem tempo para
me ajudar, pelas dicas, pelo imenso conhecimento que adquiri com eles e pelo apoio
emocional e profissional: Alan, David, Fabiana, Jaci, Juliana, Kissinara (ensaio
antioxidante cheio de emoções), Leomara, Luana, Sabrina e Vanessa.
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À Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos, da UFAM, pela colaboração e
realização do ensaio antitumoral.
À minha orientadora Dra. Cecilia Veronica Nunez, por me receber em seu
laboratório e me conceder a oportunidade de realizar este trabalho, pelos ensinamentos e
confiança.
Aos professores do PPG de Botânica do INPA, pelos ricos ensinamentos e
incentivos à continuar sempre pesquisando as maravilhas da natureza.
Ao grupo CALTQPN, pelas análises de Ressonância Magnética Nuclear e
Espectrometria de massas.
Ao CNPq pela concessão da bolsa e apoio financeiro para o projeto.
Ao INPA pela infraestrutura e amparo, e por possibilitar a realização deste
sonho.
À todos os colegas de Laboratório que contribuíram direta e indiretamente para
este trabalho, meu imenso obrigado!
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“A sorte favorece os audazes”
VIRGÍLIO – A Eneida (10, 284)
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RESUMO
A espécie Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) apresenta uma vasta riqueza de substâncias isoladas, contudo, existem poucos trabalhos de indivíduos do bioma amazônico, podendo apresentar substâncias novas ou potenciais biológicos diferenciados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi realizar a análise fitoquímica de E. bulbosa coletada na região de Altamira-PA, no bioma amazônico, e avaliar o potencial biológico de seus extratos. As folhas, flores e bulbos foram secos e posteriormente moídos. O material vegetal foi então submetido a extração com hexano ou diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e H2O, e seus extratos analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). O extrato hexânico apresentou precipitação de cristais após a concentração, sendo estes separados por lavagem com solvente e analisado por CCDC. O extrato selecionado para ser fracionado foi o metanólico do bulbo, revelando indícios da presença de classes de substâncias fenólicas, diferentes classes de terpenos, além de derivados antraquinônicos, sendo o mesmo posteriormente submetido à partição líquido-líquido e sua fase DCM fracionada. Foi possível isolar oito substâncias: sete do fracionamento da fase DCM, e uma do extrato hexânico. Por meio da análise de RMN, ao todo foi possível caracterizar 5 substâncias, eleuterina, eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol. Os extratos e eleuterina apresentaram uma alta toxidade no teste com Artemia salina, onde o metanólico do bulbo e eleuterina apresentaram a maior toxidade, nas concentrações de 1000 µg/mL e 500 µg/mL. Para o ensaio antitumoral, nenhum dos extratos e nem eleuterina apresentaram uma citotoxidade significativa frente às linhagens tumorais MCF-7, MRC-5, HCT116 e Sk-Mel-28, com exceção do extrato hexânico do bulbo que causou morte celular de 50-60% contra as linhagens MCF-7, MRC-5 e Sk-Mel-28. No ensaio antimicrobiano, o extrato metanólico e a fase DCM apresentaram uma concentração inibitória mínima (CIM) de 1000 µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente, e as substâncias Fr 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina apresentaram CIM de 500 µg/mL frente à Staphylococcus aureus e Pseudomonas fluorescens. No geral, todos os extratos analisados não apresentaram atividade antioxidante significativa frente ao radical DPPH, nem ao Fe3+/fenantrolina. Eleuterina, eleuterinol e isoeleuterina se mostraram importantes marcadores químicos desta espécie, por sua predominância na planta, e esta é a segunda vez que é relatado a presença do eleuterinol glicosilado nesta espécie. Estudos mais profundos com as substâncias isoladas, bem como a caracterização das principais responsáveis pelo potencial antimicrobiano, são necessários. Ainda, os resultados obtidos podem ser utilizados em futuros estudos comparativos da espécie e gêneros da tribo, aliados à dados morfológicos e filogenia, para a solução de problemas taxonômicos.
Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) species presents a vast wealth of isolated substances, however, there are few studies of individuals from the Amazon biome, that may present new substances or different biological potentials. Therefore, the aim of this study was to perform the phytochemical analysis of E. bulbosa collected in Altamira-PA, region from the Amazon biome, and evaluation of the biological potential of its extracts. The leaves, flowers and bulbs were dried and then grounded. Subsequently, the plant material was subjected to extraction with hexane or dichloromethane (DCM), methanol (MeOH) and H2O, and their extracts analyzed by thin layer chromatography (TLC). The hexane extract showed precipitation of crystals after concentration, which were separated by washing with solvent and analyzed by TLC. The extract selected for fractionation was the bulb's methanolic extract, which revealed evidence of the presence of phenolic substance classes, different classes of terpenes, and anthraquinone derivatives, the same being further subjected to liquid-liquid partition and it's DCM phase fractionated. It was possible to isolate eight substances: seven from the DCM phase fractionation, and one from the hexane extract. By NMR analysis, it was possible to characterize 5 substances: eleutherin, eleutherol, eleutherinol-8-O-β-glucoside, isoeleutherin and eleutherinol. The extracts and eleutherin showed high toxicity in Artemia salina assay, where the bulb's methanolic extract and eleutherin showed the highest toxicity at 1000 µg/mL and 500 µg/mL concentrations. For antitumor assay, none of the extracts or eleuterine showed significant cytotoxicity against MCF-7, MRC-5, HCT116 and Sk-Mel-28 tumor cell lines, except the bulb’s hexanic extract, which caused 50-60% cell death against MCF-7, MRC-5 and Sk-Mel-28 cell lines. In the antimicrobial assay, the methanolic extract and the DCM phase showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 1000 µg/mL and 500 µg/mL, respectively, and also the substances Fr 61+62 (FD), eleutherol and isoeleutherin showed a MIC of 500 µg/mL against Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens. Overall, all extracts analyzed showed no significant antioxidant activity against the DPPH radical, or the Fe3+/phenanthroline. Eleutherin, eleutherol and isoeleutherin showed to be very important chemical markers of this species since its predominance in the plant, and this is the second time it is reported the presence of glycosylated eleutherinol in this species. Further studies with the isolated substances, as well the characterization of the main ones responsible for the antimicrobial potential, are necessary. Thus, the results obtained can be used in future comparative studies of the species and genera of the tribe, combined with morphological and phylogeny data, to solve taxonomical problems.
4.3.3 TESTE DE TOXIDADE UTILIZANDO Artemia salina ............................. 36
4.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL .................................................................. 36 4.3.4.1 Linhagens Celulares .............................................................................. 36 4.3.4.2 Teste do Alamar blue ............................................................................ 37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 38
5.1 Coleta e obtenção dos extratos .............................................................................. 38
5.2 Análises Cromatográficas, Isolamento e Elucidação Estrutural ........................... 38
xiii
5.2.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e RMN ........ 38 5.2.1.1 Cristais do extrato bruto hexânico ............................................................... 38 5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo ......................... 390 5.2.1.3 Fracionamento do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa ................... 49 5.2.1.4 Análise e Fracionamento das Fases da partição líquido-líquido ................. 51 5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD) ..................... 54 5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12) ................ 63 5.2.1.7 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 29+30 (06-12).................72 5.2.1.8 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 34+35 (14-20).................81
Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: SANTOS (2007)..................................................................................................p.3
Figura 2: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Adaptado de Santos (2007) e Dewick (2002).....................................................p.4
Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002).................................................................................p.6
Figura 4 - Estrutura química da flavona Fonte: Adaptado de Campos (2005)...............................................................................p.7
Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003)......................................................p.8
Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-Lapachona e β-Lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013).....................................................p.9 Figura 7 – Estrutura química dos tetraterpenos β-caroteno e licopeno. Fonte: Adaptado de Saxena et al. (2013).....................................................................p.10
Figura 8: Mapa de distribuição global de Iridaceae Fonte: STEVENS (2008).............................................................................................p.15
Figura 9: Morfologia de Eleutherine bulbosa Fonte: GOLDBLATT & SNOW (1991)......................................................................p.20
Figura 10: Flores, bulbo e espécie cultivada numa horta doméstica no interior de São Paulo Fonte: LORENZI & MATOS (2008)...........................................................................p.20
Figura 11: Eleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...................................................................p.22
Figura 12: Isoeleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...................................................................p.22
Figura 13: Isoeleuterol Fonte: Adaptado de Insanu et al. (2014).....................................................................p.22 Figura 14: Eleuterinona Fonte: Adaptado de Alves, Kloos & Zani (2003).......................................................p.22
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Figura 15: Hongconin Fonte: Adaptado de Zhengxiong et al. (1986)…..……………………………...........p.22
Figura 16: Fluxograma da preparação dos extratos de Eleutherine bulbosa..............p.26
Figura 17: Fluxograma da partição do extrato metanólico de Eleutherine
Figura 18: Fluxograma geral de fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa.....................................................................................................p.33
Figura 19 – (a) Eleutherine bulbosa coletada no município de Altamira, PA. (b) Exsicata fértil depositada no herbário do INPA, Manaus, AM..................................p.38
Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa.....................................................................................................p.39
Figura 21 - Análise em CCDC do cristal originário do extrato hexânico do bulbo. Eluição em Hex/Acetona (7:3). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – cloreto férrico; 5 – DPPH; 6 – Dragendorff; 7 – KOH 10 %; 8 – vapor de iodo..............................................................................................................................p.40
Figura 22 – Estrutura da eleuterina e suas correlações no COSY e HMBC..............p.43
Figura 23 – Espectro de RMN de 1H da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).................p.44
Figura 24 – Espectro de RMN de 13C da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)................p.45
Figura 25 – Mapa de contorno HSQC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...............p.46
Figura 26 – Mapa de contorno COSY da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...............p.47
Figura 27 – Mapa de contorno HMBC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)..............p.48
Figura 28 - Análise em CCDC do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH (9:1). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – cloreto férrico; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico........................................p.49
Figura 29 – Fluxograma parcial do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa. Fases da partição líquido-líquido...............................................p.50
Figura 30 – Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa. Fracionamento da FDE, da FD e o posterior fracionamento das frações da FD................................................................................................................p.53
Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico...............................................................................................................p.54
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Figura 32 – Estrutura do eleutherinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC.........................................................................................................................p.56
Figura 33 – Espectro de RMN de 1H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6
Figura 35 – Espectro de DEPT 135o do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)............................................................................................................................p.59
Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6
Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico....................................................................................p.63
Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC...............p.65
Figura 41 – Espectro de RMN de 1H do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).................p.66
Figura 42 – Espectro de RMN de 13C do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.67
Figura 43 – Espectro de DEPT 135 do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)....................p.68
Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.69
Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)................p.70
Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...............p.71
Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico.....................................................................................p.72
Figura 48 - Estrutura da isoeleuterina e suas correlações no COSY e HMBC...........p.74
Figura 49 – Espectro de RMN de 1H da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)............p.75
Figura 50 – Espectro de RMN de 13C da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...........p.76
xvii
Figura 51 – Espectro de RMN de DEPT 135o da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz).............................................................................................................................p.77
Figura 52 – Mapa de contorno COSY da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.78
Figura 53 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.79
Figura 54 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)..........p.80
Figura 55 - Análise em CCDC da Fração Fr 34+35 do fracionamento da fração Fr 14-20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – cloreto férrico; 6 – KOH 10 %; 7 – KOH 10% (UV – 365)...............................................................................................................................p.82
Figura 56 - Estrutura do eleuterinol e suas correlações no COSY e HMBC..............p.83
Figura 57 - Espectro de 1H do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).........................p.84
Figura 58 - Espectro de 13C do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)........................p.85
Figura 59 - Espectro de RMN de DEPT 135o do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).............................................................................................................................p.86
Figura 60 - Mapa de contorno COSY do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).......p.87
Figura 61 - Mapa de contorno HSQC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)........p.88
Figura 62 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)......p.89
Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa
frente a S. aureus..........................................................................................................p.90
Figura 64 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase DCM obtida do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus........................................................................p.94
Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a P. fluorescens....................................................................................p.96
Figura 66 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a S. aureus...........................................................................................p.96
Figura 67 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a P. fluorescens...................................................................................p.97
xviii
Figura 68 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a S. aureus...........................................................................................p.97
Figura 69 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a P. fluorescens.....................................................................................p.98
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1 – Reveladores químicos e físicos aplicados nas cromatoplacas de sílica como
método colorimétrico para revelar as diversas classes químicas presentes no extrato, de
acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984. ............................................................p.28
Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos,
produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI-
Tabela 3 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo...................................................................................................................p.42 Tabela 4 – Visão geral das massas obtidas pela partição do extrato metanólico do bulbo
de Eleutherine bulbosa, mostrando a massa inicial obtida de cada fase, o rendimento em
relação à massa do extrato bruto, a massa armazenada para eventuais análises e testes,
as fases unidas por semelhança na CCDC, e a massa final utilizada no
Tabela 5 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz,
DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo........................................p.55
Tabela 6 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol.....................................................................................p.65
Tabela 7 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 29+30 (06-12), isoeleuterina...............................................................................p.74
Tabela 8 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 34+35 (14-20), eleuterinol...............................................................p.83
xix
Tabela 9 – Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da
naftoquinona Eleuterine, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa
utilizando o método com DPPH, mostrando valores de absorbância, equivalência do
ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios
Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos
em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterine frente à
Artemia salina, valores finais em porcentagem............................................................p.99
Tabela 13 – Determinação da morte celular de linhagens de células tumorais frente à
extratos de Eleutherine bulbosa e à naftoquinona eleuterina.....................................p.102
Quadro 01: Substâncias químicas e atividades biológicas de constituintes químicos isolados de Eleutherine e sinonímias..........................................................................p.22
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LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt – Acetato de Etila
CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CDCl3 – Clorofórmio deuterado
CIM – Concentração Mínima Inibitória
CL – Concentração Letal
CLSI – Clinical Laboratory and Standards Institute
COTI – Coordenação de Tecnologia e Inovação
DCM – Diclorometano
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO – Dimetilssulfóxido
DMSO – d6 – Dimetilssulfóxido deuterado
DPPH – 1,1-difenil-2-picril-hidrazila
FD – Fase DCM
FA – Fase AcOEt
HEX – Hexano
Hz – Hertz
INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
KOH – Hidróxido de Potássio
J – Constante de acoplamento
MeOH – Metanol
RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze
UV – Ultravioleta
d – Dubleto
t – Tripleto
ddd – Duplo Duplo Dupleto
dt – Duplo Tripleto
m – Multipleto
s – Singleto
ppm – Partes por milhão
1
1. INTRODUÇÃO
A Floresta Amazônica é conhecida pela sua vasta biodiversidade, abrigando
cerca de 20% da biodiversidade mundial (SUFFREDINI et al., 2002). A utilização das
plantas, no tratamento e cura de diversas doenças, é uma prática milenar e, até hoje, se
mostra como principal recurso terapêutico de muitos grupos e comunidades tradicionais.
As informações populares sobre o uso dessas plantas conduziram ao longo dos anos a
uma gama de informações de grande validade com relação à eficiência e aos efeitos
medicinais das plantas (OTTOBELLI et al., 2011). Segundo Cunha & Roque (2005a),
uma planta medicinal pode ser definida como aquela que possui atividade
farmacológica, usada com fins terapêuticos, e ainda, cujos metabólitos posteriormente
passam a ser incluídos em medicamentos.
As plantas são um dos principais organismos estudados produtores dos diversos
tipos de estruturas moleculares na natureza, através de seu metabolismo primário,
envolvido na manutenção da própria planta, e principalmente através do seu
metabolismo secundário, onde tais substâncias não são essenciais à manutenção da
planta, mas são essenciais para a sobrevivência da mesma no ecossistema, podendo ter
inúmeras funções diferentes. Ciente do papel dos metabólitos secundários, estes estão
especialmente relacionados com as propriedades terapêuticas das plantas (NEVES &
CUNHA, 2012).
Os estudos dos metabólitos foram iniciados pelos químicos orgânicos, do século
XIX e início do século XX, interessados nessas substâncias pela sua importância como
drogas medicinais, venenos, aromatizantes e materiais industriais. Os medicamentos de
origem natural possuem vantagem por serem de fácil disponibilidade, econômicos, e
apresentarem pouco ou nenhum efeito colateral. Hoje em dia, há um interesse renovado
em medicamentos de origem natural, por serem considerados mais seguros para a saúde
humana e com produção menos prejudicial ao meio ambiente, ao contrário das drogas
sintéticas (CHANDA, 2014).
Ainda, nos últimos anos, com o aumento da resistência de micro-organismos
patogênicos a múltiplos fármacos, verificou-se um esforço maior na investigação de
produtos naturais de forma a identificar novas substâncias ativas que pudessem ser
2
utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos (NEWMAN et
al., 2003; SHU, 1998).
No campo da fitoquímica se encontra um grande número de trabalhos
experimentais publicados. A importância científica das pesquisas desenvolvidas nesta
área é demonstrada pelos resultados obtidos em diversos trabalhos, que contribuíram
para a elucidação e o conhecimento de milhares de substâncias naturais aplicados para a
criação de novos medicamentos de origem vegetal (MATOS, 2009).
Brito e Brito (1993) apontam diversos estudos químicos e/ou farmacológicos
realizados com espécies da flora brasileira, desde a Floresta Amazônica até o Pantanal,
ressaltando as potencialidades de utilização de várias delas, bem como a necessidade de
maiores estudos dessa riquíssima flora. A região Amazônica, com sua imensa
biodiversidade, desponta como um celeiro a contribuir para o surgimento de novos
medicamentos fitoterápicos (MALHEIROS, 2008).
Dentre as famílias vegetais encontradas na região Amazônica, com reconhecido
potencial terapêutico, destaca-se Iridaceae, considerada por Reeves e colaboradores
(2001) como uma das maiores famílias das Lilianae e provavelmente uma das mais
estudadas entre as monocotiledôneas. Das diversas espécies estudadas da família
Iridaceae, encontra-se a espécie Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., planta inclusa na
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), reconhecida
por diversos potenciais terapêuticos e vasta riqueza de substâncias isoladas até hoje em
diversos estudos e revisões recentes sobre a espécie e sinonímias (COUTO et al., 2016;
INSANU, KUSMARDIYANI & HARTATI, 2014; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
Ainda, apesar de diversos estudos existirem sobre a espécie Eleutherine bulbosa, os
variados potenciais de suas substâncias não foram inteiramente explorados,
principalmente de indivíduos do bioma amazônico, do qual existem poucos trabalhos
realizados. Assim, este trabalho teve como finalidade avaliar mais profundamente os
potenciais dos extratos e das substâncias isoladas de um indivíduo de Eleutherine
bulbosa do bioma amazônico, e verificar as substâncias produzidas pelo mesmo a fim
de contribuir mais com o estudo da espécie.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 METABOLISMO SECUNDÁRIO E PRODUTOS NATURAIS
A floresta amazônica é conhecida por deter a maior diversidade vegetal do
mundo com pelo menos 16 mil espécies de árvores. Apesar de existirem muitos estudos
de plantas amazônicas em busca de metabólitos secundários de interesse, o
conhecimento atual das plantas do bioma Amazônico representa apenas uma pequena
parte dessa enorme diversidade (SKIRYCZ et al., 2016; TER STEEGE et al., 2013).
O aparecimento de metabólitos biologicamente ativos na natureza é determinado
por necessidades ecológicas e possibilidades biossintéticas, tendo como fatores
estimulantes à produção desses metabólitos secundários a co-evolução de plantas,
insetos, micro-organismos e mamíferos (RHODES, 1994), além de vários outros fatores
como temperatura, sazonalidade, disponibilidade de água, radiação Ultra Violeta (UV),
disponibilidade de nutrientes e altitude, como observado na Figura 1 (GOBBO-NETO
& LOPES, 2007). Atualmente, sabe-se que muitos metabólitos secundários têm funções
ecológicas importantes, como proteção contra herbivoria e infecção por micro-
organismos, ação atrativa para polinizadores e agentes de competição planta-planta
(GERSHENZON & ENGELBERTH, 2013).
Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: GOBBO-NETO & LOPES (2007)
4
A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do
metabolismo da glicose através da via do ácido chiquímico e do acetato, onde o
primeiro origina aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos
As cumarinas são oriundas da oxidação do ácido trans-cinâmico tornando-se
ácido o-cumárico seguindo-se glicosilação, sendo posteriormente isomerizado para
forma –cis dando origem à cumarina (CUNHA & CAMPOS, 2005), como demonstrado
na figura 3. Elas possuem uma grande variedade de atividades biológicas, como ação
antimicrobiana, antiviral, anti-inflamatória, antiespasmódica, antitumoral e antioxidante
(MIRANDA, 2001), além de poderem estar relacionadas com a inibição de enzimas e
com a sua capacidade de suprimir espécies ativas de oxigênio (EAO) (HOULT &
PAYÁ, 1996).
Podem ser encontradas sozinhas ou combinadas com açúcares ou ácidos.
Possuem características odoríferas que permitem o uso na fabricação de perfumes e
agentes flavorizantes, como por exemplo, em repelente de insetos (MIRANDA, 2001).
Já os flavonoides são moléculas que tem por base a estrutura da flavona (figura
4), e as estruturas predominantes são de flavonóis e flavonas quase sempre na forma
heterosídica. Os flavonoides sintetizam-se nas plantas e participam na fase luminosa da
fotossíntese, a fenilalanina e a tirosina dão lugar ao ácido cinâmico e ao ácido p-
hidroxicinâmico que originam a estrutura cinamoil dos flavonoides após condensar-se
com unidades de acetato. O ácido cinâmico forma-se da fenilalanina, e é o precursor de
outro fenilpropanoides como a lignina, flavonoides e cumarinas (CAMPOS, 2005).
Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002).
O
O
7
Neste grupo encontram-se as antocianidinas, flavonas, flavonóis e, com menor
freqüência, as auronas, calconas e isoflavonas (SOARES, 2002).
De acordo com Campos (2005), os flavonoides têm atraído a atenção da ciência
médica devido às suas propriedades anti-carcinogênica, anti-alergênica, anti-
inflamatória, antioxidante, antibacteriana, antidiarreica e antiviral, além de serem pouco
tóxicos para o homem, sendo então, considerado por Fracaro (2004), como um dos
grupos fenólicos mais importantes, estando amplamente distribuídos no reino vegetal e
sendo altamente diversificados entre os produtos de origem natural.
Outro grupo que se destaca por sua importância medicinal são as quinonas. As
quinonas são substâncias orgânicas originários da oxidação de fenóis, onde da mesma
forma, a redução de quinonas dá origem aos fenóis. Esta classe tem como principal
característica a presença de dois grupos carbonílicos formando um sistema conjugado
(FALKENBERG, 2007).
As quinonas podem ser classificadas de acordo com a sua estrutura, onde leva-se
em consideração o tipo de sistema aromático que sustenta o anel quinonoídico: as
benzoquinonas, que possuem apenas um anel de 6 carbonos com duas carbonilas ligadas
na sua estrutura; as naftoquinonas, que possuem um anel naftalênico; e as
antraquinonas, que possuem um anel antracênico, podendo este ser linear ou angular,
como demonstrado na figura 5. As quinonas naturais são consideradas de vital
importância para diversos seres vivos como vegetais superiores, artrópodes, fungos,
liquens e diversos micro-organismos, e sua distribuição nestes organismos se dá,
possivelmente, de acordo com as suas funções biológicas (SILVA, FERREIRA &
SOUZA, 2003).
Figura 4 - Estrutura química da flavona. Fonte: Adaptado de Campos (2005).
O
O
8
As quinonas são encontradas em abundância na flora brasileira, sendo altamente
estudadas e seus potenciais biológicos comprovados, demonstrando potenciais
antimicrobiano, antimalárico, antitumoral e até mesmo tripanossomicida quando
associada a outras substâncias. Elas são encontradas em diversas famílias de plantas
superiores, sobretudo nas famílias Rubiaceae, Fabaceae (Caesalpinioideae),
Verbenaceae, Bignoniaceae, Myrsinaceae, Iridaceae, e entre outras (DE MOURA et al.,
2001; MORELLO et al., 1995; VERMA, 2006; DE ANDRADE-NETO et al., 2004;
FALKENBERG, 2007).
Um exemplo de substância conhecida é o lapachol, uma naftoquinona natural
encontrada principalmente na família Bignoniaceae, especificamente no gênero
Tabebuia (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Descrito pela primeira vez
por Paternò em 1882, e estrutura química estabelecida por Hooker em 1896, o lapachol
possui a capacidade de induzir estresse oxidativo através da formação intracelular de
espécies reativas do oxigênio, como o radical hidroxila (OH), sendo portanto capaz de
danificar significativamente células normais e malignas, pela indução da apoptose em
células tumorais e impedir seu crescimento desordenado. Contudo, por conta da mesma
poder prejudicar células sadias, muitos estudos foram realizados para criar substâncias
derivadas do lapachol, tornando esta a matéria prima para síntese e semi-síntese de
muitas outras substâncias de distintas bioatividades. Exemplos disso seriam a α-
lapachona e a β-lapachona (Figura 6), que possuem reconhecidas atividades biológicas
Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003)
A B C
O
O
O
O
O
O
9
já descritas na literatura, tais como atividade antitumoral, leishmanicida, anti-
inflamatória, anti-fúngica, tripanomicida, antiprotozoária e antimicrobiana (ASCHE,
2005; LIU, LI & SAKYA, 2004; SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003; ALMEIDA et
al., 1990; DE MOURA et al., 2001; GAFNER et al., 1996; TEIXEIRA et al., 2001;
ZANI et al., 1997; MACHADO et al., 2003).
Outra classe de metabólitos com grande potencial medicinal são os terpenos. Os
terpenoides são uma classe derivada de unidades de isopreno de 5 carbonos (C5), que
possuem estruturas multi-cíclicas variadas que se diferenciam nos grupos funcionais e
nos esqueletos básicos de carbono, e podem ser encontrados em praticamente todas as
classes de seres vivos, por isso sendo considerado o maior grupo de produtos naturais.
Estes são encontrados principalmente em óleos essenciais de plantas, e por conta disso,
muitos dos terpenoides possuem alto interesse comercial por possuírem fragrâncias
distintas, sendo usados no campo de alimentação e cosmética.
Os terpenos podem ser classificados em hemiterpenoides (C5), possuindo apenas
uma unidade isoprênica em sua estrutura; monoterpenoides (C10), com duas unidades
isoprênicas estruturadas de forma linear ou contendo dois anéis, como no caso do
eucaliptol e do limoneno; sesquiterpenos (C15), que possuem três unidades isoprênicas,
como no caso do eudesmol, encontrado no óleo de Eucalipto; diterpenos (C20),
compostos por quatro unidades isoprênicas; triterpenos (C30), que consistem em seis
unidades isoprênicas, encontrados, por exemplo, em óleos de oliva; e tetraterpenos
(C40), que contém oito unidades isoprênicas em sua estrutura, exemplos de
Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-lapachona e β-lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013)
lapachol α-lapachona β-lapachona
O
O
OH
CH3
CH3
O
O
O
CH3CH3
O
O
O
CH3
CH3
10
tetraterpenos seriam o licopeno e o betacaroteno (figura 7) (SAXENA et al., 2013;
LANGENHEIM, 1994).
Os terpenoides são conhecidos por serem o grupo com maior diversidade
estrutural entre os metabólitos secundários, conferindo a eles uma ampla gama de
funções, como defesas contra herbivoria, produção de óleos voláteis para atração de
polinizadores, e funções de compostos sinalizadores e reguladores de crescimento na
planta (fitohormônios). Ainda, eles apresentam diversas propriedades medicinais
comprovadas, como propriedades anti-malárica, anti-tumoral, hepaticida e
antimicrobiana (DEGENHARDT et al., 2003; DUDAREVA, PICHERSKY &
Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos, produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI-INPA
39
(figura 20) obtendo-se uma amostra 50 mg de massa, posteriormente submetida à
análise de CCDC para verificar o grau de pureza da substância.
5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo
A substância em questão foi denominada CR-Bulbo até a sua
identificação. A análise de CCDC dos cristais revelou que a amostra encontrava-se em
mistura (figura 21). Puderam-se observar fluorescências persistentes em ambos os
comprimentos de onda do UV (254 nm e 365 nm, respectivamente), indicando a
possível presença de derivados antraquinônicos e substâncias fenólicas. A revelação
com anisaldeído indicou a possível presença de classes de terpenos, além de uma
Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa.
40
complexidade de substâncias que torna difícil inferir as possíveis classes de metabólitos
presentes na amostra. Na revelação com cloreto férrico, observou-se a presença de
substâncias aromáticas na amostra. O DPPH revelou a presença de substância com
potencial antioxidante. Já a revelação com Dragendorff não se mostrou positiva para a
presença de alcaloides, contudo, houve a aparição de uma mancha de cor preta na placa,
incomum para este revelador, e por isso não se pôde inferir a classe de metabólito que
causou essa reação. A revelação com KOH 10% revelou a forte presença de classes de
quinonas, representadas pelas manchas de cor vermelha e violeta. Na revelação com
vapores de iodo, foi revelada a presença de substâncias com duplas ligações em sua
estrutura. Por fim, na revelação com sulfato cérico, revelou manchas de cores
avermelhadas que são indicativas da presença de terpenos (mas não houve a revelação
de manchas roxas que são mais comuns para a presença de terpenos). E foram reveladas
manchas de cor verde, que não são características de nenhuma classe química
específica. A fluorescência de cor amarela na placa 2 é típica de classes como chalconas
e flavonoides, e quando revelada com DPPH, revela uma substância com potencial
antioxidante, característica comumente encontrada em substâncias fenólicas, o que
reforça a possibilidade de esta mancha ser uma substância fenólica. É interessante
ressaltar ainda que os cristais, quando testados no ensaio antioxidante, apresentaram
baixo potencial. Essa observação sugere que as substâncias fluorescentes apresentem
potencial antioxidante quando não estão em mistura, provavelmente por serem
compostos minoritários da amostra.
A análise em CCDC indica a presença de um constituinte majoritário, o qual
apresenta uma intensa absorção no comprimento de onda 254 nm, revelou com KOH e
com o vapor de iodo, sendo que tudo isso indica se tratar de uma substância aromática,
possivelmente da classe das antraquinonas.
A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M]+ revelou íon pico
molecular majoritário de 273.11 m/z, correspondendo à fórmula molecular de C16H16O4.
No espectro de RMN de 1H (300 MHz) do CR-Bulbo (Figura 23), foram observados
sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 1,33 (3H, d, J = 6,05, 3H) e δ
1,51 (3H, d, J = 6,6, 3H), sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,17 (ddd, J = 18,25;
10,24; 3,8, 1H) e 2,72 (dt, J = 18,25; 2,5, 1H). O sinal de singleto em δ 3,97 (3H)
representa um sinal bem característico de metoxila, radical comumente presente nas
substâncias isoladas desta espécie. Os sinais em δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e
41
δ 7,68 (d, J = 7,54) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático. Por meio
das análises dos espectros de 13C (Figura 24) e HSQC (Figura 25), pôde-se definir que a
substância em questão possui três carbonos metílicos (CH3), sendo um ligado à oxigênio
(metoxila), um carbono metilênico (CH2), cinco carbonos metínicos e sete carbonos
quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.
No mapa de contorno COSY (Figura 26) e no mapa de contorno HMBC (Figura
27), pôde-se observar as correlações de carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos,
em específico as correlações entre os sinais δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e δ
7,68 (d, J = 7,54). Por estes dados (Tabela 3), e em comparação com dados da literatura
(HARA et al., 1997; KUSUMA et al., 2010; SHIBUYA et al., 1997), a substância CR-
Bulbo foi identificada como sendo a naftoquinona eleuterina em mistura (Figura 22).
A naftoquinona eleuterina já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em diversos
trabalhos, tornando ela um potencial marcador quimiotaxonômico da espécie. Ainda, ela
apresentou comprovados potenciais biológicos como antimicrobiano, antifúngico, ação
vaso dilatadora (útil para tratamento de doenças do coração) e inibição da
topoisomerase II humana (útil para inibição da replicação de células cancerígenas)
(HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI,
2012; PARAMAPOJN et al., 2008; ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006).
42
Tabela 3 - Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo.
5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD)
A análise por CCDC da fração Fr 51-53 (FD) apresentou fluorescências
persistentes em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e UV-365 nm, além de
forte revelação no iodo indicando substâncias com duplas ligações, corroborando com a
revelação com cloreto férrico, que indicou a presença de substâncias aromáticas. A
coloração roxa visualizada no anisaldeído indicaria a presença de terpenos, porém, a
revelação com sulfato cérico não apresentou indícios desta classe, não corroborando
então para o indício de terpenos nas frações. Por fim, a revelação com KOH 10%
demonstrou a presença de derivados de quinonas na amostra (Figura 31).
A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H]+ revelou íon pico
molecular majoritário de 419.1337 m/z, com fórmula molecular de C21H23O9. No
espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 51-53 (Figura 33), foram observados
sinais típicos de hidrogênios de metilas na região entre δ 0,81 e δ 2,73, sinais de
hidrogênios de metilenos em δ 3,50 e 3,70 e sinais de metinos na região entre δ 3,24 e
3,38. O dupleto em δ 4,99 (1H, J = 7,26 Hz) demonstra a presença de hidrogênio
próximos à oxigênio. Na região entre δ 6,21 e 7,31, há sinais típicos de hidrogênios
ligados a anéis aromáticos. Os demais hidrogênios não foram considerados como sendo
da substância, tal como o sinal em δ 1,20, típico de metilas de graxas ou lipídios,
comumente isoladas de materiais extraídos com solventes mais apolares como hexano e
diclorometano.
Através das análises dos espectros de 13C (Figura 34) e DEPT 135o (Figura 35),
pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois carbonos metílicos
(CH3), um sinal de carbono metilênico (CH2), dez sinais carbonos metínicos e oito
sinais de carbonos quaternários (C), totalizando 21 carbonos na estrutura.
A análise das correlações observadas nos mapas de contorno COSY (Figura 36),
HSQC (Figura 37) e HMBC (Figura 38), permitiu correlacionar os deslocamentos
químicos que confirmaram a presença de anéis aromáticos na estrutura, além de
correlações que demonstraram a presença de hidrogênios típicos de açúcares, mais
especificamente da região entre δ 3,24 e 3,38 do espectro de 1H. Por estes dados (Tabela
55
6), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010), a substância Fr 51-
53 (FD) foi identificada como sendo o policetídeo eleuterinol-8-O-β-glicosídeo (Figura
32).
Esta substância foi previamente isolada por Gallo e colaboradores (2010),
tornando este o segundo relato de isolamento deste policetídeo na literatura. Ainda, não
há também relatos de ensaios biológicos com esta substância.
Posição δ C DEPT 135o δ H
(mult., J (Hz) COSY HMBC
2 163,86 C - - - 3 112,19 CH 6,21 (s) - C-2, C-4a 4 178,70 C - - -
Tabela 5 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo.
2 1 3 4
5 6 7
51-53 51-53 51-53 51-53
51-53 51-53 51-53
Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico
Figura 32 – Estrutura do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC.
57
Figura 33 – Espectro de RMN de 1H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
58
Figura 34 – Espectro de RMN de 13C do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
59
Figura 35 – Espectro de DEPT 135o do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
60
Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
61
Figura 37 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
62
Figura 38 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).
63
5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12)
A fração Fr 01+02, originária do refracionamento da fração 06-12 da fase DCM,
apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e
UV-365 nm, sugerindo a presença de derivados antraquinônicos e substâncias
aromáticas. Na revelação com anisaldeído sulfúrico, manchas de coloração esverdeada e
roxa sugerem a presença de classes de terpenos, incluindo os presentes em óleos
essenciais devido a coloração esverdeada. Na revelação com sulfato cérico, formas
circulares de coloração marrom revelaram-se ao redor das amostras, não podendo então
inferir o tipo de classe revelada através deste revelador. Na revelação com KOH 10%,
não houve revelação de quinonas para a fração 01+02, somente para as frações
posteriores, sendo representadas pelas colorações em vermelho e roxo. Na revelação
com o cloreto férrico não houve revelação de substâncias aromáticas para a fração
01+02, somente para as frações posteriores (Figura 39).
A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H]+ revelou íon pico
molecular majoritário de 245.0813 m/z, com fórmula molecular de C14H11O4. No
espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 01+02 (06-12) (Figura 41), pôde-se
observar um dupleto em δ 1,74 (3H, J = 6,5) típico de hidrogênio de metila, além de um
forte sinal de singleto em δ 4,12, característico de metilas ligadas à oxigênio. Na região
entre δ 5,70 e 7,88, verificou-se a presença de sinais típicos de hidrogênios ligados a
carbonos de anéis aromáticos.
Através das análises dos espectros de 13C (Figura 42), DEPT 135o (Figura 43) e
HSQC (Figura 44), pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois
carbonos metílicos (CH3), cinco sinais carbonos metínicos (CH2) e 7 sinais de carbonos
quaternários (C), totalizando 14 carbonos na estrutura. A ausência de carbonos
metilênicos sugere uma estrutura química composta de anéis aromáticos onde
predomina-se a presença de metinos na estrutura.
No mapa de contorno do COSY (Figura 45) e no mapa de contorno do HMBC
(Figura 46), pôde-se correlacionar os deslocamentos químicos que confirmaram a
presença de anéis aromáticos na estrutura, além de correlações que demonstraram
carbonos quaternários ligados a oxigênio, como o carbono 1 no sinal em δ 170,60, o que
justifica seu deslocamento elevado. Por estes dados (Tabela 7), e em comparação com
dados da literatura (IEYAMA, GUNAWAN-PUTERI & KAWABATA, 2011;
01+02
64
SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 01+02 (06-12) foi identificada como sendo o
naftaleno eleuterol (Figura 40).
Esta substância é comumente isolada nesta espécie e suas sinonímias ao redor do
mundo, tendo sido isolada em diversos outros trabalhos já publicados, com
comprovadas atividades biológicas como antifúngico e estimulante da circulação
sanguínea (BIANCHI & CERIOTTI, 1975; HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983;
ZHENGXIONG et al., 1986).
1 2 3
4 5 6
Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa. Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico
C-11 10 125,88 C - - 11 127,90 C - - 12 117,49 C - - 13 137,19 C - -
Me-3 19,16 CH3 1,74 (d, J = 6,5) H-1 C-3, C-11 Me-O 56,39 CH3 4,12 (s) - C-6, C-5 OH 149,16 C 9,65 (s) - C-12, C-11, C-4
Me-3
Me-O
9 8
7
6
5
4
3
1
10
11 12
13
COSY
HMBC
Tabela 6 – Dados de RMN de 1H, 13C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol.
O
CH3
H
OHHH
H
OCH3
OH
Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC.
66
Figura 41 – Espectro de RMN de 1H do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
67
Figura 42 – Espectro de RMN de 13C do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
68
Figura 43 – Espectro de DEPT 135o do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
69
Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
70
Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
71
Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz).
72
5.2.1.7 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 29+30 (06-12)
A fração Fr 29+30, originária do refracionamento da fração 06-12 da fase DCM,
também apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-
254 e UV-365 nm, típicos de substâncias aromáticas, e cromóforos de coloração
amarela típicos de derivados antraquinônicos. No geral, esta fração apresentou classes
de substâncias como quinonas, representadas por manchas azuladas na revelação com
KOH 10%, classes de terpenos visto na revelação com anisaldeído sulfúrico
representados por manchas roxas e esverdeadas, porém não houve indícios de terpenos
na revelação com sulfato cérico. A revelação com cloreto férrico não apresentou
manchas típicas de substâncias aromáticas (escuras e marrons), apenas as manchas
amarelas persistentes da amostra.
A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M]+ revelou íon pico
molecular majoritário de 273.11 m/z, com fórmula molecular de C16H16O4. Os dados
espectrais desta substância possuem grande semelhança com a substância eleuterina, por
esta ser sua forma “iso”. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da Fr 29+30 (06-12)
(Figura 49), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ
1,34 (3H, d, J = 6,05) e δ 1,54 (3H, d, J = 6,71), onde comprova-se a diferença na
estrutura da eleuterina pela constante de acoplamento da metila em δ 1,54. Foi possível
visualizar também sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,23 (ddd, J = 19,0; 10,2;
1,8) e 2,69 (dd, J = 19,0; 3,3). O sinal de singleto em δ 4,01 (3H) representa um sinal
bem característico de metoxila. Os sinais em δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ
7,73 (dd, J = 8,0; 1,0) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático.
Através das análises dos espectros de 13C (Figura 50) e DEPT 135o (Figura 51) pôde-se
definir que a substância em questão possui três carbonos metílicos (CH3), sendo um
ligado à oxigênio (metoxila), um carbono metilênico (CH2), cinco carbonos metínicos e
sete carbonos quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.
Através das análises dos mapas de contorno COSY (Figura 52), HSQC (Figura
53) e no mapa de contorno HMBC (Figura 54), pôde-se observar as correlações de
carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos, em específico as correlações entre os
sinais δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0). Por estes dados
(Tabela 8), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010; HARA et
al., 1997; MALHEIROS, 2008; SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 29+30 (06-12)
73
foi identificada como sendo a naftoquinona (Figura 48), justificando o fato de sua
fórmula molecular e massa serem idênticas a da eleuterina.
A naftoquinona isoeleuterina, já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em
diversos trabalhos, sendo considerada como um dos importantes isoeleuterina
constituintes químicos do gênero. Ainda, ela apresentou comprovados potenciais
biológicos como antimicrobiano, antifúngico, antiamebiana, moduladora de respostas
imunes em células de camundongos, ação vaso dilatadora (útil para tratamento de
doenças do coração) e atividade inibitória da replicação do vírus HIV (HARA et al.,
1997; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI, 2012; PARAMAPOJN et al., 2008;
ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2012; HONG et
al., 2008).
29+30
29+30 29+30 29+30
29+30 29+30 1 2 3
4 5 6
Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo E. bulbosa. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico
Acinetobacter baumanii - 1000 *O controle positivo utilizado foi oxitetraciclina a uma concentração de 125 μg/mL. Concentração dos extratos e das fases de 1000 µg/mL até 7,8 µg/mL
O extrato metanólico apresentou uma inibição significativa na concentração de
1000 µg/mL quando comparado com o controle positivo, e uma inibição de mais de
50% na concentração de 500 µg/mL frente à S. aureus, quando comparado com o
controle negativo (figura 63). Já a fase DCM apresentou uma atividade inibitória
significativa em ambas as concentrações de 1000 e 500 µg/mL (figura 64).
Tabela 11. Concentração inibitória mínima (MIC) para o extrato metanólico e a fase DCM oriundos do bulbo de Eleutherine bulbosa
94
Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa
frente a S. aureus.
Figura 64 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase DCM obtida do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus.
Bra
nco
Contr
ole
+
Contr
ole
-
1000
500
250
125
62,5
31,2
5
15,6
7,8
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
De
nsid
ad
e o
ptica
µg/mL
Bra
nco
Contr
ole
+
Contr
ole
-
1000
500
250
125
62,5
31,2
5
15,6
7,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
De
nsid
ad
e o
ptica
µg/mL
95
Com este resultado ficou clara a presença de substâncias com potenciais
antimicrobianos, e com isso, foi realizado o teste de CIM para as substâncias isoladas.
Concentração Inibitória Mínima (CIM) das substâncias isoladas
As sete substâncias isoladas da fase DCM do extrato metanólico do bulbo, bem
como a substância isolada do extrato hexânico do bulbo, foram submetidas ao teste de
CIM frente à todas as bactérias mencionadas. Para as substâncias, a concentração inicial
foi de 500 µg/mL sendo diluídas até 3,9 µg/mL.
No geral, de todas as substâncias testadas, apenas três delas apresentaram CIM
de pelo menos 50% de inibição, contra somente S. aureus e P. fluorescens, sendo estas
as frações 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina. Na fração 61+62 (FD) observou-se que
houve uma inibição de 49,68% na concentração de 500 µg/mL, contra P. fluorescens,
quando comparado com o crescimento do controle negativo (figura 65). Para o
eleuterol, observou-se que houve uma inibição de 51,59% na concentração de 500
µg/mL contra S. aureus (figura 66), e de 65,43% na concentração de 500 µg/mL, contra
P. fluorescens (figura 67). Já para a isoeleuterina, observou-se que houve uma inibição
de 49,13% na concentração de 500 µg/mL contra S. aureus (figura 68), quando
comparado com o crescimento do controle negativo, e de 81,23% na concentração de
500 µg/mL contra P. fluorescens (figura 69). Eleuterinol e isoeleuterina apresentaram
atividades semelhantes, com exceção do fato da isoeleuterina apresentar uma inibição
maior contra P. fluorescens.
Observou-se que eleuterina não demonstrou potencial antimicrobiano
significativo, ao contrário de isoeleuterina. Isto pode ser justificado pelo fato que as
atividades biológicas das naftoquinonas estão diretamente relacionadas com os seus
aspectos estruturais, sendo ativas ou inativas, por exemplo, pela simples retirada de um
metileno (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Com isso, é provável que a
mudança na posição do hidrogênio e da metila do C-3 da estrutura de ambos influencie
no potencial antimicrobiano.
96
Bra
nco
Contr
ole
+
Contr
ole
-
500
250
125
62,5
31,2
5
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0,2
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0,6
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1,0
1,2
Den
sid
ad
e o
ptica
µg/mL
Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a P. fluorescens.
Bra
nco
Con
tro
le +
Co
ntr
ole
-
50
0
25
0
12
5
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0,4
0,6
0,8
1,0
Den
sid
ad
e o
ptica
µg/mL
Figura 66 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa
frente a S. aureus.
97
Bra
nco
Con
trole
+
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trole
-
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0
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0
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0,8
1,0
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De
nsid
ade
optica
µg/mL
Figura 67 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa
frente a P. fluorescens.
Bra
nco
Con
trole
+
Co
ntr
ole
-
50
0
25
0
12
5
62,5
31
,25
15,6
7,8
3,9
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
De
nsid
ade
op
tica
µg/mL
Figura 68 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a S. aureus.
98
Malheiros (2008) também realizou testes antimicrobianos com o extrato
etanólico do bulbo de Eleutherine plicata coletada em Belém-PA contra S. aureus e E.
coli, onde obteve resultados positivos para atividade antimicrobiana, enquanto que a do
presente estudo, não apresentou atividade frente a essas cepas.
Padhi & Panda (2015) realizaram testes antimicrobianos com extratos de
Eleutherine bulbosa, coletada na Índia, contra S. aureus, E. coli e P. fluorescens,
encontrando resultados positivos para o extrato etanólico da espécie, testado através da
metodologia de difusão em ágar, em uma concentração de 30 mg/mL de amostras.
Ifesan e colaboradores (2009) também realizaram testes antimicrobianos com
extratos de Eleutherine americana, coletada na Tailândia, onde os extratos da mesma
apresentaram atividade inibitória frente a várias cepas de S. aureus presentes em
alimentos. Ainda, Ifesan, Ibrahim & Voravuthikunchai (2010) testaram os extratos
contra diversos outros micro-organismos, e nesse trabalho constataram atividade contra
S. aureus e nenhuma atividade contra E. coli.
Panda e colaboradores (2016), realizaram teste antimicrobiano com os extratos
aquoso e metanólico de Eleutherine bulbosa frente a diversas bactérias, encontrando
resultados positivos, onde uma porcentagem bem maior de inibição bacteriana foi
Bra
nco
Co
ntr
ole
+
Co
ntr
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-
500
250
125
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0,2
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Den
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ptic
a
µg/mL
Figura 69 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine
bulbosa frente a P. fluorescens.
99
demonstrada pelo extrato metanólico, apresentando uma concentração inibitória mínima
ainda maior do que a deste estudo, onde a menor foi de 22 µg/mL. Os autores justificam
esse potencial maior do extrato metanólico por conta dele possuir substâncias de baixa e
média polaridade, além de substâncias polares primárias. Além disso, extratos
metanólicos que são parcialmente diluídos em água, tem maior chance de quebrar a
membrana celular de bactérias, especialmente as Gram-Negativas, por estas possuírem
uma camada parcialmente hidrofílica que permite a passagem de pequenas moléculas
hidrofílicas do extrato na membrana, perturbando o equilíbrio celular e levando a morte
celular da bactéria.
5.3.3 TESTE DE TOXIDADE FRENTE À Artemia salina
O teste com Artemia salina foi realizado em triplicata de cada uma das amostras
testadas, nas concentrações de 1000, 500, 250, 125 µg/mL. Na tabela abaixo, são
mostrados os valores da taxa de mortalidade dos indivíduos e os controles do solvente e
solução salina, para uma maior confiabilidade nos resultados. As médias e o desvio
padrão das amostras foram calculados baseados na mortalidade dos indivíduos de
Artemia salina nos três poços, os resultados são demonstrados na tabela 12.
Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos
em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterina frente à
A análise fitoquímica de Eleutherine bulbosa coletada no bioma amazônico,
revelou a presença quinonas e derivados de quinonas. Foi possível o isolamento de
sete substâncias, contudo só foi possível a caracterização de cinco delas: eleuterina,
eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol.
O ensaio biológico de toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina, revelou
que os extratos de folhas, flores e bulbo possuem substâncias com alta toxidade, sendo
interessantes para a realização de ensaios antitumorais.
O ensaio antitumoral com revelou que o extrato hexânico do bulbo conseguiu
matar 50-60% da células tumorais de MCF-7, MRC-5 e SK-Mel-28, sendo promissor
para posteriores ensaios a fim de explorar esse potencial. Os extratos de folhas, flores
e bulbo, juntamente com a naftoquinona eleuterina, não apresentaram potencial
antitumoral frente às linhagens tumorais testadas, apesar da sua toxidade no ensaio
contra Artemia salina.
O ensaio antimicrobiano revelou que o extrato metanólico do bulbo e a fase
DCM, originária do mesmo, possuem substâncias com potencial antimicrobiano
presente nas amostras para 11 das bactérias testadas, e em menor concentração para a
fase DCM frente à S. aureus. Das substâncias isoladas, apenas a fração 61+62 (FD),
eleuterol e isoeleuterina, apresentaram CIM de 500 µg/mL contra S. aureus e P.
fluorescens.
Os extratos de folhas, flores e bulbo, juntamente com naftoquinona eleuterina,
não apresentaram atividade antioxidante significativa.
Os resultados deste estudo contribuíram para o conhecimento químico e
potencial biológico de Eleutherine bulbosa do bioma amazônico, contudo, em estudos
posteriores faz-se necessário o teste das substâncias isoladas e em sinergia com outras
substâncias, contra diferentes linhagens tumorais e cepas bacterianas para explorar
ainda mais o potencial desta espécie. Os dados aqui podem ser usados em futuros
trabalhos comparativos da química da espécie e gêneros inclusos em sua tribo, para
estudos quimiotaxonômicos, aliados com dados de morfologia e genética para a
solução de problemas taxonômicos.
104
7. REFERÊNCIAS
AHMED, S. A; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of immunological methods, v. 170, n. 703, p. 211–224, 1994.
ALBUQUERQUE, J. M. Plantas Medicinais de Uso Popular. Brasília: ABEAS, 1989.
ALMEIDA, E. R. DE et al. Antiinflammatory action of Lapachol. Journal of Ethnopharmacology, v. 29, p. 239–241, 1990.
ALVES, T. M. A.; KLOOS, H.; ZANI, C. L. Eleutherinone, a novel fungitoxic naphthoquinone from Eleutherine bulbosa (Iridaceae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 98, n. 5, p. 709–12, jul. 2003.
ARAÚJO, E. L.; ALENCAR, J. R. B.; ROLIM NETO, P. J. Lapachol: segurança e eficácia na terapêutica. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 12, p. 57–59, 2002.
ASCHE, C. Antitumour Quinones. Mini -Reviews in Medicinal Chemistry, v. 5, n. 5, p. 449–467, 2005.
AVILA, N. S. Neotropical Iridaceae. In: MILLIKEN, W., KLITGÅRD, B. & BARACAT, A. (Ed.). . Neotropikey - Interactive key and information resources for flowering plants of the Neotropics. 2009. ed. [s.l: s.n.].
BARBERENA, I. et al. Screening of anticancer and immunomodulatory activities of panamanian plants. Pharmaceutical Biology, v. 42, n. 7, p. 552–558, 2004.
BIANCHI, C.; CERIOTTI, G. Chemical and Pharmacological Investigations of Constituents of Eleutherine bulbosa (Miller) Urb. (Iridaceae). Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 64, n. 8, p. 1305–1308, 1975.
BRAND, D. J.; FISHER, J. F. Reductive transformations of 10-deoxydaunomycinone. The Journal of Organic Chemistry, v. 55, n. 2, p. 2518–2530, 1990.
BRASILEIRO, B. G. et al. Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 2, p. 195–202, 2006.
BRITO, A. R. M.; BRITO, A. A. S. Forty years of Brazilian medicinal plant research. Journal of ethnopharmacology, v. 39, n. 1, p. 53–67, maio 1993.
CAMPOS, M. DA G. Flavonóides. In: CUNHA, A. P. DA (Ed.). . Farmacognosia e Fitoquímica. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 238–289.
CHANDA, S. Importance of pharmacognostic study of medicinal plants: An overview. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 2, n. 5, p. 69–73, 2014.
CHUKR, N. Eleutherine. Disponível em: <<http://reflora.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB8048>>.
CHUN, S.-S. et al. Phenolic antioxidants from clonal oregano (Origanum vulgare) with antimicrobial activity against Helicobacter pylori. Process Biochemistry, v. 40, n. 2, p. 809–816, fev. 2005.
CLARRIDGE, J. E. et al. Extraintestinal human infection caused by Edwardsiella
tarda. Journal of clinical microbiology, v. 11, n. 5, p. 511–4, maio 1980.
COLEY, P. D. et al. Using ecological criteria to design plant collection strategies for
105
drug discovery. Frontiers in Ecology and the Environment, v. 1, n. 8, p. 421–428, 2003.
CORRÊA, A. G. TAXOL: DA DESCOBERTA AO USO TERAPÊUTICO. Química Nova, v. 18, n. 5, p. 460–467, 1995.
COUTO, C. L. L. et al. Eleutherine bulbous ( Mill .) Urb .: A review study. Journal of Medicinal Plants Research, v. 10, n. 21, p. 286–297, 2016.
CUNHA, A. P. DA; BATISTA, M. T. Taninos. In: CUNHA, A. P. DA (Ed.). . Farmacognosia e Fitoquímica. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 292–316.
CUNHA, A. P. DA; CAMPOS, M. DA G. Cumarinas. In: CUNHA, A. P. DA (Ed.). . Farmacognosia e Fitoquímica. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 226–235.
CUNHA, A. P. DA; CAVALEIRO, C.; SALGUEIRO, L. Fármacos Aromáticos (Plantas aromáticas e óleos essenciais). In: CUNHA, A. P. DA (Ed.). . Farmacognosia e Fitoquímica. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 339–401.
CUNHA, A. P. DA; ROQUE, O. R. A Farmacognosia nos Estudos Farmacêuticos. In: CUNHA, A. P. DA (Ed.). . Farmacognosia e Fitoquímica. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 3–15.
DE ANDRADE-NETO, V. F. et al. Antimalarial activity of phenazines from lapachol, β-lapachone and its derivatives against Plasmodium falciparum in vitro and Plasmodium berghei in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v. 14, n. 5, p. 1145–1149, 2004.
DE MOURA, K. C. G. et al. Trypanocidal Activity of Isolated Naphthoquinones from Tabebuia and Some Heterocyclic Derivatives: A Review from an Interdisciplinary Study. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 12, n. 3, p. 325–338, 2001.
DE SOUZA, N. J. Industrial development of traditional drugs: the forskolin example. A mini-review. Journal of ethnopharmacology, v. 38, n. 2-3, p. 177–80, mar. 1993.
DEGENHARDT, J. et al. Attracting friends to feast on foes: Engineering terpene emission to make crop plants more attractive to herbivore enemies. Current Opinion in Biotechnology, v. 14, n. 2, p. 169–176, 2003.
DEWICK, P. M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. New York: John Wiley & Sons, 2002.
DUDAREVA, N.; PICHERSKY, E.; GERSHENZON, J. Biochemistry of Plant Volatiles 1. Plant physiology, v. 135, n. August, p. 1893–1902, 2004.
EGGERS, L. A família Iridaceae no Parque Estadual de Itapuã, Viamão, Rio Grande do Sul, Brasil. Revista Brasileira de Biociências, v. 6, n. 3, p. 167–175, 2008.
EGGERS, L. et al. Iridaceae. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB136>.
FALKENBERG, M. DE B. Quinonas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. (Eds.). . Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6a. ed. Porto Alegre; Florianópolis: Editora da UFSC; Editora da UFRGS, 2007. p. 657–683.
FERREIRA, V. F. et al. Aspectos da Obra Científica de Antonio Ventura Pinto: Uma
106
Vida Dedicada ao Estudo da Reatividade Química de Quinonas Naturais e Sintéticas. Revista Virtual de Química, v. 5, n. 5, p. 1022–1047, 2013.
FISCHER, N. H. et al. Antimycobacterial evaluation of germacranolides. Phytochemistry, v. 49, n. 2, p. 559–564, 1998.
FRACARO, S. N. Potencial de toxicidade reprodutiva do extrato de Tillandsia usneoides Linnaeus, 1762 (Barba-de-pau) em coelhas gestantes. [s.l.] Universidade Federal do Paraná, 2004.
GAFNER, S. et al. Antifungal and antibacterial naphthoquinones from Newbouldia
laevis roots. Phytochemistry, v. 42, n. 5, p. 1315–1320, 1996.
GALLO, F. R. et al. Polyketides from Eleutherine bulbosa. Natural product research, v. 24, n. 16, p. 1578–86, out. 2010.
GAUDIANO, G.; KOCH, T. H. Redox chemistry of anthracycline antitumor drugs and use of captodative radicals as tools for its elucidation and control. Chemical research in toxicology, v. 4, n. 16, p. 2–16, 1991.
GERSHENZON, J.; ENGELBERTH, J. E. Metabólitos Secundários e Defesa Vegetal. In: TAIZ, L.; ZEIGER, E. (Eds.). . Fisiologia Vegetal. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. p. 370–400.
GERSHMAN, M. D. et al. Multistate outbreak of Pseudomonas fluorescens bloodstream infection after exposure to contaminated heparinized saline flush prepared by a compounding pharmacy. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, v. 47, n. 11, p. 1372–9, 1 dez. 2008.
GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 374–381, 2007.
GOLDBLATT, P. Phylogeny and Classification of Iridaceae. Annals of The Missouri Botanical Garden, v. 77, p. 607–627, 1990.
GOLDBLATT, P. et al. Iridaceae “ Out of Australasia ”? Phylogeny , Biogeography , and Divergence Time Based on Plastid DNA Sequences. Systematic Botany, v. 33, n. 3, p. 495–508, 2008.
GOLDBLATT, P.; MANNING, J. C. The Iris family: the natural history and classification. London: Timber Press, 2008.
GOLDBLATT, P.; MANNING, J. C.; RUDALL, P. Iridaceae. In: KUBITZKI, K. (Ed.). . The families and genera of vascular plants IV. Berlin: Springer Verlag, 1998. p. 295–333.
GOLDBLATT, P.; SNOW, N. Systematics and chromosome cytology of Eleutherine herbert (Iridaceae). Annals of The Missouri Botanical Garden, v. 78, p. 942–949, 1991.
GONZÁLEZ, A. M. et al. Detección de metabolitos fúngicos con actividad tóxica mediante bioensayo sobre Artemia salina. Revista Iberoamericana de Micología, v. 24, p. 59–61, 2007.
HALLIWELL, B. et al. The Characterization of Antioxidants. Food and Chemical Toxicology, v. 33, n. 7, p. 601–617, 1995.
HAMBURGER, M.; HOSTETTMANN, K. Bioactivity in plants: the link between
107
phytochemistry and medicine. Phytochemistry, v. 30, n. 12, p. 3864–3874, 1991.
HAN, A.-R. et al. Identification of a new naphthalene and its derivatives from the bulb of Eleutherine americana with inhibitory activity on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production. Chemical & pharmaceutical Bulletin, v. 56, n. 9, p. 1314–6, set. 2008.
HANAWA, F.; TAHARA, S.; MIZUTANI, J. Isoflavonoids produced by Iris
pseudacorus leaves treated with cupric chloride. Phytochemistry, v. 30, n. 1, p. 157–163, jan. 1991.
HARA, H. et al. Elecanacin, a novel new naphtoquinone from the bulb of Eleutherine
americana. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 45, n. 10, p. 1714–1716, 1997.
HARADA, T. N. Correlação entre os ensaios de citotoxidade em Artemia salina e atividade antineoplásica sobre linhagens de células tumorais para algumas classes de produtos naturais. [s.l.] Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 2009.
HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. The phytochemical richness of the Iridaceae and its systematic significance. Annali di Botanica, v. 58, p. 43–50, 2000.
HONG, J. H. et al. Isoeleutherin and eleutherinol, naturally occurring selective modulators of Th cell-mediated immune responses. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 371, p. 278–282, 2008.
HOOKER, S. C. Constitution of Lapachol and it’s derivatives. The structure of the Anylene Chain. Journal of the Chemical Society, n. 69, p. 1356, 1896.
HOULT, J. R.; PAYÁ, M. Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins: natural products with therapeutic potential. General pharmacology, v. 27, n. 4, p. 713–22, jun. 1996.
IEYAMA, T.; GUNAWAN-PUTERI, M. D. P. T.; KAWABATA, J. a -Glucosidase inhibitors from the bulb of Eleutherine americana. Food Chemistry, v. 128, n. 2, p. 308–311, 2011.
IFESAN, B. O. T. et al. Inhibitory effect of Eleutherine americana Merr. extract on Staphylococcus aureus isolated from food. Journal of food science, v. 74, n. 1, p. M31–6, 2009.
IFESAN, B. O. T.; IBRAHIM, D.; VORAVUTHIKUNCHAI, S. P. Antimicrobial activity of crude ethanolic extract from Eleutherine americana. Journal of Food, Agriculture and Environment, v. 8, n. 3-4 PART 2, p. 1233–1236, 2010.
INSANU, M.; KUSMARDIYANI, S.; HARTATI, R. Recent Studies on Phytochemicals and Pharmacological Effects of Eleutherine Americana Merr. Procedia Chemistry, v. 13, p. 221–228, 2014.
JUDD, W. S. et al. (EDS.). Sistemática Vegetal – Um enfoque filogenético. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009.
KAMCHONWONGPAISAN, S.; MESHNICK, S. R. The mode of action of the antimalarial artemisinin and its derivatives. General pharmacology, v. 27, n. 4, p. 587–92, jun. 1996.
KARMINI; YULIET; KHUMAIDI, A. Formulasi Tablet Antioksidan Bawang Hutan (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb). Online Jurnal of Ntural Scince, v. 3, n. December, p. 247–256, 2014.
108
KOMURA, H. et al. New Anthraquinones from Eleutherine americana. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 31, n. 11, p. 4206–4208, 1983.
KRISHNAN, P.; BASTOW, K. F. Novel mechanisms of DNA topoisomerase II inhibition by pyranonaphthoquinone derivatives-eleutherin, alpha lapachone, and beta lapachone. Biochemical pharmacology, v. 60, n. 00, p. 1367–1379, 2000.
KUNTORINI, E. M. Kemampuan Antioksidan Bulbus Bawang Dayak ( Eleutherine
americana Merr ) Pada Umur Berbeda. Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, p. 297–302, 2013.
KUNTORINI, E. M.; ASTUTI, M. D. PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL BULBUS BAWANG DAYAK (Eleutherine americana Merr.). Sains dan Terapan Kimia, v. 4, n. 1, p. 15–22, 2010.
KUSUMA, I. W. et al. Antidermatophyte and antimelanogenesis compound from Eleutherine americana grown in Indonesia. Journal of Natural Medicines, v. 64, n. 2, p. 223–226, 2010.
LACAILLE-DUBOIS, M. A.; WAGNER, H. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, v. 2, n. 4, p. 363–86, mar. 1996.
LANGENHEIM, J. H. Higher plant terpenoids: A phytocentric overview of their ecological roles. Journal of Chemical Ecology, v. 20, n. 6, p. 1223–1280, 1994.
LIN, T.-S. et al. 2,3-Dimethyl-1,4-naphthoquinone Derivatives as Bioreductive Alkylating Agents with Cross-Linking Potential. Journal of Medicinal Chemistry, v. 27, n. 6, p. 813–815, 1984.
LIU, K. K.-C.; LI, J.; SAKYA, S. Synthetic approaches to the 2003 new drugs. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, v. 4, n. 10, p. 1105–1125, 2004.
LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. 2. ed. Nova Odessa, São Paulo: Instituto Plantarum de Estudos da Flora LTDA, 2008.
MACHADO, T. B. et al. In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 21, n. 3, p. 279–284, 2003.
MACRAE, W. D.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. Studies on the pharmacological activity of Amazonian Euphorbiaceae. Journal of ethnopharmacology, v. 22, p. 143–172, 1988.
MALHEIROS, L. C. D. S. “ Isoeleuterol e Isoeleuterina : Potenciais marcadores químicos da tintura de Eleutherine plicata Herb ( Iridaceae ) e atividades microbiológica e antioxidante ”. [s.l.] Universidade Federal do Pará, 2008.
MALHEIROS, L. C. DA S.; MELLO, J. C. P. DE; BARBOSA, W. L. R. Eleutherine Plicata – Quinones and Antioxidant Activity. In: RAO, A. V.; RAO, L. G. (Eds.). . Phytochemicals - Isolation, Characterisation and Role in Human Health. [s.l.] InTech - Open science, open minds, 2015. p. 323–338.
MANNING, J. Iridaceae. Disponível em: <http://www.plantzafrica.com/frames/plantsfram.htm>.
MARAGAKIS, L. L. et al. Outbreak of multidrug-resistant Serratia marcescens infection in a neonatal intensive care unit. Infection control and hospital
109
epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America, v. 29, n. 5, p. 418–23, maio 2008.
MARTINS, A. G. et al. Levantamento etnobotânico de plantas medicinais, alimentares e tóxicas da Ilha do Combu, Município de Belém, Estado do Pará, Brasil. Revista Brasileira de Farmácia, v. 86, n. 1, p. 21–30, 2005.
MCCASKILL, D.; CROTEAU, R. Some caveats for bioengineering terpenoid metabolism in plants. Trends in Biotechnology, v. 16, n. 8, p. 349–355, 1998.
MCLAUGHLIN, J. L.; ROGERS, L. L.; ANDERSON, J. E. The Use of Biological Assays to Evaluate Botanicals. Drug Information Journal, v. 32, p. 513–524, 1998.
MEYER, B. N. et al. Brine Shrimp : A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Planta medica, v. 45, p. 31–34, 1982.
MICHAEL, A. S.; THOMPS, C. G.; ABRALIOV, M. Artemia Organism Bioassay. Science, v. 123, n. March - 3194, p. 464, 1956.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, B. Plantas de Interesse ao SUS. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/sus/pdf/marco/ms_relacao_plantas_medicinais_sus_0603.pdf>. Acesso em: 6 jun. 2016.
MIRANDA, J. A. DE. Caracterização fotofísica de derivados de cumarinas. [s.l.] UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA, 2001.
MITSUHASHI, J. Invertebrate Cell System Applications. [s.l.] CRC Press, 1989.
MORELLO, A. et al. Effects and mode of action of 1,4-naphthoquinones isolated from Calceolaria sessilis on tumoral cells and Trypanosoma parasites. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, v. 112, n. 2, p. 119–128, 1995.
MUÑOZ, V. et al. The search for natural bioactive compounds through a multidisciplinary approach in Bolivia. Part II. Antimalarial activity of some plants used by Mosetene indians. Journal of ethnopharmacology, v. 69, n. 2, p. 139–55, fev. 2000.
NACZK, M.; SHAHIDI, F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A, v. 1054, n. 1-2, p. 95–111, out. 2004.
NASCIMENTO, M. S. et al. Characterisation of isoeleutherine in aqueous extract of Eleutherine plicata herb, Iridaceae, active against Entamoeba
hystolitica/Entamoeba dispar in-vitro. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, v. 3, n. 4, p. 1096–1100, 2012.
NEVES, J. M.; CUNHA, S. Plantas Medicinais. Revista da Faculdade de Ciências da Saúde, v. 3, p. 50–57, 2012.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M.; SNADER, K. M. Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002. Journal of natural products, v. 66, n. 7, p. 1022–37, jul. 2003.
NØRBAEK, R.; KONDO, T. Anthocyanins from flowers of Crocus (Iridaceae). Phytochemistry, v. 47, n. 5, p. 861–864, 1998.
NØRBAEK, R.; NIELSEN, J. K.; KONDO, T. Flavonoids from flowers of two Crocus
chrysanthus-biflorus cultivars: “Eye-catcher” and “Spring Pearl” (Iridaceae). Phytochemistry, v. 51, p. 1139–1146, 1999.
110
NÚÑEZ-SELLÉS, A. J. Antioxidant therapy: Myth or reality? Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 16, n. 4, p. 699–710, 2005.
O’RYAN, M.; PRADO, V.; PICKERING, L. K. A millennium update on pediatric diarrheal illness in the developing world. Seminars in Pediatric Infectious Diseases, v. 16, n. 2, p. 125–136, abr. 2005.
OLIVEIRA NETO, A. R. et al. O uso de Eleutherine plicata no tratamento de doenças gastrointestinais na amazônia paraense. Anais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil. Caxambu - MGAnais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil, , 2007.
OTTOBELLI, I. et al. Estudo químico de duas plantas medicinais da amazônia: Philodendron scabrum k. Krause (Araceae) e Vatairea guianensis Aubl. (Fabaceae). Acta Amazonica, v. 41, n. 3, p. 393–400, 2011.
OYOFO, B. A et al. Enteropathogens associated with acute diarrhea in community and hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMS immunology and medical microbiology, v. 34, n. 2, p. 139–46, 11 out. 2002.
PADHI, L.; PANDA, S. Antibacterial activity of Eleutherine bulbosa (Miller) Urban (Iridaceae) against multidrug resistant bacteria. Journal of Acute Medicine, v. 5, n. 3, p. 53–61, 2015.
PANDA, S. K. et al. Large Scale Screening of Ethnomedicinal Plants for Identification of Potential Antibacterial Compounds. Molecules, v. 21, n. 293, p. 1–20, 2016.
PARAMAPOJN, S. et al. Analysis of naphthoquinone derivatives in the Asian medicinal plant Eleutherine americana by RP-HPLC and LC–MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 47, p. 990–993, 2008.
PATERNÓ, E. Ricerche sull’acido lapacico. Gazzetta Chimica Italiana, v. 12, p. 337–392, 1882.
PESSOA, L. M. et al. Anthelmintic activity of essential oil of Ocimum gratissimum Linn. and eugenol against Haemonchus contortus. Veterinary parasitology, v. 109, n. 1-2, p. 59–63, 16 out. 2002.
PHOEM, A. N.; VORAVUTHIKUNCHAI, S. P. Growth Stimulation/Inhibition Effect of Medicinal Plants on Human Intestinal Microbiota. Food Science and Biotechnology, v. 21, n. 3, p. 739–745, 2012.
PIETTA, P. G. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, v. 63, n. 7, p. 1035–1042, 2000.
RAVENNA, P. Notes on Iridaceae. Phytologia, v. 56, n. 4, p. 193–195, 1984.
REEVES, G. et al. Molecular systematics of Iridaceae : evidence from four plastid dna regions. American Journal of Botany, v. 88, n. 11, p. 2074–2087, 2001.
RHODES, M. J. C. Physiological roles for secondary metabolites in plants: some progress, many outstanding problems. Plant molecular biology, v. 24, n. 1, p. 1–20, jan. 1994.
RIBEIRO, C. M. Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas utilizadas na medicina popular da amazônia. [s.l.] Universidade Federal do Pará, 2008.
SALMON-CHEMIN, L. et al. 2- and 3-substituted 1,4-naphthoquinone derivatives as
111
subversive substrates of trypanothione reductase and lipoamide dehydrogenase from Trypanosoma cruzi: Synthesis and correlation between redox cycling activities and in vitro cytotoxicity. Journal of Medicinal Chemistry, v. 44, n. 4, p. 548–565, 2001.
SANTOS, R. I. DOS. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In: SIMÕES, C. M. O. et al. (Eds.). . Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre; Florianópolis: Editora da UFSC; Editora da UFRGS, 2007. p. 403–434.
SAXENA, M. et al. Phytochemistry of Medicinal Plants. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 1, n. 6, p. 168–182, 2013.
SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; ATHAYDE, M. L. Saponinas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. (Eds.). . Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre; Florianópolis: Editora da UFSC; Editora da UFRGS, 2007. p. 711–740.
SHAHIDI, F. Natural antioxidants: an overview. In: SHAHIDI, F. (Ed.). . Natural Antioxidants: chemistry, health effects, and applications. [s.l.] Newfoundlands: Aocs, 1996. p. 1–11.
SHEN, B. A New Golden Age of Natural Products Drug Discovery. Cell, v. 163, n. 6, p. 1297–1300, 2015.
SHIBUYA, H. et al. Indonesian Medicinal Plants. XX. Chemical Structures of Eleuthosides A, B, and C, Three New Aromatic Glucosides from the Bulbs of Eleutherine palmifolia (Iridaceae). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 45, n. 7, p. 1130–1134, 1997.
SHU, Y. Z. Recent natural products based drug development: a pharmaceutical industry perspective. Journal of natural products, v. 61, n. 8, p. 1053–71, ago. 1998.
SILVA, M. N. DA; FERREIRA, V. F.; SOUZA, M. C. B. V. DE. Um panorama atual da química e da farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β-lapachona e derivados. Química Nova, v. 26, n. 3, p. 407–416, 2003.
SINGH, R. Chemotaxonomy : A Tool for Plant Classification. v. 4, n. 2, p. 90–93, 2016.
SIQUEIRA, J. M. DE; BOMM, M. D.; PEREIRA, N. F. G. Estudo Fitoquímico de Unonopsis lindmanii - Anonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxicidade sobre Artemia salina LEACH. Química Nova, v. 21, n. 5, p. 557–559, 1998.
SKIRYCZ, A. et al. Medicinal Bioprospecting of the Amazon Rainforest: A Modern Eldorado? Trends in Biotechnology, v. xx, n. yy, p. 1–10, 2016.
SOARES, S. E. Ácidos fenólicos como antioxidantes Phenolic acids as antioxidants. Revista de Nutrição, v. 15, n. 1, p. 71–81, 2002.
SOUZA, M. M.; BELLA CRUZ, A. SCHUHMACHER, M. B. KREUGER, M. R. O. FREITAS, R. A.; BELLA CRUZ, R. C. M. Métodos de avaliação de atividade biológica de produtos naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T. M. B; CECHINEL, V. F. (Ed.). . Ciências Farmacêuticas; Contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí - SC: Univali, 2003. p. 107–166.
STEVENS, P. F. Iridaceae. Disponível em: <http://www.mobot.org/mobot/research/apweb/orders/asparagalesweb.htm#Iridaceae>.
SUCUPIRA, N. R. et al. Métodos Para Determinação da Atividade Antioxidante de Frutos. UNOPAR Científica Ciências Biológicas e da Saúde, v. 14, n. 4, p. 263–
112
269, 2014.
SUFFREDINI, I. B. et al. Antibacterial activity of Apocynaceae extracts and MIC of Tabernaemontana angulata stem organic extract. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 38, n. 1, p. 89–94, 2002.
SULASTRI, E.; OKTAVIANI, C. Formulasi Mikroemulsi Ekstrak Bawang Hutan dan Uji Aktivitas Antioksidan. Jurnal Pharmascience, v. 2, n. 2, p. 1–14, 2015.
TECN, C. S.; UNIVERSIT, C.; DERMO-COSM, F. Prevenção do envelhecimento cutâneo e atenuação de linhas de expressão pelo aumento da síntese de colágeno. 2007.
TEIXEIRA, M. J. et al. In vitro and in vivo Leishmanicidal Activity of 2- Hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-1,4- naphthoquinone (Lapachol). Phytotherapy Research, v. 15, n. 1, p. 44–48, 2001.
TELZAK, E. E. et al. A Nosocomial outbreak of Salmonella enteritidis infection due to the consumption of raw eggs. The New England Journal of Medicine, v. 323, n. 6, p. 394–397, 1990.
TER STEEGE, H. et al. Hyperdominance in the Amazonian tree flora. Science (New York, N.Y.), v. 342, n. 6156, p. 1243092, 2013.
TILDEN, J. et al. A new route of transmission for Escherichia coli: infection from dry fermented salami. American journal of public health, v. 86, n. 8, p. 1142–5, ago. 1996.
TURNBULL, P. C. et al. Severe clinical conditions associated with Bacillus cereus and the apparent involvement of exotoxins. Journal of Clinical Pathology, v. 32, n. 3, p. 289–93, mar. 1979.
UNCHERN, S. Basic techniques in animal cell culture. Drug Delivery, p. 1–30, 1999.
VÁSQUEZ, S. P. F.; MENDONÇA, M. S. DE; NODA, S. DO N. Etnobotânica de plantas medicinais em comunidades ribeirinhas do Município de Manacapuru , Amazonas , Brasil. Acta Amazonica, v. 44, n. 4, p. 457–472, 2014.
VERMA, R. P. Anti-cancer activities of 1,4-naphthoquinones: a QSAR study. Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry, v. 6, n. 5, p. 489–499, 2006.
VIEIRA, L. S. Fitoterapia da Amazônia - Manual de Plantas Medicinais. 2. ed. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1992.
VINATEA, J. E. Acuicultura continental. Lima - Peru: Libreria Studium, 1982.
WAGNER, H. .; BLADT, S.; ZGAINSKI, E. M. Plant drug analysis. New York: Springer Verlag, 1984.
WANNMACHER, L. Uso indiscriminado de antibióticos e resistência microbiana : Uma guerra perdida ? Boletim de Saúde, v. 1, n. 4, p. 1–6, 2004.
WEBER, P.; BENDICH, A.; SCHALCH, W. Vitamin C and human health: a review of recent data relevant to human requirementes. International Journal for Vitamin and Nutrition Research., v. 66, p. 19–30, 1996.
WILLIAMS, C. A.; HARBORNE, J. B. Biflavonoids , Quinones and Xanthones as Rare Chemical Markers in the Family Iridaceae. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences, v. 40C, n. 5-6, p. 325–330, 1985.
WILLIAMS, C. A.; HARBORNE, J. B.; GOLDBLATT, P. Correlations between phenolic patterns and tribal classification in the Family Iridaceae.
113
Phytochemistry, v. 25, n. 9, p. 2135–2154, 1986.
WONG, K. F.; YUAN, Y.; LUK, J. M. Tripterygium wilfordii bioactive compounds as anticancer and anti-inflammatory agents. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 39, n. July 2011, p. 311–320, 2012.
XU, J. et al. New bioactive constituents from Eleutherine americana. Frontiers of Chemistry in China, v. 1, n. 3, p. 320–323, 2006.
ZANI, C. L. et al. Anti-plasmodial and anti-trypanosomal activity of synthetic naphtho[2,3-b]thiophen-4,9-quinones. Bioorganic and Medicinal Chemistry, v. 5, n. 12, p. 2185–2192, 1997.
ZHENGXIONG, C. et al. Hongconin, a New Naphtalene Derivative from Hong-Cong, the Rhizome of Eleutherine americana Merr. et Heyne (Iridaceae). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 34, n. 7, p. 2743–2746, 1986.