MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA _________________________________________________________________________________ ESTUDO FITOQUÍMICO DOS EXTRATOS DAS CASCAS DOS FRUTOS SECOS DA Copaifera langsdorffii Desf. THANIARA BARBOSA DA COSTA Sinop-MT 2018/2
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
Trabalho de Curso apresentado ao Curso de Farmácia da Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT, campus de Sinop como requisito parcial para obtenção do título de Farmacêutico, sob a orientação do Professor
Dr. Adilson Paulo Sinhorin
Sinop-MT
2018/2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
As plantas são utilizadas há muitos séculos, desempenhando um papel de grande importância na vida da população, no tratamento de doenças, onde apresentam ações terapêuticas, que dão direcionamento aos estudos e que necessitam de comprovação científica, para que então seja validado o seu uso, e produção de futuros medicamentos, a fim de contribuir com a saúde humana. O presente trabalho teve como objetivo a identificação dos compostos químicos presentes nos extratos das cascas dos frutos da Copaifera langsdorffii, bem como avaliar o potencial antioxidante, quantificar o teor de fenóis e flavonoides totais nos extratos hexânico, acetato de etila e etanólico e análise espectrométrica por RMN e Infravermelho. Foram preparados os extratos da casca do fruto seco de C. langsdorffii, por maceração com hexano, acetato de etila e etanol, sucessivamente. Os extratos brutos hexânico (EH), acetato de etila (EAE) e etanólico (EE) foram submetidos a análises fitoquímicas por reações qualitativas de identificação de grupos funcionais, e por cromatografia em camada delgada (CCD). A avaliação do potencial antioxidante foi analisado pela técnica de DPPH, a quantificação do teor de fenóis e flavonoides, foram realizadas seguindo o método de Folin-Ciocalteau e precipitação com cloreto de alumínio, respectivamente. Os extratos foram análisados por RMN e infravermelho. Os extratos obtiveram rendimento total de 27,1% no processo de extração. Na análise fitoquímica foram identificados terpenos em todos os extratos, taninos em EE, flavonoides e cumarinas em EAE e EE. Na dosagem de fenóis e flavonoides, EE teve maior teor de fenóis (17,02 mgEAG/g), e todos os extratos apresentaram baixo teor de flavonoides. O EE foi o que obteve maior percentual de atividade antioxidante, realizado através do método de Souza. Nas análises por RMN e IV foi possível identificar a presença de compostos com estruturas alílicas e alifáticas, aromáticos, a presença de funções fenólicas ou álcool. Através de todo estudo realizado com extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii, foi possível determinar as classes de compostos presentes em extratos de diferentes polaridades desse material. Com esses dados, pode-se seguir com análises que especifiquem ainda mais os compostos presentes nos extratos, como a espectrometria de massas e cromatografia gasosa, a fim de decifrar esses componentes e propor uma avaliação de possível atividade biológica, destacando que extratos complexos como estes podem ter uma ação sinérgica, a fim de contribuir com a melhora da saúde e tratamento de doenças que acometem a população em geral.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Copaifera langsdorffii Desf. Rio Ronuro, Nova Ubiratã........................ 24
Figura 2. Fruto da Copaifera langsdorffii ............................................................ 25
Figura 3. Cascas secas dos frutos da Copaifera langsdorffii ............................. 26
Figura 4. Produto em filtração após a maceração com hexano...........................26
Figura 5. Equipamento de Infravermelho do Departamento de Química da UFMT....................................................................................................................32
Figura 6. Fluxograma do estudo das cascas dos frutos secos de Copaifera langsdorffii Desf....................................................................................................33
Figura 7. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de alcaloides nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com reagente Dragendorff....................................................................................35
Figura 8.Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de cumarinas nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com hidróxido de potássio 5%, visualização no UV 356 nm.........................................................................................................................36
Figura 9. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de flavonoides nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com NP-PEG, visualização no UV 356 nm.........................................................................................................................37
Figura 10. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de taninos nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com cloreto férrico 2%........................................................................................................................38
Figura 11.Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de terpenos nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com anisaldeído sulfúrico.............................................................................................39
Figura 12. Resultado do potencial antioxidante dos extratos das cascas da C. langsdorffii............................................................................................................41
Figura 13. Ácido copálico identificado por RMN de 1H e 13C isolado do extrato bruto das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado...........................................................................................................45
Figura 14. Óxido de cariofileno identificado por RMN de 1H e 13C isolado do extrato bruto das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado...........................................................................................................45
Figura 15. Ácido caurenóico identificado por RMN de 1H e 13C isolado do extrato bruto das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado...........................................................................................................46
Figura 16. 3-O-alfa-ramnopiranosil-canferol identificado por RMN de 1H e 13C isolado do extrato bruto das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado...........................................................................................................47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultado do teste para grupos funcionais com EH, EAE e EE..........................................................................................................................34
Tabela 2. Resultados da determinação do teor total de fenóis e flavonoides nos extratos das cascas dos frutos da Copaifera langsdorffii........................................40
Tabela 3. Porcentagem antioxidante de EH, EAE e EE.........................................42
Tabela 4. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EH das cascas dos frutos da C. langsdorffii.................................................43
Tabela 5. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EAE das cascas dos frutos da C. langsdorffii................................................43
Tabela 6. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EE das cascas dos frutos da C. langsdorffii.................................................44
Tabela 7. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EH das cascas dos frutos da C. langsdorffii.................................................47
Tabela 8. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EAE das cascas dos frutos da C. langsdorffii...............................................48
Tabela 9. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EE das cascas dos frutos da C. langsdorffii..................................................49
Tabela 10. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EH das cascas dos frutos da C. langsdorffii...........................................................................................50
Tabela 11. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EAE das cascas dos frutos da C. langsdorffii...........................................................................................51
Tabela 12. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EE das cascas dos frutos da C. langsdorffii...........................................................................................53
LISTA DE ABREVIATURAS
CCD – Cromatografia em Camada Delgada EE – extrato etanólico EH – extrato hexânico EAE – extrato acetato de etila DPPH – 2,2-difenilpicril-hidrazila RMN – Ressonância Magnética Nuclear IV – Infravermelho UFMT - Universidade Federal de Mato Grosso
acessório parte integrante do equipamento. Ela foi utilizada como branco e em
seguida utilizada para a leitura juntamente com as amostras.
No EH foi preparado com 0,529 g de extrato em 1 mL de hexano, em seguida,
e adicionado 100 µL da solução de EH na pastilha de KBr e deixado em estufa à 100
°C por 10 minutos, e em seguida realizado a leitura. Em EAE foi preparado uma
solução da amostra com 0,7071 g de extrato e 1 mL de acetato de etila. Foram
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adicionados à pastilha de KBr 80 µL dessa solução amostra, e deixado por 20 minutos
em estufa à 100 °C. No EE, uma pequena quantidade de extrato, indetectável pela
balança analítica, foi incorporada com o KBr, e realizado a confecção da pastilha,
sendo tirado o branco com outra pastilha contendo somente KBr, e em seguida
realizado a leitura.
Posteriormente realizou-se a aquisição do espectro de IV usando o software
IRSolution (Versão: 1.50) utilizando os seguintes parâmetros de aquisição: Modo de
Medida (% Transmitância); Apodizaiton (Happ_Genzel); Número de Scans (200);
Resolução (16); Range (400 à 4000 cm-1); Gain (1).
Figura 5. Equipamento de Infravermelho do Departamento de Química da UFMT
Fonte: Acervo Próprio
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Extração
Depois do processo de secagem a massa obtida foi de 1,135 kg, que
posteriormente passou pelo processo de moagem, obtendo um peso de 1,119 kg.
Após os processos de maceração por extração exaustiva, foram obtidos 249,1 g de
EH, 47,2 g de EAE e 6,9 g de EE, após a retirada de todos os solventes. O rendimento
do processo de extração, considerando a droga já triturada foi de 22,26% para o EH,
4,22% para o EAE e 0,62% para o EE. Somando, o processo de extração obteve um
rendimento total de 27,1%. O fluxograma a seguir apresenta os passos consecutivos
no estudo das cascas dos frutos secos de C. langsdorffii (Figura 6).
Figura 6. Fluxograma do estudo das cascas dos frutos secos de C. langsdorffii.
34
5.2 Triagem Fitoquímica
5.2.1 Grupos Funcionais
Com os três extratos foram realizados testes para identificação de alguns
grupos funcionais, onde conforme característica observada após o término das
reações aplicadas aos extratos, confirmou-se ou não a presença de determinados
grupos de substâncias. A tabela 1 abaixo apresentam os resultados obtidos para cada
extrato testado.
Tabela 1. Resultado do teste para grupos funcionais com EH, EAE e EE.
Grupos Funcionais EH EAE EE
Alcaloides + + +
Cumarinas
Esteroides e Triterpenoides
Flavonoides
-
-
+
+
-
+
+
-
+
Polissacarídeos
Purinas
Saponinas
Taninos
-
+
+
-
-
+
-
-
-
-
-
+
Através das reações qualitativas, foi possível identificar os compostos
presentes em cada extrato, de acordo com o descrito por Teixeira (2012). No EH
obteve-se resultados positivos para flavonoides, alcaloides, saponinas, purinas. No
EAE foi verificado a presença de flavonoides, alcaloides, cumarinas e purinas. No
extrato etanólico constatou-se resultados positivos para flavonoides, taninos,
cumarinas e alcaloides.
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Esses ensaios qualitativos, são testes que dependem, de maneira
considerável, das percepções e conclusões do analista, podendo ou não ser
interpretada de maneiras diferentes, com opiniões que se divergem. Porém a
realização desses ensaios é de grande valia para se realizar uma triagem fitoquímica
e direcionar os estudos químicos de acordo com os tipos de substâncias e compostos
presentes em cada um desses extratos, e o tipo de atividade biológica que tais
produtos podem exercer, principalmente em casos em que não há relato na literatura.
5.2.2 Cromatografia de Camada Delgada (CCD)
Sendo este um método amplamente utilizado na separação de compostos, mas
que também auxiliam na identificação destes, foram realizados ensaios para
identificação de alcaloides, cumarinas, flavonoides, taninos e terpenos.
Para identificação dos alcaloides foi utilizada como fase móvel os solventes
tolueno, acetato de etila e dietilamina, na proporção 70:20:10, respectivamente, e
usou-se como revelador o reagente Dragendorff. O resultado para ambos os extratos
testados foram negativos, como mostra a figura 7 abaixo, visto que o esperado era o
aparecimento de bandas de coloração laranja ou marrom.
Figura 7. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de alcaloides nos
extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com reagente Dragendorff.
Fonte: Acervo Próprio
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EH = extrato hexânico; EAE = extrato acetato de etila; EE = extrato etanólico
Nos ensaios qualitativos de grupos funcionais obteve-se resultados positivos
para alcaloides, porém na CCD, esse resultado foi negativo para as três amostras.
Com isso podemos considerar que esses compostos podem não estar presentes
nessas amostras, visto que nos ensaios qualitativos dependem muito do analito, e a
qualidade dos reagentes utilizados, como o Mayer, Dragendoorf e Bouchardt podem
interferir nos resultados.
Para a identificação de cumarinas, foi utilizada a fase móvel clorofórmio,
acetona e ácido fórmico, nas proporções 75:16,5:8,5 respectivamente, e como
revelador hidróxido de potássio à 5% em etanol. A coloração esperada para essa
classe de compostos é azul claro florescente, sendo possível detectar a presença dos
mesmos apenas em EAE e EE (Figura 8), o que também se confirma nos ensaios
qualitativos de grupos funcionais.
Figura 8. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de cumarinas nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com hidróxido
de potássio 5%, visualização no UV 356 nm.
Fonte: Acervo Próprio
De acordo com Neto e Silveira (2008), existem poucas citações na literatura até
mesmo do fruto da copaíba, sendo encontrados alguns relatos sobre ácidos graxos e
cumarinas nas sementes. Alguns estudos realizados com óleo das sementes de C.
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langsdorfii, mostraram a presença da cumarina umbeliferona e de oligossacarídeos
xiloglucânicos (JÚNIOR; PINTO, 2002).
A primeira descrição de C. langsdorffii foi relatada por Mors e Monteiro, onde
identificaram a presença de compostos cumarínicos e a umbiliferona nos extratos das
sementes dessa espécie. Nas sementes de C. langsdorffi já foram identificados
amiloides xiloglucânicos e nos cotilédones polissacarídeos. Em sementes de
Copaifera sp já foram identificados os ácidos graxos: palmítico, oleico, linoleico,
araquídico e beênico (Neto et al, 2008).
Para identificação de flavonoides foram utilizados clorofórmio, acetona e ácido
fórmico, em uma primeira fase móvel, para agliconas de flavonoides, na proporção
75:16,5:8,5 e em uma segunda fase móvel acetato de etila, ácido fórmico, ácido
acético e água, nas proporções 10:1,1:1,1:0,5, para heterosídeos. Como revelador foi
utilizado o reagente NP-PEG (difenilborato de aminoetanol com polietilenoglicol),
sendo a coloração esperada, amarelo fluorescente, na visualização à luz UV no
comprimento de onda de 356 nm (Figura 9). Neste caso, obteve-se resultados
positivos para os extratos EAE e EE.
Figura 9. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de flavonoides nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com NP-PEG,
visualização no UV 356 nm.
Fonte: Acervo Próprio
38
De acordo com os resultados dos ensaios qualitativos de grupos funcionais, os
compostos flavonoides estão presentes nos três extratos analisados, porém na CCD,
apenas EAE e EE contém esse grupo de substâncias.
Para a identificação de taninos, utilizou-se como fase móvel acetato de etila,
ácido fórmico e água, na proporção 100:11:5, com formação de bandas de coloração
azul, após revelação com cloreto férrico 2% (Figura 10). Obteve-se resultado positivo
em EE. O que é confirmado pelos ensaios qualitativos de grupos funcionais.
Figura 10. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de taninos nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com cloreto férrico 2%.
Fonte: Acervo Próprio
No teste para identificação de terpenos usou-se como fase móvel hexano e
acetato de etila, na proporção 80:20, e como revelador anisaldeído sulfúrico, formando
coloração azul escuro, como já esperado, de acordo com a literatura (Wagner; Bladt,
1995), com resultado positivo para terpenos nos três extratos.
39
Figura 11. Resultado da cromatografia de camada delgada para identificação de terpenos nos extratos das cascas dos frutos da C. langsdorffii após revelação com anisaldeído
sulfúrico.
Fonte: Acervo Próprio
Nos ensaios qualitativos de grupos funcionais por reações químicas, obteve-se
resultados negativos para os compostos terpênicos. Considerando que esses
compostos são marcadores nesses tipos de amostras resinosas, podemos constatar
que os ensaios qualitativos apresentaram um resultado falso-negativo, que pode ter
ocorrido devido a qualidade dos reagentes utilizados.
De acordo com relatos na literatura o EH das cascas dos frutos contém ácidos
diterpênicos, como o ácido caurenóico, ácido poliáltico e nivenolídeo, além de conter
uma mistura de ácido caurenóico e óxido de cariofileno (NETO et al, 2008). Através
desta técnica cromatográfica, foi possível constatar a presença de compostos
terpênicos em EH, em EAE e EE, o que indica que esses compostos estão em grande
quantidade presentes nas cascas dos frutos secos.
5.3 Determinação de Fenóis e Flavonoides Totais
Através da equação da reta, obtidas a partir das curvas padrões com ácido
gálico (fenóis totais) e quercetina (flavonoides totais), foi possível quantificar os fenóis
40
e os flavonoides totais constantes nos extratos brutos das cascas dos frutos da
espécie C. langsdorffii. (Tabela 2).
A equação da curva de calibração da quercetina foi Y = 0,0709X+0,0154, onde
Y é a concentração da quercetina, X é a absorbância a 425 nm e o coeficiente de
correlação R2 = 0,9978. E o teor foi determinado em mg de EQ (equivalentes de
quercetina) por grama de extrato.
A equação da curva de calibração do ácido gálico foi Y = 0,0182X + 0,0173,
onde X é a concentração do ácido gálico, Y é o valor da absorbância a 750 nm e
apresentou o coeficiente de correlação R2 = 0,9969. O teor de fenóis totais foi
expresso em miligrama de equivalente de ácido gálico por grama de extrato (mg
EAG/g).
Tabela 2. Resultados da determinação do teor total de fenóis e flavonoides nos extratos das cascas dos frutos da Copaifera langsdorffii Desf.
Amostra Teor de fenóis totais
mg EAG/g
Teor de flavonoides
totais
mg EQ/g
EH 7,84 1,12
EAE 6,54 1,15
EE 17,02 1,09
Entre as amostras da espécie C. langsdorffii, a que apresentou maior teor de
fenóis totais foi a EE, com 17,02 mg EAG/g. Esse resultado pode sugerir que esse
extrato possui um elevado teor de fenóis, mas apenas uma pequena parte deste, é
formada por flavonoides. O EH apresentou um teor de 7,84 mg EAG/g, possuindo o
segundo maior teor, mesmo sendo um extrato mais apolar, e de acordo com o
estudado, o que possui maior teor de gorduras. E o EAE obteve um teor de 6,54 mg
EAG/g. Os teores de flavonoides totais foram estatisticamente iguais entre os três
extratos estudados.
41
Segundo Batista et al (2016), em estudos realizados com a polpa dos frutos da
C. langsdorffii, o extrato etanólico e o extrato etanólico 60%, foram quantificados com
elevados teores de polifenóis, sendo confirmado por diferentes métodos de análises,
como Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Esses resultados foram
capazes de reduzir o efeito deletério da ciclofosfamida, sendo que essa capacidade
antioxidante está ligada à prevenção de alterações genéticas.
5.4 Avaliação do Potencial Antioxidante
Para se avaliar a capacidade antioxidante dos extratos, foi determinada a
porcentagem de DPPH remanescente, e posteriormente estabelecida uma relação
entre DPPH remanescente e as concentrações das amostras para se determinar a
CE50, que é a concentração mínima necessária para o antioxidante reduzir em 50% a
concentração inicial de DPPH. Portanto, quanto menor o valor de CE50 apresentado
pelos extratos, maior será sua atividade antioxidante (Figura 12).
Figura 12. Resultado do potencial antioxidante dos extratos das cascas da C. langsdorffii.
Fonte: Acervo Próprio
EH = extrato hexânico; EAE = extrato acetato de etila; EE = extrato etanólico
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
% d
e D
PP
H R
eman
esce
nte
Concentração amostra µg.mL
Potencial antioxidante
EH EAE EE AA RT
42
Avaliando o gráfico acima, onde estão presentes os valores de DPPH
remanescentes para dois padrões utilizados na técnica, podemos constatar que o
extrato que mais se aproximou dos padrões ácido ascórbico e rutina, dois potentes
antioxidantes, foi o EE. E apresentou CE50 em 135 µg/mL, e os extratos EAE e EH
não atingiram a CE50.
Isso pode ser explicado devido ao extrato EE conter substâncias mais polares
em relação ao EAE e EH, podendo conter mais compostos fenólicos, que também são
substancias antioxidantes, e por esse motivo esse extrato apresentou uma melhor
atividade.
Foi determinado a porcentagem de antioxidante em cada concentração para
cada uma das amostras, através dos valores de absorbância obtidos da solução inicial
de DPPH e absorbância da mistura reacional, DPPH + amostras, onde se confirma
que o EE é o que apresenta melhor potencial antioxidante (Tabela 3).
Tabela 3. Porcentagem antioxidante de EH, EAE e EE.
Concentrações µg.mL EH EAE EE
250 21 % 18 % 82 %
200 22 % 31 % 78 %
150 22 % 17 % 66 %
100 22 % 18 % 55 %
50 20 % 16 % 33 %
25 22 % 17 % 34 %
5.5 Ressonância Magnética Nuclear
Com a análise de RMN dos extratos, mesmo sendo amostras que contém
diversos compostos, foi possível atribuir a cada um, os grupamentos orgânicos
presentes, de acordo com os deslocamentos químicos e a multiplicidade dos picos,
como mostra as tabelas 4, 5 e 6 abaixo.
43
Tabela 4. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EH das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
δ (ppm) 1H Multiplicidade Grupos Correspondentes
0,78 – 1,08 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,26 – 1,38 multipleto CH2 de cadeias alifáticas
1,69 - 1,77 multipleto CH2 de cadeias alifáticas
2,03 – 2,06 multipleto CH2 de cadeias alifáticas
2,19 – 2,21 multipleto CH2 de cadeias alifáticas
2,65 singleto CH2 de cadeias alifáticas
3,51 – 3,98 singleto Hidrogênio ligado à CH2 alfa à C=O ou alfa à C-O
4,76 – 5,58 multipleto C=C de cadeias alílicas
5,72 – 6,28 multipleto C=C de cadeias alílicas
Tabela 5. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EAE das cascas dos frutos da C. langsdorffii
δ (ppm) 1H Multiplicidade Grupos Correspondentes
0,74-0,97 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,17-1,37 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,60-1,77 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,99-2,21 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
2,31-2,37 multipleto CH2 de cadeias alifáticas
2,66 singleto CH2 de cadeias alifáticas
3,51 singleto Hidrogênio ligado à CH2 alfa à C=O ou alfa à C-O
3,73-3,77 multipleto Hidrogênio ligado à CH2 alfa à C=O ou alfa à C-O
3,98 singleto Hidrogênio ligado à CH2 alfa à C=O ou alfa à C-O
44
4,22-4,89 multipleto C=C de cadeias alílicas
5,69-5,72 dupleto C=C de cadeias alílicas
6,0 dupleto Hidrogênio ligado à aromáticos
7,07 singleto Hidrogênio ligado à aromáticos
7,49 singleto Hidrogênio ligado à aromáticos
8,04 singleto Hidrogênio ligado à aromáticos
Tabela 6. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 1H do EE das cascas dos frutos da C. langsdorffii
δ (ppm) 1H Multiplicidade Grupos Correspondentes
0,89 – 1,00 multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,14 – 1,31 Multipleto CH3 de cadeias alifáticas
1,32 – 1,62 Multipleto CH3 de cadeias alifáticas
2,00 – 2,21 Multipleto CH3 de cadeias alifáticas
2,44 – 2,61 Multipleto CH2 de cadeias alifáticas
2,88 – 2,94 Multipleto CH2 de cadeias alifáticas
3,02 – 4,06 multipleto Hidrogênio ligado à C-OH ou à C-O (açúcar)
4,07 – 4,34 Multipleto C=C de cadeias alílicas
4,48 – 4,52 multipleto C=C de cadeias alílicas
5,13 Singleto C=C de cadeias alílicas
5,40 – 5,83 Multipleto C=C de cadeias alílicas
6,53 e 6,56 Singleto Hidrogênio ligado à aromáticos
6,94 Singleto Hidrogênio ligado à aromáticos
45
7,08 – 7,13 Multipleto Hidrogênio ligado à aromáticos
7,28 – 7,38 Multipleto Hidrogênio ligado à aromáticos
8,05 – 8,08 dupleto Hidrogênio ligado à aromáticos
Foi possível sugerir a presença de cadeias alifáticas e cadeias alílicas, bem
como a presença de hidrogênio ligado à carbonila e hidrogênios de ligações duplas
entre carbonos, nos três extratos.
Considerando os dados obtidos, podemos afirmar que os sinais com
deslocamentos químicos de δ 0,75 ppm à aproximadamente δ 2,20 ppm são
hidrogênios ligados ao carbonos alifáticos, os deslocamentos entre δ 3,02 à 3,98 ppm,
presentes em EH e EAE, são hidrogênios alílicos, e segundo estudos feitos por Neto
et al (2008) e Sousa (2011), estes são pertencentes a grupos metílicos, presentes nos
principais compostos diterpênicos, como o óxido de cariofileno e ácido copálico
(Figuras 13 e 14).
Figura 13. Ácido copálico
identificado por RMN de 1H e 13C isolado do
extrato bruto das folhas da C. langsdorffii,
apresentado como tese de doutorado.
Fonte: Sousa, 2011
Figura 14. Óxido de cariofileno
identificado por RMN de 1H e 13C isolado do
extrato bruto das folhas da C. langsdorffii,
apresentado como tese de doutorado.
Fonte: Sousa, 2011
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Porém os picos característicos pela intensidade e tipo de multiplicidade,
presentes em EE, com deslocamentos entre δ 3,02 à 4,06 ppm contribuem para
unidades glicosídicas, de acordo com a proposta de Sousa (2011) e Petrica et al
(2014), o que confirma a presença de compostos açucarados somente nesse extrato.
De acordo com Sousa et al. (2011), em espectro de RMN de 1H, hidrogênios
entre δ 4.48 e 4.84 ppm são hidrogênios de ligações duplas exocíclicas, e
deslocamentos de δ 5.40 à 5.83 ppm são de hidrogênios de ligações duplas
endocíclias, característicos de diterpenos, encontrados em óleo-resina de Copaifera
sp., como o ácido copálico e ácido caurenóico (Figura 15), marcadores químicos
presentes nessas espécies, o que confirma os dados obtidos nos extratos EH e EAE.
Figura 15. Ácido caurenóico identificado por RMN de 1H e 13C isolado do extrato bruto
das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado.
Fonte: Sousa, 2011
Já os picos com deslocamentos aproximados de δ 6.0 à 8.0 ppm, obtidos
apenas no EAE e EE, são relativos à presença de anéis aromáticos, presentes em
compostos como 3-O-alfa-ramnopiranosil-canferol (Figura 16), segundo Sousa et al
(2011).
47
Figura 16. 3-O-alfa-ramnopiranosil-canferol identificado por RMN de 1H e 13C isolado do
extrato bruto das folhas da C. langsdorffii, apresentado como tese de doutorado.
Fonte: Sousa, 2011
Nas análises de RMN de 13C verificou-se a presença dos grupos funcionais
correspondentes à cada pico apresentado nos espectros, através dos dados de
deslocamento químico, apresentados nas tabelas 7, 8 e 9.
Tabela 7. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EH
das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
δ (ppm) 13C Grupos Correspondentes
15,69 e 16,35 -CH3 de Hidrocarbonetos acíclicos;
18,43 e 19,11 -CH3 e -CH2 de Hidrocarbonetos acíclicos; C3H6 de
Hidrocarbonetos alicíclicos;
20,27 -CH3 e -CH2 de Hidrocarbonetos acíclicos;
21,85 -CH3 e -CH2 de Hidrocarbonetos acíclicos
C4H8 a C10H20 Hidrocarbonetos alicíclicos;
24,77; 26,72; 27,50;
29,71; 29,92
-CH3 -CH2 e CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C4H8 a
C10H20 Hidrocarbonetos alicíclicos;
48
33,11; 37,91; 39,65;
40,73
-CH2 CH C de Hidrocarbonetos acíclicos;
41,28 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C-OH de Álcoois;
43,66 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C-OH de Álcoois;
44,24; 47,28; 48,97;
50,87
CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C-OH de Álcoois;
54,33 CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C-OH de Álcoois;
C-O-C de Éteres;
57,01 CH de Hidrocarbonetos acíclicos; C-OH de Álcoois; C-O-
C de Éteres;
77,22 C=C=C Alenos; C=C-R de Alquinos; C-OH de Álcoois; C-
Tabela 8. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EAE
das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
δ (ppm) 13C Grupos Correspondentes
38,89 -CH2 CH C de Hidrocarbonetos acíclicos;
47,72 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH de Álcoois
47,89 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH de Álcoois
49
48,06 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH de Álcoois
48,23; 48,45 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH de Álcoois
62,75; 69,56; 70,37; 70,50; 70,64;
71,17; 71,58; 72,08; 72,48; 72,93;
73,49; 74,92; 76,64; 76,73; 83,53
C-OH de Álcoois; C-O-C Éteres;
92,56; 96,83; 97,79 Ar-Y de Aromáticos;
Analisando os espectros obtidos de RMN de 13C, pode-se sugerir a presença
de compostos de cadeia alifáticas ou acíclicos, que foram identificados também na
análise de 1H, variando de δ 0,74 à 2,94 ppm, e de 13C com deslocamentos partindo
de δ 15,69 ppm, como no EH, até δ 57,01 ppm. Foi possível verificar a presença de
carbonos ligados à função álcool, com deslocamentos entre δ 41,28 à 83,53 ppm, que
podem ser confirmadas pelos picos de 1H com deslocamentos entre δ 3,31 à 3,98
ppm.
Tabela 9. Resultados dos grupamentos encontrados através dos espectros de RMN 13C do EE
das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
δ (ppm) 13C Grupos correspondentes
38,89 -CH2 CH C de Hidrocarbonetos acíclicos;
47,89; 48,06 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH Álcoois;
48,23; 48,45 -CH2 CH de Hidrocarbonetos acíclicos;
C-OH Álcoois;
62,75; 69,56; 70,37; 70,50; 70,64;
71,17; 71,58; 72,08; 72,48; 72,93;
73,49; 74,92; 76,64; 76,73; 83,53;
C-OH Álcoois; C-O-C Éteres;
50
96,83; 97,79 Ar-Y Aromáticos
103,92 Ar-Y Aromáticos; Heteroaromáticos
Os compostos aromáticos foram identificados com deslocamentos de δ 92,56
à 155,92 ppm, sendo confirmada pelo RMN de 1H que apresentou deslocamentos na
faixa de δ 6,0 à 8,0. Porém, na análise de RMN de 13C foram detectados esse tipo de
estrutura nos três extratos em estudo, e no RMN de 1H, apenas no EAE e EE, não
apresentando picos equivalente a essa classe de compostos no EH. Isso pode ser
devido a concentração das amostras, ou o pico com deslocamento de δ 155,92 em
EH, corresponde apenas a função éster.
Em um estudo realizado por Neto et al (2008), no RMN de 13C, foi identificado
a presença de uma ligação dupla exocíclica, com deslocamento químico de 103,5,
que pertencia ao esqueleto caureno. Através disso, podemos propor que o carbono
que apresentou deslocamento químico de δ 103,92 corresponde ao mesmo tipo de
ligação.
5.6 Infravermelho
Através dos dados obtidos com a realização do infravermelho, é possível
detectar as funções orgânicas presentes nas amostras, realizando uma comparação
dos comprimentos de onda. Em EH foi possível verificar a presença de grupos como
haletos de alquila, aril-alquil-éter, grupos nitro, éster, aril-cetona e ácido carboxílico
(Tabela 10).
Tabela 10. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EH das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
cm-1 Ligação/Grupamento Intensidade Referência
1026,13 C-O Aril-alquil-éter; F 1280-1220 e 1100-1020 cm-1 F
1157,29 C-O; F 1300-1000 cm-1 F
1249,87 C-O Aril-alquil-éter; F 1280-1220 e 1100-1020 cm-1 F
51
1643,35 C=O Aril-cetona; F 1700-1630 cm-1 F
1697,36 C=O Éster MF 1750-1670 cm-1 F
2677,20 O-H Ác. Carboxílico;
Aldeído
M 3200-2500 cm-1 L
2830-2700 cm-1 f-M
2731,20 O-H Ác. Carboxílico M 3200-2500 cm-1 L
2870,08 O-H Ác. Carboxílico MF 3200-2500 cm-1 L
2939,52 O-H Ác. Carboxílico MF 3200-2500 cm-1 L
3070,68 O-H Ác. Carboxílico; C-
H Alcano
F 3200-2500 cm-1 L
3000-2840 cm-1 M-F
Onde as intensidades das bandas são representadas por: f = fraco; M = médio; F =
forte; MF = muito forte; L = largo
De acordo com a metodologia seguida de Lopes e Fascio (2004), foram
encontradas bandas que correspondem a haletos de alquila, álcool e fenóis, aril-alquil-
éter, aril-cetona, éster e ácido carboxílico e aldeído no EAE, como mostra a tabela 11
a seguir.
Tabela 11. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EAE das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
cm-1 Ligação/Grupamento Intensidade Referência
1026,13 C-O; C-O Aril-Alquil-
éter
F 1300-1000 cm-1 F
1280-1220 e 1100-1020 1400-
500 cm-1 F
1149,57 C-O; C-O Alquil-éter; F 1300-1000 cm-1 F
52
1150-1080 cm-1 F
1242,16 C-O Aril-Alquil-éter; F 1280-1220 e 1100-1020 1400-
500 cm-1 F
1643,35 C=O; C=O Aril-cetona; F 1820-1630 cm-1 F
1700-1630 cm-1 F
1697,36 C=O Éster MF 1820-1630 cm-1 F
1750-1670 cm-1 F
2677,20 O-H Ác. Carboxílico M 3200-2500 cm-1 L
2738,92 O-H Ác. Carboxílico;
Aldeído
M 3200-2500 cm-1 L
2830-2700 cm-1 f-M
2870,08 O-H Ác. Carboxílico MF 3200-2500 cm-1 L
293,80 O-H Ác. Carboxílico MF 3200-2500 cm-1 L
3070,68 O-H Ác. Carboxílico F 3200-2500 cm-1 L
3348,42 O-H Álcool ou Fenol F 3650-3100 cm-1 F
3441,01 O-H Álcool ou Fenol F 3650-3100 cm-1 F
Analisando os picos encontrados, podemos verificar a presença de bandas com
absorções de 1026,13 à 1249,87 cm-1 atribuídas à ligações C-O de Aril-alquil-éter;
1643,35 à 1697,36 cm-1 atribuídas a C=O de Aril-cetona ou éster; 2677,20 à 3070,68
cm-1 à O-H de ácidos carboxílicos e 3387,00 cm-1 atribuídas à O-H de álcool ou fenol.
Em estudos realizados por Pinto et al (2000), o espectro de IV do óleo bruto de
copaíba apresentou uma absorção a 1740 cm-1, correspondente a C=O, uma faixa
larga entre 3500 e 2600 cm-1, atribuída aos ácidos carboxílicos, e ainda absorções a
3300 cm-1 correspondente a banda de hidroxila, e 1160 cm-1 com C-O, sugerindo a
53
presença de ácidos carboxílicos no extrato bruto. Esses resultados foram obtidos do
óleo bruto de Copaifera cearenses, adquiridos através do exsudato da perfuração
direta do tronco da árvore. Esse estudo sugere a presença desses grupos também
nas das cascas do fruto seco da C. langsdorffii.
No EE foram encontradas as funções orgânicas haletos de alquila, aril-alquil-
éter, aril-alquil-amina, alceno, alcano e grupo funcionais como o álcool e fenol (Tabela
12). Segundo Moreira (2018), a presença da ligação de carbono C=C pode estar
associado à presença de um grupo vinílico ou uma estrutura contendo anel com dupla
ligação, sendo explicável a presença desse tipo de banda nesse tipo de amostra,
devido a presença de compostos terpênicos.
Tabela 12. Resultados da análise de Infravermelho do extrato EE das cascas dos frutos da C. langsdorffii.
cm-1 Ligação/Grupamento Intensidade Referência
1072,42 C-O Aril-alquil-éter; F 1100-1020 cm-1 F
1273,02 C-N Aril-alquil-amina; M 1360-1250 e 1280-1180 cm-1 f-
M
1350,17 C-N Aril-alquil-amina; M 1360-1250 e 1280-1180 cm-1 f-
M
1620,21 C=C Alceno M 1680-1620 cm-1 f-M
2939,52 C-H Alcano M 3000-2840 M-F
3387,00 O-H Álcool ou Fenol MF 3650-3100 cm-1 F
De acordo com os dados obtidos, podemos constatar os possíveis
grupamentos existentes em cada um dos extratos, destacando a semelhança de
grupamentos entre EH e EAE, bem como maior quantidade de terpenos nestes
extratos,o que seja provável devido à maior proximidade de polaridade dos solventes
54
utilizados para extração de cada um, em relação ao EE. Pode-se verificar que existem
algumas diferenças entre os comprimentos de onda e intensidade dos picos, o que
pode ser devido à metodologia utilizada na confecção da pastilha, sendo diferente
para cada uma das três amostras analisadas, e ainda devido à concentração de cada
extrato utilizado, resultando em menor absorção e intensidade das bandas.
55
6. CONCLUSÕES
Através de todo estudo realizado com extratos das cascas dos frutos da C.
langsdorffii, foi possível sugerir quais as classes de compostos presentes em extratos
de diferentes polaridades desse material. Pelas análises qualitativas, através de
reações químicas, podemos sugerir a presença de flavonoides, alcaloides, saponinas,
purinas no EH. Já no EAE identificou-se a presença de flavonoides, alcaloides,
cumarinas e purinas. E no EE, foram identificados flavonoides, taninos, cumarinas e
alcaloides.
Nos experimentos realizados para confirmação desses dados, através da CCD,
foram constatados os compostos cumarinas e flavonoides, em EAE e EE, taninos
apenas no EE, e os compostos terpênicos, presentes nos três extratos.
As análises de RMN 1H e 13C e IV, complementam esses estudos, onde se
identificou a presença de compostos com cadeia alílicas e alifáticas, grupos com
deslocamentos químicos correspondentes à funções éster e álcoois, e ainda a
presença de estruturas que contém compostos aromáticos, em EAE e EE.
Na determinação do teor de flavonoides totais, todas as amostras
apresentaram quantidades de flavonoides semelhantes, porém o EE foi o que obteve
maior quantidade de compostos fenólicos, com 17,02 mgEAG/g o que pode ser
explicado pelo solvente a ser utilizado na extração ser o mais polar dentre os três
utilizados, o que possibilita a extração desses componentes. Por esse mesmo motivo,
o EE foi o que obteve maior percentual de atividade antioxidante, com 81,92%.
Com esses dados, pode-se seguir com análises que especifiquem ainda mais
os compostos presentes nos extratos, como a espectrometria de massas e
cromatografia gasosa, a fim de decifrar esses componentes e propor uma avaliação
de possível atividade biológica, a fim de contribuir com a melhora da saúde e
tratamento de doenças que acometem a população em geral. Destacando que
extratos complexos como estes, podem ter uma ação sinérgica, podendo não exercer
determinada atividade ou função se passarem por processos de isolamento, por isso
56
a importância de se realizar primeiramente uma análise desses compostos em
conjunto.
57
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62
ANEXO A
Espectro de RMN 1H da amostra de EH na concentração de 17 mg/mL, com CDCl3
obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.
63
Espectro de RMN 1H da amostra de EAE na concentração de 17,5 mg/mL, com
CDCl3 obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.
64
Espectro de RMN 1H da amostra de EE na concentração de 17,6 mg/mL, com
CDCl3 obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.
65
Espectro de RMN 13C da amostra de EH na concentração de 17 mg/mL, com CDCl3
obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.
66
Espectro de RMN 13C da amostra de EAE na concentração de 17,5 mg/mL, com
CDCl3 obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.
67
Espectro de RMN 13C da amostra de EE na concentração de 17,6 mg/mL, com
CDCl3 obtido em espectrômetro Bruker Magnet System AscendTM 500 MHz.