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Universidad de Concepcin Facultad de Ciencias Qumicas
Departamento de Fsico Qumica Grupo de Qumica Biolgica y
Computacional
Estudio qumico computacional sobre la formacin del intermediario
LThDP en el
ciclo cataltico de la enzima acetohidroxi sintasa
Tesis para optar al grado acadmico de Licenciado en Qumica y al
ttulo profesional de Qumico
Omar Blas Alvarado Carripn
Concepcin, Octubre del 2012
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin ii
Resumen
El cido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina
dependiente que
cataliza los primeros pasos de la ruta biosinttica de los
aminocidos de cadena
ramificada valina, leucina e isoleucina. Esta enzima se
encuentra en plantas, hongos
y bacterias por lo que es el principal blanco de accin de
herbicidas, fungicidas y
agentes antimicrobianos. El ciclo cataltico de la AHAS est
constituido por cuatro
pasos principales. En el primer paso el intermediario iluro
realiza un ataque
nucleoflico sobre una molcula de piruvato para dar paso a la
formacin del
intermediario (2S)2LactilThDP (LThDP). La formacin de este
intermediario
necesita adems la presencia de un hidrgeno el cual en la AHAS es
de
procedencia desconocida, debido a la inexistencia de grupos
ionizables cercanos a
las zonas del sitio activo de la enzima. Por este motivo en la
presente tesis se
estudi el mecanismo de reaccin para la formacin del LThDP,
postulando que
el grupo encargado de promover la transferencia protnica es el
grupo amino del
anillo de pirimidina cuando este se encuentra bajo la forma APH.
Para ello se
realiz una exploracin de la superficie de energa potencial (SEP)
de la reaccin
considerando a los sustratos aislados en fase gas. Adems se
realizaron clculos de
las funciones de Fukui para el sustrato piruvato, para el estado
de transicin y para
el intermediario iluro bajo las formas AP y APH con el fin de
contrastar la
reactividad de ambas formas tautomericas. Por ltimo se
realizaron clculos
termodinmicos utilizando medios de distintas constante
dielctrica, con el
propsito de verificar la estabilidad de formacin del
intermediario iluro bajo la
forma APH debido a la protonacin del anillo pirimidnico por
parte del
aminocido glutamato. Los clculos computacionales se realizaron
con el paquete
computacional GAUSSIAN 03, empleando la teora de los funcionales
de densidad
(DFT) a nivel B3LYP/631++G(d,p) para la exploracin de la SEP y
B3LYP(C
PCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) para los clculos
termodinmicos, en
tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete
computacional Jaguar
7.7, empleando B3LYP/631++G(d,p). Los resultados obtenidos
indicaron que la
formacin del LThDP ocurre de manera concertada, mostrando una
barrera de
activacin de aproximadamente 21 Kcal/mol. Adems se observ que es
el iluro
bajo la forma AP quien realiza el ataque nucleoflico sobre la
molcula de piruvato.
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin iiii
Abstract
Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiaminedependent enzyme
that catalyzes
the first steps in the biosynthetic pathway of branched chain
amino acids valine,
leucine and isoleucine. This enzyme is found in plants, fungi
and bacteria making it
the main target of action of herbicides, fungicides and
antimicrobial agents. The
catalytic cycle of AHAS consists of four main steps. In the
first step the
intermediate ylide performs a nucleophilic attack on a molecule
of pyruvate to
make way for the formation of the intermediate (2S)2lactylThDP
(LThDP). The
formation of this intermediate also needs the presence of a
hydrogen which is of
unknown origin in the AHAS, due to the absence of ionizable
groups in the active
site of the enzyme. For this reason in this thesis studied the
reaction mechanism for
the formation of LThDP, postulating that the group responsible
for the
protonation is the amino group of the pyrimidine ring when the
form is APH. In
order to validate this hypothesis, the potential energy surface
(PES) was explored
considering the reaction between isolated substrates in gaseous
phase. Furthermore,
Fukui function calculations were performed for the substrate
pyruvate, for the
transition state and for the intermediate ylide under the forms
and AP and APHin
order to compare the reactivity of both tautomeric forms.
Finally thermodynamic
calculations were performed using different dielectric media, in
order to verify the
stability of the intermediate ylide formation under the form APH
owing to
protonation of the pyrimidine ring by the amino acid glutamate.
The computations
were performed using the GAUSSIAN 03 software package, using the
density
functional theory (DFT) at B3LYP/631++G(d,p) for the exploration
of the SEP
and B3LYP(CPCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) for
thermodynamic
calculations, while reactivity studies were performed using the
software package
Jaguar 7.7 employing B3LYP/631++G(d,p). The results obtained
indicated that the
formation of LThDP occurs in a concerted way, showing an
activation barrier of
approximately 21 Kcal / mol. Also was observed that the ylide in
the AP form is
responsible for the nucleophilic attack on the molecule of
pyruvate.
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin iiiiii
ndice general
CAPITULO 1: Introduccin..1
1.2 Propuestas de
investigacin...................................................................................
6
1.3 Propuestas de
investigacin.................................................................................
11
1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis
............................................................ 13
1.4.1 Hiptesis
..............................................................................................
13
1.4.2 Objetivos
..............................................................................................
13
CAPITULO 2:
Metodologa.....................................................................................
14
2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados
............................................ 15
2.2 Clculos de reactividad
.......................................................................................
17
2.3 Clculos termodinmicos
...................................................................................
18
2.3.1 Clculos en fase gas
.............................................................................
18
2.3.2 Clculos en solucin
............................................................................
19
CAPITULO 3: Resultados y discusin
....................................................................
20
3.1 Exploracin de la SEP con los sustratos aislados
.............................................. 21
3.1.1 SEP a nivel semiempirico
...................................................................
21
3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p)
................ 28
3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel
B3LYP/6 31++G(d,p)
....................................................................................................
30
3.2 Estudio de reactividad
........................................................................................
36
3.3 Anlisis termodinmico
......................................................................................
39
CAPITULO 4: Conclusiones y proyecciones
......................................................... 41
4.1 Conclusiones
.......................................................................................................
42
4.2 Proyecciones
.......................................................................................................
43
Bibliografa
................................................................................................................
44
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin iviv
ndice de figuras
Figura 1: sntesis de (2S)2acetolactato y
(2S)2aceto2hidroxibutirato................... 6
Figura 2: estructura del cofactor tiamina difosfato con diedrosp
yT .................. 7
Figura 3: mecanismo de protonacin del cofactor ThDP
correspondiente a las
etapas de activacin del cofactor para formacin del intermediario
Iluro ................ 8
Figura 4: estructura del cofactor FAD, las unidades de
riboflavina, adenina, ribosa y
el grupo difosfato
.........................................................................................................
9
Figura 5: ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en
literatura ..................... 10
Figura 6: mecanismo de formacin del intermediario LThDP en
literatura ......... 12
Figura 7: mecanismo postulado para la formacin del intermediario
LThDP ............... 12
Figura 8: coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la
formacin del
intermediario
LThDP...............................................................................................
15
Figura 9: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con
R1=
CH2CH2OH.
.............................................................................................................
18
Figura 10: ciclo termodinmico para calculo de G del equilibrio
en solucin.... 19
Figura 11: representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico
PM3....................... 22
Figura 12: representacin bidimensional de la SEP a nivel
semiempirico PM3..... 22
Figura 13: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel
PM3 optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET1, (C)
intermediario I, (D)
estado de transicin ET2, (E) producto LThDP
.................................................... 23
Figura 14: estructura rotulada del cofactor ThDP,
correspondiente al intermediario
I...................................................................................................................................
24
Figura 15: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del
intermediario
LThDP mediante clculos a nivel
PM3...................................................................
27
Figura 16: diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico
PM3..................... 27
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin vv
Figura 17: representacin 3D de la superficie de energa potencial
a nivel DFT ... 28
Figura 18: representacin 2D de la superficie de energa potencial
a nivel DFT. .. 29
Figura 19: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel
DFT optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET, (C)
producto LThDP......... 30
Figura 20: estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel
DFT ..................... 31
Figura 21: estructura del estado de transicin ET con el
stretching simultneo de las
coordenadas de reaccin C2C2 y H4O2
.......................................................... 32
Figura 22: esquema de los clculos IRC aplicados al estado de
transicin ET....... 32
Figura 23: estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio
preferencial de
protonacin del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R
igual a 5(2
[hidroxidifosfato]etil)4metil1,3tiazol3io..............................................................
33
Figura 24: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del
intermediario
LThDP mediante clculos a nivel
B3LYP/631++G(d,p)....................................... 35
Figura 25: diagrama de energa para la SEP a nivel
B3LYP/631++g(d,p) .............. 35
Figura 26: funciones de Fukui para el (A) APHIluro, (B) APIluro,
(C) estado
de transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui para (E)
piruvato ............... 36
Figura 27: ndices atmicos de Fukui para APIluro y APHIluro. Con
R1=
CH2CH2OH
..............................................................................................................
37
Figura 28: ndices atmicos de Fukui (A) y (B) para la molcula de
piruvato
....................................................................................................................................
37
Figura 29: ndices atmicos de Fukui y , en parntesis, para el
estado de
transicin ET de la SEP DFT. Con R1=
CH2CH2OH.......................................... 38
Figura 30: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con
R1=
CH2CH2OH
..............................................................................................................
39
f
f +
f
f f +
f f +
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin vivi
ndice de tablas
Tabla I: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los
ngulos diedros p
y T para los puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a
nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano
PM3......................................................... 23
Tabla II: valores de longitudes y ngulos de enlace para los
puntos crticos de la
SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano PM3
....................................................................................................................................
24
Tabla III: valores de cargas atmicas tras MPA para los puntos
crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel
PM3........................................................................
24
Tabla IV: valores de longitudes de enlace del anillo pirimidnico
para los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico
utilizando el
hamiltoniano PM3
.....................................................................................................
26
Tabla V: ordenes de enlace de Mulliken del anillo pirimidnico
para los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico
utilizando el
hamiltoniano PM3
.....................................................................................................
26
Tabla VI: valores de cargas atmicas tras MPA para el anillo
pirimidnico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin obtenido a nivel
PM3..................... 26
Tabla VII: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y los
ngulos diedrosp
yT para los puntos crticos de la SEP en fase gas a con el mtodo
DFT a nivel 6
31++G(d,p).
................................................................................................................
30
Tabla VIII: valores de longitudes de enlace de los puntos
crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p)
............................................. 31
Tabla IX: valores de ngulos de enlace para los puntos crticos de
la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP/631++G(d,p)
............................................ 31
Tabla X: valores de ordenes de enlace para los puntos crticos de
la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p)
............................................. 31
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Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin viivii
Tabla XI: valores de cargas atmicas tras anlisis NBO para los
puntos de crticos
de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p)
...................................................................
33
Tabla XII: valores de longitudes de enlace para el anillo
pirimidnico de los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP
631++G(d,p) ............... 34
Tabla XIII: valores de ordenes de enlace NBO para el anillo
pirimidnico de los
puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP
631++G(d,p) ... 34
Tabla XIV: valores de cargas atmicas del tipo NBO para el anillo
pirimidnico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin a nivel
B3LYP/631++G(d,p) ...... 34
Tabla XV: valores de G para la reaccin acido base entre el
residuo altamente
conservado Glu139, simulado con una molcula de acido actico y
APIluro....... 39
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 11
Captulo 1
Introduccin
n este captulo se dar una breve descripcin de lo que son las
enzimas y
sus propiedades. Posteriormente, se expondrn aspectos generales
de la
enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra,
las
reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo
cataltico que hasta el
momento se le ha postulado en literatura. Esto permitir revelar
las interrogantes
asociadas a la enzima y as dar paso a la propuesta de trabajo en
que est enfocada
esta tesis.
E
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 22
1.1 Enzimas.
Las enzimas son protenas globulares, de gran tamao y que
funcionan como
catalizadores biolgicos. Estn formadas por largas cadenas de
aminocidos unidos
a travs de enlaces peptdicos. Estas cadenas de residuos de
aminocidos
presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades
especficas que
posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar
diferentes
estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a
la secuencia de
aminocidos de la cual est constituida la enzima y es lo que se
considera como la
estructura primaria. El siguiente nivel de organizacin abarca a
las hlices alfa y a la
conformacin beta plegada, estas dos formas estn determinadas por
el tipo de
interaccin entre las cadenas laterales de aminocidos de
distintos polipeptidos
dentro de la enzima y son las que componen las estructuras
secundarias. La
estructura terciaria corresponde a la disposicin tridimensional
de todos los tomos
que componen la protena. Por ltimo se encuentra la estructura
cuaternaria, la
cual se compone de complejos de ms de una cadena polipeptdica.
Estos tipos de
plegamientos estn regidos por las interacciones entre los
enlaces no covalentes
presentes en el ambiente enzimtico. Estas interacciones
corresponden a enlaces de
hidrgeno, enlaces inicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales
ayudan a
mantener la forma de las enzimas. Es as como la distribucin de
los
aminocidos polares y no polares orientan la forma en que se
pliegan las enzimas.
Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el
interior de la enzima,
mientras que las cadenas laterales polares, tienden por s mismas
a disponerse cerca
del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal
forma que su
estructura adopte la menor energa libre posible. Las diferencias
de plegamientos y
formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas
enzimas corresponden a
enzimas que difieren en su secuencia de aminocidos y por ende en
su
ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan
principalmente por catalizar
la misma reaccin qumica que otras enzimas, pero mostrando
diferentes
parmetros cinticos.
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 33
Cada enzima acta sobre un sustrato especfico y generalmente
cataliza
exclusivamente una sola reaccin, aunque esto vara dependiendo de
la cantidad de
cofactores que presente cada enzima en su composicin. La regin
en que las
enzimas llevan a cabo la reaccin con los sustratos se denomina
sitio activo. Las
enzimas en su sitio activo requieren adems de la presencia de
molculas no
proteicas para ejercer su actividad cataltica que se denominan
cofactores, estas
pueden ser metales divalentes o molculas orgnicas que reciben el
nombre de
coenzimas.
En un principio se pensaba que esta interaccin enzimasustrato
ocurra bajo el
modelo de llave cerradura, pero sin embargo este modelo falla al
intentar explicar
la estabilizacin de los estados de transicin. Por este motivo
Daniel Koshland
sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en
donde se
establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con
lo que el sitio activo
podra cambiar su conformacin estructural debido a la interaccin
con el sustrato.
Como resultado, las cadenas aminoacdicas que componen el sitio
activo
interactan especficamente con los distintos cofactores y
sustratos, permitiendo a la
enzima llevar a cabo su funcin cataltica. Existe un tercer
modelo, llamado tensin
sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland. En
este modelo el
sustrato es tensionado hacia la formacin del producto como
resultado de una
transicin conformacional inducida por la enzima, la cual deforma
los ngulos de
enlace y activa al sustrato.
Una manera de cuantificar la interaccin enzimasustrato es a
partir de la constante
de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuacin de MichaelisMenten.
Esta
constante tiene una gran importancia prctica debido a que es
independiente de la
concentracin de la enzima, permite el clculo de la concentracin
de sustrato que
conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad
mxima de reaccin
y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el
sustrato. Dentro de este
mbito existen adems otros factores que influyen en la interaccin
enzimasustrato
y que estn directamente relacionados con la actividad enzimtica.
Entre ellos se
encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta tambin lo hace
la velocidad
enzimtica, pero si esta aumenta demasiado se produce la
desnaturalizacin del
ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimtica.
Otro factor es el
pH, el cual es especfico para la actividad mxima en cada enzima
y basta un
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 44
pequeo cambio para provocar la desnaturalizacin de esta, que en
otras palabras
se refiere a la modificacin de todas las estructuras de la
enzima, excepto la
estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el
efecto de la concentracin
de sustrato y de los productos finales, la existencia de
isoenzimas, adems de
modificaciones alostricas y covalentes en la estructura proteica
de las enzimas,
tambin provocan variaciones de la actividad enzimtica. Uno de
los factores ms
importantes que influyen en la actividad enzimtica y que generan
un gran inters
debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos
pueden clasificarse
segn la forma en que interactan con las enzimas, la cual puede
ser de forma
reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles
reaccionan con la enzima
para producir una protena que no tiene actividad enzimtica y a
partir de la cual es
imposible regenerar la enzima original. En cambio los
reversibles se unen
covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser
liberado, por lo que se
habla de una unin temporal. Dentro de esta ltima clasificacin
estos pueden
subdividirse segn la manera en que intervienen en la reaccin, de
forma
competitiva y no competitiva con respecto al sustrato.
En la actualidad se conoce un gran nmero de enzimas, las cuales
catalizan una
amplia gama de reacciones en los ms diversos organismos. Por
este motivo la
Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular ha
desarrollado una
nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los
denominados nmeros
EC (Enzyme Commission), donde la clasificacin comienza con las
letras EC,
seguidas por cuatro nmeros los cuales estn separados por puntos.
El primer
nmero indica la clase principal de la enzima y los siguientes
son especificaciones
progresivas. Las clases principales se dividen en: 1.
Oxidoreductasas: que catalizan
reacciones de oxidorreduccin; 2. Transferasas: que transfieren
grupos activos a
otras unidades receptoras, pero no transfieren molculas de agua;
3. Hidrolasas: las
cuales catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente
obtencin de
monmeros a partir de polmeros; 4. Liasas: que catalizan
reacciones en las que se
adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a
travs de la
eliminacin de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que
transfieren grupos
dentro de la misma molcula para formar ismeros; 6. Ligasas: que
catalizan la
degradacin o sntesis de los enlaces CC, CS, CO y CN mediante
el
acoplamiento de molculas de alto valor energtico.
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 55
Dentro de la clasificacin de las transferasas se encuentra una
de las enzimas ms
importantes para la vida de organismos tales como bacterias,
hongos y plantas. La
enzima acetohidroxi sintasa, conocida comnmente como AHAS o
acetolactato
sintasa se denomina con el nmero EC 2.2.1.6. El primer nmero se
debe a que la
AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosinttica de
los aminocidos de
cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus
productos son
transferidos a otras enzimas de la ruta biosinttica,
(transferasa). El segundo
nmero, el 2, se debe a que las molculas transferidas poseen al
menos un grupo
cetnico en su estructura. En tanto el tercer nmero, el 1, denota
que la enzima
corresponde a una transcetolasa (transfiere molculas formadas
por la
condensacin de dos tomos de carbono). Por ltimo el numero 6
corresponde
solo a un nmero arbitrario de clasificacin para las
transferasas.
La produccin de los aminocidos de cadena ramificada en la que
est involucrada
la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento
de los organismos
antes mencionados. La inhibicin de esta enzima y por ende de la
produccin de
estos aminocidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta
caracterstica la
AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores,
entre los que se
encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los
herbicidas se
utilizan en las plantaciones para la eliminacin de malezas, las
cuales son dainas ya
que compiten directamente con los cultivos por el acceso al
agua, al sol y a los
nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han
desarrollado para la
eliminacin de bacterias responsables de enfermedades tales como
la
tuberculosis.
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 66
1.2 AHAS.
El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima
que se encuentra
en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencion
anteriormente. Su
funcin es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta
biosinttica de
los aminocidos de cadena ramificada valina, leucina e
isoleucina. Las reacciones
que cataliza la AHAS consisten en la condensacin de dos molculas
de ceto
cidos, figura 1. En primera instancia cataliza la
descarboxilacion, de forma
irreversible y no oxidativa, de una molcula de piruvato.
Figura 1. Sntesis de (2S)2acetolactato y
(2S)2aceto2hidroxibutirato. Los tomos de carbono en negro, los de
oxigeno en rojo y los de hidrgenos en blanco.
Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos,
dependiendo de
cul sea el segundoceto cido en reaccionar. Si este corresponde a
una segunda
molcula de piruvato, se produce la formacin de (2S)2acetolactato
(AL), el cual
es el precursor de los aminocidos de cadena ramificada valina y
leucina. Pero si el
segundo sustrato corresponde a una molcula de 2cetobutirato
(2CB) se produce
la formacin de (2S)2aceto2hidroxibutirato (AHB) el cual es el
precursor del
aminocido de cadena ramificada isoleucina.
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Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 77
N
N
CH2
N+
SNH2CH3
CH3
CH2CH2
OP
O
O
O
P OH
O
O
H
Mg2+
1`
12
3
4
5
2`3`
4`
5`
6` 6
7
7`P
T
La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina
dependiente, ya que para su
actividad cataltica requiere del cofactor tiamina difosfato
(ThDP). Pero adems, la
AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El
primero corresponde al
metal divalente Mg y el segundo corresponde al cofactor flavina
adenina
dinucleotido (FAD).
El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al
interior de la enzima es el
cofactor
3[(4amino2metilpirimidina5il)metil]5(2[hidroxidifosfato]etil)4
metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina
B1 y es conocido
comnmente como ThDP. Este cofactor est formado por un anillo
tiazolio y por
un anillo pirimidnico. El anillo pirimidnico se encuentra
sustituido en la posicin
2 por un grupo metilo y en la posicin 4 por un grupo amino.
Ambos anillos estn
enlazados a travs de un carbono puente con el cual forman los
ngulos diedrosP
= N3C7C5C4 yT = C2N3C7C5 tal como se muestra en la figura 2.
Las
tres conformaciones bsicas que puede adoptar el ThDP debido a la
torsin de
estos diedros son: la conformacin tipo F ( 90, 0), la
conformacin tipo S (
150, 100) y la conformacin tipo V ( 70, 95), en donde el primer
valor
corresponde al diedrop y el segundo al diedroT,
respectivamente.
Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedrosp
yT.
La conformacin tipo V es la que confiere la actividad al ThDP,
debido a la
cercana existente entre el grupo imino del anillo pirimidnico y
el hidrgeno
enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales
existe una distancia
promedio de 3.0 . Esta cercana permite la abstraccin del
hidrgeno enlazado al
carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera
la formacin
de la especie activa conocida como iluro, figura 3. Estas etapas
de activacin
consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la
protonacin del
nitrgeno N1 por parte del aminocido altamente conservado acido
glutmico
(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa
de la forma 4
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 88
aminopirimidina (AP) a la forma 4aminopirimidinio (APH). Luego,
el grupo
amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en
la forma 1,4
iminopirimidina (IP). Por ltimo, el grupo imino del anillo de
pirimidina en la
forma IP extrae el tomo de hidrgeno enlazado al carbono C2
formando la
especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas
etapas de activacin son
comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual
que los dos
primeros pasos del ciclo cataltico de la AHAS.
Figura 3. Mecanismo de protonacin del cofactor ThDP
correspondiente a las etapas de activacin del cofactor (verde) para
formacin del intermediario iluro (azul).
Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, ste adems
de estar unido al
carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un
grupo
etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal
divalente Mg. Este metal
cumple la funcin de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al
interactuar con
dos aminocidos del ambiente enzimtico, los cuales corresponden
especficamente
a un cido asprtico y a una asparraguina.
El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con
sustratos debido a
que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxidoreduccin, es el
cofactor flavina
adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor est compuesto por una
unidad de
riboflavina (vitamina B2), que est unida a un grupo pirofosfato,
el cual que est
enlazado a una ribosa, la que a su vez est unida a una adenina,
figura 4. Se ha
postulado que el FAD confiere dos propiedades fundamntales a la
AHAS, una de
ellas consiste en el aumento de la actividad cataltica de la
enzima cuando este
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 99
N
N
NN
O
NH2
O
OHOH
OP
O
OOH
P
O
OH
OH
OH
OH
N
NHN
O
O
CH3CH3
cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la
AHAS a adoptar la
conformacin de tetrmero, confiriendo al FAD un rol estructural
dentro de la
enzima.
Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de
riboflavina, adenina, ribosa y el grupo difosfato se muestran con
los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.
El ciclo cataltico de la AHAS postulado hasta el momento se
muestra en la
figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de
estos pasos se compone
de un ataque nucleoflico por parte del carbono C2 del
intermediario iluro sobre el
carbono carbonlico de una molcula de piruvato, generando al
intermediario (2S)
2[(1carboxi1hidroxi)etil]tiaminadifosfato tambin conocido como
2lactil
tiaminadifosfato (LThDP). En el segundo paso el LThDP sufre
una
descarboxilacin dando origen al segundo intermediario del ciclo
cataltico: el 2(1
hidroxietil)tiaminadifosfato (HEThDP). Una caracterstica
importante de este
intermediario es que sus dos estructuras resonantes
correspondientes a la forma de
enamina y la forma activa C2carbanin poseen diferente
reactividad, siendo ms
estable la forma de enamina. En tanto la forma C2carbanin es la
que contina
con el ciclo cataltico de la AHAS, dando origen al tercer paso
del ciclo. En este
tercer paso el HEThDP, en su forma aninica, reacciona con el
segundo ceto
cido, el cual puede ser una molcula de piruvato o una molcula de
2cetobutirato.
En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleoflico sobre
el carbono
carbonlico de la segunda molcula de sustrato en cuestin,
formando el
intermediario
(1S,2S)2[(2carboxi1,2dihidoxi1,2dimetil)etil]tiaminadifosfato,
comnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP),
cuando
reacciona con una molcula de piruvato, como tambin el
intermediario (1S,2S)2
[(2carboxi1,2dihidoxi2etil1metil)etil]tiaminadifosfato que
comnmente recibe
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1010
el nombre de 2acetohidroxibutiratotiaminadifosfato (AHBThDP)
cuando
reacciona con la molcula de 2cetobutirato, respectivamente.
Figura 5. Ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en
literatura.
De acuerdo a lo postulado en bibliografa, un punto a destacar en
este tercer paso
es que al igual que en el paso nmero uno del ciclo, aqu tambin
es necesaria la
presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo
ionizable capaz
de protonar al oxgeno carbonlico del segundo ceto cido. Por
ltimo, en el paso
nmero cuatro del ciclo cataltico el producto es liberado tras el
rompimiento del
enlace C2C2 y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de
iluro el cual se
reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, adems en este cuarto
paso, nuevamente es
necesaria la presencia de algn residuo cercano al cofactor que
posea un grupo
ionizable, el cual ahora debe promover la extraccin del hidrgeno
ubicado en el
primer hidroxilo formado de los intermediarios ALThDP o AHBThDP,
segn
sea el caso, con el fin de formar los productos
(2S)2acetolactato y (2S)2aceto2
hidroxibutirato, respectivamente. Sin embargo, a raz de los
anlisis de la
estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los
aminocidos
cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos
que se encuentran
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1111
prximos al grupo amino del anillo pirimidnico y al carbono C2
del anillo tiazolio,
no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones.
Debido a estas
interrogantes, se ha postulado para los pasos nmero 3 y 4 del
ciclo, la posibilidad
de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia
de grupos
ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio
activo.
1.3 Propuesta de investigacin.
En los ltimos 30 aos se han publicado una gran cantidad de
artculos
relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su
totalidad los
mecanismos de activacin e inhibicin. Entre los aspectos ms
relevantes que se
han publicado se encuentran por ejemplo la obtencin de la
estructura cristalina de
la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a
diversas bacterias, clases
de hongos y tipos de plantas. Adems se han realizado estudios
enfocados tanto en
su actividad cataltica, como tambin en la deteccin de los
intermediarios
presentes en el ciclo cataltico, para los cuales adems se han
determinado las
constantes de velocidad de formacin. Sin embargo, a pesar de
esta gran
cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes
relacionadas con esta
enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos
relacionados directamente
con su ciclo cataltico, referentes a la forma en que ocurren los
mecanismos de
reaccin que dan paso la formacin de los intermediarios en los
distintos pasos del
ciclo cataltico, adems de la ausencia de grupos ionizables
cercanos al sitio activo
capaces de promover transferencias protnicas para la formacin de
estos
intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de
los pasos del ciclo
cataltico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la
falta de estos grupos
ionizables y del cual adems se desconoce la forma en que ocurre
su mecanismo de
reaccin, es el paso nmero 1 del ciclo cataltico, correspondiente
a la formacin
del LThDP. Tal como se describi en la seccin anterior, este paso
consta de un
ataque nucleoflico por parte del cofactor tiamina difosfato
(ThDP) hacia el primer
sustrato incorporado en el ciclo cataltico de la AHAS
correspondiente a una
molcula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la
forma de iluro,
figura 6.
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1212
Figura 6. Mecanismo de formacin del intermediario LThDP en
literatura.
Adems, en este paso se requiere de la protonacin del oxgeno
carbonlico de la
molcula de piruvato, para la formacin del intermediario LThDP.
Pero, debido
a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de
algn cido o de un
grupo de similares caractersticas, el origen del protn requerido
en esta etapa
del ciclo cataltico es desconocido.
Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente
tesis se ha propuesto
un mecanismo para la formacin del intermediario LThDP, el cual
no requiere de
la presencia de un grupo con carcter cido aledao al sitio activo
de la enzima.
Con esto se postula que el origen del hidrgeno requerido en esta
etapa del ciclo
cataltico proviene del mismo cofactor ThDP, especficamente del
grupo imino
cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se
encuentra en la
forma de APH, figura 7.
Figura 7. Mecanismo postulado para la formacin del intermediario
LThDP.
-
Capitulo 1: Introduccin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1313
1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis.
1.4.1 Hiptesis.
La protonacin del oxgeno carbonlico de la molcula de piruvato en
la
formacin del intermediario LThDP, se lleva a cabo por el grupo
4imino
del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo
pirimidnico
bajo la forma de APH.
1.4.2 Objetivos.
Objetivo general: modelar tericamente mediante mtodos
mecnico
cunticos el mecanismo de reaccin postulado para la formacin
del
intermediario LThDP desde el punto de vista de la cintica,
reactividad y
termodinmica.
Objetivos especficos:
1. Cintica: explorar el mecanismo de reaccin y determinar la
barrera
de activacin para la formacin del LThDP, considerando los
sustratos aislados en fase gas, mediante la construccin de
una
superficie de energa potencial (SEP) con el anillo pirimidnico
en la
forma de APH al momento de realizar la trasferencia
protnica.
2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los ndices
atmicos
de Fukui para los reactantes y estado de transicin.
3. Termodinmica: calcular los G en fase gas y en solucin para
la
reaccin acido base entre el residuo altamente conservado
GLU139
y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH,
utilizando
solventes con distintos valores de constante dielctrica.
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1414
Capitulo 2
Metodologa
n este captulo se presenta la metodologa empleada para la
construccin
de las SEP con los sustratos aislados en fase gas a nivel
semiemprico y las
posteriores correcciones energticas para las estructuras
obtenidas
empleando la teora de los funcionales de densidad (DFT), adems
se indica la
metodologa utilizada para los clculos termodinmicos tanto en
fase gas como en
solucin. Tambin se presenta la metodologa empleada para el
clculo de las
funciones de Fukui a las distintas molculas de inters.
E
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1515
N
N N+ SC
CH3 CH2
N+
H
H
H CH2
OH
CH3
CH3COO
CO2
CH3OR2R1
C2
C1
O2
C2H4`
.
..
.
2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados.
Para la construccin y exploracin de la superficie de energa
potencial (SEP) en
fase gas y con los sustratos aislados, se consideraron dos
coordenadas de reaccin
tal como se observa en la figura 8. Una de las coordenadas
corresponde al ataque
nucleoflico entre el carbono C2 y el carbono carbonilico C2 (R1)
y la otra
corresponde a la transferencia protnica de uno de los hidrogeno
enlazados al
grupo 4amino cuaternario hacia el oxgeno carbonilico del
piruvato (R2).
Figura 8. Coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la
formacin del intermediario LThDP.
Con el propsito de considerar de una manera simple el ambiente
apoenzimatico
en la construccin de la SEP se realizaron tres aproximaciones.
En primer lugar, en
todos los clculos se consider al cofactor ThDP en la conformacin
tipo V con
valores para P de 66 y T de +96, obtenidos de la estructura
cristalina de la
AHAS. En segundo lugar, en todos los clculos realizados al
intermediario L
ThDP, este siempre se consider con la estructura del enantimero
S. Por ltimo,
en todas las estructuras se incluy al residuo altamente
conservado glutamato,
debido a la importante interaccin que posee con el tomo N1 del
anillo
pirimidnico. Este aminocido fue reemplazado por una molcula de
acido
actico, con el fin de simular de una forma simple el grupo
carboxlato del acido
glutmico. Lo mismo se hizo con el grupo hidrxidifosfato, el cual
se
reemplazo con un grupo hidroxilo debido a que su rol solo consta
en anclar el
ThDP al sitio activo, por lo que no tiene ninguna contribucin en
la actividad
cataltica del cofactor. Adems, en ninguno de los clculos se
incluye el
metal divalente Mg ya que su rol es coordinar el grupo difosfato
del ThDP y
adems no tiene participacin directa en la catlisis.
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1616
Posteriormente esta estructura se optimiz utilizando el
hamiltoniano PM3
(Parameterized Model number 3) con el programa MOPAC 2009. Una
vez
optimizada la molcula se restringi la longitud de enlace C1C2a
una distancia
de 1.55 y se optimiz nuevamente. A continuacin, con este
resultado se
generaron 73 estructuras diferentes, las cuales se obtuvieron al
cambiar la distancia
de la coordenada de reaccin R1 desde 1.40 hasta 5.00 con
intervalos de 0.05
. En cada una de estas estructuras se restringieron longitudes
de enlaces, ngulos
de enlaces y ngulos diedros con la finalidad de resaltar solo lo
cambios de energa
producidos nicamente por las coordenadas de reaccin en estudio y
adems para
reproducir de cierta forma la rigidez del cofactor en el sitio
activo de la enzima.
Luego, en cada una de estas estructuras la coordenada R2 fue
variada entre 3.70
y 0.9 con intervalos de 0.034 , asegurando de esta manera que
ambas
coordenadas de reaccin, tanto R1 como R2, tuviesen un total de
72 pasos cada
una. A continuacin la energa de cada una de las 5300 estructuras
se grafic en
funcin de la coordenadas R1 y R2 con el programa SigmaPlot
10.0,
construyendo de esta manera la SEP a nivel semiemprico
utilizando el
hamiltoniano PM3. Para encontrar los estados de transicin en
esta superficie se
seleccionaron estructuras representativas correspondientes a la
regin de los puntos
de silla de la superficie y se procedi a su optimizacin y
posteriores clculos de
frecuencia con el programa MOPAC 2009.
Sin embargo, debido a las conocidas limitaciones que presenta el
mtodo
PM3, la SEP PM3 fue corregida utilizando Density Functional
Theory
(DFT) a nivel B3LYP/631++g(d,p). Para esto con el software
GAUSSIAN
03se realizaron clculos single points de las estructuras
optimizadas a nivel PM3.
Posteriormente estas energas corregidas se graficaron versus las
coordenadas de
reaccin R1 y R2 para obtener la SEP corregida a nivel DFT. A las
estructuras
optimizadas al nivel B3LYP/631++g(d,p) de los posibles estados
de transicin de la
SEP se les realiz un clculo IRC(Intrinsic Reaction Coordinate)
al mismo nivel
de teora, con la finalidad de confirmar el estado de transicin
correspondiente a la
reaccin de inters. Este clculo condujo hacia reactantes y
producto, y sus
resultados fueron comparados con las estructuras optimizadas a
nivel B3LYP/6
31++g(d,p) del sistema reactantes y del producto obtenidas a
partir de la SEP DFT.
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1717
2.2 Clculos de reactividad.
Para los estudios de reactividad se calcularon las funciones de
Fukui y los ndices
atmicos de Fukui y . Estas funciones e ndices atmicos
permitieron
visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las
distintas especies
involucradas en la reaccin de formacin del LThDP. La funcin
(r)refleja la
reactividad global de la molcula respecto a un centro
electroflico. En tanto la
funcin (r) refleja la reactividad hacia un eventual ataque
nucleoflico. Estas
funciones estn definidas por las ecuaciones 1 y 2.
( ( ) ( )) /N Nf r r + + = (1)
( ( ) ( )) /N Nf r r = (2)
Con estas ecuaciones las funciones de Fukui fueron calculadas
mediante una
aproximacin de diferencias finitas, donde N es el nmero de
electrones, es la
densidad electrnica de cierto tomo(r) yes una fraccin de un
electrn, donde
el valor utilizado fue de 0.01. En tanto para el anlisis de los
ndices atmicos de
Fukui, estos se calcularon simultneamente con los de las
funciones de
Fukui mediante la metodologa implementada en el paquete
computacional Jaguar
7.7y con la ayuda de la interfaz grafica Maestro 9.1.
Los resultados de las funciones de Fukui fueron entregados y
visualizados como
isosuperficies, mientras las funciones atmicas de Fukui, tambin
conocidas como
las funciones condesadas de Fukui, se obtuvieron por el clculo
descrito en las
ecuaciones 1 y 2, correspondientes al cambio de densidad
electrnica entre las
molculas neutras y sus especies radicales, donde se registr la
poblacin
electrnica sobre los tomos de las molculas analizadas. Para la
obtencin
de las poblaciones atmicas se realizaron clculos del tipo MPA
(Mulliken
Population Analysis), anlisis implementado en la metodologa de
Jaguar 7.7 para
el clculo de funciones de Fukui.
f + f
f
f +
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1818
2.3 Clculos termodinmicos.
2.3.1 Clculos en fase gas.
Las estructuras que se muestran en la figura 9, fueron
optimizadas en fase gas con
el software GAUSSIAN 03 y utilizando la teora de los funcionales
de densidad al
nivel B3LYP/631++G(d,p). Posteriormente sobre las estructuras
optimizadas se
realizaron clculos de frecuencia al nivel de teora a
B3LYP/6311G.
Figura 9. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con
R1= CH2CH2OH.
Los resultados de las funciones termodinmicas entregadas por los
clculos de
frecuencia fueron obtenidos de acuerdo a las ecuaciones 3, 4 y
5. Donde ESCF es la
energa potencial (SelfConsistent Field Energy), ZPE es la energa
del punto cero
(Zero Point Energy), kB es la constante de boltzmann, T la
temperatura y EInt es la
suma de las energas trasnacional, rotacional, vibracional. Con
el valor de la
energa libre de las molculas de la figura 9 se calcul el valor
del G para
reaccin acido base entre en residuo y los tautmeros APIluro y
APHIluro.
tot SCF IntE E ZPE E = + + (3)
corr tot BH E k T = + (4)
corr corr totG H TS = (5)
-
Capitulo 2: Metodologa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 1919
2.3.2 Clculos en solucin.
Las estructuras de la figura 9 fueron optimizadas en fase gas.
Los efectos de
solvatacin implcita fueron modelados de acuerdo al modelo CPCM
(Conductor
Polarizable Continuum Model), tal como est implementado en
Gaussian 03.
Las constantes dielctricas de los medios considerados fueron
2.01 y 32.63,
como paradigmas de medios apolares y polares respectivamente,
con el fin de
resaltar el efecto del ambiente enzimtico, tratando de simular
en primer lugar las
estabilizaciones producidas por las fuerzas de Van der Waals que
otorgan los
residuos cercanos al sitio activo y que generan un ambiente
hidrofbico de una
constante dielctrica con valores entre 2 y 4. Para el segundo
caso se intento
simular el ambiente enzimtico en el interior de la enzima, pero
ahora
considerando las estabilizaciones de carcter electrosttico por
parte de
aminocidos que presentan grupos ionizados. Adems todos los
clculos
fueron hechos considerando al residuo altamente conservado
glutamato
interactuando con el tomo N1 como una forma simple de considerar
el ambiente
apoenzimatico. Este residuo fue reemplazado por una molcula de
acido actico,
con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxlato
del acido glutmico.
Las energas libres en solucin fueron calculadas a nivel
B3LYP(CPCM)/6
311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p), mediante el empleo del ciclo
termodinmico,
que se muestra en la figura 10, tomando la diferencia entre elG
del equilibrio en
fase gas y los valores deG de solvatacin obtenidos de los
clculos single points
en solucin de las molculas involucradas (ecuacin 6).
Figura 10. Ciclo termodinmico para calculo deG del equilibrio en
solucin.
0 0 0 0solucion gas solvB solvAG G G G = + (6)
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2020
Capitulo 3
Resultados y discusin
n este captulo se presenta la SEP con los sustratos aislados en
fase gas
realizada a nivel semiemprico PM3 y su posterior refinamiento
con el
mtodo DFT a nivel 631++G(d,p). Tambin se presenta el resultado
de
los ndices de reactividades correspondientes a las funciones de
Fukui para el iluro
con el anillo pirimidnico en la forma AP y APH, para la molcula
de piruvato y
para el estado de transicin. Adems, se presentan los valores del
cambio de la
energa libre en condiciones estndar obtenido del anlisis
termodinmico
realizado para la reaccin acido base entre el residuo altamente
conservado
GLU139 y APIluro.
E
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2121
3.1 Exploracin de la SEP con los sustratos aislados.
3.1.1 SEP a nivel semiemprico PM3.
La exploracin de la SEP a nivel semiemprico con el hamiltoniano
PM3, figuras
11 y 12, muestran que el mecanismo de reaccin para la formacin
del LThDP
presenta la formacin de un intermediario y la presencia de dos
estados de
transicin. La primera etapa del mecanismo consiste en el
desplazamiento de la
molcula de piruvato hacia el cofactor ThDP, promoviendo el
ataque nucleoflico
por parte del carbono C2 hacia el carbono carbonlico C2 de la
molcula de
piruvato, alcanzando de esta forma el primer estado de transicin
ET1. Este estado
de transicin est caracterizado con solo una frecuencia
imaginaria de 407 cmy
que corresponde al stretching de la coordenada C2C2.La barrera
de activacin
observada, calculada a nivel PM3, es aproximadamente de 29
Kcal/mol. Durante
esta etapa no se observa transferencia protnica. A continuacin,
el ataque
nucleoflico se completa formando el intermediario I, con una
longitud de enlace
C2C2de aproximadamente 1.55 , que corresponde a la longitud
promedio de
un enlace simple carbonocarbono. Luego, una vez formado este
intermediario, se
produce la transferencia protnica desde el grupo 4NH2 al oxgeno
carbonilico
O2, formando finalmente el producto LThDP, va el estado de
transicin ET2.
Este estado de transicin tambin esta caracterizado con una sola
frecuencia
imaginaria igual a 2004 cm,correspondiente al stretching H4O2.
La barrera
de activacin observada, calculada a nivel PM3, para esta ltima
etapa es
aproximadamente de 5 Kcal/mol.
Cabe destacar que estas barreras de activacin se obtuvieron a
partir de las
estructuras de los puntos crticos de la reaccin que fueron
optimizadas en fase gas
sin restricciones, una vez construida la SEP. Ya que no
corresponden a las
estructuras con las que se construyo la superficie, las cuales
fueron restringidas en
algunas variables tales como longitudes de enlaces, ngulos de
enlaces y ngulos
diedros. Estas nuevas optimizaciones se realizaron utilizando el
hamiltoniano PM3
en MOPAC 2009.
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2222
Figura 11. Representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico
PM3.
Figura 12. Representacin bidimensional de la SEP a nivel
semiempirico PM3.
Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos
diedrosp y
T para los diferentes puntos crticos de la SEP optimizados sin
restriccin de
variables se presentan en la tabla I. Para la regin de los
reactantes, del
intermediario y del producto se tomaron las estructuras de menor
energa
encontradas en la SEP. Mientras que para los estados de
transicin se tomaron las
estructuras encontradas en las zonas de puntos de silla de la
superficie.
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2323
En la figura 13 se muestran los resultados de las estructuras
optimizadas en fase gas
de los puntos crticos de esta SEP. Adems, para resaltar los
cambios estructurales
ocurridos durante el transcurso de la reaccin, en la tabla II se
presentan los valores
de algunas longitudes y ngulos de enlace, pertenecientes
principalmente a la
molcula de piruvato y al grupo imino del anillo pirimidnico. Por
otro lado en la
tabla III, se presentan las cargas atmicas obtenidas del anlisis
poblacional de
Mulliken (MPA) para los tomos ms relevantes involucrados en el
ataque
nucleoflico y en la transferencia protnica. En esta ltima tabla
y con el fin de
comparar la variacin de la carga sobre los nitrgenos N4, figura
14, tambin se
presentan las cargas atmicas del nitrgeno N3.
Figura 13. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel
PM3 optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de
transicin ET1, (C) intermediario I, (D) estado de transicin
ET2, (E) producto LThDP.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2424
Figura 14. Estructura rotulada del cofactor ThDP,
correspondiente al intermediario I.
En el sistema de reactantes la molcula de piruvato presenta una
geometra trigonal
plana, con valores de algunos de enlaces cercanos a los 120. En
esta regin de la
SEP, el piruvato se encuentra a una distancia de 4.05 del
intermediario iluro,
orientando su grupo carbonilo hacia el grupo imino cuaternario
del anillo
pirimidnico. Por su parte el nitrgeno N4 en esta regin registra
la mayor
densidad de carga positiva, en comparacin a los dems puntos
crticos de la SEP,
ya que a medida que avanza la reaccin la carga atmica del
nitrgeno N4 adopta
valores negativos, especficamente en el segundo estado de
transicin y en el
producto. Adems, el enlace N4C4 muestra una longitud de enlace
de 1.33 ,la
cual es menor que el valor de longitud de enlace promedio para
un enlace doble
carbononitrgeno, correspondiente a 1.38 . As, el anillo
pirimidnico se
encuentra bajo la forma de APH, acorde a lo postulado en
literaturapara otras
enzimas ThDP dependientes.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2525
A medida que la reaccin avanza y se sita en la regin del primer
estado de
transicin ET1, los valores de los ngulos de enlaces de la
molcula de piruvato
comienzan a sufrir modificaciones. Claro ejemplo de esto es la
disminucin del
valor del ngulo de enlace C1C2O2 desde 122 a 114.Esto da cuenta
del
cambio de geometra que sufre el piruvato, pasando de una
geometra trigonal plana
a una geometra tetradrica, producto del ataque nucleoflico
realizado por el
carbono C2. Adems como consecuencia de lo ocurrido en esta etapa
de la
reaccin, la densidad de carga negativa sobre el carbono C2
disminuye,
produciendo una variacin en la carga atmica de 0.220 a 0.359
desde los
reactantes hasta el intermediario I. En tanto la longitud del
enlace C2O2
aumenta de 1.21 a 1.34 , aumentando tambin la carga negativa
sobre el
oxgeno O2.
Una vez en la regin del intermediario I, la molcula de piruvato
se encuentra
enlazada al cofactor ThDP, adoptando una geometra tetradrica con
ngulos de
enlace cercanos a los 109. Sin embrago la orientacin del oxgeno
carbonilico O2
de la molcula de piruvato no ha sufrido modificaciones con
respecto a la que
presentaba en el sistema de reactantes. Esto se debe
principalmente a que el
cofactor ThDP no ha perdido su conformacin tipo V, la cual se
mantiene durante
todo el transcurso de la reaccin, al igual que el ngulo de
enlace H4N4C4.
Como consecuencia, la transferencia protnica desde el grupo
imino cuaternario
del anillo pirimidnico hacia el oxgeno carbonilico O2se
encuentra favorecida,
quedando el oxgeno O2 a una distancia de 1.68 con respecto al
hidrgeno
H4. Finalmente, el aumento de la densidad de carga negativa
sobre el nitrgeno
N4 al atravesar la zona del segundo estado de transicin ET2 y
posteriormente al
llegar a la formacin del intermediario LThDP, indica que el
anillo pirimidnico
queda bajo la forma de IP, acorde a los postulado en bibliografa
para otras
enzimas ThDP dependientes. Con un valor de 1.31 para la longitud
del
enlace N4C4 y una carga atmica sobre el nitrgeno N4 de
0.276.
En lo que respecta al anillo pirimidnico, tanto los valores de
las longitudes de
enlace, tabla IV, como los valores de los rdenes de enlace,
tabla V, ambos
obtenidos por MPA, muestran que desde el sistema de reactantes y
hasta la zona
del intermediario I, los enlace del anillo se encuentran
deslocalizados.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2626
A medida que la reaccin avanza y pasa desde el intermediario I
hasta la formacin
del producto LThDP, las longitudes de los enlaces C4C5 y C4N3
aumentan,
disminuyendo sus ordenes de enlace y formando enlaces simple
carbonocarbono y
carbononitrgeno, respectivamente. Esto provoca que la densidad
de carga
negativa sobre el carbono C4 disminuya, tabla VI. Lo mismo
ocurre con los
enlaces C6N1 y N1C2, los cuales tambin sufren un aumento en sus
longitudes
de enlaces en estas etapas de la reaccin, disminuyendo sus
ordenes de enlace y
provocando un aumento en la densidad de carga negativa sobre el
nitrgeno N1
(tabla III). A pesar de esto, el nitrgeno N1 se mantiene con una
carga parcial
positiva durante toda la reaccin. En cuanto a los enlaces C5C6 y
C2N3, estos
mantienen sus ordenes de enlaces constantes durante toda la
reaccin, con valores
correspondientes a rdenes de enlaces intermedios entre un enlace
simple y un
enlace doble.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2727
De acuerdo a los resultados obtenidos de la exploracin de la SEP
utilizando el
hamiltoniano PM3, se propone el siguiente mecanismo para la
formacin de
intermediario LThDP, figura 15.
Figura 15. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del
intermediario LThDP mediante clculos a nivel PM3.
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de
energa que se muestra
en la figura 16. La barrera de activacin, en trminos de energa
electrnica, para
este mecanismo de reaccin es de 32.65 Kcal/mol, considerando la
barrera
energtica del estado de transicin ET2 con respecto al sistema de
reactantes,
debido a que la etapa limitante de la reaccin corresponde a la
segunda etapa del
mecanismo.
Figura 16. Diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico
PM3.
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2828
3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p).
La correccin DFT de la SEP fue necesaria debido a las conocidas
limitaciones del
mtodo PM3, a causa de las simplificaciones en la descripcin
electrnica de este
mtodo, como por ejemplo considerar solo a los electrones de
valencia y la
utilizacin de un mnimo de funciones bases. Estas
simplificaciones traen como
consecuencia valores errneos de las cargas sobre los tomos de
nitrgeno y una
sobre estimacin de las barreras de activacin. Sin embargo, los
mtodos
semiempricos siguen siendo una buena alternativa para una
exploracin preliminar
de la superficie de energa potencial para un posterior
refinamiento a nivel DFT.
Figura 17. Representacin 3D de la superficie de energa potencial
a nivel DFT.
La correccin de la SEP se llev a cabo de acuerdo a la metodologa
descrita en la
seccin 2.1. Los resultados de esta correccin se muestran en las
figuras 17 y 18.
Esta nueva superficie de energa potencial muestra diferencias
importantes en su
topologa con respecto a aquella obtenida a nivel PM3. La zona
correspondiente al
intermediario I, ya no presenta la estabilidad energtica
descrita por el mtodo
PM3. Como consecuencia, las zonas de los puntos de silla
correspondientes a los
estados de transicin ET1 y ET2 han desaparecido. Ahora en esta
nueva SEP, es
posible observar que la reaccin ocurre mediante un mecanismo
concertado, va un
estado de transicin asncrono, donde la coordenada de reaccin
R1,
correspondiente al ataque nucleoflico del carbono C2 sobre el
carbono carbonilico
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 2929
C2, se adelanta a la coordenada de reaccin R2. De esta manera,
se observa que a
medida que se acerca la molcula de piruvato hacia el cofactor
ThDP, se comienza
a producir el ataque nucleoflico. Mientras esto ocurre, la
distancia entre el oxgeno
O2 y el hidrgeno H4 disminuye paulatinamente. Ya en la zona del
estado de
transicin ET y hasta la formacin del producto LThDP, se lleva a
cabo la
transferencia protnica, rompindose el enlace entre el hidrgeno
H4 y el
nitrgeno N4 y formndose el enlace O2H4, mientras el ataque
nucleoflico se
completa.
Figura 18. Representacin 2D de la superficie de energa potencial
a nivel DFT.
Debido a que la metodologa implementada para corregir la SEP a
nivel DFT solo
consisti en realizar clculos single points sobre estructuras
optimizadas a nivel
PM3, fue necesario realizar optimizaciones al nivel
B3LYP/631++G(d,p) para los
puntos crticos de la SEP DFT. Para las regiones correspondientes
al sistema de
reactantes y al producto LThDP, se tomaron las estructuras de
menor energa
encontradas en la superficie. En tanto, para la identificacin
del estado de
transicin ET se tomaron varias estructuras aproximadas,
pertenecientes a la regin
de punto de silla de la SEP. A todas las estructuras optimizadas
se les realizaron
clculos de frecuencia, para cuantificar la barrera energtica del
mecanismo en
trminos del cambio de energa libre.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3030
3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel
B3LYP/631++G(d,p).
Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos
diedrosp y
T para los diferentes puntos crticos de la SEP DFT, optimizados
al nivel
B3LYP/631++G(d,p), se presentan en la tabla VII. Adems, en la
figura 19 se
muestran los resultados de las estructuras optimizadas de los
puntos crticos de la
SEP.
Figura 19. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel
DFT optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de
transicin ET, (C) producto LThDP.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3131
En las tablas VIII y IX, se presentan los valores de algunas
longitudes y ngulos de
enlace de los puntos crticos, pertenecientes principalmente a
las molculas de
piruvato, acido actico y al grupo imino del anillo pirimidnico,
figura 20. En tanto,
en la tabla X se muestran algunos rdenes de enlace, obtenidos
del clculo NBO
(Natural Bond Orbital). Clculo que realiza un anlisis de los
rdenes de enlaces y
de las hibridaciones basado en la poblacin electrnica obtenida
del anlisis NPA
(Natural Population Analysis), anlisis incorporado en el clculo
NBO.
Figura 20. Estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel
DFT.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3232
La optimizacin y caracterizacin del estado de transicin
calculado al nivel
B3LYP/631++G(d,p) mostr como resultado una nica frecuencia
imaginaria de
222 cm,correspondiente al stretching simultaneo de las
coordenadas de reaccin
C2C2 yH4O2, como se muestra en la figura 21.
Figura 21. Estructura del estado de transicin ET con el
stretching simultneo de las coordenadas de reaccin C2C2y H4O2.
Con la finalidad de corroborar que el estado de transicin
encontrado corresponde
a la reaccin de inters, se llev a cabo un clculo IRC. El
resultado condujo al
producto y al sistema de los reactantes previamente optimizados,
tal como se
muestra en la figura 22.
Figura 22. Esquema de los clculos IRC aplicados al estado de
transicin ET.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3333
CH3
OO
H
N
N R1
NH2CH3
CH3
OO
H
N
N R1
NH2+
CH3
1.57
:
.. ..
:
1.33
..
De acuerdo a los resultados, se observa que en la zona de los
reactantes el piruvato
se encuentra a 4.96 de distancia de la molcula iluro y a 3.51 de
distancia con
respecto a la coordenada de reaccin R2, orientando su grupo
carboxlato hacia el
grupo 4NH2. A medida que la molcula de piruvato se acerca al
carbono C2 del
iluro, sta cambia su orientacin y es el oxigeno O2quien queda ms
prximo al
grupo 4NH2, otorgando la configuracin tipo S presente en el
LThDP. Una vez
que la reaccin cruza la zona del estado de transicin y hasta la
formacin del L
ThDP, la longitud de enlace entre el carbono C4 del anillo
pirimidnico y el
nitrgeno N4 del grupo imino disminuye, debido a la transferencia
protnica
desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno O2. Como consecuencia, la
densidad de
carga negativa sobre el N4 aumenta en la formacin del LThDP,
tabla XI. De
igual forma, la distancia del enlace de hidrgeno formado entre
el residuo y el
nitrgeno N1, disminuye desde 1.57 a 1.43 , sin producirse
transferencia
protnica, quedando el anillo de pirimidnico en la forma de
4iminopirimidina.
Adems, estructuralmente se observa que durante toda la reaccin
el sitio
preferencial de protonacin del anillo de pirimidina,
correspondiente al nitrgeno
N1, se encuentra desprotonado, figura 23, al igual que en la
estructura cristalina de
la AHAS. Mostrando que el grupo imino cuaternario puede formarse
debido a la
estabilizacin de la carga negativa sobre el nitrgeno N1 por
parte del enlace de
hidrgeno formado con el residuo, el cual esta a una distancia de
1.57 del
nitrgeno N1 en la zona de los reactantes y en el estado de
transicin ET.
Figura 23. Estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio
preferencial de protonacin del anillo de aminopirimidina en la
forma AP con R igual a 5(2[hidroxidifosfato]etil)4metil
1,3tiazol3io.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3434
Adicionalmente, el anillo pirimidnico durante la reaccin se
encuentra con sus
enlace deslocalizados, segn las longitudes y rdenes de enlace
que muestra el
anillo, tablas XII y XIII, respectivamente. En tanto, las cargas
parciales para los
tomos de anillo pirimidnico, obtenidas del anlisis NBO, se
presentan en la XIV.
As, las principales diferencias que ha otorgado el refinamiento
de la SEP a nivel
B3LYP/631++G(d,p) en comparacin a la construida con el mtodo
PM3, recaen
principalmente en que el mecanismo de reaccin ocurre de manera
concertada y
no por etapas y que para la formacin del grupo imino del anillo
pirimidnico no
necesaria la protonacin del nitrgeno N1. De esta manera, segn
los resultados
obtenidos es posible que el anillo pirimidnico no se encuentre
bajo la forma de
APH al momento de realizar tanto el ataque nucleoflico sobre el
carbono
carbonlico C2, como la transferencia protnica hacia el oxigeno
carbonilico O2.
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3535
En virtud de los resultados obtenidos de la SEP corregida a
nivel DFT, se propone
el siguiente mecanismo, figura 24, para la formacin del
intermediario LThDP.
Figura 24. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del
intermediario LThDP mediante clculos a nivel B3LYP/631++G(d,p).
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de
energa que se muestra
en la figura 25. La barrera de activacin observada para la
formacin del
intermediario LThDP es de aproximadamente 21 Kcal/mol. El valor
de esta
barrera de activacin est por debajo de la barrera de activacin
terica informada
en otros estudios, la cual tiene un valor de 35.83 Kcal/mol segn
clculos realizados
en fase gas y con los sustratos aislados a nivel DFT. La barrera
de activacin
experimental es de 16.21 Kcal/mol.
Figura 25. Diagrama de energa para la SEP a nivel
B3LYP/631++g(d,p).
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3636
3.2 Estudio de reactividad.
Con el fin de complementar los resultados anteriores se realiz
un estudio de
reactividad en trminos de las funciones de Fukui y de las
diferentes especies
participantes en la reaccin. Las funciones y se calcularon de
acuerdo a la
metodologa implementada en Jaguar 7.7 y los resultados se
muestran en la
figura 26, en la cual las funciones se visualizan como
isosuperficies. Para las
molculas de APIluro, APHIluro y para el estado de transicin ET
obtenido de
la SEP DFT se calcul la funcin . En tanto, para la molcula de
piruvato se
calcularon las funciones y . Las zonas azules de la funcin
corresponden a
regiones que pierden densidad electrnica, cuando la molcula se
somete a un
ataque electroflico o cuando la molcula acta como un nuclefilo.
Por otro lado,
las zonas rojas de la funcin corresponden a regiones que ganan
densidad
electrnica cuando la molcula sufre un ataque nucleoflico o
cuando la molcula
acta como un electrfilo.
Figura 26. Funciones de Fukui para el (A) APHIluro, (B) APIluro,
(C) estado de transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui para (E)
piruvato.
f + f
f + f
f
f +
f
f f
f +
f +
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Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3737
Los tomos que no poseen regiones coloreadas no presentan
reactividad. En este
sentido, en la estructura del iluro en la forma APH se puede
apreciar que los
centros nucleoflicos ms importantes corresponden a los oxgenos
carboxlicos del
residuo, en cambio el carcter nucleoflico del carbono C2 del
anillo de tiazolio es
muy bajo. Sin embargo, en el caso del iluro bajo la forma AP se
observa que el
tomo con mayor carcter nucleoflico corresponde al carbono C2,
como es de
esperar para que se produzca el ataque nucleoflico a la molcula
de piruvato. Por
otro lado, los ndices atmicos de Fukui calculados sobre el
carbono C2,
resultan ser 0.34 y 0.00 para las formas AP y APH,
respectivamente, figura 27.
Estos resultados sugieren que el ataque nucleoflico del iluro
sobre el piruvato
requiere al iluro en su forma AP (APIluro).
Figura 27. ndices atmicos de Fukui para APIluro y APHIluro. Con
R1= CH2CH2OH.
En lo que respecta al sustrato, la molcula de piruvato, muestra
un importante
carcter nucleoflico sobre todos los tomos de oxgenos y el
carbono C2muestra
caractersticas de electrfilo. Los ndices de Fukui atmicos para
el carbono C2y
el oxigeno carbonilico son = 0.51 y el oo = 0.24, figura 28.
Estas caractersticas
complementarias entre APIluro y el piruvato sugieren que la
reaccin de
formacin del LThDP ocurra mediante el mecanismo postulado a
nivel DFT.
Figura 28. ndices atmicos de Fukui (A) y (B) para la molcula de
piruvato.
2Cf
2Cf +
2Of
f
f f +
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3838
En el estado de transicin ET se puede observar que las funciones
de Fukui antes
mencionadas se mantienen y los lbulos estn dirigidos en la
orientacin correcta.
Es decir el lbulo del tomo C2 est orientado hacia el carbono C2y
el lbulo del
oxigeno carbonilico est orientado hacia el hidrgeno del grupo
4NH2. En este
estado de transicin postulado, el ndice local de Fukui sobre el
oxigeno carbonilico
de la molcula de piruvato alcanza el valor mximo de 0.27, figura
29, que
comparado con su respectivo valor en la molcula de piruvato
aislada de 0.24,
indica el aumento en el carcter nucleoflico de este oxigeno como
consecuencia
del ataque del iluro sobre el carbono C2.
Figura 29. ndices atmicos de Fukui y , en parntesis, para el
estado de transicin
ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.
En la figura 29, la funcin condensada de Fukui se muestra entre
parntesis.
Aqu se observa que otra de las variaciones presentes en el
estado de transicin ET,
es la disminucin de los ndices de Fukui para los nitrgenos N1,
N4 y para el
carbono C2. La funcin condensada de Fukui para el carbono C2
tambin
disminuye en esta etapa de la reaccin.
En definitiva, estos resultados complementan el mecanismo de
reaccin postulado
a nivel DFT. La nula reactividad del carbanion C2 cuando el
anillo pirimidnico se
encuentra bajo la forma del APHdeja en evidencia que al momento
del ataque
nucleoflico el anillo pirimidnico se encuentra con la forma de
AP.
f f +
f
f +
f +
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 3939
3.3 Anlisistermodinmico.
Los resultados de la exploracin de la SEP y de la optimizacin
del estado de
transicin a nivel DFT sugieren que durante el ataque nucleoflico
del iluro, a la
molcula de piruvato, el anillo pirimidnico se encuentra con el
nitrgeno N1
desprotonado y el nitrgeno N4 en su forma imino. Adems, los
clculos IRC
indican que el producto LThDP se encuentra tambin con el
nitrgeno N1
desprotonado y el nitrgeno N4 se encuentra en su forma imino, a
diferencia de lo
reportado para enzimas ThDP dependientes.
Con la finalidad de corroborar estos resultados y determinar el
estado de
protonacin del nitrgeno N1 del anillo pirimidnico durante la
reaccin, desde el
punto de vista termodinmico se ha estudiado el equilibrio acido
base entre el
residuo altamente conservado GLU139, simulado con una molcula de
acido
actico y las formas AP y APH del iluro, figura 30, considerando
medios de
diferente constante dielctrica. En la tabla XV, se presentan los
valores de losG
para cada uno de los medios y en la figura 30 se muestran
algunas longitudes de
enlace () y cargas parciales del tipo NBO para algunos de los
tomos ms
relevantes de la reaccin.
Figura 30. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con
R1= CH2CH2OH.
-
Capitulo 3: resultados y discusin
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 4040
En este sentido, el equilibrio involucra directamente la
estabilidad de las bases
conjugadas formadas, contrastando la factibilidad de la
protonacin del nitrgeno
N1 del anillo pirimidnico por parte del residuo GLU139. Los
resultados que se
muestran en la tabla XV indican que en los tres medios
considerados la especie
termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno N1
desprotonado, la
forma APIluro. Este resultado est en concordancia con los
resultados descritos en
las secciones anteriores, es decir, durante el ataque
nucleoflico el anillo
pirimidnico se encuentra con el nitrgeno N1 desprotonado al
igual que el
producto LThDP formado. Una mayor estabilizacin de la base
conjugada de la
forma APHdebido a la deslocalizacin de la carga negativa del
nitrgeno N1 en
el anillo pirimidnico, permite que la forma AP sea
energticamente ms estable.
En comparacin, la base conjugada del acido actico posee una
menor cantidad de
estructuras resonantes capaces de estabilizar la carga negativa
sobre el oxigeno O1.
Estos resultados adems, presentan una concordancia con el estado
de protonacin
del residuo GLU139 encontrado en las diferentes estructuras
cristalinas obtenidas
de la AHASy con los clculos de los pKa experimentales del
nitrgeno N1
y del grupo carboxlato del residuo GLU139, que tiene valores de
7.0 y 9.1,
respectivamente, donde el rango de pH de mayor actividad
cataltica que presenta
la AHAS es de 7.5, aproximadamente. Sin embargo, tambin se
observa una
fuerte dependencia del valor de G con el medio, lo que sugiere
la posibilidad que
en el sitio activo de la enzima la forma APH pueda existir
debido a
estabilizaciones producidas por los residuos aminoacdicos y que
por ende es
posible que la forma APHpueda participar en otras etapas del
ciclo cataltico de la
AHAS.
-
Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 41
Capitulo 4
Conclusiones y proyecciones
n este captulo se presentan las conclusiones referentes a los
resultados
obtenidos en la presente tesis. Entre ellas se encuentran la
determinacin
del mecanismo de reaccin para la formacin del intermediario
LThDP,
la limitacin del anlisis energtico de la reaccin al trabajar en
fase gas y con los
sustratos asilados y la disyuntiva existente entre cual es la
forma del anillo de
pirimidina en el intermediario iluro a la hora de llevar a cabo
el primer paso del
ciclo cataltico. Adems se presentan las posibles proyecciones
necesarias para
complementar las hiptesis investigadas.
E
-
Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 42
4.1 Conclusiones
Los resultados de la presente tesis permiten concluir lo
siguiente:
1. La reaccin de formacin del intermediario LThDP ocurre va
un
mecanismo concertado, es decir la carboligacion C2C2y la
transferencia
protnica desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno carbonilico O2 de
la
molcula de piruvato ocurren de forma simultnea.
2. Durante la reaccin el tomo N1 del anillo pirimidnico esta
desprotonado.
3. En todo momento el cofactor ThDP se encuentra estabilizado a
travs de
un fuerte enlace de hidrogeno formado entre el anillo
pirimidnico y el
grupo carboxlico del residuo acido glutmico, a 1.57 ,
estabilizando la
eventual carga negativa sobre el tomo N1.
4. La estructura optimizada del estado de transicin muestra
valores mximos
de los ndices atmicos de Fukui sobre el oxigeno carbonilico de
0.27
comparado con el valor de 0.24 del piruvato aislado, indicando
el aumento
de su carcter nucleoflico como consecuencia del ataque del tomo
C2 del
iluro sobre el carbono C2de la molcula de piruvato. Tambin se
observa
que la funcin de Fukui sobre el tomo C2 est orientada hacia el
tomo
C2del piruvato evidenciando el ataque nucleoflico en curso.
5. La barrera de activacin observada es de 21.87 Kcal/mol en
correspondencia al valor reportado en literatura de 16.21
Kcal/mol.
6. La estructura optimizada del producto LThDP muestra que el
tomo N4
est en su forma imino mientras que el nitrgeno N1 esta
desprotonado.
7. Los resultados adems indican que en los tres medios
considerados la
especie termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno
N1
desprotonado.
8. La participacin del anillo pirimidnico en la forma APH
durante la
reaccin entre el piruvato y el iluro no est avalada por los
clculos
qumicos cunticos de esta tesis.
-
Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 43
4.2 Proyecciones
Con el fin de corroborar el mecanismo de reaccin obtenido,
cuantificar la
estabilizacin otorgada por el ambiente enzimtico en la reaccin
y
principalmente para determinar cul de las dos formas
tautomericas del anillo
de pirimidina es la involucrada en la formacin del intermediario
LThDP, para
el presente trabajo de tesis se proponen como proyecciones:
Realizar simulaciones de dinmica molecular, para encontrar
una
estructura representativa del sitio activo de la enzima. Con los
resultados
de las simulaciones determinar aquellos aminocidos que
aporten
mayor estabilidad al cofactor y a la molcula de piruvato,
mediante
clculos de energas de interaccin.
Con el resultado de la simulacin de dinmica molecular realizar
la
exploracin de la superficie de energa potencial, mediante
clculos
hbridos QM/MM, con la finalidad de incorporar el ambiente
enzimtico en la formacin del LThDP y cuantificar su efecto sobre
el
mecanismo de reaccin propuesto.
-
Bibliografa
Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 4444
Bibliografa
[1] Fersht, A. Estructura y mecanismo de las enzimas. Barcelona:
editorial Revent S.A. 1980. p 35.[2] Pea, Arroyo, Gmez, Tapia.
Bioqumica. Mxico D.F: editorial Limusa. 2004. p 8389. [3]
Dzyaloshinskii, I. E.; Lifshitz, E. M.; Pitaevskii, L. P. Soviet
Physics Uspekhi. 1961. 4 (2): 153176. [4] Alberts, Bray, Hopkins,
Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Introduccin a la biologa
celular. Madrid: editorial medica panamericana S.A. 2006. p
119157.[5] Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Lusick. Biologa
molecular del gen, sexta edicin. Madrid: editorial medica
panamericana. 2008. p 80. [6] Peret, J.; Sendia, R.; Pamblanco, M.;
Bao, C. Fundamentos de bioqumica. Madrid: editorial Universidad de
Valencia. 2007. p 5960. [7] Koshland, D. E. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA. 1958. 44: 98104. [8] Bender, M.
J; Brubacher, L. J. Catlisis y accin enzimtica. Barcelona:
editorial Revent S.A. 1997. p 1930. [9] Devlin, T. M. Bioqumica,
cuarta edicin. Barcelona: editorial Revent S.A. 2004. p 414450.
[10] Nomenclature Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (NCIUBMB). EC2 Transferase
Nomenclature. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC2/. [11]
McCourt, J. A.; Duggleby, R. G. Amino Acids. 2006. 31:173210. [12]
Chipman, D. M.; Barak, Z.; Scholss J. V. Biochimica et Biophysica
Acta. 1998. 1385: 401419. [13] Chipman, D. M.; Duggleby, R. G.;
Tittman, K. Current Opinion in Chemical Biology. 2005. 9: 475481.
[14] Pang, S. S; Duggleby, R. G.; Guddat, L. W. Journal of
Molecular Biology. 2002. 317: 249262. [15] Friedemann, R.; Naumann,
S. Journal of Molecular Structure: Theochem. 2003. 630: 275281.
[16] Lie, M. A.; Schiott, B. Journal of Computational Chemistry.
2007. 29, 7: 10371047. [17] BarIlan, A.; Balan, V.; Tittman, K.;
Golbik, R.; Vyazmensky, M.; Hubner, G.; Barak, Z.; Chipman, D.M.
Biochemistry. 2001. 40: 11946 11954. [18] Delgado, E. J.; Alderete,
J. B.; Jaa. G. A. Journal Molecular Modeling. 2011. 11: 27359. [19]
Singh, B. K; Schmitt, G.K. FEBS Letters. 1989. 258, 1:113115. [20]
Nemeria, N.; Baykal, A.; Joseph, E.; Zhang, S.; Yan, Y.; Furey, W.;
Jordan, F. Biochemistry. 2004. 43: 65656575. [21] Nemeria, N.;
Chakraborty, S.; Balakrishnan, A.; Jordan, F. Journal FEBS. 2009.
276: 24322446. [22] Ti