1 ESTUDIO DE NUEVAS DIANAS TERAPÉUTICAS PARA EL DESARROLLO DE COMPUESTOS NEUROPROTECTORES Investigadores principales: Dr. Rafael Maldonado López Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida UPF Dr. Fernando Rodríguez de Fonseca Hospital Carlos Haya Fundación IMABIS. Málaga Dr. Emilio Fernández Espejo Facultad de Medicina de Sevilla Duración: 3 años
20
Embed
ESTUDIO DE NUEVAS DIANAS TERAPÉUTICAS PARA …statics.ccma.cat/webs/tv3/marato/simposiums/marato2011/cast/Dr... · neurotoxicidad inducida por 6-hidroxidopamina y MDMA. Se utilizará
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
ESTUDIO DE NUEVAS DIANAS TERAPÉUTICAS PARA EL
DESARROLLO DE COMPUESTOS NEUROPROTECTORES
Investigadores principales:
Dr. Rafael Maldonado López
Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida UPF
Dr. Fernando Rodríguez de Fonseca
Hospital Carlos Haya Fundación IMABIS. Málaga
Dr. Emilio Fernández Espejo
Facultad de Medicina de Sevilla
Duración: 3 años
2
3
1. Resumen
Las acil-etanolamidas, anandamida (AEA), oleil-etanolamida (OEA) y
palmitoil-etanolamida (PEA) son endocannabinoides que actúan en los
receptores cannabinoides CB1 (AEA) o del peroxisoma activado por
proliferadores alfa (PPARα) (OEA, PEA). Se han sugerido efectos
neuroprotectores para estos compuestos, dado que se acumulan en el
cerebro después de isquemia o neurotoxicidad, por cuya razón serían
importantes en el control de la supervivencia y plasticidad neuronales. La
neuroprotección inducida por AEA ya ha sido publicada, pero no por OEA o
por PEA. Este proyecto estudiará si estos transmisores modifican la
neurotoxicidad causada por 6-hidroxidopamina en ratas y por MDMA en
ratones normales y genéticamente modificados para anular el gen que
codifica para el receptor PPARα. Específicamente investigaremos si la
administración de OEA/PEA modifica la duración e intensidad de la
neurotoxicidad inducida por 6-hidroxidopamina y MDMA. Se utilizará una
estrategia multidisciplinar para medir diferentes parámetros de toxicidad.
En los estudios comportamentales se evaluarán efectos cognitivos y
motores. Se realizarán correlaciones anatómicas de la neurodegeneración
dopaminérgica para evaluar la expresión de tirosina hidroxilasa y la
inducción de apoptosis. La integridad de la transmisión dopaminérgica se
estudiara midiendo cambios en los transportadores de dopamina y la
inducción de genes pro- o antidegeneración, incluidos el estrés oxidativo y
las enzimas antioxidantes. Los estudios in vitro con cultivos de neuronas
dopaminérgicas se llevarán a cabo para evaluar los efectos protectores de
las acil-etanolamidas. La participación de estos transmisores en los
mecanismos mencionados se verificará mediante métodos farmacológicos.
Así, se desarrollarán nuevos análogos de OEA y PEA, más potentes y
duraderos. El objetivo final de este proyecto es evaluar si estos
intermediarios lipídicos podrían ofrecer nuevas estrategias terapéuticas para
aliviar el daño neuronal.
Los objetivos del proyecto son los siguientes:
4
1. La primera hipótesis es que la oleoil-etanolamida (OEA) y la palmitoil-
etanolamida (PEA) administradas antes de que la neurotoxina 6-
hidroxidopamina (6-OHDA) pueden favorecer la viabilidad o proteger las
neuronas dopaminérgicas de los efectos neurotóxicos en ratas, así como
proteger de la toxicidad cultivos de neuronas mesencefálicas
dopaminérgicas. Los agonistas sintéticos del PPAR-α deberían tener efectos
neuroprotectores similares a los de la OEA y/o la PEA.
2. La segunda hipótesis es que la OEA y la PEA administradas antes que la
neurotoxina 3,4-metilen-dioximetanfetamina (MDMA, éxtasis) pueden
facilitar la viabilidad o proteger las neuronas dopaminérgicas de los efectos
neurotóxicos en ratones. Los agonistas sintéticos del PPAR-α deberían tener
efectos neuroprotectores similares a los de la OEA y/o la PEA. Además, los
animales PPAR-α knock-out deberían presentar una mayor sensibilidad a los
efectos neurotóxicos del MDMA que los ratones de tipo salvaje, mientras
que los efectos neuroprotectores de la OEA y/o la PEA deberían desaparecer
en estos animales modificados genéticamente. Los ratones PPARα knock-out
también serán útiles para identificar el papel de este factor de transcripción
en los efectos neuroprotectores de la AEA, que actúa principalmente en una
diana diferente, el receptor cannabinoide CB1.
3. El perfil farmacológico de la OEA y la PEA se analizará en la expresión
de genes relacionados con la neurodegeneración en el estriado dorsal y el
mesencéfalo ventral de ratas y ratones tratados con OEA/PEA antes de la
administración de una dosis neurotóxica de 6-OHDA o de MDMA. El
estudio se llevará a cabo mediante análisis del genoma completo seguido
por PCR cuantitativa en tiempo real de los genes candidatos. Además, la
expresión de proteínas de los genes candidatos seleccionados será
estudiada en el estriado dorsal y el mesencéfalo ventral de ratas o ratones
tratados con OEA/PEA antes de la administración de una dosis neurotóxica
de 6-OHDA o MDMA. Si fuese necesario, también se realizará un Western
blot, así como immunohistoquímica.
4. Se diseñarán y sintetizarán nuevos análogos de la acil-etanolamida
basados en estructuras de sulfamoil. La capacidad de estos nuevos
5
compuestos de regular la expresión génica mediante la activación de los
receptores PPAR-α será validada in vitro y serán ensayados como
neuroprotectores utilizando las técnicas descritas en los objetivos 1 y 2.
2. Resultados
Los principales resultados obtenidos para alcanzar los diferentes objetivos
se describen a continuación.
Objetivo 1. Efectos neuroprotectores de la oleoil-etanolamida y la
palmitoil-etanolamida frente a la 6-OHDA (subproyectos 1 y 3 )
La eficacia neuroprotectora potencial de la administración sistémica de
OEA ha sido ensayada in vivo y en modelos de Parkinson con 6-OHDA
(ratas) y de degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la substantia
nigra inducida por MPTP (ratones). Los resultados de los estudios in vivo en
ratas revelaron que la administración periférica de la acil-etanolamida OEA
(0,5, 1 y 5 mg/kg) viene seguida de un rápido paso de la barrera
hematoencefálica y por una rápida eliminación del compuesto. Los estudios
funcionales indicaron que todos los déficits funcionales se redujeron en los
animales tratados con la OEA (5 mg/kg). Además, la reducción de la
densidad inmuno-rreactiva de la tirosina-hidroxilasa del estriado y de la
substantia nigra inducida por 6-OHDA (TH-ir), así como la expresión de
sinaptofisina en el estriado, fueron significativamente antagonizados por la
OEA (5 mg/kg). La respuesta oxidativa a la lesión de la toxina en el
estriado, medida como expresión de la hemooxigenasa-1, también se
redujo tras la administración de la OEA (5 mg/kg). En resumen, la OEA
atraviesa la barrera hematoencefálica tras la administración sistémica y,
dependiendo de la dosis, protege el circuito estriado de la toxicidad inducida
por 6-OHDA. Los ratones C57BL/6 de tipo salvaje y PPAR-α knock-out
convertidos en parkinsonianos mediante una dosis tóxica de MPTP (40
mg/kg) que induce la muerte celular del 70-80% en la substantia nigra,
fueron tratados con OEA sistémica (0, 0,5, 1, y 5 mg/kg) antes y después
de la administración de MPTP. La OEA (5 mg/kg) redujo significativamente
la pérdida de TH-ir en el estriado y la muerte celular nigral. Curiosamente,
6
este efecto neuroprotector de la densidad de TH en estriado, pero no del
número de células dopaminérgicas nigrales, también se encontró en ratones
PPAR-α knock-out, sugiriendo por tanto que los efectos protectores de la
OEA en el estriado dorsal no están mediados por su acción agonista sobre
los receptores PPAR-α. En resumen, la OEA (5 mg/kg) sistémica ejerce
efectos neuroprotectores parciales en los animales parkinsonianos, tanto en
modelos con 6-OHDA como con MPTP, y el efecto en el estriado no parece
estar mediado por los receptores PPAR-α (Galán-Rodríguez et al.,
Neuropharmacology, 2009).
También se llevaron a cabo estudios in vitro de los efectos de la acil-
etanolamida OEA en células cultivadas después de la inducción de estrés
oxidativo mediante 6-OHDA en las neuronas dopaminérgicas primarias y
células cromafinas extraadrenales. Los efectos protectores fueron medidos
por los ensayos de la lactato-deshidrogenasa (LDH) y el bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólico (MTT). La OEA (0,5 y 1 µM)
administrada antes y después de la toxina ejerce, de forma significativa,
efectos neuroprotectores sobre las neuronas cultivadas. Sin embargo, la
OEA administrada antes de la 6-OHDA fue ineficaz, pero suministrada
después de la 6-OHDA (OEA 1 µM) resultó efectiva. Los efectos de la OEA
siguieron unas curvas de dosis-respuesta en forma de U. Este tipo de
respuesta podría indicar una toxicidad debida a la elevada concentración del
fármaco o que se activan vías intracelulares opuestas con dosis de los
fármacos diferentes. Los efectos protectores inducidos por la OEA fueron
abolidos después de la adición de dosis bajas de capsaicina, agonista de los
receptores TRPV1 (0,1 a 1 µM), o del inhibidor de la adenilato ciclasa MDL-
12,330A (1 y 10 µM), pero no mediante la adición de GW6471, bloqueador
del receptor PPAR-α. Estos resultados sugieren que los efectos protectores
de la OEA sobre las neuronas dopaminérgicas son mayoritariamente
mediados por el bloqueo de los receptores TRPV1 y la activación de la vía
del AMPc. En otra serie experimental, las propiedades de protección in vitro
de la PEA y el WY14643, un agonista selectivo de los receptores PPAR-α, se
evaluó en neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra y células
cromafinas extraadrenales noradrenérgicas utilizando un método similar al
descrito anteriormente. La PEA tiene efectos neuroprotectores en las células
de la substantia nigra en el ensayo de la LDH en todas las dosis probadas
7
(0,5, 1 y 5 µM), aunque sólo la dosis de 5 µM de PEA fue eficaz en el
ensayo del MTT. El WY14643 no induce efectos neuroprotectores en estos
ensayos cuando se administra a dosis de 1, 5 y 10 µM. Estos datos indican
que la PEA induce efectos neuroprotectores sobre las neuronas
dopaminérgicas como lo hace la OEA, aunque el agonista del PPAR-α
WY14643 no tiene estos efectos protectores (Galán-Rodríguez et al.,
Neuropharmacology, 2009).
Además, estábamos interesados en discernir si las neuronas
dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc) se ven
afectadas en los ratones PPAR-α knock-out y si los efectos tóxicos inducidos
por MPTP se han modificado en estos ratones mutantes. En primer lugar, los
datos revelaron que los ratones PPAR-α knock-out presentaron un SNpc
reducido en comparación con los ratones de tipo salvaje, tanto en volumen
como en número de neuronas dopaminérgicas. Este resultado sugiere que
los receptores PPAR-α son necesarios para proteger las neuronas
dopaminérgicas nigrales del daño oxidativo normal. La parte lateral de la
SNpc fue la más dañada en los ratones PPAR-α knock-out. A nivel
bioquímico se encontró una disminución significativa de las moléculas
antioxidantes en el SNpc de ratones knock-out, lo que podría explicar la
reducción de la protección contra el daño oxidativo normal. Como era de
esperar, el MPTP causó un rápido inicio de Parkinson en ratones de tipo
salvaje, vinculado a una fuerte reducción en el número de neuronas
dopaminérgicas de la substantia nigra (74%). Sin embargo, los ratones
PPAR-α knock-out eran más resistentes que los ratones de tipo salvaje al
MPTP, ya que este tóxico indujo una reducción menos intensa de las
neuronas dopaminérgicas nigrales (36%). El MPTP indujo un aumento del
óxido nítrico en la substantia nigra pars compacta en ratones de tipo
salvaje, pero la producción de óxido nítrico se redujo en los ratones knock-
out, lo que sugiere que la falta de receptores PPAR-α baja la actividad de la
sintasa del óxido nítrico y la producción de óxido nítrico después del
tratamiento con MPTP (González-Aparicio et al., Neuroscience, 2011).
La participación de los receptores PPAR-α en la sensibilización motora
producida por la morfina y la cocaína también fue investigada en ratones
PPAR-α knock-out y mediante el uso de un agonista selectivo de PPAR-α,
8
WY14643. Los resultados encontrados en ratones indican que el PPAR-α
desempeña un papel inhibidor en la expresión, pero no en la inducción, de
la sensibilización motora a la morfina. Sin embargo, la sensibilización a la
cocaína no se modificó en estos ratones mutantes, lo que sugiere que este
receptor nuclear participa en la activación motora de los opiáceos, pero no
de los psicoestimulantes. Además, la expresión del PPAR-α en cerebro fue
aumentada con la dosis más alta de la administración repetida de morfina,
pero no crónica de la cocaína, lo que sugiere que este receptor podría
desempeñar un papel compensatorio para mantener la homeostasis en la
administración crónica de opioides. Conforme a esto, el WY14643 sistémico
bloqueó la sensibilización a la morfina, confirmando que el PPAR-α
desempeña un papel compensatorio oponiéndose a la sensibilización motora
inducida por la morfina, probablemente a través de una reducción de los
cambios asociados con la inflamación (Fernández-Espejo et al.
Neuroscience, 2009)
También se ha estudiado la distribución anatómica de los receptores
PPRA-α en áreas del cerebro de rata relacionadas con la transmisión
dopaminérgica, así como la expresión de genes específicos relacionados con
la transmisión dopaminérgica y la neuromodulación para acil-etanolamidas
por PCR en tiempo real. El análisis de los efectos de la OEA en el cerebro de
rata se está realizando y comparando con los de las ratas tratadas con 6-
OHDA. Se ha demostrado la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
en la PEA y la OEA (Plaza-Zabala et al., Synapse 2010). Finalmente se han
estudiado los posibles cambios inducidos por la administración sistémica de
la OEA en las redes de neuropéptidos diencefálicos (Serrano et al.
Neurofarmacología 2011). Este estudio reveló que la OEA induce cambios
sustanciales en las señales periféricas que se dirigen al hipotálamo, que
parecen desempeñar un papel más importante que el efecto directo sobre
las neuronas peptidérgicas del hipotálamo.
Objetivo 2. Neuroprotección frente a la neurotoxicidad inducida por