Luis Alejandro Barrera Ph.D. Director Instituto Errores Innatos del Metabolismo Universidad Javeriana. Bogotá ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del Diagn METABOLISMO. Del Diagn ó ó stico a las alternativas stico a las alternativas terape terape ú ú ticas ticas
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ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del Diagnóstico … · 2011. 2. 28. · ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del Diagnóstico a las alternativas terapeúticas.
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Luis Alejandro Barrera Ph.D.Director Instituto Errores Innatos del Metabolismo
Universidad Javeriana. Bogotá
ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del DiagnMETABOLISMO. Del Diagnóóstico a las alternativas stico a las alternativas
•• 50 de las 72 (20.8%) 50 de las 72 (20.8%) TransiciTransicióón (Cn (C------G)G)
MATERIALES Y METODOS:MATERIALES Y METODOS:POBLACIONES DE ESTUDIOPOBLACIONES DE ESTUDIOSABOYA
PAUNA
VIEJO CALDAS
MEDELLIN
DIAGNOSTICO
•Estudios moleculares:
PCRs , PCRs largos
•Fragmentos 14 Exones
F1------ Exon 1------------- 200 pb
F2------ Exon 2, 3, 4------- 2.0 kb
F3-1--- Exon 5,6,7,8------- 2.7 kb
F3-2--- Exon 9-------------- 3.0 kb
F4------ Exon 10,11,12 ---- 5.0 kb
F5------ Exon 13, 14-------- 3.7 kb
R386C/?SeveroM16
R386C/R386CSeveroF15
A75G/A75GSeveroM14
A75G/A75GSeveroF13
G301C/G301CSeveroF12
G301C/G301CSeveroM11
S162F/?SeveroF10
G301C/?SeveroM9
S162F/S162FSeveroM8
S162F/S162FSeveroM7
G301C/G301CSeveroM6
G301C/G301CSeveroF5
F69V/?SeveroM4
G301C/G301CSeveroF3
G301C/G301CSeveroM2
G301C/G301CSeveroM1
GenotipoFenotipoGéner
oPaciente
GenotipoGenotipo de de loslos pacientespacientes colombianoscolombianos con MPS IVAcon MPS IVA
Pares de pacientes con fondo gris son hermanos
0.1540.154??
0.1150.115R386CR386C
0.0380.038F69V/F69V/
0.0770.077A75GA75G
0.1150.115S162FS162F
0.5000.500G301CG301C
FrecuenciaFrecuenciaMutacionMutacion
FrecuenciaFrecuencia de de laslas mutacionesmutaciones
Kato et al, 1997 Human Genetics
Tomatsu et al, 2004 Human Genetics
GAUCHER TIPO 1GAUCHER TIPO 1
Inicialmente, el paciente Inicialmente, el paciente presenta un severo presenta un severo envolvimiento hepenvolvimiento hepáático y tico y esplespléénico. Ilustracinico. Ilustracióón:paciente n:paciente postesplenectomizado. postesplenectomizado. El hEl híígado ocupa toda la gado ocupa toda la cavidad abdominal.cavidad abdominal.Desarrollo de brazos en forma Desarrollo de brazos en forma de arco, debido al compromiso de arco, debido al compromiso óóseo.seo.Los signos de enfermedad Los signos de enfermedad progresiva rprogresiva ráápida son mas pida son mas comcomúúnmente observados en nmente observados en niniñños.os.
GAUCHER TIPO 2GAUCHER TIPO 2
VisceromegaliaVisceromegaliaEstrabismoEstrabismoPulgares corticalesPulgares corticalesRetroflexionRetroflexion del cuellodel cuelloCaquexiaCaquexiaFalla para medrar.Falla para medrar.
GAUCHER TIPO 3GAUCHER TIPO 3
PresentaciPresentacióón tn tíípica de pica de manifestaciones severas a manifestaciones severas a temprana edad.temprana edad.Agrandamiento visceral Agrandamiento visceral masivo.masivo.Desarrollo progresivo Desarrollo progresivo retardado.retardado.
NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES EN ENFERMEDAD DE GAUCHEREN ENFERMEDAD DE GAUCHER
DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutaciones masmasfrecuentementefrecuentemente encontradasencontradas en en otrasotraspoblacionespoblaciones (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutacionesmasmas comunmentecomunmente halladashalladas en la en la poblacipoblacióónnEspaEspaññolaola. (G377S, T134P y 1451delAC).. (G377S, T134P y 1451delAC).DeterminarDeterminar la la existenciaexistencia de de nuevasnuevas mutacionesmutacionesusandousando SSCP y SSCP y secuenciacisecuenciacióónn..HacerHacer laslas correlacionescorrelaciones genotipogenotipo--fenotipofenotipo
Anormalidades Anormalidades exonexon 66
Gen Gen GBAGBA y Sus Mutaciones y Sus Mutaciones
Mutaciones causantes de la EGCerca de 200 mutaciones hasta ahora reportadas en el gen GBA
85% Mutaciones puntuales
15% Inserciones, Deleciones y Alelos Complejos
N370S = 5841A-GL444P = 6433T-C D309H = 5957G-C
84insGGRecNciI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
I II III IV V VI VII VIII IX X
5’ 3’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
I II III IV V VI VII VIII IX X
5’ 3’
7 kb 16 Kb 5 Kb
5’ 3’GBAGBA GBAP GBAP 1q21
Resultados Resultados
Frecuencia de Mutaciones en Frecuencia de Mutaciones en el gen el gen GBAGBA en 26 pacientes en 26 pacientes
ColombianosColombianos
1,00Total
0,06Sin identificar
0,02898 del G
0,02G195W
0,04E236K
0,04Y313H
0,06D380H
0,06K198E
0,06RecNciI
0,08595-96 del CT
0,12L444P
0,44N370S
FrecuenciaMutación
Alelos totales esperados = 52
Total alelos N370S = 23
19 pacientes Heterocigotos
N370S
2 pacientes Homocigotos
N370S
18
15
Total Pacientes Analizados 17Total Pacientes Analizados 17
GBA →h = 0,767
Objetivos Objetivos GeneralGeneral
Identificar cuáles de los alelos de cinco marcadores moleculares de la región 1q21 están asociados con mayor significancia a la mutación N370S en el gen de la β-Glucosidasa Ácida en el grupo de pacientes colombianos con EG.
EspecEspecííficosficos
Establecer las frecuencias de los alelos encontrados para el locus GBA junto con su heterocigosidad (h), en el grupo de pacientes colombianos con Enfermedad de Gaucher.De igual modo, determinar las frecuencias alélicas, en el grupo de pacientes, de cinco de los microsatélites cercanos al gen GBA.
Determinar cuáles de los distintos alelos de los marcadores estudiados en los pacientes se han heredado junto con las mutaciones causantes de la EG, especialmente la mutación mas frecuente, e inferir los haplotipos correspondientes
Estimar por medio de análisis estadístico el Desequilibrio de Ligamiento entre cada uno de los alelos de los cinco loci microsatélites estudiados y la mutación del gen GBA con mayor frecuencia en el grupo de pacientes colombianos con EG.
La asociación 201-N370S tuvo lugar hace 18.8 generaciones,
esto es hace 470 aproximadamente
RecomendacionesRecomendaciones
Determinar la fase gamética para los ocho cromosomas N370S colombianos que no fueron incluidos en el análisis de Desequilibrio deLigamento y estudiar de manera similar los pacientes recientemente diagnosticados, portadores de la mutación N370S.
Ampliar los haplotipos N370S con al menos un STR mas de la región conservada, localizado a una distancia similar del locus D1S2777 y los polimorfismos localizados en el interior del locus GBA de modo que estos puedan ser comparables con los cromosomas N370S de otras poblaciones.
Una vez obtenido el número máximo posible de haplotipos N370S, llevar a cabo un nuevo análisis de Desequilibrio de Ligamento y emplear las herramientas de coalescencia que permitan datar con mayor certeza la mutación N370S colombiana.
Incluir a la mutación colombiana, 595-96 del CT en un estudio como el que se ha llevado a cabo hasta ahora con la mutación N370S
SINTOMATOLOGÍA
•FASCIES TOSCAS
•DISOSTOSIS MULTIPLE
•ANORMALIDADES ESQUELÉTICAS
•HEPATOESPLENOMEGALIA
•OPACIDAD CORNEAL
•ENFERMEDAD DEL MIOCARDIO
•HIPERTENSIÓN PULMONAR
•ALTERACIONES DE SNC
Iduronato 2-sulfato sufatasa 550 aminoacidos
Modelo de predicción de estructura terciaria de la GALNS
Ubicación (con relación al sitio activo) de 15 mutaciones estudiadas
Todas las mutaciones que se encuentran en regiones conservadas, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo severo.
A291D
Todas las mutaciones que se encuentran en regiones alejadas del sitio activo, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo interemedio o leve.
G247D
Expresion de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en E. coli
Vector: pUC13-IDS
-Células E. coli JM109 competentes-Transformación en E. coli JM109 -Amplificación-Purificación-Verificación por corte con enzimas de
restricción,-Induccion de la expression en medio
adecuado
Transformación
Escherichia coli
Pichia pastoris
Levaduras:
Línea 1: P. pastoris nativa,Línea 2 a 5, P. pastoris/IDS28 a las 0, 24, 48 y 72 horas.
Western blot para la Iduronato 2-sulfato sulfatasa humana recombinante expresada en P. pastoris/IDS28.
Expresión de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en Pichia pastoris
Sulfamidasa Lisosoma Heparán sulfato Sanfilipo A (MPS IIIA)
Sulfatase 1 (KIAA 1077) No conocido No conocido No conocido
Sulfatase 2 No conocido No conocido No conocido
VENTAJAS PRODUCCIVENTAJAS PRODUCCIÓÓN N IgYIgY
Distancia Distancia FilogenFilogenééticatica entre aves y entre aves y mammamííferos: alta producciferos: alta produccióón de anticuerpos.n de anticuerpos.No hay sacrificio del animalNo hay sacrificio del animal1 Huevo puede producir 11 Huevo puede producir 1--10mg/ml de 10mg/ml de IgYIgYespecespecíífico.fico.No presentan reactividad cruzada con No presentan reactividad cruzada con IgGsIgGsde mamde mamííferosferos
TTéécnica de Dotcnica de Dot--blot. Se utilizaron los anticuerpos extrablot. Se utilizaron los anticuerpos extraíídos dos de yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencide yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencióóel reconocimiento de la proteel reconocimiento de la proteíína IDS por parte de los na IDS por parte de los anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control positivo). CN (Control negativo).positivo). CN (Control negativo).
ELISA ELISA ““SANDWICHSANDWICH””
00.5
11.5
22.5
33.5
1/200 1/800 CP
Diluciones anticuerpo
ELISA INDIRECTA IgY A2
Las placas fueron sensibilizadas con antLas placas fueron sensibilizadas con antíígeno (IDS) a una geno (IDS) a una concentraciconcentracióón de 1.7n de 1.7µµg/ml y se realizaron diluciones dobles g/ml y se realizaron diluciones dobles
seriadas de los Anticuerpos A2 seriadas de los Anticuerpos A2