Estructura de aminocidos y precipitacin de casena. Erika
Patricia Caicedo Yela1, Tatiana Patricia Valencia Murcia2
1Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniera y
Administracin. Programa de Ingeniera Ambiental, 2Departamento de
Ciencias, Facultad de Ingeniera y Administracin. Programa de
Ingeniera Ambiental. Laboratorio de Bioqumica, Departamento de
Ciencias Bsicas, Facultad de Ingeniera y Administracin, Universidad
Nacional de Colombia Sede Palmira.
Marzo 14 de 2015
Resumen
Las soluciones que contengan protenas, en el caso de la prctica
elaborada la leche y su protena la casena, se someten a
procedimientos en los que mediante ciertos reactivos podemos
evidenciar los conceptos de pH Isoelctrico, desnaturalizacin,
presencia de calcio, presencia de carbohidratos, presencia de
protenas o presencia de rivoflavina, entre muchas otras que
manifiestan las propiedades con las que cuenta la solucin y la
protena en cuestin.
Introduccin
Bien es sabido que las protenas son polmeros de aminocidos
entrelazados por enlaces peptdicos entre el grupo carboxilo de un
aminocido y el grupo amino de otro. Dichos enlaces son covalentes,
por lo que poseen la caracterstica de ser muy fuertes.Las
sustancias en las cuales estn inmersas las protenas son muchas
veces complejas; sin embargo, a pesar de esto es posible separarlas
mediante desnaturalizacin de la protena. Para desnaturalizar una
protena simplemente vasta con adicionar cualquier factor que
modifique la interaccin entre sta y el solvente, haciendo que
disminuya la estabilidad de la solucin y por tanto induciendo la
precipitacin de la protena ya desnaturalizada.Una forma de
desnaturalizar una protena para precipitarla es alcanzar el
denominado pH Isoelctrico de la misma, el cual se logra cuando se
llega a una carga neta de cero que se evidencia mediante la
precipitacin de la protena que posteriormente se separa de los
lquidos sobrantes que contienen las dems sustancias.Las protenas de
la leche, por ejemplo, pueden separase mediante este mtodo; as
pues, una de ellas, la Casena cuenta con un pH Isoelctrico de 4,7,
as que al cambiar el pH de la solucin hasta 4,7, para lo cual se
adiciona una sustancia cida, se consigue que la casena se
precipite.
Materiales y mtodos
Parte 1: Extraccin de la Casena:
MaterialesMtodos
ReactivosMateriales
50mL de LecheVaso de precipitados
cido Actico 2MAgitador
Medidor de pH
En el vaso de precipitados agregar la leche, calentar a
aproximadamente 40C y dejar reposar. Adicionar gota a gota cido
actico hasta que el pH sea 4,7, filtrar el precipitado y secar.
Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas:
MaterialesMtodos
ReactivosMateriales
3mL Suero de leche2 tubos de ensayo
Casena
2mL Agua
Reactivo de Biuret
Disponer el suero de leche en un tubo de ensayo y la casena en
el otro, a esta ltima agregarle el agua.Calentar al bao de mara.
Adicionar el reactivo y observar la coloracin.
Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato
lactosa:
MaterialesMtodos
ReactivosMateriales
Reactivo de Fehling A1 Tubo de ensayo
Reactivo de Fehling B
1mL de Suero de leche
Colocar 0.5mL de reactivo Fehling A y 0.5mL de reactivo Fehling
B y calentar al bao de mara por 2 minutos. Agregar el suero de
leche.Calentar nuevamente y observar la formacin de un precipitado
rojizo.
Parte 4: Determinacin de la presencia de Calcio:
MaterialesMtodos
ReactivosMateriales
1mL Suero de leche1 Tubo de ensayo
Oxalato de disolucin de amonio al 4%
Disponer el suero de leche en el tubo de ensayo y aadir 3 gotas
de oxalato de disolucin de amonio al 4%.Observar la formacin de un
precipitado blanco
Parte 5: Determinacin de la presencia de riboflavina en la
leche:
MaterialesMtodos
ReactivosMateriales
2mL de Suero de leche1 Tubo de ensayo
Luz Ultravioleta
Colocar 2 mL de suero de leche en un tubo de ensayo, luego, con
cuidado acercar el tubo a una fuente de luz ultravioleta y
observar.
Resultados y Anlisis.
Parte 1: Extraccin de Casena
Tabla 1: cambio de pH de la leche a 40 C al aadir cido
actico.
Gotas de cido Actico 2MpH
106
205.8
305.3
404.7
Peso del papel sobre el que se deposita la casena = 1,4grPeso
total del papel y la casena = 7,6gr
Peso Casena = 6,2gr
Despus de que se llega al pH 4.7 en el cual la protena casena se
desnaturaliza y se precipita, se procedi a la filtracin del
producto por medio de separacin del suero de leche y posteriormente
se realiz secado de la casena. El paso en el cual se lavaba el
precipitado con 20mL de Etanol y ter etlico en mezcla 1:1 fue
omitido del procedimiento. Se puede observar que aunque quien
realiza el experimento trate de recoger totalmente la Casena y
separarla correcta y totalmente del suero de leche, pequeos restos
de esta an permanecen en el suero de leche.
Adems del anterior hecho se observ que pequeas cantidades de la
protena se perdan o separaban de la masa compacta de casena, muchas
se lograban recuperar, pero otras quedaban unidas a las toallas y
pasaban desapercibidas para quien realizaba el experimento.
Los hechos anteriores provocan que cambie el peso de la casena y
por lo cual no se sepa con exactitud la masa total de casena
presente en el volumen de leche usado para el experimento; el
resultado de masa que se logra obtener es aproximado a la cantidad
de protena que se logra recolectar.
Tambin es importante destacar que el proceso de secado de la
protena mediante toallas no permite expulsar en su totalidad el
suero de leche, aunque se seque lo ms posible esta antes de su
pesaje, aun despus de finalizado el experimento an segua la protena
eliminando suero.
Tambin hay que tener en cuenta otra anomala o error que podra
presentarse al momento de obtener la masa correspondiente a la
presencia de Casena en el volumen dado de leche, y es el margen de
error que presenta la balanza utilizada para medicin, a fallas de
calibracin del instrumento y en general a fallidas mediciones del
realizador del experimento.
En resumen, cuando se alcanza el punto isoelctrico de la casena
se neutralizan sus cargas, lo cual impide que esta
protenainteractuecon las dems molculas presentes en la solucin. Al
no interactuar con alguna otra molcula, la protena termina
precipitndose, lo que hace fcil su aislamiento del resto de la
solucin. Pero en este punto es importante considerar que la casena
es la nica protena de la leche que alcanza su punto isoelctrico a
un pH de 4.8, lo que garantiza que es la nica protena que se est
aislando.
Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas.
Tabla 2: Cambios fsicos y observaciones durante el
experimento.
Tubo de ensayo con suero de leche y R. de Biuret.Tubo de ensayo
con casena + 2mL de agua y R. de Biuret.
Se observa la formacin del precipitado
La mezcla se torna de un leve tono violeta/morado muy tenue.
Se observa la formacin de precipitado pero en este tubo fue en
menor cantidad.
La mezcla se torna de un leve tono violeta/morado an ms tenue
que el del otro tubo.
Para esta prueba se usa reactivo de Biuret, el cual contiene
CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o
KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color
violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre
los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. As pues la
prueba da positiva puesto que ambas cuentan con presencia de
protenas.
REACCION CON BIURET
Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato
lactosa.
El resultado de la prueba fue fsicamente la formacin de un
precipitado rojizo y visiblemente la mezcla se torn amarillo
anaranjado tendiendo a rojo, siendo una prueba positiva para el
carbohidrato en cuestin.
Para explicar esto se debe tener en cuenta que los reactivos de
Fehling son usados para identificar la presencia de azucares
reductores mediante un mecanismo en el que el catin cprico Cu++
reacciona con el azcar pasando a xido cuproso que se refleja
mediante un precipitado rojizo. De esta manera, nuestra prueba da
positivo debido a que la lactosa, protena que se quiere
identificar, es un disacrido formado por glucosa y galactosa. La
galactosa no tiene carcter reductor pero la glucosa si, por lo cual
la lactosa tiene caracterstica de azcar reductor.
Parte 4: Determinacin de la presencia de calcio.
El tubo de ensayo dispuesto en su interior con 1mL de suero de
leche al cual se agregaron 3 gotas de Oxalato de amonio al 4% se
torn blancuzco al instante, su coloracin blanca da como resultado
una prueba positiva, lo cual significa la presencia de calcio en la
mezcla en cuestin.
El Oxalato de Amonio ((NH4)22C2O4) en contacto con un compuesto
que contenga calcio reacciona dando lugar a Oxalato de Calcio
(CaC2O4), de ah que se obtenga un precipitado blanco ms otros
productos de la reaccin, que determina una prueba positiva para
Calcio.
OXALATO DE AMONIOOXALATO DE CALCIO
Parte 5: Determinacin de riboflavina en la leche.
Estructura de la riboflavinaFuente: Es.wikipedia.org
En la presente prueba se dispuso en un tubo de ensayo 2mL
aproximadamente de suero de leche, posterior a esto se apagaron las
luces del laboratorio y se acerc a la muestra una lmpara
fluorescente de luz negra que emite luz ultravioleta (la longitud
de onda lo determina el equipo que haya sido usado), al acercar
dicho artefacto al tubo el contenido del mismo se torn de un color
reflexivo verdoso fluorescente con el cual se concluye fue una
prueba positiva a la presencia de riboflavina en el suero de leche
extrado.
La fluorescencia se puede explicar desde varios ngulos.
Inicialmente hay que mencionar ciertas caractersticas de la
riboflavina, esta es una vitamina hidrosoluble conformada
bsicamente por un grupo de 3 anillos, dos de los cuales son
heterocclicos, y estos a su vez estn unidos a una cadena lineal
ribosa, la fluorescencia se asocia en este caso y en general en las
flavinas (grupo de bases nitrogenadas que poseen pigmentos
amarillos fluorescentes cuando se encuentran oxidadas) se debe a la
gran cantidad de dobles enlaces presentes en la riboflavina y adems
a las diferentes estructuras que se producen debido al movimiento
de los electrones dentro de las estructuras cclicas, los cuales
actan en resonancia con los dobles enlaces externos con el
oxgeno.
Cuestionario
1. Cmo pueden clasificarse los aminocidos? Examine las
caractersticas comunes de cada grupo, compare los diferentes
radicales de cada aminocido y familiarcese con su estructura.
Segn Bohinski (1991) la clasificacin a la que podemos llegar
segn las caractersticas del grupo R de los aminocidos esta
inicialmente constituida por aquellos que son neutros (no presenta
carga, es decir, no puede ionizarse), los que son cidos (se puede
cargar negativamente-cido de Brnsted) y los que son bsicos (se
pueden cargar positivamente-base de Brnsted)
Tabla 3. Carcter de ionizacin de los grupos R de los
aminocidos.
Otra clasificacin que nos aporta este autor es la que toma en
cuenta la polaridad de los grupos R, que determina, entre otras
caractersticas, la afinidad con el agua, para la que se tiene la
siguiente tabla:
Tabla 4. Carcter polar de los grupos R de los aminocidos.
Sin embargo, hay una clasificacin ms especfica para los
aminocidos, basada en la composicin qumica de los grupos R, la cual
arroja siete grupos, as:
Tabla 5. Clasificacin determinada por composicin qumica de los
grupos -R
Alifticos
Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina (tambin podra
incluirse la Prolina)
Hidroxilados
Serina Treonina (podra incluirse la Tirosina)
Sulfurados
Cistena Metionina
Aromticos
Fenilalanina Tirosina Triptfano (podra incluirse la
Histidina)
cidos (y su amida correspondiente)
Acido asprtico Asparagina Acido Glutmico Glutamina
Bsicos
Arginina Histidina Lisina
Imnicos
Prolina
A continuacin se presentan las estructuras de los 20 aminocidos
para familiarizarnos con sus grupos R y comprender el porqu de sus
clasificaciones:
2. Qu se entiende por pH o punto isoelctrico de un aminocido o
una protena? Por qu, en dicho punto, las especies precipitan? Qu es
lo que permite que los aminocidos acten como reguladores de pH de
los fluidos biolgicos?
Por pH Isoelctrico o punto Isoelctrico se entiende como el pH al
cual la carga neta del aminocido o de la protena es cero, es decir
donde la concentracin del Zwitterin es mxima por lo que la
concentracin de especies protonadas y desprotonadas se iguala.En el
punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas
positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima
posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad, esto
se justifica debido a que las molculas que estn cargadas igual se
repelen entre s, y as forman una dispersin estable en el agua. La
eliminacin de la carga elimina la fuerza repulsiva y permita
interactuar a las molculas entre si y precipitar en la mayora de
los casos.Los aminocidos tienen carcter anftero, es decir, pueden
ceder protones y tambin captarlos, gracias a que cuentan con el
grupo amino y el grupo carboxilo. A pH fisiolgico, el cido
carboxlico existe como in carboxilato (COO-) con una carga negativa
y el grupo amino existe como in NH3 +. Cuando el pH es cido, el
grupo carboxilo ocupa el exceso de iones de hidrgeno para volver de
nuevo a la forma de cido carboxlico. Si el pH se vuelve alcalino,
se produce una liberacin de un protn desde el in NH3 +, que toma la
forma de NH2. As vemos como esa capacidad de captar o ceder
protones le confiere a los aminocidos la caracterstica de ser
amortiguadores del pH.
3. Experimentalmente, Cmo diferenciara usted entre un aminocido
aromtico y otro que no lo es? Indague al respecto y disee un breve
protocolo de laboratorio para la respectiva experimentacin.
Reaccin Xantoproteica
La reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico con acido
ntrico, produciendo derivados del nitrobenceno de color amarillo.
Estos derivados amarillos se tornan anaranjados a la alcalinidad de
la solucin con o NaOH. En las condiciones de la reaccin la
fenilalanina es difcil de nitrar por cuanto se requiere la
presencia de un catalizador.
Materiales: 4 tubos de ensayo Pipeta Triptfano 0.1% Metionina
0.1% Albumina de huevo al 1% Solucin problema
Procedimiento
1. Tomar cuatro tubos de ensayo
2. Colocar 1mL de cada aminocido en tubos de ensayo
diferentes
3. Agregar a cada tubo de ensayo 0.5mL de concentrado en cada
tubo
4. Calentar al bao de mara los tubos por 10 minutos usando la
campana de extraccin
5. Retire los tubos de ensayo y djelos enfriar a temperatura
ambiente
6. Observe la coloracin, la prueba es positiva para aromticos si
se presenta una coloracin de color amarillo.
NOTA: si se desea comprobar la veracidad del experimento se
puede continuar desde el punto 6 con esto.
7. Agregue lentamente 1mL de o de NaOH concentrado en la campana
de extraccin.
8. Observe el cambio de coloracin de amarillo a anaranjado en la
interfase.
Conclusiones
Los Aminocidos los compuestos orgnicos que debido a la presencia
de dos grupos funcionales presentan caractersticas anfipaticas,
esto les atribuye caractersticas qumicas muy diversas en las cuales
influye, el pH de sus dos grupos funcionales, el tamao del R, la
complejidad de la estructura. Adems, tiene gran importancia el
medio en el que se encuentre el aminocido, ya que dependiendo de
este el aminocido puede tender a generar estructuras inicas.
Conociendo el punto isoelctrico de una determinada molcula
antiptica, es posible aislarla. Por lo que alcanzando elpunto
isoelctrico de la casena, esta se precipita, lo que hace posible su
aislamiento del resto de la leche.
Es posible el aislamiento de la casena de la leche utilizando la
poca solubilidad que esta protena tiene cuando se lleva hasta su
punto isoelctrico y la rapidez de sedimentacin de la misma.
La leche es una mezcla de protenas, lpidos y glcidos en un medio
acuoso (coloide en el que la grasa es la partcula dispersa y el
agua es el medio dispersante), dichas molculas pueden ser aisladas
teniendo en cuenta su punto isoelctrico y sus caractersticas
qumicas.
Referencias Bibliogrficas
1. Annimo. Quimitube. El Comportamiento Acido-Base de los
Aminocidos. Recuperado de:
http://www.quimitube.com/el-comportamiento-acido-base-de-los-aminoacidos.
Consultado el 14 de febrero de 2015
2. Bohinski, R., Bioqumica, Quinta Edicin, editorial Pearson
Educacin, Mxico, 1991, Pg. 63-75
3. Calvo, Miguel. Bioqumica de los alimentos. Riboflavina.
Recuperado de:
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html
Consultado: 14 de marzo de 2015
4. Hicks, Juan. Bioqumica, segunda edicin, editorial Mc Graw
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