1 2010 1 Farbstoffe und Färbungen Farben, Biologisches Material Esther Osterwalder Esther Osterwalder / 2010 2 Mögliche Darstellung von Strukturen, Krankheiten Braune Käppchen bei den Zellkernen (Virusproteine) Orcein Hepatitis-B-Antigen Blaue, kurze, kommaförmige Stäbchen Giemsa C Helicobacter pylori Rostrot bis grünbraun Rhodanin Kupfer LM: lachsfarbig Polar.: apfelgrün Kongorot Amyloidose Fuchsinfarbige Stäbchen Ziehl Neelsen Säurefeste Stäbchen bei Verdacht auf Tuberkulose Diastase verdaut allfällige Glykogenschollen: die Differenz der beiden Nachweise (pink) zeigt auf, ob Glykogen vorhanden war oder nicht Immer 2 Färbungen: PAS + D-PAS Chemisches Färbeprinzip Glykogen Kalk schwarz von Kossa = eine Silberimprägnation Kalk, Mikroverkalkungen z:B. in der Mamma Proteindepots rot SFOG = eine Trichromfärbung Proteinablagerungen in der Niere bei Kimmelstiel- Wilson dargestellt Nachweis Bezeichnung
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2010 1
Farbstoffe
und
Färbungen
Farben,
BiologischesMaterial
Esther Osterwalder
Esther Osterwalder / 2010 2
Mögliche Darstellung von Strukturen, Krankheiten
Braune Käppchen bei den Zellkernen (Virusproteine)
OrceinHepatitis-B-Antigen
Blaue, kurze, kommaförmige Stäbchen
Giemsa CHelicobacter pylori
Rostrot bis grünbraunRhodaninKupfer
LM: lachsfarbigPolar.: apfelgrün
KongorotAmyloidose
Fuchsinfarbige StäbchenZiehl NeelsenSäurefeste Stäbchen bei Verdacht auf Tuberkulose
Diastase verdaut allfällige Glykogenschollen: die Differenz der beiden Nachweise (pink) zeigt auf, ob Glykogen vorhanden war oder nicht
Immer 2 Färbungen:PAS + D-PAS
Chemisches Färbeprinzip
Glykogen
Kalk schwarzvon Kossa = eine Silberimprägnation
Kalk, Mikroverkalkungen z:B. in der Mamma
Proteindepots rotSFOG = eine Trichromfärbung
Proteinablagerungen in der Niere bei Kimmelstiel-Wilson
dargestelltNachweisBezeichnung
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Gewebespezifische Färbungen an Kleinbiopsien
HE, EVG,Ab-PASDarmbiopsien
HE, EVG,Ab-PAS, Gic (Giemsa C)Magenbiopsien
HE, EVGGefässe (Blut-)
HE, EVGHerzbiopsien
HE, EVG, Ab-PAS, EisenLungenbiopsien
HE, Giemsa, GomöriLymphknoten
HE, EVG, PAS, D-PAS, CAB, Eisen,
Gomöri, Orcein
Leberbiopsie
HE, PAS, Silbermethenamin SFOG,Nierenbiopsie
Färbungen, NachweiseOrgan/Gewebe
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Voraussetzungen für Färbungen in allen Fachgebieten
mit Phasenkontrast, links ungefärbt 200x, rechts ungefärbt, 100x
links: TUNEL-Reaktion (Rotfärbung), ca 300x, rechts: gleiches Präparat ohne Phasenkontrast
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Blutaustrich normal, nach Pappenheim gefärbtBiologischesMaterial
Blutaustrich normal, ungefärbt
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FarbenBiologischesMaterial
+
Mikroskop:Spongiosa, KM / Goldner /Kallus am Knochenbälckchen /Osteoporose
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BiologischeBausteine
ProteineKohlenhydrateLipideMineralien
Zusammenfassung:
sind die Partner der Farbstoffe und Reaktionslösungen.
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Woher stammen die Farbstoffe?
Was sind Farbstoffe?
Welche Farbstoffe werden für diemikroskopischen Färbungen
gebraucht?
Farbstoffe
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Färbende Mittel
Farbstoffe Pigmente
werden mit einem Bindemittel aufgestrichen
anorganischeRussorganische
gehen mit dem biologischen Material
eine feste Bindung ein
TierePflanzenTeerderivate
Woher stammen die Farbstoffe?Farbstoffe
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Anorganische Pigmente stammen aus dem
Mineralreich:
Umbra-Braun
Farbstoffe
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Rötel
Ocker
Farbstoffe
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Eisen- und ManganhaltigeTonarten
Zinnober
Farbstoffe
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Lapislazuli
Farbstoffe
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TuscheFarb-Russe
Russ besteht zu 80 - 99.5% aus Kohlenstoff und ist ein schwarzer, pulverförmigerFeststoff.
Darstellung von Gang-systemen
Farbstoffe
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Organische Pigmente
Melanin
Hämosiderin
Farbstoffe
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Tierreich
Sekrete und Extrakte
Farbstoffe
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Purpur
6,6 -Dibromindigo
Farbstoffe
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Karmin
Cochenille
Farbstoffe
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Pflanzenreich
Textilfärberei
aller Kulturen
Farbstoffe
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Indigo
Farbstoffe
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Farbstoffe
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Hämatoxylin
Blauholzbaum
Hämalaun nach P. Mayer
**PflanzenFarbstoffe
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· Bleihämatoxylin nach McConaill· Chrom-Hämatein nach Hansen· Eisenhämatoxylin nach Faure· Eisenhämatoxylin nach Hansen· Eisenhämatoxylin nach Häggqvist· Eisenhämatoxylin nach Heidenhain· Eisenhämatoxylin nach Weigert· Hämalaun-Erythrosin-Safran nach Masson
Hämatoxylin nach Gill· Hämatoxylin nach Delafield· Hämatoxylin nach Harris· Hämatoxylin-Chrysoidin-Färbung· Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung)· Hämatoxylin-Safranin-Färbung· Molybdänhämatoxylin nach Held· Saures Hämalaun nach Mayer
· Saures Hämatoxylin nach Ehrlich
**Pflanzen
Farbstoffe
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Teerderivate
Synthetische Farbstoffe
Erster synthetischer Farbstoff:
die Pikrinsäure
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Farbstoffe
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Muskulatur durch Pikrinsäure gelbVG - Färbung
***TeerderivateFarbstoffe
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Was sind Farbstoffe?
oder
Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?
Farbstoffe
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Merkmale der Farbstoffe
a) Sie besitzen ganz bestimmte Absorptionsmaxima
b) Farb Kationen+ oder Farb Anionen-
können an Gegen Ionen gebunden sein
c) Farbstoffe können echt färben
Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?Farbstoffe
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Farbstofflösungen absorbieren bestimmteWellenlängen des sichtbaren Lichtes.
a)Sie besitzen ganz bestimmte Absorptions-maxima:
Farbstoffe
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Der Farbstoff erscheint in der Farbe desdurchgelassenen Restlichtes (Mischfarbe)
Mischfarbe
Farbstoffe
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Jeder Farbstoff besitzt seine typischeAbsorptionskurve.
Farbstoffe
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Jeder Farbstoff hat weltweit seine
C.I.-Nummer
(Color Index)
Farbstoffe
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Nicht jeder farbige Stoff ist ein Farbstoff.
Ein Farbstoff enthält:
Chromophore Gruppen
und
Auxochrome Gruppen
Farbstoffe
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Chromophore
Azo Gruppe - N = N
Nitro Gruppe - NO2
Karbonyl Gruppe - C = O
Farbstoffe
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Die Gruppen wirken nur farbig in Verbindung miteinem oder mehreren Benzolringen.
Chromophor
Chromophor
Farbstoffe
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Auxochrome
Hydroxyl Gruppe - OH
Amino Gruppe - NH2
Sulfonsäure Gruppe - SO3H
Karboxyl Gruppe - COOH
Farbstoffe
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Chromophor
Chromophor
(Aminoazobenzol)
Farbstoffe
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Die auxochromen Gruppen wirken nicht nur Farbvertiefend, sie stellen vielmehr die Ver-bindung zwischen Farbstoff und färbendemMaterial her.
Der Farbstoff wird salzartig an dasbiologische Material gebunden.
ProteineKohlenhydrateLipideMineralien
Na+ Cl-
Farbstoffe
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b) Farb Kationen+ oder Farb Anionen-können an Gegen ionen gebunden sein
Giemsa
Farbstoffe
neutraler Farbstoff
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c) Farbstoffe können echt färben
Rep.: Coulomb / van der Waal
Farbstoffe
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Einteilung der Farbstoffe:
positive Ladung negative Ladung
Kationische Farbstoffe Anionische Farbstoffe
AlcianblauAzur A + B (Giemsa)BismarckbraunFuchsin bas.GentianaviolettKarbolfuchsinKristallviolettMethylenblauParafuchsinKernechtrot (Lack)Hämalaune (Lacke)Harris Hämatoxylin (Lack)
Lichtgrün SFSäurefuchsinHämatoxylin resp. HämateinPikrinsäureEosin YOrange GKernechtrot
Farbstoffe
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Buchstaben interpretieren
X = indifferent (in Lösung pH un-abhänig)
M = Mischung
Y = yellowish = gelblichL = lichtecht
W = wasserlöslichH = hitzebeständig
T = tiefer FarbtonG = grünstichig
S = besser löslich (solubel)F = klare Töne
R = rotstichigD = zum Drucken
P = PigmentC = chlorecht
O = orangeB = blaustichig
N = neuA = Acetatseide
Anzahl vor dem Buchstaben deutet auf die Farbintensität hin.
HE - PAS - VG EVG Alcianblau-PAS - Gic - CAB Berlinerblau -Gomöri von Kossa Fettnachweis - Kongo
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Färbungen zuordnen: Übersichtsfärbung
Die Übersichtsfärbung verschafft einen Überblick über das Gewebe, die Strukturen, die Zellverteilung, Anfärbbarkeitund Kern-Plasma-Relationen.Sie besteht aus Kernfärbung und Zytoplasmafärbung.
zB: Hämatoxylin-EosinGiemsa
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Zellen/Zellkernanfärben:
Für alle Färbungen gültig:
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+
---
-
Für alle Färbungen gültig:
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Schematischer Aufbau eines Zellkernes:
Nukleoproteid
Protein:
Histon+
Nukleotidkette:diese besteht aus
Nukleinsäuremolekülen,von denen jedes aus
- Phosphorsäure-
- Pentose- N-haltige Base
besteht
Hämalaunv. HE
Übersichtsfärbung
Für alle Färbungen gültig:
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Die Kernfarbstoffe sind meist Farblacke
das Eisen III Hämatoxylin nach Weigert
Hämalaun : Hämatein + Alaun
Hämalaun nach P. Mayer besteht aus Kalium-Aluminiumsulfat plus Hämatein. Alaune sind so genannte Doppelsalze.
Klüver Barrera, Luxol Fast BlueMarkscheiden Neurohistologie
GiemsaParasiten
Rubeansäure-Färbung, RhodaninKupfer
Orcein, ViktoriablauHepatitis B-Antigen
ToluidinblauMastzellen
Warthin StarrySpirochäten
Gram, Brown BrennBakterien
GrocottPilze (Soor, Candida sp.)
Diastase-PAS: immer im Vergleich mit PAS!
Glycogen
SFOGProteinablagerungen
FärbungSubstanz
Weitere wichtige Nachweise
Esther Osterwalder / 2010 62
Färbungen zuordnen: Reaktionsprinzipien (3)
1.Chemisches Färbeprinzip: Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substratverläuft nach den Gesetzmässigkeiten der chemischen Bindung. Die Färbe-ergebnisse lassen sich durch eine chemische Reaktionsgleichungcharakterisieren = Histochemie.z.B. PAS, Berlinerblau, (Enzymnachweise = Enzymhistochemie)
z.B Nachweis von dreiwertigem Eisen mit der Berlinerblau-Reaktion:
Gelbes Blutlaugensalz = Ferro-zyankalium = Kaliumhexazyanoferrat II (Fe II)
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Esther Osterwalder / 2010 63
PAS Reaktion periodic acid Schiff s reaction
1. Hydrolyse mit Perjodsäure HJO4 :das Zuckermolekül öffnet sich unter Bildung zweier dichtgelagerter Aldehydgruppen und H2O
2. Anlagerung des Schiff schen Reagens (Fuchsinsulfit) an diese Aldehyd-Gruppen
+ F (SO2H)2
FFuchsinsulfit
kationischer Farbstoff
Aldehydfuchsin
Reaktionsprinzipien
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PAS positive Substanzen/StrukturenChitinStärkeZellulose (Pollen)DextraneGlycogen (PAS + D-PAS zusammen)GlycoproteineSialomuzine (Sialo- = Speichel )BasalmembranSchleimbildende Drüsen, bzw. deren SekreteLeukozyten, Plasmazellen
Reaktionsprinzipien
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Esther Osterwalder / 2010 65
Chemische Färbeprinzipien nennt man in der Histologie meist Histochemie .
Histochemische Nachweise lassen sich nicht mehr entfärben, da das Produkt auf einer chemischer Reaktion beruht.
Verunreinigungen können bei histochemischenNachweisen zu Fehlreaktionen führen, besondersbei den Enzymnachweisen.
Merke
Reaktionsprinzipien
Esther Osterwalder / 2010 66
2. Physikalisches Färbeprinzip
Löslichkeit eines Farbstoffes in verschiedenen Medien (z.B. Ethanol / Fett)
z.B. Fettnachweis mit Sudan III, Ölrot
Reaktionsprinzipien
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Esther Osterwalder / 2010 67
3. Physikalisch-chemisches oder physiko-chemisches Färbeprinzip
Elektroabsorption: Coulomb
Dispersität: Farbstoffgrösse + Zeit spielen eine grosse Rollez.B. bei den Trichromfärbungen
Grenzflächenadsorption: Adsorption ist ein physikalischer Prozess Aktivkohle hält Farbstoff aufgrundder aufgerauten Oberfläche fest. Meist van der Waal involviert.
z.B. HE, VG, EVG, AP, Gic, CAB, Kongo
Reaktionsprinzipien
Esther Osterwalder / 2010 68
Als Adsorption (lat.: adsorptio bzw. adsorbere = (an-)saugen) bezeichnet man die Anreicherung von Stoffen aus Gasen oder Flüssigkeiten an der Oberfläche eines Festkörpers, allgemeiner an der Grenzfläche zwischen zwei Phasen.Adsorption unterscheidet sich von der Absorption, bei der die Stoffe in das Innere eines Festkörpers oder einer Flüssigkeit eindringen. Der Oberbegriff für diese Anreicherungsvorgänge lautet Sorption.Adsorbieren zwei oder mehr Spezies an eine Oberfläche, nennt man dies Koadsorption. Dies spielt vor allem bei Katalysatoreneine wichtige Rolle, bei denen die verschiedenen Atomsorten auf einer Oberfläche adsorbiert werden und dort reagieren.
Abb. a) Adsorbens, b) Adsorbat an der Grenzfläche, c) Gasphase bzw. Lösung mit Adsorptiv
Im allgemeinen Sinn ist Adsorption ein physikalischer Prozess.
Welche Strukturen werden angefärbt ausser den Zellkernen?
VG CAB - Goldner - SFOGTrichromfärbungen
keine Trichrom-färbung!
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Aussagen zu den Fasern im Bindegewebe:
Kollagene Fasern: Anfärbung mit grobdispersen anionischen Farbstoffen wegen der basischen Aminosäuren des Kollagens.
Retikuläre Fasern: Schwach anfärbbar mit anionischen Farbstoffen.
Elastische FasernDas Protein Elastin weist zum Kollagen eindeutig weniger basische Aminosäuren auf, dagegen die seltene saure AS Desmosin. Der saure Charakter der elastischen Fasern erlaubt die Anfärbung mit kationischen Farbstoffen zB. Orcein, Resorcin-Fuchsin
Trichromfärbungen
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Esther Osterwalder / 2010 75
Spezialfärbungen werden zur Darstellung bestimmter Strukturen durchgeführt. Sie bestehen aus einer geeigneten Farbstoff- oder Reaktionslösung und einer Gegenfärbung.(Kernfärbung oder Hintergrundfärbung erhöhen den Farb-kontrast)
SpezialfärbungenFärbungen zuordnen:
zB: Ziehl NeelsenSilberimprägnationen
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Schematische Darstellung der Zellwand von Mykobakterienohne Berücksichtigung Speziesspezifischer Unterschiede.
Beachte: M tuberculosis hat keine Kapsel
Zellwandaufbau der Mykobakterien
Ziehl NeelsenZN
Spezialfärbungen
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Esther Osterwalder / 2010 77
Mykolsäuren sind Bestandteile der säurefesten Zellwand. Durch ihre Einlagerung werden die Zellen stark hydrophob. Sie besitzen lange Alkylketten und sind über Arabinogalaktanan das Murein gebunden, das ein Peptidoglykan ist.
Ziehl NeelsenZN
Spezialfärbungen
basisches Fuchsin
Esther Osterwalder / 2010 78
Versilberung/Silberimprägnation
meist zur Darstellung von Aldehyden
Argentaffine oder argyrophile Stoffe lassen sich mit Silber imprägnieren .
- Argentaffine Strukturen können ohneVorbehandlung metallisches Silber ausSilbernitatlösungen reduzieren. Diese lagern sich dann dort ab. (Kalk)
- Argyrophile Strukturen benötigen eineoxidierende Vorbehandlung, um dieselbeWirkung zu erzielen. (retikuläre Fasern)
z.B. von Kossa Gomöri
Spezialfärbungen
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Esther Osterwalder / 2010 79
Versilberung/Silberimprägnation
Silbersalze werden durch starke Laugen in Silberoxyd umgewandelt, das dann als schwarzer Niederschlag ausfällt.
Durch Zugabe von Ammoniak entsteht Diaminsilberoxid, das sich durch Formalin reduzieren lässt.
AgO + 4 NH3 (Ag[NH3]2)2ODiaminsilberoxid
Dabei entsteht metallisches Silber als Niederschlag,Ammoniak und Ameisensäure.
(Ag[NH3]2)2O + HCHO Ag + 4 NH3 + HCOOH
Formaldehyd Ammoniakmetallisches Silber
Ameisensäure
Spezialfärbungen
Esther Osterwalder / 2010 80
1. Kaliumpermanganat (Oxidationsmittel) oxidiertEthanolgruppen der Glykoproteine zu Aldehyden
2. Eisenalaun imprägniert die Strukturen
3. Silberionen lagern sich an Aldehydgruppen
4. Formalin wirkt als Entwickler
(5. Mit Goldchlorid wird das Silber schwarz getönt)
6. Mit Na-thiosulfat wird fixiert (entfernen des noch ionisierten Ag)
Prinzip von GomöriSpezialfärbungen Versilberung/Silberimprägnation
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Esther Osterwalder / 2010 81
Färbungen zuordnen:
meist maschinell gefärbt
HE Übersichtsfärbung für Kerne + Zytoplasma
VG Übersichtsfärbung für kollagenes Bindegewebe + Muskulatur; oft durch EVG ersetzt
PAS neutrale Zucker sind PAS-positiv (ungenaue Aussage)inkl. *D-PAS beim indirekten Glykogennachweis
Alcianblau (Ab) saure Muzine der Becherzellen
Ab-PAS saure + neutrale Muzine der Becherzellenunterscheiden
Routinefärbungen
Esther Osterwalder / 2010 82
1. Schnitt: normaler PAS-Nachweis + werden positiv pink2. Schnitt: zuerst mit Diastase das Glykogen verdauen, dann PAS ausführen
Glykogen ist verdaut; nur noch wird positiv pink
Diastase-behandlung
PAS nach Diastase-behandlung = D-PAS
= hier war Glycogenvorhanden
*D-PAS indirekter Glykogennachweis beim z.B. primären Leberzellkarzinom
Routinefärbungen
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Esther Osterwalder / 2010 83
D-PASPAS
Parotistumor
Routinefärbungen
Esther Osterwalder / 2010 84
Routinefärbungen Alcianblau ist ein kationischer Kupferphthalocyanin-farbstoff und verbindet sich mit negativ geladenen Zellbestandteilen wie z.B. saure GAG.