Esterilizacion de Biorreactores

4. Métodos de esterilización

4.1. Introducción

En las fermentaciones industriales se requiere de un alto grado de limpieza y asepsia

No existe un método cuantitativo seguro y confiable para medir el número o la concentración de contaminantes en el sistema

Posibles elementos de contaminación en un proceso fermentativo:

El medio El inóculo y el proceso de

inoculación El suministro de aire La adición de nutrientes, antiespu-

mantes, etc. durante el proceso El fermentador en sí

4.2. Esterilización de medios de cultivo

A. Eliminación físicaa) Filtraciónb) Centrifugaciónc) Flotaciónd) Atracción electrostáticae) Intercambio iónicof) Adsorción por carbón de virus


B. Destrucción

a) Calor húmedob) Calor secoc) Radiación electromagnéticad) Radiación sónicae) Agentes químicos


La técnica de mayor aplicación a nivel industrial es el tratamiento térmico que se puede llevar a cabo en procesos intermitentes y continuos

El vapor es el recurso utilizado universalmente para la esterilización del medio de fermentación

Cinética de esterilización

La destrucción de microorganismos por vapor (calor húmedo) puede ser descrita como una reacción química de primer orden:

- dN = KN (1) dDonde:

N No. de m.o. viables presentes Tiempo del tratamiento de esterilizaciónK Constante de reacción

Constantes de velocidad de reacción (K) y tiempos de reducción decimal de diferentes esporas bacterianas suspendidas en buffer a 121°C

Especie Ka 121°C(min-1)

Da 121°C(min)

Bacillus subtilis FS 5230

Bacillus stearothermophilus FS 1518

Bacillus stearothermophilus FS617

Clostridium sporogenes PA 3679

3.8-2.6

0.77

2.9

1.8

0.6-0.9

3.0

0.8

1.3


Integrando la ecuación (1):

N = e-K (2)

N0

Donde:N No. de m.o. viables al tiempo

N0 No. de m.o. Viables presentes al inicio del tratamiento de

esterilización


Otra forma de expresar la ecuación (2):

ln N = -K (3)

N0

Donde:N No. de m.o. viables al tiempo

N0 No. de m.o. viables presentes al inicio del tratamiento de

esterilización

Representación gráfica de la ecuación (2)

N/N0

Representación gráfica de la ecuación (3)

ln (N/N0)


La esterilización total nunca puede alcanzarse

Valores de N < 1 se deben considerar en términos de la probabilidad de que un microorganismo sobreviva al tratamiento

Las gráficas representadas anteriormente sólo se observan cuando se lleva a cabo la esterilización de un cultivo puro bajo condiciones ideales de esterilización


El valor de K no sólo depende de las especies, sino también depende de la forma fisiológica de la célula

Ejemplo: las endoesporas del género Bacillus son más resistentes que las células vegetativas

Richards generó una serie de gráficas ilustrando las desviaciones que en la práctica se presentan de la teoría

Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas

ln (N/N0)

La activación de esporases significativamente mayor que su destrucción durante los primeros estados del proceso

a)


ln (N/N0)

La activación de esporases balanceada por su muer-te durante los primeros estados del proceso

b)


ln (N/N0)

La activación de esporases menor que su muer-te durante los primeros estados del proceso

c)

Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados

ln (N)

Mezcla constituida princi-palmente por el microorga-nismo menos resistente térmicamente

d)

Microorganismo sensitivoMicroorganismo resistente

Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados

ln (N)

Mezcla constituida princi-palmente por el microorga-nismo más resistente térmicamente

e)

Microorganismo sensitivoMicroorganismo resistente

Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius

d ln K = Ea (4) dT RT2

Donde:Ea Energía de activaciónR Constante de los gasesT Temperatura absoluta

Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius

Integrando la ecuación (4):

ln K = ln A - Ea (5) RT

Ecuación para la esterilización térmica de un cultivo puro:

Combinando las ecuaciones (3) y (5):

ln N0 = A e-E/RT (6)

N

Factor DEL o Factor NABLA (V)

Definido por Deinoerfer y Humprey (1959) como un criterio de diseño para la esterilización:

V = ln N0 (7)

N

De donde: V = A e-EA/RT

(8)

ˉ

ˉ

ˉ

Factor DEL o Factor NABLA (V)

Rearreglando la ecuación (8):

ln = E + ln V (9)

RT A

Este factor es una medida de la reducción fraccional de organismos viables producido por un cierto régimen de tiempo y temperatura

ˉ

ˉ

Efecto del tiempo de esterilización y de la temperatura sobre el factor DEL alcanzado en el proceso

1/T

ln Factores DEL

2.3

4.6

23

69

Diseño de proceso de esterilización de medios de fermentación

El mismo grado de esterilización se puede obtener a partir de un gran número de combinaciones de tiempo y temperatura

De acuerdo a Deindoerfer y Humprey (1959), Richards (1968) y Banks (1979) un factor de riesgo de que un batch de mil esté contaminado se utiliza frecuentemente en la industria de las fermentaciones

ˉ

Diseño de proceso de esterilización de medios de fermentación

Se supone que los únicos contaminantes presentes son esporas de Bacillus stearothermophilus, que es de los microorganismos más termorresistentes, cuyas características son:

Ea = 67.7 Kcal/molA= 1 x 10 36.2 seg-1

Una serie de reacciones deteriorativas pueden presentarse en el medio durante su esterilización, resultando en una pérdida de la calidad nutritiva

ˉ

Efecto deteriorativo del incremento del tiempo de tratamiento sobre la productividad del proceso de fermentación

Duraciónde la esterilización (min)

% d

e la m

áxim

a p

rod

uct

ivid

ad

Pérdida de calidad nutritiva del medio durante la esterilización

Dos tipos de reacciones básicas contribuyen a la pérdida de calidad nutritiva durante la esterilización:

i. Interacciones entre nutrientes constituyentes del medio, Ejem: reacción de Maillard

ii. Degradación de componentes termolábiles como vitaminas y aminoácidos

Para evitar reacciones deteriorativas se recomiendan sistemas de esterilización continuos de alta temperatura y corto tiempo (HTST)

4.2.1. Esterilización intermitente

Existen diferentes tipos de equipo utilizado para la esterilización del medio de cultivo, dependiendo del método empleado para el calentamiento

1. Inyección de vapor

2. Calentamiento eléctrico

V V V V

V V V V

3. Calentamiento con vaporFuente isotérmica de calor

4. Enfriamiento con refrigeranteRefrigerante no isotérmico

Perfiles de temperatura en esterilización batch

Tipo Ecuación de perfil

1

2

3

4

T = T0 1 + t

1 +t

Hiperbólico

T = T0 (1 + t)

Lineal

T = TH (1 +e-t)

Exponencial

T = TCo (1 +e-t)

Exponencial

= hs = S/M

MCpT0

= q

MCpT0

= UA = T0 – TH

MCp TH

= WCp’ 1 – exp -UA

MCp WCp’

= (T0 –TCo)/TCo

Terminología

A área de transferencia de calor (m2)Cp calor específico del medio (Kcal/Kg °C)Cp’ calor específico del refrigerante (Kcal/Kg

°C)h contenido entálpico del vapor (Kcal/Kg)M masa inicial del medioq velocidad de transferencia de calor (Kcal/seg)S flujo másico de vapor (Kg/seg, Kg/min, Kg/hr)T0 temperatura inicial del medio (°K)

TH temperatura de la fuente de calor (°K)

TCo temperatura inicial del refrigerante (°K)U coeficiente global de transferencia

(Kcal/m2 hr °C)

Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch

total = ln N0 = Kdt = ’ e-E/RT dt

N

total = calent + reten + enfr

∫ ∫0 0

tt


calent = ln N0 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt

N1

reten = ln N1 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt

N2

enfr = ln N2 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt

N

∫ ∫0 0

t1t1

∫ ∫0 0

t2t2

∫ ∫0 0

t3t3


Donde:

t = t1 + t2 + t3

N nivel de esterilidad (No. de m.o. después de la esterilización)

N0 nivel de contaminación (No. de m.o. antes de la esterilización)

N1 No. de m.o. contaminantes después del período de calentamiento, t1

N2 No. de m.o. contaminantes después del período de retención, t2

4.2.2. Esterilización continua

Menos utilizados en la industria que los intermitentes

Equipo más utilizado para la esterilización continua del medio de fermentación:

Esterilizador tipo inyección Intercambiador de placas

Esterilización continua por inyección

Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.

Perfil de temperatura – tiempo en esterilizadores continuos

por inyección de vapor

Esterilización continua con intercambiadores de calor

Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.

Perfil de temperatura – tiempo en esterilizadores continuosde intercambiador de platos

Ventajas de la esterilización

CONTINUA sobre la BATCH

Mantenimiento superior de la calidad del medio

Fácil escalamiento Fácil control automático Reducción del tiempo de

esterilización Reducción de corrosión en el

fermentador

Ventajas de la esterilización

BATCH sobre la CONTINUA

Control manual simple

Fácil de aplicarse a un medio que contenga una alta proporción de material sólido

4.3. Esterilización del aire

En los procesos de fermentación se necesita aire estéril, por lo que es común el uso de un sistema de filtración y uno de esterilización

El tamaño de los microorganismos varía desde unas milimicras hasta cientos de micras

Los microorganismos más pequeños suelen ser absorbidos en el polvo del aire, lo que facilita su eliminación durante la filtración

4.3. Esterilización del aire Durante el proceso de esterilización del

aire se eliminan las partículas de tamaño entre 0.5 y 1.0 micra

Para poder diseñar un sistema de esterilización es necesario conocer el tamaño de las partículas y el número de microorganismos presentes en el aire, así como la cantidad de otras partículas.

En Inglaterra se han reportado valores promedio de 3 a 9 x 103 partículas/m3 y en Japón 12 x 103

El proceso de esterilización del aire más utilizado es el de FILTRACIÓN

Requisitos de un sistema de filtración

1. El sistema debe ser de diseño sencillo

2. Su operación debe ser barata

3. Debe ser estable y resistente a varias esterilizaciones con vapor

4. Debe acondicionar el aire, ajustando temperatura y humedad

Tipos de filtros

Tipos de filtros

Escala pequeña: Filtros millipore, de asbesto o porcelana Filtros fibrosos de lana de vidrio o

materiales similares

Escala mayor: Filtros granulados, partículas de carbón Filtros fibrosos

4.3.1. Análisis fundamental

El comportamiento de un filtro para aire se define de la siguiente manera:

= N – N0 x 100 (%) (10)

N0

Siendo la eficiencia total de retención del filtro

-

-

Mecanismos de retención de partículas finas por filtros de aire

a) Impacto

b) Intercepción

c) Difusión

d) Sedimentación

e) Atracción electromagnética

Líneas de corriente de aire producidas por el flujo alrededor de una fibra cilíndrica

Dfb

Impacto inercial (1)

La retención por este método se expresa como:

1 = b/Df (11)

b = Df + 2Dp (12)

Donde:b ancho específico de la corriente

(, cm)Df diámetro de la fibra (, cm)

Dp diámetro de la partícula (, cm)

Impacto inercial (1)

Masa de partículamuy pequeña

oVelocidad de aire

muy baja

Fuerza inercial insuficiente para que la

partícula choque con la

fibra

Velocidad crítica, Vc, en la que los efectos inerciales se vuelven mínimos

Velocidad Crítica (Vc)

Vc = 1.125 a Df (13)

C p Dp2

Donde:Vc velocidad superficial crítica del airea viscosidad del aire

p densidad de la partícula

C factor de correlación basado en la Ley de Stokes

Velocidad Crítica (Vc)

Para bacterias de 1 micra de diámetro:

Vc = 0.066 Df (14)

Vc en ft/segDf en micras

Intercepción (2)

Para partículas esféricas:

2 = 1 [(1+Re)ln(1+Re)2 – (1+Re) + 1/(Re+1)]

2(2-lnRe) (15)

Donde: Re = Df v (16)

v velocidad del aire

Difusión (3)

La difusividad de las partículas finas, D, puede expresarse como una función de Dp y considerando como Do el diámetro efectivo de desplazamiento de la partícula por difusión se tiene:

3 = 1 [2(K)lnK – K + 1/K] (17)

2(2-lnRe)

-

Difusión (3) Donde:

K = 1 + 2 Do/Df (18)

Do/Df = 2.24 (2 – lnRe) D 1/3

(19)

VDf

D = C K T (20) 3Dp

K constante de Boltzman (1.38x10-16 erg/°K)T temperatura absoluta

-

-

Relación entre la eficiencia total () y las eficiencias de una sola fibra (0)

0 = 1 + 2 + 3 (21)

Para un filtro real, la eficiencia se define:

= (1 – ) Df ln 1 (22)

4 L 1 - 0 Eficiencia de colección de una sola fibra

cuya fracción volumétrica es

Eficiencia total de recolección de un filtro

-

-

-

Relación entre la eficiencia total () y las eficiencias de una sola fibra (0)

Experimentalmente se ha encontrado:

= (1 – 4.5 ) 0 (23)

Para: 0 < < 0.1

-

4.3.2. Diseño de filtros

La penetración de microorganismos en un filtro es de naturaleza logarítmica:

dN = – K’ N (24) dL

ln N = -K’ L (25)

N0


Donde:

N0 Número de microorganismos que entran al filtro

N Número de microorganismos que salen del filtroL Longitud del filtroK’ Constante de filtración


K’ es función de: La velocidad del aire Densidad del filtro Tamaño de las fibras Tamaño y densidad del microorganismo

eliminado K’ se puede expresar en términos de la

profundidad del filtro, como la longitud para eliminar el 90% de N0, L90.


ln N0 = 2.3 (L) (26)

N L90

ln N0 = 1.23 0 (1 + 4.5) L (27)

N (1 – ) Df

Criterio de diseño: N = 10-3

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