Estabelecimento de culturas de linhas celulares estáveis ...medicina.med.up.pt/bcm/.../2006/tiestabelecimentolinhascelulares.pdf · dos constituintes celulares, observando-se imediatamente

Estabelecimento de culturas de linhas celulares estáveis

que expressem proteínas fluorescentes

Cristina DuqueLuís Flores

Introdução

No centro da divisão celular está o fuso mitótico, cuja função é segregar os cromossomas para pólos opostos da célula.

O fuso mitótico é constituído por microtúbulos e centrossomas.

Thomas J. Deerinck. Fluorescently labeled cell culture. Confocal Microscopy University of Toronto. http://www.mie.utoronto.ca/labs/lcdlab/biopic/biofigures.htm

Microtúbulos

Constituídos por um heterodímero de tubulina α e tubulina β;

As extremidades dos microtúbulos estão dispostas no fuso mitótico de acordo com a sua polaridade;

Alberts et al. MBOC4

Cooper et al. The Cell. 2nd ed

Microtúbulos

Os microtúbulos encontram-se associados a diversas proteínas que participam na regulação das suas propriedades dinâmicas;

A instabilidade dinâmica dos microtúbulos desempenha um importante papel ao longo da mitose, permitindo que ocorra a segregação dos cromossomas.

Centrossomas

Os centrossomas são os centros organizadores dos microtúbulos;

Cada um é constituído por um par de centríolos e proteínas associadas, como a γ-tubulina;

Alberts et al. MBOC4

Cromossomas

O centrómero é uma região dos cromossomas com sequências de DNA e proteínas específicas, que contém os dois locais de ligação ao fuso mitótico, os cinetocóros.

Alberts et al. MBOC4

Objectivo

Estabelecer uma linha celular estávelque expresse uma proteína fluorescente, obtendo a mesma expressão proteica ao longo das gerações, permitindo o estudo continuado da proteína marcada em células VIVAS.

Neste trabalho foram marcadas:

1) Em células HeLa (células tumorais humanas)CLASP 2α com a GFP.

2) Em células Schneider 2 (células embrionárias de Drosophila) que já expressavam GFP-α-tubulinaou GFP-centrossomina

cid com mCherry

3) Em células 1182-4 (células acentriolares de Drosophila)

α-tubulina com GFP

Proteínas de fluorescência

Através de marcações com proteínas fluorescentes, podemos fazer com que a célula passe a ter uma proteína semelhante a uma das proteínas endógenas a emitir fluorescência.

As proteínas fluorescentes usadas neste trabalho foram a GFP e a mCherry.

Green Fluorescent Protein

Aequorea victoria

Tsien lab Website. http://www.tsienlab.ucsd.edu

DsRed

DNA-Gdańsk. http://www.dnagda.com/labgen.html

Discosoma sp.

University of Queensland: Biomolecular Modelling. http://www.ccms.uq.edu.au/research_biomolecular.htm

A escolha da mCherryw e ry

mHoney

Bana

Oran

Toma

ange

r

rawb

herde

m

na

m

getd

tomT

inmSt

er

mCry

Shaner et al. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology.

Tsien lab Website. http://www.tsienlab.ucsd.edu

Proteínas marcadas

• A α-tubulina é uma das proteínas constituintes dos microtúbulos.

• A cid (centromere identifier) é uma proteína aparentada com as histonas-H3, mas que só existe ligada à zona do cinetocóro. Este proteína de Drosophila é homóloga à CENP-A humana.

Proteínas marcadas

• A centrossomina é uma proteína ligada ao centrossoma que se pensa estar relacionada com o seu funcionamento durante a segregação dos cromossomas.

• A γ-tubulina é uma proteína também existente nos centrossomas.

Proteínas marcadas

• A CLASP 2α (CLIP associating protein) pertence a uma família de proteínas (+TIPs) associadas à extremidade (+) dos microtúbulos;

• As CLASPs desempenham um papel na manutenção da bipolaridade no fuso mitótico, na ligação dos microtúbulos aos cinetocóros e na congressão dos cromossomas;

• A CLASPs ligam-se aos cinetocóros durante a mitose;

• A CLASP 1α tem um domínio central de ligação a microtúbulos e um terminal C de domínio cinetocoriano, aparecendo também no centrossoma e no mid-body (citocinese).

Maiato et al, Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics,2003

Métodos• Construção do plasmídeo• Proteína de fusão• Transformação de bactérias competentes• Screening das colónias• Amplificação do plasmídeo de interesse• Transfecção estável das células eucarióticas• Selecção das culturas• Microscopia

PlasmídeoXba I

GFP α-tubulinaA

mpi

cilin

a

Higromicina

Sac II

Sal I

Sal I

Proteína de fusão

Green Fluorescent Protein. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm

Green Fluorescent Protein. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm

Transformação

Adaptado de Cooper et al. The Cell - A Molecular Approach (2nd ed). Sinauer Associates, Inc

Transformação

Meio com Ampicilina

TransformaçãoColónia

Screening

Amplificação

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (4th ed). Garland Publishing

Transfecção

Nikon's MicroscopyU. http://www.microscopyu.com

Selecção das culturas

Meio com antibiótico

Microscopia de fluorescência

Resultados e Discussão

1) GFP CLASP 2α : Microscopia de Fluorescência

DNACLASP 2α

DNACLASP 2α

DNACLASP 2α

DAPI GFP-CLASP2α Merge

Western Blotting

Anticorpos Primários1:2500 α-GFP AbCam (Rabbit)1:1000 α-TUB (Mouse)

Anticorpos Secundários1:1000 α-Rabbit-HRP1:5000 α-Mouse-HRP

250 KDa

150 KDa

75 KDa

50 KDa

37 KDa

100 KDa

Os resultados obtidos sugerem um erro na sequência codificante:

• Ausência de fluorescência nos cinetocoros; • Menor peso molecular da proteína

(<170KDa).

Erro durante o PCR- DNA Polimerase Pfu

• A síntese proteica terminou prematuramente, eliminando o domínio cinetocoriano da CLASP 2α;

• Não se observou nenhuma anomalia decorrente desta ausência, devido à existência da própria proteína endógena.

Resultados610nm484nm DIC

GFP-α-tubulina mCherry-cid

GFP-α-tubulina mCherry-cid

cidα-tubulina

cidα-tubulina

DIC

Futuro

• Técnicas de microcirurgia laserpermitindo manipular ainda melhor alguns dos constituintes celulares, observando-se imediatamente os seus efeitos

Agradecimentos

Dra Ana PereiraDra Sara Pereira

Prof Doutor Hélder Maiato

Dra Irina Matos Dra Rita Maia

Algumas referências...• Rieder C. Mitosis and Meiosis. Cell Biology, Virtual Text. Ergito.com. • Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular

Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland Publishing; 2002.• Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY. A guide to choosing fluorescent

proteins. Nature Methods. 2005 Dec; 2(12):905-9.• Nikon MicroscopyU [homepage on the Internet]. Introduction to

Fluorescent Proteins. http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html

• Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 2004 Dec;22(12):1567-72.

• Wadsworth P, Rusan NM, Tulu US, Fagerstrom C. Stable expression of fluorescently tagged proteins for studies of mitosis in mammalian cells. Nature Methods. 2005 Dec;2(12):981-7.