Espectroscopía de Fluorescencia 2 Ana Denicola
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Espectroscopía de Fluorescencia 2
Ana Denicola
“Quenching” de fluorescencia
quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión
IF (Q) < IF (-Q)
Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional)
Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete
Rearreglos moleculares
Transferencia de energía
Transferencia de carga
Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)
F Q F Q
F Q F Q
F Q F Q
F Q P
*
* *
* + -
*
+ → +
+ → +
+ → +
+ →
Mecanismos de desactivación bimolecular
d[F*]dt
[F*] + [F*] + [F*][Q]r nr d= Σ Σ Σk k k
Quenching colisional
Transferencia de energía
Transferencia de carga
Reacción
τ0
τ / τ0 = F/F0
Quenching colisional o dinámico
X X*hν
hν’
τ < τ0
QXQ*
X + Q
X
kQ
A una concentración fija del fluoróforo, medimos cómo varía la fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula:
F0/F (F0: fluorescencia en ausencia de quencher)
F0/F
[Q]
1
Ksv
Gráfico de Stern-VolmerF0/F = 1 + Ksv [Q]
Ksv = constante de Stern-Volmer, depende de:
• tipo de fluoróforo y quencher
• accesibilidad del fluoróforo
(viscosidad,temperatura)
Quenching colisional o dinámico
Quenching colisional o dinámico
F0/FStern-Volmer
Quenching de triptofano por O2
KSV = 32 M-1
Quenching colisional o dinámico
KSV = kq τ0 kq = cte. vel. quenching
k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión)
fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching
kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski:
O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:
= 1
Quenching dinámico y estático
• Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular
• Quenching dinámico o colisional: Q + F*
• Quenching estático: Q + F
• Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente)
Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q
Colicin E1 = proteina de membrana12 W
Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like –NH3+, -COOH, histidine protonated
Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)
DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescenteSBP = steroid binding protein
Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)
Quenching intermolecular
Q y F están unidos covalentemente
Enzima flavina reductasa con FMN unidoLa F de FMN en solución > F de FMN unido
La Y35 responsible de quenching interno de FMN por transferenciaelectrónica
Autoquenching – elevada concentración del fluoróforo
Fluoróforos con pococorrimiento Stokes
- reabsorción de las λmenores de emisión
- formación de excímeros
Rodamina 6G
5 µM
0.16 mM
5.7 mM
Transferencia de energía
hνDonante Aceptor
hν1
FRET
hν2
Cuando una molécula del donante absorbe un fotón y hay una moléculade aceptor cerca, puede ocurrir la transferencia de energía del estadoexcitado del donante al aceptor por una via no radiativa.
Como resultado de la transferencia de energía se observa una disminuciónen la intensidad de fluorescencia emitida por el donante y, si el aceptor esfluorescente, la aparición de una nueva señal fluorescente.
RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET):
λEM D λEX A
A
λEM A
A
λEM A
λEX D
D*
λEX D
D
F
A *
D
Solapamiento espectral
Donante
Aceptor
Solapamiento
Absorbancia
Absorbancia
Fluorescencia
Fluorescencia
La eficiencia de la transferencia depende de:
• la distancia entre D y A
• el grado de solapamiento entre el espectro de emisión de D y el de absorción de A
• la orientación relativa entre D y A
• el tiempo de vida de D*
kT (r) = (1 / τD) (R0 / r)6
R0: distancia de Föster (depende del par D-A)r: distancia D-A
La constante de velocidad del proceso es:
22 )coscos3(cos ADT θθθκ −=
R
D
AθD
θTθA
φ
donde θT es el ángulo entre losmomentos de D y A , dado por
ADADT θθφθθθ coscoscossinsincos +=
θD, θA son los ángulos entre el vector de separación R, y los momentos D y A, respectivamente, y φ es el ángulo entre los planos (D,R) y (A,R)
Los límites para κ2 son 0 to 4, si las moléculas presentan movimientosisotrópicos rápidos κ2 = 2/3
El factor de orientación
D
D*A*
A
Transiciones acopladas
D* A* Interacción dipolo-dipolodepende de la distancia entre moléculas y de la orientación relativa entre los dipolos
Diagrama de energía simplificado
k JN rTE
d,a d
d
a=
⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅
9000 10128
2
45 6ln κ Q
ηπ τ
Eficiencia de la transferencia de energía
Experimentalmente, E puede calcularse a partir de los tiempos de vida o intensidades de fluorescencia del donante en ausencia y presencia del aceptor.
d,a d,a
d d
I1 1
I E = - -
ττ
=
TE
TE + i
kE =k k∑
Eficiencia de la transferencia de energía
E Rr R
=+ο
ο
6
6 6d,a
E k
k=
+TE
d TE1 / τ k RΤΕ τ
( od
) = 1
R JNo
d
a6
59000 10
128
2
4=
⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ln κ Q
ηπ
k JN rTE
d,a d
d
a=
⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅
9000 10128
2
45 6ln κ Q
ηπ τ
Dependencia con la distancia
E Rr R
=+ο
ο
6
6 6d,a
Donante Aceptor Ro (Å)
Fluoresceina Tetrametilrodamine 55 IAEDANS Fluoresceina 46 Fluoresceina Fluoresceina 44 BODIPY FL BODIPY FL 57
0
0.25
0.5
0.75
1
0 20 40 60 80 100
Distance in Angstrom
Effic
ienc
y of
tran
sfer
Se pueden medir distancias porFRET entre ~0.5 R0 and ~1.5R0
¿Para que sirve?• para medir distancia inter o intramoleculares.Con esa informacion se puede:-estudiar cambios conformacionales-medir asociaciones- colocalizar in vivoetc,etc
λEM AλEX D
F
• se puede ver la disminución de la fluorescencia de D o el aumentode la emisión de A. En general se usa la primera forma.
Hidrólisis de un sustrato
Unión de un sustrato
Fusión de vesículas
Cambios conformacionales
Medir distancias intramoleculares
Formación de agregados moleculares
Related Documents
