Espectrometra de masas
1. Espectrofotometra UV-VIS, 6 horas, das 15, 16 de Octubre de 2012: - Leyes de la absorcin UV-VIS - Propiedades de la radiacin UV-VIS - Origen de los espectros UV-VIS - Principios de anlisis cuantitativo - Instrumentacin en espectrofotometra UV-VIS - Modos de trabajo y aplicaciones2. Espectrofotometra IR (FTIR), 9 horas, das 17, 18, 19 de Octubre de 2012: - Fundamentos de ls espectrofotometra IR y FTIR. Comparacin con otras tcnicas. Tipos de muestras. - Mtodos de obtencin de los espectros. Tipos de espectros. - Instrumentacin y tcnicas de medida - Interpretacin y anlisis de espectros - Aplicaciones al estudio estructural de biomolculas3. Espectrometra de masas, 6 horas, das 22, 23 de Octubre de 2012: - Introduccin, terminologa y fundamentos - Instrumentacin: fuentes de ionizacin, analizadores, detectores y modos de trabajo - Interpretacin de los espectros de masas - GCMS - LCMS Espectrometra de masasEspectrometra de masas, 6 horas, das 22, 23 de Octubre de 2012: - Introduccin, terminologa y fundamentos - Instrumentacin: fuentes de ionizacin, analizadores, detectores y modos de trabajo - Interpretacin de los espectros de masas - GCMS - LCMS
IntroduccinLa espectrometra de masas (EM) es una tcnica de anlisis basada en la separacin de las especies cargadas formadas a partir de la ionizacin de una muestra de acuerdo a sus razones masa/cargaEspectroscopaEspectrometra de masasNo es un mtodo espectroscpico como las tcnicas de IR o UV
Cambios qumicos no fsicosTcnica destructiva FundamentoGeneracin de iones gaseosos a partir de la muestra (molculas orgnicas gaseosas)M +e- M+ + 2e-
Separacin de los mismos en funcin de la masa/carga
Deteccin con dispositivos adecuados
Obtencin del espectro que es una repre-sentacin bidimensional donde se muestra la abundancia de iones en ordenadas frente a la relacin carga/masa de cada uno de ellos
Generacin de ionesM +e- M+ + 2e-
M+ catin-radical molecular excitado(Nuevas rupturas) E+ + R radical M+ P+ + M molcula
Los iones que se forman dependen de la estructura qumica de las molculas, en funcin de la abundancia de estos iones podemos identificar la molcula de la que partimosGeneracin de ionesLa mayora de los iones producidos tiene una carga correspondiente a la prdida de un solo electrn (e = 1.6 10-19 C), aunque tambin se pueden obtener iones multicargados. La carga total de los iones se representa usualmente por q (q=ze), donde e es la carga del electrn y z el nmero de cargas sobre el in.
La masa se expresa en unidades de masa atmica (u) o Dalton (Da) (1u = 1Da = 1.6654 10-27 kg) de manera que la razn masa/carga (m/z) se expresa en Thompson (Th = Da/z). Los iones as separados son detectados como corrientes inicas cuyas intensidades son proporcionales a sus abundancias respectivas. La Spectrometra de Masas NecesitaSistema de entradala muestra se introduce en el espectrometroFuente de iones la muestra se carga Analizador de masas Formadas como consecuencia de la ruptura de las molculas de la muestraDetector de ionesSistema de vacioSistema de controlSistema de datosIntro-duccin de muestraFuente de ionesAnalizadorDetector de ionesSistema de vacioSistema de control y manipulacin de datosIones en fase gaseosaClasificacin de ionesMass Spectrometry (MS)Introduce sample to the instrumentGenerate ions in the gas phaseSeparate ions on the basis of differences in m/z with a mass analyzer Detect ions
ComponentesVariantesSistema de entrada1 Directo2 Indirecto3 Columna capilar cromatogrficaFuente de iones1 Impacto electrnico2 Ionizacin qumica3 Ionizacin de campo4 Desorcin de campo5 Bombardeo con tomos rpidos6 Electroespray (nanospray, microespray)7 Matrix-assisted laser desortion (MALDI)Analizador de masas1 Cuadrupolo2 Trampa de iones (ion-trap)3 Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF)4 Analizador FT-ICRFormacin de iones en fase gaseosaMuestras gaseosas ya ionizadasEl movimiento de los iones en el campo puede ser manipulados fcilmente por campos electromagnticos.Espectrmetros muy sensibles precisosDesventajas:Dificultad de generar iones y colocarlos en fase gaseosaMuestras lquidasMuestras slidasInletIon SourceMassFilterDetectorDataSystemSistema de alto vacoTurbo bombasBombas de Difusion +Bombas de desbaste RotatoriasSample PlateTargetHPLCGCSolids probeMALDIESIIonSprayFABLSIMSEI/CITOFQuadrupoleIon TrapMag. SectorFTMSMicroch plateElectron Mult.Hybrid Detec.PCsUNIXMacSistemas de entrada
Sodas directas para slidos purosLas mezclas, deben separarse antes de entrar en el espectrmetroCromatgrafo de gasesCromatgrafo de lquidosequipos de cromatografa de lquidos (LC)Cromatografa de fluidos supercrticos, HPLC electroforesis capilar
Introduccin indirecta: En este sistema, la vaporizacin de la muestra se realiza en un recipiente externo al espectrmetro; un baln de vidrio o de metal esmaltado interiormente que se mantiene a temperatura elevada.slidos sublimables, liquidos Tb NH4+). 393 Bombardeo con tomos rpidos(Fast Atom Bombardment: FAB) la muestra est disuelta en una matriz lquida no voltil, siendo la glicerina la sustancia ms frecuentemente utilizada con este fin. Sobre la disolucin se hace incidir un flujo de tomos (Xe, Ar) con elevada energa cintica, logrndose extraer iones y partculas neutras hacia la fase gaseosa. En condiciones favorables las molculas de la muestra forman una monocapa en la superficie de la disolucin que puede mantenerse continuamente pese al bombardeo, por difusin de otras molculas de muestra del seno de la disolucin hacia dicha superficie. Esto garantiza dos caractersticas muy deseables: reproducibilidad y presencia reducida de iones procedentes de la matriz en el espectro.
3 Bombardeo con tomos rpidosDe acuerdo con el diagrama, inicialmente ocurre la ionizacin del argn, estos iones son acelerados, y en la cmara de intercambio el choque de los iones con tomos de argn genera el flujo de tomos rpidos: Ar.+ (rpido) + Ar (lento) ------------> Ar.+ ( (lento) + Ar ( rpido) El flujo pasa entre dos electrodos que elimina todas las especies inicas, de manera que solamente los tomos neutros rpidos impactan sobre la muestra disuelta en la matriz. Los iones extrados son acelerados y enfocados por electrodos hacia el analizador. 413 Bombardeo con tomos rpidosFAB es muy eficiente para producir iones a partir de compuestos polares con masas moleculares altas, siendo muy til para el estudio de pptidos y nucletidos. Como se trata de una tcnica de ionizacin blanda, los EM-FAB contienen esencialmente las seales de los iones pseudomoleculares y muy escasa presencia de iones fragmento. Gran Reproducibilidad y permite realizar diferentes tipos de anlisis a la misma muestra ya que mediante esta fuente, los flujos de iones pueden mantenerse por largos perodos de tiempo, en ocasiones de varios minutos.3 Bombardeo con tomos rpidos
La fuente de ionizacin FAB tiene baja sensibilidad comparada con otras fuentes recientemente desarrolladas. El uso de una matriz hace que los espectros sean ms complicados debido a las seales que las mismas introducen. En la Tabla 4.1 se dan los picos asociados a las matrices ms utilizadas en fuentes de ionizacin FAB.
3 Bombardeo con tomos rpidos4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz El pulso de lser realiza ambas funciones: la vaporizacin e ionizacin de la muestra.Generalmente, pulsos de lser intensos (106-1010 W cm-1) se enfocan sobre una superficie reducida de muestra (10-3 - 10-4 cm2), usualmente un slido. Esos pulsos de lser crean un microplasma de iones y molculas neutras, los cuales pueden reaccionar entre ellos en la densa fase vapor, cerca de la superficie de la muestra.
454 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz
Iones se generan en corto intervalos de tiempoRequieren analizadores rpidos de deteccin simultanea o de tiempo de vueloLos iones producidos de la fragmentacin molecular son >500 DPara superar inconvenientes MALDIMALDI (Matrix-Assisted Laser Desortion Ionization)1) La muestra en estudio se disuelve en una matriz de molculas pequeas con gran poder de absorcin del laser2)La mezcla se seca , se elimina el disolvente lquido, queda la muestra dispersa en cristales de disolvente (mezcla eutctica)2) Aplicacin de impulsos intensos de laser sobre la disolucin slida produce la sublimacin de los cristales de la matriz que se expande en la fase gaseosa entrando en esta las molculas a estudiar que se ionizan mediante: fotodisociacin, transferencia protnica del estado excitado, reacciones ion-molcula o desorcin de iones preformados474 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz
Tcnica mas sensible que las anteriores de laserLa presencia de molculas de matriz hace que la muestra se disperse en ella y se evitan agrupaciones moleculares que impidan la formacin de iones molecularesLa matriz tambin sirve para minimizar el dao que puede causar el pulso de lser a la muestra, absorbiendo la mayor parte de la energa incidente e incrementando la eficiencia de la transferencia de energa del lser a la muestra. Por esta va se incrementa notablemente la intensidad No es necesario ajustar la longitud de onda para hacerla coincidir con la absorcin de cada muestra pues es la matriz la que absorbe la radiacin del lser.MALDI permite la desorcin e ionizacin de sustancias con masas moleculares muy altas. Por ejemplo, es posible la deteccin de picomoles de protenas con masas moleculares superiores a 300 000 Da. 4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz La fuente de ionizacin MALDI es ms sensible que otras tcnicas de ionizacin por lser, a lo cual contribuyen diferentes factores. El nmero de molculas de la matriz excede ampliamente al de la muestra analizada, separando a stas y evitando la formacin de agrupaciones moleculares que pueden inhibir la aparicin de iones moleculares.49En la tcnica de ionizacin MALDI se han utilizado lseres de diferente tipo.
Los lseres ultravioleta (UV) son los ms utilizados debido a su fcil manipulacin y bajo costo, siendo los de nitrgeno (= 337 nm) los estndares. Tambin se pueden utilizar lseres infrarrojos (IR) tales como los de COB2B (= 10,6 m). Los espectros de masas MALDI obtenidos con lseres UV e IR son esencialmente idnticos. Una de las pocas diferencias es que en MALDI-IR ocurre menos formacin de aductos y menos fragmentacin que con un lser UV.4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz 50Las matrices deben: tener una fuerte absorbancia a la longitud de onda del lser masa suficientemente baja para que la sublimacin ocurra con facilidad, estabilidad al vaco y prcticamente carecer de reactividad qumica excepto su capacidad para ceder protones. No obstante, esta generalizacin es insuficiente para garantizar que se pueda disponer de una matriz apropiada, que contina siendo una seleccin guiada por la experiencia prctica. 4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz Los pasos ms importantes para la obtencin de un espectro de masas MALDI son la seleccin de la matriz y el protocolo de preparacin de la muestra. 51Los pasos ms importantes para la obtencin de un espectro de masas MALDI son la seleccin de la matriz y el protocolo de preparacin de la muestra. En la Tabla se incluyen algunas matrices UV-MALDI comunes. Una preparacin tpica de muestra para MALDI se logra disolviendo 20mg de cido sinpico en 1mL de una mezcla acetonitrilo: agua: cido trifluoroactico 50:50:0.1, se aade la muestra y finalmente se evapora cuidadosamente el solvente. 4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz Matriz UV MALDIAplicacionescido -ciano-4-hidroxicinmico Pptidos, protenas, compuestos orgnicos cido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinmico(sinpico) Biopolmeros de elevada masa molecular cido 2,5-dihidroxibenzico(gentsico) Pptidos,protenas, carbohidratos cido 3-hidroxipicolnico Oligonucletidos Trihidroxiacetofenona Oligonucletidos, pptidos cido 5-clorosaliclico Polmeros insolubles en agua. 4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz La espectrometra de masas con fuente de ionizacin MALDI es un poderoso mtodo para el estudio de polmeros y biopolmeros sintticos. Un espectro MALDI tpico incluye principalmente especies moleculares monocargadas (iones cuasimoleculares), algunos iones con carga mltiple y muy pocos fragmentos. En protemica se utiliza la tcnica MALDI-TOF para identificar protenas aisladas por electroforesis en gel y en la llamada peptide mass fingerprint (ver aplicaciones). En la Figura 4.11 se muestran dos espectros de masas obtenidos utilizando la fuente de ionizacin MALDI. Obsrvese en (a) la deteccin del in molecular del anticuerpo monoclonal y de algunas especies multicargadas y la ausencia de fragmentaciones. En el espectro del polimetacrilato de metilo (b) pueden detectarse las especies moleculares de diferente grado de polimerizacin. Figura
4 Ionizacin mediante desorcin por lser asistida por matriz
En la Figura 4.11 se muestran dos espectros de masas obtenidos utilizando la fuente de ionizacin MALDI. Obsrvese en (a) la deteccin del in molecular del anticuerpo monoclonal y de algunas especies multicargadas y la ausencia de fragmentaciones. En el espectro del polimetacrilato de metilo (b) pueden detectarse las especies moleculares de diferente grado de polimerizacin. Figura
555 Ionizacin por electronebulizacin (Nebulizacin elctrica)
5 Ionizacin por electronebulizacin (Nebulizacin elctrica) 1) La muestra se disuelve en una fase mvil voltilagua con acetonitrilo o metanol (1:1)2) se bombea a travs de un fino capilar de acero inoxidable cuyo extremo se encuentra a un potencial elctrico elevado (3-6 kV). 3) Este elevado potencial unido al pequeo radio de curvatura al final del capilar crean un fuerte campo elctrico, que produce reacciones de oxidacin-reduccin y hace que el lquido emerja como gotas finas cargadas elctricamenteLas formacin de las gotas dependen de:la velocidad del flujola tensin superficial la conductividad de la solucin (debe ser baja) Cionica=10-4 MLa nebulizacin ocurre a presin atmosfrica y es usualmente asistida por un flujo de nitrgeno.La niebla atraviesa una serie de cmaras con vaco creciente. La fuente de ionizacin por electronebulizacin (Electrospray Ionization: ESI) se incluye en el conjunto de tcnicas denominadas de ionizacin a presin atmosfrica (Atmospheric Pressure Ionization: API). En la Figura 4.12 se muestra un diagrama de una fuente ESI. La muestra se disuelve en una fase mvil voltil, tal como una mezcla de agua con acetonitrilo o metanol (1:1), se bombea a travs de un fino capilar de acero inoxidable cuyo extremo se encuentra a un potencial elctrico elevado (3-6 kV). Este elevado potencial unido al pequeo radio de curvatura al final del capilar crean un fuerte campo elctrico, que produce reacciones de oxidacin-reduccin y hace que el lquido emerja como gotas finas cargadas elctricamente. En la formacin de las gotas cargadas resultan crticas la velocidad del flujo, la tensin superficial y la conductividad de la solucin. La conductividad debe ser baja lo que implica concentraciones de electrolitos menores que 10P-4P M. La nebulizacin ocurre a presin atmosfrica y es usualmente asistida por un flujo de nitrgeno gaseoso (el gas nebulizador) que fluye a travs de un tubo coaxial al capilar principal. La niebla atraviesa una serie de cmaras con vaco creciente. La nebulizacin ocurre a presin atmosfrica y es usualmente asistida por un flujo de nitrgeno gaseoso (el gas nebulizador) que fluye a travs de un tubo coaxial al capilar principal. La niebla atraviesa una serie de cmaras con vaco creciente. Se realiza en condiciones atmosfricas de presin y temperatura. La disolucin de la muestra se bombardea a travs de una aguja capilar de acero inoxidable a un flujo de algunos microlitros por minuto. Las agujas se mantienen a un potencial de varios kV con respecto al electrodo cilndrico que rodea a dicha aguja. La niebla de finas gotitas cargadas resultantes pasa a travs de un capilar de desolvatacin donde se produce la evaporacin del disolvente y de las molculas del analito y donde estas adquieren la carga. Debido a que las gotitas se vuelven ms pequeas por la evaporacin del disolvente, su densidad aumenta producindose la desorcin de los iones en la atmsfera gaseosa. 575 Ionizacin por electronebulizacin (Nebulizacin elctrica)
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5 Ionizacin por electronebulizacin (Nebulizacin elctrica) Las fuentes de ionizacin EI y CI son generalmente las ms utilizadas para el estudio de compuestos de baja masa molecular (M < 1 000 Da), voltiles y trmicamente estables. La fuente CI genera espectros que tienen informacin sobre la masa molecular de la sustancia analizada, mientras que la fuente EI origina una gran fragmentacin, siendo muy til para obtener informacin estructural. Los espectros de masas obtenidos con una fuente de ionizacin EI son reproducibles y pueden ser utilizados para la identificacin estructural de sustancias con el auxilio de extensos bancos de datos, lo cual no ocurre con otras fuentes de ionizacin. Dado el carcter complementario de los espectros de masas EI y CI, resulta conveniente la obtencin de ambos para el anlisis de una sustancia. En el caso de compuestos trmicamente lbiles o con baja presin de vapor, los iones tienen que ser directamente extrados de la fase condensada, para lo cual existen dos variantes: la extraccin de iones de la fase lquida y de la fase slida. En el primer caso, la muestra se encuentra en disolucin, sta se transforma mediante un procedimiento de nebulizacin y las gotas formadas se introducen en el espectrmetro mediante el auxilio de una bomba de vaco. Las fuentes de ionizacin por electronebulizacin (ESI) y termonebulizacin corresponden a este tipo. En el caso de la fuente FAB se utiliza una matriz lquida no voltil. La fuente FAB es til para el estudio de sustancias de masa molecular elevada (6 kDa), no voltiles, polares y trmicamente inestables. Los pptidos, protenas pequeas y otros biopolmeros son ejemplos de sustancias a las cuales se ha aplicado con xito la tcnica de ionizacin FAB. No obstante la fuente FAB ha sido gradualmente sustituida en este campo por fuentes como MALDI y ESI. En el caso de una fuente de ionizacin con extraccin de iones de la fase slida, la muestra se encuentra embebida en una matriz y sta se irradia con partculas energizadas o fotones que desorben iones cercanos a la superficie slida. Esos iones pueden ser extrados mediante un campo elctrico y enfocados hacia el analizador. La fuente de ionizacin MALDI es apropiada para registrar espectros de masas de sustancias con propiedades similares a las descritas para la fuente FAB, pero su sensibilidad es muy superior. Se aplica a compuestos con masas moleculares por sobre 500 kDa. Dado que los iones producidos por esas fuentes son predominantemente monocargados, la elevada razn masa/carga hace necesaria la utilizacin de analizadores con gran alcance de masas, como los de tiempo de vuelo.La fuente de ionizacin ESI es apropiada para compuestos similares a los que se estudian mediante la fuente MALDI, con una ligera reduccin en la sensibilidad y en el rango de masas. Cuando se utiliza esta tcnica, se generan iones con carga mltiple, lo cual hace que la razn masa /carga se encuentre dentro del alcance de masas de los espectrmetros de masas comunes, aun para protenas de elevadas masas moleculares. En la Tabla 4.3 se resumen los aspectos bsicos analizados sobre las fuentes de ionizacin que hemos considerado previamente.59AnalizadoresTienen como misin separar y enfocar los iones generados en la fuente de ionizacin hacia el detector de acuerdo con la relacin m/zLos analizadores constan de campos elctricos y magnticos que se llaman lentes60Caractersticas de los analizadoresel lmite de masas superior o alcance de masas valor ms alto de la razn m/z que puede ser medido (thomson (Th) o unidades atmicas (u))
la transmisin (razn entre el nmero de iones que llega al detector y el nmero de iones producido en la fuente)
la resolucin (resolucin es la capacidad del espectrmetro para detectar seales diferentes correspondientes a iones con una diferencia de masas pequea)Las tres caractersticas principales de un analizador son el lmite de masas superior o alcance de masas, la transmisin y la resolucin. El lmite de masas es el valor ms alto de la razn m/z que puede ser medido y se expresa en thomson (Th) o unidades atmicas (u) para un ion portador de una carga elemental, esto es z =1.
La transmisila razn entre el nmero de iones que llega al detector y el nmero de iones producido en la fuenten es.
El poder de resolucin es la capacidad del espectrmetro para detectar seales diferentes correspondientes a iones con una diferencia de masas pequea.Al igual que existe una gran variedad de fuentes de ionizacin, tambin existen analizadores de diferente tipo. Luego de que los iones se han producido en la fuente de ionizacin, deben ser separados y enfocados hacia el detector de acuerdo con el valor de la razn masa/ carga de cada uno. Esto se logra mediante los analizadores, que constituyen la ptica inica de un espectrmetro de masas. Esta ptica inica es frecuentemente un sistema de campos elctricos y magnticos mediante el cual un flujo de iones puede ser separado en sus componentes de acuerdo con sus valores de m/z y enfocado hacia el detector. Al sistema de campos elctricos y magnticos se le denomina lentes, por analoga con su contraparte ptica.
El lmite de masas es el valor ms alto de la razn m/z que puede ser medido y se expresa en thomson (Th) o unidades atmicas (u) para un ion portador de una carga elemental, esto es z =1. La transmisin es la razn entre el nmero de iones que llega al detector y el nmero de iones producido en la fuente. El poder de resolucin es la capacidad del espectrmetro para detectar seales diferentes correspondientes a iones con una diferencia de masas pequea.Al igual que existe una gran variedad de fuentes de ionizacin, tambin existen analizadores de diferente tipo.
61Analizador de sector magnticoCuando especies cargadas en movimiento son sometidas a la accin de un campo magntico sufren deflexin, bajo la accin de fuerzas descritas por la ley de Lorentz y cuya magnitud est gobernada por el momento del in, tal como se muestra en la Figura 4.15. La energa cintica del in es esencialmente la adquirida a travs de la aceleracin a la salida de la fuente inica y viene dada por:Cuando especies cargadas en movimiento son sometidas a la accin de un campo magntico sufren deflexin, bajo la accin de fuerzas descritas por la ley de Lorentz y cuya magnitud est gobernada por el momento del in, tal como se muestra en la Figura 4.15. La energa cintica del ion es esencialmente la adquirida a travs de la aceleracin a la salida de la fuente inica y viene dada por:1mv2 zV[4.2] 2siendo Vel potencial de aceleracin aplicado a los iones que salen de la fuente inica y z el nmero de cargas sobre cada ion de masa m que se mueve a la velocidad v.62
Energa cintica de los ionesV= potencial de aceleracin aplicado a los iones que salen de la fuente inica y z el nmero de cargas sobre cada ion de masa m que se mueve a la velocidad v.La fuerza centrpeta sobre el in que experimenta la accin del campo magntico B es igual a la fuerza ejercida por dicho campo sobre una carga en movi_. miento: r es el radio del arco de la trayectoria del ion que es deflectadoCuando especies cargadas en movimiento son sometidas a la accin de un campo magntico sufren deflexin, bajo la accin de fuerzas descritas por la ley de Lorentz y cuya magnitud est gobernada por el momento del in, tal como se muestra en la Figura 4.15. La energa cintica del ion es esencialmente la adquirida a travs de la aceleracin a la salida de la fuente inic63
m rm rV rB rB r
Es posible lograr que los iones alcancen a un solo punto del detector de forma secuencial, lo cual significa que r se mantiene constante, de donde:
V constante y variando el campo magntico B y el alcance de masas depende de la potencia del magneto.Analizador de sector elctrico
Un analizador electrosttico (AE) est compuesto por dos arcos de seccin cilndrica cargados elctricamente tal como se muestra en la Figura. Este analizador realiza enfoque direccional (o angular) y tambin dispersivo de la energa de un haz de iones.
67donde E es el potencial elctrico (voltaje) entre los platos del analizador electrosttico y r el radio de curvatura de la trayectoria del in. Es evidente que los iones con igual energa cintica se movern en una trayectoria comn de igual radio r. Por lo tanto un analizador electrosttico dispersa un haz inico de acuerdo a sus energas cinticas.
Segn la ecuacin [4.8], en el sector elctrico la trayectoria de un haz de iones con igual energa cintica describe un arco que depende solamente del voltaje de aceleracin V y del campo elctrico E del analizador electrosttico.Combinacin de analizadores magntico-electrostticoLos sistemas combinados que hacen uso de analizadores electrostticos y magnticos estn presentes en los equipos EM llamados de doble enfoque o doble sector. En esta combinacin el flujo de iones puede ser colimado primero en un analizador electrosttico y entonces los haces correspondientes a iones de igual relacin m/z pero diferencias ligeras en sus energas cinticas pueden ser reenfocados por el analizador magntico tal como se muestra en la Figura 4.19.
El espectrmetro de masas de doble enfoque est diseado de forma tal que iones de la misma masa con energas diferentes converjan a un mismo punto del registrador por lo que estos equipos poseen muy alta resolucin y se pueden utilizar para la determinacin de frmulas globales de los iones (ver epgrafe 4.2.2.6) y mediciones muy exactas de masas moleculares.Los sistemas pticos de espectrometra de masas de doble enfoque pueden ser de dos tipos en dependencia de las posiciones relativas de los analizadores magntico y elctrico. En la Figura 4.18 se ha mostrado el de geometra directa (configuracin EB o de Nier-Johnson) donde el haz inico penetra primero en el analizador electrosttico. En los equipos con geometra inversa el haz inico penetra primero en el analizador magntico. El sistema de doble enfoque permite compensar la dispersin del haz inico debido a las diferencias en energa cintica en el mismo y garantiza que iones con el mismo valor de la razn m/z lleguen a un mismo punto del registrador, garantizando un alto poder de resolucin, por lo que son muy tiles para la determinacin exacta de valores de m/z, por el amplio rango de masas que cubren y por su sensibilidad sobre todo a valores elevados de la razn m/z.70 Analizador cuadrupolar
Los analizadores de masas cuadrupolares se componen de cuatro varillas paralelas equidistantes a un eje central imaginario, como se muestra en la Figura 4.20. La seccin transversal contiene las cuatro superficies conductoras o polos que adoptan idealmente la forma de 2 hiprbolas ortogonales. A las varillas opuestas, que corresponden a cada una de las hiprbolas, se le aplica un potencial electrosttico U (500-2000 V) de igual signo y opuesto al de las otras dos varillas. Adicionalmente se aplica un potencial alterno V (0- 3000 V) asociado con una radiofrecuencia :0 = +(U V cost)0 = (U V cost)En estas condiciones los iones avanzarn a lo largo del analizador siguiendo trayectorias oscilantes siendo repelidos y atrados continuamente por las placas polares. Para valores definidos de U y V slo
Es posible resumir el trabajo de un analizador cuadrupolar de la manera siguiente: mediante la aplicacin de potenciales elctricos estticos y alternantes a un ordenamiento de cuatro placas polares paralelas, un haz de iones puede ser filtrado a lo largo de su eje central para dar un espectro de masas. Los analizadores cuadrupolares son los ms ampliamente utilizados en los EM modernos.
Un cuadrupolo con potencial esttico U nulo y valores adecuados del potencial alterno V puede utilizarse para explotar la capacidad de estos sistemas para enfocar los iones hacia el eje central del mismo, actuando como un lente de enfoque y dejando que todos los iones de relaciones m/z superiores a un mnimo dado por V lo atraviesen.
71atravesarn el analizador cuadrupolar los iones con determinada m/z, los dems se desestabilizan y chocan contra las paredes. Manteniendo constante la razn entre la amplitud de los campos esttico y oscilante (U/V constante) y variando su intensidad puede lograse que salgan sucesivamente del analizador iones de diferentes m/z y generarse un espectro de masas. Analizador cuadrupolarEl funcionamiento del analizador cuadrupolar no depende de la energa cintica de los iones cuando stos abandonan la fuente de ionizacin. Es prctica comn acelerarlos 10-15 eV. Se requiere que el tiempo empleado por los iones en transitar el analizador sea corto comparado con el necesario para cambiar la seleccin de un valor de m/z a otro pero lo suficientemente largo para que ocurran varias oscilaciones del potencial alterno. El alcance de masas, o relacin m/z mas elevada detectable, se limita a unos 4000 Th. Analizador cuadrupolarDado que la velocidad de barrido de un analizador cuadrupolar puede ser de 1000 Th/s e incluso mayor, el barrido de un espectro completo es muy rpido lo que resulta muy apropiado para su acoplamiento con sistemas cromatogrficos y en el estudio de reacciones rpidas. Estos analizadores son adems robustos, muy compactos, de bajo costo comparados con otros tipos de analizadores y de fcil utilizacin. Por otra parte, se trata de instrumentos de baja resolucin (~3000), lo cual implica que usualmente los espectrmetros de masas con analizadores cuadrupolares son operados a "resolucin unitaria ", es decir que trabajan con resolucin suficiente para separar dos picos distantes una unidad de masas. Analizador cuadrupolarEs posible resumir el trabajo de un analizador cuadrupolar de la manera siguiente: mediante la aplicacin de potenciales elctricos estticos y alternantes a un ordenamiento de cuatro placas polares paralelas, un haz de iones puede ser filtrado a lo largo de su eje central para dar un espectro de masas. Los analizadores cuadrupolares son los ms ampliamente utilizados en los EM modernos.
Un cuadrupolo con potencial esttico U nulo y valores adecuados del potencial alterno V puede utilizarse para explotar la capacidad de estos sistemas para enfocar los iones hacia el eje central del mismo, actuando como un lente de enfoque y dejando que todos los iones de relaciones m/z superiores a un mnimo dado por V lo atraviesen. Analizador cuadrupolar75Est muy extendido el EM cuadrupolar triple con 3 cuadrupolos: el primero separa los iones procedentes de la fuente inicael segundo se realiza la activacin colisional de los iones con un gas inerte o se producen reacciones in-molcula si el gas es reactivo, actuando como lente, el tercero se analizan los iones resultantes de la fragmentacin de los iones generados en el segundo sistema de cuadrupolos.
Un espectrmetro de masas puede utilizar varios analizadores cuadrupolares situados uno despus de otro (tndem de masas en el espacio), con lo que se pueden realizar diferentes tipos de barrido. Est muy extendido el EM cuadrupolar triple con 3 cuadrupolos: el primero separa los iones procedentes de la fuente inica, en el segundo se realiza la activacin colisional de los iones con un gas inerte o se producen reacciones in-molcula si el gas es reactivo, actuando como lente, y en el tercero seanalizan los iones resultantes de la fragmentacin de los iones generados en el segundo sistema de cuadrupolos. En la Figura 4.21 se muestra un esquema de este tipo de instrumento.
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En la Figura 4.22 se muestran diferentes tipos de barrido para un tndem de 3 cuadrupolos. Esta configuracin incrementa notablemente la capacidad del espectrmetro al poder realizar barrido de iones fragmento, barrido de prdida de fragmentos neutros e identificacin de iones precursores.El primer tipo de barrido consiste en seleccionar un in de determinada m/z mediante el primer espectrmetro o analizador cuadrupolar EM-1. Este in se activa por colisiones con molculas de un gas inerte en el segundo cuadrupolo, que acta como lente focalizador de iones, inducindose fragmentaciones. Los productos de las reacciones son analizados en el tercer cuadrupolo, que acta como un segundo espectrmetro de masas, EM-2. Este barrido se denomina de iones fragmento o de iones hijos.La segunda posibilidad consiste en enfocar el segundo espectrmetro en un in seleccionado de determinada m/z y utilizar el primer cuadrupolo EM-1 para realizar un barrido de m/z. Todos los iones que producen el seleccionado por fragmentacin sern detectados. Este mtodo se denomina barrido de precursores o de iones padres.En el tercer tipo de tndem ambos espectrmetros realizan barridos pero con una diferencia de masas m constante entre ellos. Para un valor seleccionado de m cuando un in de masa m es seleccionado en EM-1 y se fragmenta para dar un in en m - m, ser detectado en EM-2. Este tipo de barrido se denomina de fragmentos neutros. As por ejemplo, los alcoholes tienden a perder agua. Un barrido de este tipo con m = 18 permitir detectar los alcoholes presentes en una mezcla.78Es un dispositivo formado por tres electrodos, dos de ellos hiperblicos, y entre estos un electrodo en forma de anillo toroidal. El sistema tiene el mismo fundamento que el analizador de cuadrupolo.Se aplican, simultneamente, una corriente continua y un potencial de radiofrecuencia, de tal forma que los iones generados quedan confinados dentro del anillo toroidal.Los iones son expulsados de la cmara tras la aplicacin de rampas de radiofrecuencia. Conforme aumenta el voltaje, aumenta la amplitud de su movimiento oscilatorio hasta ser expulsados. Los iones de mayor masa se desestabilizan conforme va aumentando el voltaje de radiofrecuencia, de tal forma que los iones se detectan de forma secuencial, obteniendo as el espectro en funcin del voltaje y la masa.En sistemas que usan este analizador, la ionizacin se suele realizar por impacto electrnico por medio de una fuente pulsante. Analizador de trampa de iones.Concebido al mismo tiempo que el analizador de cuadrupolo y por la misma persona (Wolfgang Paul, Premio Nbel ) su fsica es muy similar. Los iones generados en la fuente son atrapados, durante un cierto tiempo, en un campo de radiofrecuencia dentro de un anillo toroidal situado entre dos electrodos hiperblicos. Mediante la aplicacin simultanea de corrientes DC y RF se consigue atrapar y mantener dentro del anillo central los iones procedentes de la fuente de iones. Una vez all, dichos iones pueden ser extrados a voluntad aplicando corrientes de radiofrecuencia variables hasta valores de resonancia y expulsados a traves del anillo de salida. La posicin de los anillos exteriores puede ser modificada para una mayor eficiencia de transmisin. Un espectro de masas completo se obtiene mediante el barrido de un rango de radiofrecuencia determinado. Las trampas inicas tienen usos y utilizaciones similares a los cuadrupolos y est muy extendido su uso como detectores de masas en sistemas CG-EM. Otra aplicacin muy extendida es la posibilidad de utilizarlos en la tcnica de masas-masas (MSn), puesto que permite la extraccin de iones individuales (Parents Ions) que posteriormente pueden ser fragmentados para anlisis estructural ( Daughter Ions)79
Analizador de trampa de iones.Estos dos voltajes de radiofrecuencia dan lugar a un campo electromagntico cuadrupolar tridimensional en el que quedan confinados los iones con una trayectoria oscilante estable, dependiendo el movimiento exacto de cada ion de los voltajes aplicados y de su relacin m/z. Para detectar los iones, se altera la seal de radio-frecuencia del electrodo anular, lo que da lugar a la desestabilizacin de la trayectoria de un ion en concreto que es eyectado de la trampa. Un cambio gradual en la amplitud del campo de radiofrecuancia, dar lugar a que los iones sean eyectados de la trampa en orden creciente de su relacin m/z, lo que dar: Analizador de trampa de iones.Durante el proceso de analisis de masas, se aplica entre los electrodos superior e inferior un potencial de radiofrecuencia de 525 kHz (voltaje de modulacin axial); al mismo tiempo, sobre el electrodo central se aplica otro voltaje de radiofrecuencia de 1,1 MHz y de amplitud variable entre 0 y 7.500 V. Estos dos voltajes de radiofrecuencia dan lugar a un campo electromagntico cuadrupolar tridimensional en el que quedan confinados los iones con una trayectoria oscilante estable (figura 10), dependiendo el movimiento exacto de cada ion de los voltajes aplicados y de su relacin m/e. Para detectar los iones, se altera la seal de radiofrecuencia del electrodo anular, lo que da lugar a la desestabilizacin de la trayectoria de un ion de concreto que es eyectado de la trampa. Un cambio gradual en la amplitud del campo de radiofrecuancia, dar lugar a que los iones sean eyectados de la trampa en orden creciente de su relacin m/e, lo que darFigura 10. Ion con trayectoria establelugar a un espectro de masas.El analizador de trampa de iones presenta la ventaja de ofrecer una sensibilidad bastante ms elevada que las conseguidas utilizando otros analizadores; al mismo tiempo, su velocidad de barrido es tambin muy alta, por lo que sus pretaciones como detector cromatogrfico son francamente buenas. Por otro lado, debe tenerse en cuenta que al existir una concentracin de iones bastante elevada en el interior de la "trampa", es relativamente frecuente la existencia de reacciones bimoleculares entre los iones, lo que puede dar lugar a espectros con esquemas de fragmentacin diferentes a los que se obtienen por medio de los otros tipos de analizadores.81
Trampa de iones
Ventajas:Las trampas inicas son muy simples y de bajo coste, y se caracterizan porque son muy sensibles.Inconvenientes:tienen poca capacidad de resolucin y hay probabilidad de que se produzcan interacciones in-molcula, por lo que suelen estar asociados a un cromatgrafo de gases.
Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)1)Los iones son extrados en pulsos de la fuente de ionizacin2) inmediatamente son acelerados mediante la accin de un campo elctrico para lograr la uniformidad en sus energas cinticas antes de que entren al analizador. 3) Los iones con movimiento rectilneo uniforme atraviesan un tubo evacuado hacia el detector. El tiempo necesario para atravesar la longitud del tubo (tiempo de vuelo) depende del valor de la razn m/z de cada ion. Para iones con carga unitaria (z=1; m/z=m), el tiempo necesario para recorrer la distancia de la fuente al detector es depende de su masa, de manera que mientras mayor sea sta, ms lentamente llegar el ion al detector.87En el caso del analizador TOF no existen campos elctricos o magnticos que obliguen a los iones a describir complicadas trayectorias. En la Figura 4.23 se ilustra el funcionamiento de un analizador TOF, que en este caso se denomina TOF-lineal.Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)Funcionamiento de un analizador TOF, que en este caso se denomina TOF-lineal.
Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)90
Si d es la distancia de la fuente de ionizacin al detector, entonces el tiempo necesario para que un in atraviese el tubo de corrimiento ser:
manteniendo E constante en el instrumento, el tiempo de vuelo resulta:Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)ventajastiles combinados con fuentes de ionizacin blandas en el anlisis de macromolculas. Los analizadores TOF tienen una transmisin inica eficiente por lo que son instrumentos muy sensibles. Adems, el barrido de un espectro es muy rpido, por lo que son componentes ideales en los equipos acoplados con cromatgrafos.Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)desventajassu baja resolucin espectral, lo que tiene su origen en que iones de igual m/z presentan cierta dispersin en los valores de energa cintica despus de la aceleracin, y por lo tanto, iones de un valor de m/z dado se superponen con los valores de m/z prximos al llegar al detector.
Entre las variantes ms utilizadas para enfrentar esta dificultad se destaca la utilizacin de un reflector inico electrosttico, denominado reflectrn, que usualmente est compuesto por una serie de rejillas y electrodos de anillo. El reflectrn crea un campo retardador que acta como un espejo y enva los iones de retorno hacia el tubo de vuelo
Analizadores de tiempo de vuelo(Time-Of-Flight: TOF)
Los iones con ms alta energa cintica penetrarn ms profundamente en el reflectrn y por lo tanto, estarn un tiempo mayor en el mismo. As, estos iones impactarn al detector al mismo tiempo que aquellos iones ms lentos que tienen el mismo valor de m/z y penetran menos en l. El reflectrn incrementa la resolucin espectral a expensas de la sensibilidad, dado que muchos iones se pierden en su rea, y adems introduce una limitacin en el alcance de masas. Este sistema se denomina TOF-reflectrn, para diferenciarlo del TOF-lineal.94
Modo de accin del reflectnComo se puede apreciar, un pulso de iones se extrae de la fuente de ionizacin. Es necesario que la extraccin de los iones sea en forma de pulsos, pues resulta importante que todos salgan de la fuente de ionizacin simultneamente. De inmediato los iones son acelerados mediante un campo elctrico E, de manera que la energa cintica que adquieren viene dada por:mv2 zeE[4.9] 22zeE12 Reordenando:v m[4.10]Si d es la distancia de la fuente de ionizacin al detector, entonces el tiempo necesario para que un ion atraviese el tubo de corrimiento ser:t = d (m/z)1/2 / (2eE) 1/2[4.11] y manteniendo E constante en el instrumento, el tiempo de vuelo resulta:t (m/z)1/2[4.12] Es decir, el tiempo de vuelo t es proporcional a la raz cuadrada de m/z.En principio, no existe un lmite superior en el rango de valores de la masa de los analizadores TOF, lo que los hace especialmente tiles combinados con fuentes de ionizacin blandas en el anlisis de macromolculas. Los analizadores TOF tienen una transmisin inica eficiente por lo que son instrumentos muy sensibles. Adems, el barrido de un espectro es muy rpido, por lo que son componentes ideales en los equipos acoplados con cromatgrafos. La deficiencia principal de los analizadores TOF es su baja resolucin espectral, lo que tiene su origen en que iones de igual m/z presentan cierta dispersin en los valores de energa cintica despus de la aceleracin, y por lo tanto, iones de un valor de m/z dado se superponen con los valores de m/z prximos al llegar al detector. Entre las variantes ms utilizadas para enfrentar esta dificultad se destaca la utilizacin de un reflector inico electrosttico, denominado reflectrn, que usualmente est compuesto por una serie de rejillas y electrodos de anillo. El reflectrn crea un campo retardador que acta como un espejo y enva los iones de retorno hacia el tubo de vuelo(Figura 4.24).
95Resonancia ciclotrn-ion y Espectrometra de Masas por transformada de Fourier.Si un in penetra en una regin donde est presente un campo magntico y su vector velocidad es ortogonal al vector induccin magntica, comenzar a moverse describiendo un arco de crculo. A bajas velocidades y campo magntico suficientemente intenso, el radio de la trayectoria ser pequeo y en estas condiciones puede ser "atrapado" de forma tal que describa una trayectoria circular: este es el denominado movimiento ciclotrnico y el principio de la tcnica denominada Resonancia Ciclotrn-Ion (ICR).
Si un ion penetra en una regin donde est presente un campo magntico y su vector velocidad es ortogonal al vector induccin magntica, comenzar a moverse describiendo un arco de crculo. A bajas velocidades y campo magntico suficientemente intenso, el radio de la trayectoria ser pequeo y en estas condiciones puede ser "atrapado" de forma tal que describa una trayectoria circular: este es el denominado movimiento ciclotrnico y el principio de la tcnica denominada Resonancia Ciclotrn-Ion (ICR).96
Un ion de carga q (q = z.e) con velocidad lineal v inyectado en un campo magntico B experimentar una fuerza magntica equivalente a la fuerza centrpeta del movimiento:El in se estabilizar en una trayectoria en la cual:Sustituyendo la velocidad lineal v por la angular w , v = w r,y dado que = 2 ( frecuencia ciclotrnica) :As, tanto la velocidad angular como la frecuencia dependen de la razn z/m, siendo independientes de la velocidad lineal. En la mayora de los equipos ICR el campo magntico B es constante por lo que la frecuencia ciclotrnica (kHz-MHz) depende solo de la razn m/z. No obstante, el radio de la trayectoria crece, para un ion dado, proporcionalmente con la velocidad lineal segn la ecuacin a determinacin de la masa en este caso consiste en la determinacin de la frecuencia, lo cual puede ser hecho con mtodos diferentes, que son clasificados en dos categoras: los que se basan en la observacin de frecuencias aisladas y los que utilizan ondas complicadas y transformaciones de Fourier.97a determinacin de la masa en este caso consiste en la determinacin de la frecuencia, lo cual puede ser hecho con mtodos diferentes, que son clasificados en dos categoras: los que se basan en la observacin de frecuencias aisladas y los que utilizan ondas complicadas y transformaciones de Fourier. Resonancia Ciclotrn IonTransformada de Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR, FT-MS)Resonancia ciclotrn-ion y Espectrometra de Masas por transformada de Fourier.Resonancia Ciclotrn Ion
magntico B est orientado a lo largo del eje-z. Los iones son inyectados en la trampa a lo largo del ese eje-z, siendo atrapados en esa direccin por un potencial elctrico V (tpicamente de 1V) aplicado a los platos frontal y trasero. Los iones rotan en el plano xy alrededor del eje-z debido al movimiento ciclotrnico. El sentido de la rotacin indicado en la Figura corresponde a iones positivos.La aplicacin de una radiacin electromagntica (platos emisores en la Figura 4.26) solo modifica el estado de movimiento de los iones si aqulla posee la misma frecuencia que la del movimiento ciclotrnico,; es ,pues, un fenmeno de resonancia. Los iones pueden en estas condiciones absorber energa de la radiacin. La energa que de esta forma se transfiere al ion eleva su energa cintica e incrementa el radio de la trayectoria. Es posible medir la corriente imagen inducida por la circulacin de los iones en la pared de la celda perpendicular a la trayectoria de los iones (platos receptores).99Para que los iones puedan ser detectados, tienen que circular en sus rbitas coherentemente como paquetes compactos. Cuando esto se cumple, iones de la misma m/z excitados con la misma energa se encontrarn en la misma rbita y rotarn con la misma frecuencia. Si los iones estuvieran distribuidos aleatoriamente en cualquier parte la rbita, cuando uno de ellos pasa cerca de uno de los platos detectores, estadsticamente habr otro de igual m/z pasando cerca del plato detector opuesto, por lo que la corriente inducida resultante sera nula. Para lograr observar una seal, los iones tienen que ser excitados en un intervalo de tiempo muy corto, tal que se encuentren agrupados en la rbita y de esa forma estn en fase.
Transformada de Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR, FT-MS)Esta tcnica consiste en la excitacin simultnea de todos los iones presentes en el ciclotrn mediante un barrido rpido de un rango amplio de frecuencias en un tiempo de alrededor de 1 s. Esto induce trayectorias que se acercan a la pared perpendicular a la rbita donde los iones se mueven en fase (coherencia). Lo importante es que iones de determinada m/z tienen una frecuencia ciclotrnica caracterstica.El registro de la corriente imagen como funcin del tiempo permite, mediante una transformacin de Fourier, obtener el espectro de frecuencias ciclotrnicas que se corresponde con el espectro de masas(Figura 4.27). Estos analizadores actan simultneamente como detectores (a travs de la corriente imagen) y permiten conservar a los iones para manipulaciones posteriores.
Los equipos FT-MS son excelentes en cuanto a resolucin y sensibilidad en el campo de la EM pero su alto costo hace que estn poco difundidos.Los mtodos experimentales basados en la Resonancia Ciclotrnica permiten la observacin de iones durante un perodo de tiempo prolongado, lo que posibilita la deteccin de iones de elevada m/z que se desplazan lentamente en el ciclotrn y que no son observables mediante otras tcnicas de Espectrometra de Masas. El hecho de que la Resonancia Ciclotrn Ion posibilite la eliminacin selectiva de iones de la celda mediante irradiacin intensa a la frecuencias de resonancia correspondientes a cada uno, y que tambin se puedan mantener iones de un solo valor de la razn m/z dentro de la celda, hace factibles los estudios de altaresolucin de reacciones inicas. Con esta tcnica, al igual que con permite la trampa de iones, es posible el trabajo en tndem en el tiempo (MSn).
105 Detectores DETECTOR PUNTUAL:Si el analizador es cuadrupolar el detector necesita cubrir solamente un punto o foco en el espacio, de manera que un espectro de masas completo se registra en el dominio del tiempo. Este tipo de detector de iones se denomina detector puntual.
DETECTOR COMPUESTO Un analizador de sector magntico puede separar iones en el espacio, lo cual permite que su llegada al detector pueda ser registrado de forma simultnea. Este tipo de detector inico se denomina detector compuesto, el registro del llegada de los iones se realiza en el dominio del espacio106Clases de detectores
Multiplicadores electrnicos
Un ion positivo o negativo proveniente del analizador y registrado en el dinodo de conversin causa la emisin de varias partculas secundarias, las cuales pueden a su vez dar lugar a iones positivos y negativos, as como a partculas neutras. Cuando iones positivos impactan al dinodo de conversin de alto voltaje negativo, las partculas secundarias de inters sern iones negativos y electrones. Por el contrario, cuando iones negativos impactan al dinodo de conversin de alto voltaje positivo, las partculas secundarias de inters sern iones positivos. Esas partculas secundarias son aceleradas en el dinodo continuo e impactan al ctodo con energa suficiente para desalojar electrones en la medida en que chocan con las paredes internas curvilneas. Los electrones pasan posteriormente al multiplicador electrnico e impactan nuevamente las paredes, y causan la emisin de ms y mselectrones en la medida en que se desplazan hacia el potencial situado al final de las paredes. De esa forma se crea una cascada de electrones que finalmente origina una corriente medible al final del multiplicador electrnico. La potencia de amplificacin es el producto del factor de conversin (nmero de partculas secundarias emitidas por el dinodo de conversin) y el factor de multiplicacin del multiplicador electrnico dinodo continuo. Este valor puede resultar del orden de 107. Los multiplicadores electrnicos son muy sensibles, si bien es cierto que su tiempo de vida es limitado debido a la contaminacin de la superficie por los iones o por un vaco relativamente pobre.Detector (colector) inico compuestoEl detector inico compuesto consiste en un nmero de elementos de deteccin inicos ordenados en una lnea o en varias lneas unas sobre otras en un plano. Cada elemento de deteccin es un multiplicador electrnico. Por esta razn, para la construccin de los detectores compuestos, los multiplicadores electrnicos individuales tienen que ser muy pequeos, de manera que puedan ser situados unos al lado del otro en el menor espacio posible. Por ello, el diseo de un elemento de un detector compuesto es significativamente diferente al de un multiplicador electrnico estndar utilizado para un detector de iones puntual, aun cuando sus mtodos de trabajo son similares. Considere un detector compuesto por dos multiplicadores electrnicos, como se muestra en la Figura 4.30 y suponga que un flujo de iones ha sido dispersado de acuerdo con los valores de m/z 200 y 201.
El ion de m/z 200 entrar al primer elemento del detector y el de m/z 201 al segundo, de forma tal que iones con los valores sealados de m/z pueden ser detectados separadamente a este nivel de dispersin. De acuerdo con esta idea, puede asumirse detectores equivalentes con n elementos. Una extrapolacin de lo anterior lleva a que ms valores de m/z pueden ser obtenidos si existen ms elementos de deteccin. Sin embargo, ubicar un nmero muy grande de elementos en un detector compuesto se torna tanto ms difcil mientras mayor sea el nmero de elementos del detector, y en la prctica se utiliza un nmero limitado de elementos.detectores compuestos pueden ser utilizados para registrar amplias regiones de un espectro de masas a baja resolucin y slo regiones pequeas a alta resolucin. La mayor ventaja de los detectores de iones compuestos sobre los detectores de iones puntuales se encuentra en la posibilidad que brindan de registrar un rango de valores de m/z y la abundancia correspondiente de los iones, todo a un mismo tiempo, que adems es muy breve.Hay dos situaciones importantes en las cuales son preferibles mediciones rpidas en espectrometra de masas:1.- Cuando se utilizan fuentes de ionizacin como la desorcin por laser, en cuyo caso se produce un pulso en un intervalo de tiempo muy corto, usualmente del orden de los nanosegundos.Si el detector se demora 1s para intentar barrer el rango de valores de m/z de los iones producidos, slo podr detectar iones durante los primeros nanosegundos. Los detectores puntuales no valen, si los compuestosCuando resulta necesario detectar trazas de un material. El problema prctico es que el espectro de masas debe ser registrado lo ms rpidamente posible, para evitar el riesgo de que los fragmentos inicos de la sustancia que existe en tan baja cantidad no sean detectados durante el barrido. El detector de iones compuesto permite registrar una regin estrecha del espectro e incluso monitorear un solo valor de m/z.
PCEs tambin un instrumento que tiene que ser calibrado y controlado en su funcionamiento. Las computadoras juegan un rol esencial en todos estos aspectos. La seal que sale de un espectrmetro de masas es un voltaje analgico de amplitud variable en el tiempo, que debe ser transformada a digital para que pueda ser almacenada en la memoria de la computadora. Esto se logra mediante un convertidor analgico-digital (ADC). Los convertidores ADC/DAC permiten el acoplamiento espectrmetro-computadora.mediante el acoplamiento espectrmetro-computadora se logra la adquisicin y procesamiento de datos experimentales, el control del funcionamiento del espectrmetro de masas y la presentacin y manipulacin de la informacin obtenida.La seal digital proveniente del ADC es amplificada y procesada para estimar el rea (abundancia inica) y centro de gravedad (equivale al valor de m/z) de cada pico. Estas dos informaciones, que se guardan en la memoria de la computadora, identifican a cada pico del espectro de masas. Es importante destacar que los datos recogidos y almacenados corresponden solo a los picos y no a los intervalos entre ellos, lo cual significa que el procesador realiza una importante reduccin del volumen de informacin que se genera. Mediante las computadoras se controla el funcionamiento del espectrmetro de masas, introduciendo los valores de diferentes parmetros necesarios para el trabajo del instrumento. De forma anloga se realizan las calibraciones necesarias. 119Generar datos en la forma usual de un espectro de masas, es decir, valores de m/z e intensidades de l los picos, tanto para el espectro total como para un sector del mismo. Tambin pueden ser obtenidos datos dependientes del tiempo tales como: corriente inica total, temperaturas, voltajes, potenciales de aceleracin y otras variantes posibles.Creacin de bases de datos y utilizacin en el anlisis espectral. En estos casos los resultados confiables se han obtenido utilizando principalmente fuentes de ionizacin electrnica, las cuales generan espectros con buena reproducibilidad. Productos totalmente diferentes podran tener, de manera accidental, espectros de masas similares.Calcular las composiciones posibles de iones de una masa dada, teniendo presente solamente los elementos incluidos en la frmula molecular.Acoplamiento con otras tcnicas instrumentales. 1 Acoplamiento cromatografa-espectrometra de masas. 2 Espectrometra de masas en tndem.Acoplamiento Cromatografa-Espectrometra de MasasLa Cromatografa es un mtodo utilizado para la separacin de mezclas en sus componentes individuales, haciendo que stos pasen a travs de una columna de un slido o un lquido. Para que ocurra el proceso cromatogrfico son necesarias una fase mvil y una estacionaria CG fase mvil es un gas y la estacionaria una columna embebida de lquido. En la Cromatografa Lquida (CL) la fase mvil es un lquido y la estacionaria generalmente es una columna de un slido poroso. El flujo de la fase mvil a travs de la estacionaria, fuerza a la mezcla a moverse por la columna cromatogrfica. Una variante de la (CL) es la Cromatografa Lquida de Alto Rendimiento (High Performance Liquid Chromatography: HPLC), en la cual la fase mvil se somete a presin para obtener una mayor eficiencia de separacin.Por su parte, la Espectrometra de Masas es un mtodo altamente eficiente para deducir la estructura qumica de una sustancia. Sin embargo, su utilidad es limitada en el anlisis de mezclas, debido a que el espectro de masas de stas es una complicada superposicin de los espectros correspondientes a los componentes individuales.
Para el anlisis de mezclas complejas de sustancias se utilizan los acoplamientos CG-EM y CL-EM. La idea esencial es realizar la separacin cromatogrfica de los componentes de la mezcla, que una vez separados se inyectan en sucesin al espectrmetro de masas para obtener los espectros de cada uno de ellos, tal como se ilustra en la Figura 4.31.124 interfases entre el cromatgrafo y el espectrmetro de masasCromatografa Gaseosa-Espectrometra de Masas (CG/EM)Acoplamiento de hendidura abierta
Acoplamiento directo
interfases entre el cromatgrafo y el espectrmetro de masas
Dado que los mtodos de separacin cromatogrfica suministran un flujo de eluyentes lquidos o gasosos, generalmente a presin atmosfrica, que deben ser introducidos en la fuente de ionizacin del espectrmetro de masas donde existe alto vaco, resulta necesario utilizar interfases entre el cromatgrafo y el espectrmetro de masas. Existen diferencias significativas entre las interfases utilizadas que dependen del tipo de cromatografa utilizada, lo que ser ilustrado con algunos ejemplos.
Acoplamiento de hendidura abierta Un acoplamiento de hendidura abierta se muestra en la Figura 4.32. Un tubo en forma de T contiene a su vez a un tubo de dimetro pequeo, en el cual se introduce un extremo de la columna cromatogrfica. A este tubo llega tambin un capilar de platino o de slice fundida que va hacia la fuente de ionizacin del espectrmetro de masas. El capilar se mantiene sellado al vaco y se calienta para eliminar la condensacin.La longitud y el dimetro del tubo que entra al espectrmetro de masas se seleccionan de forma que el flujo suministrado a la fuente de ionizacin sea cercano al mximo aceptable con respecto a la conductancia gaseosa de la fuente y la capacidad de bombeo. Por ejemplo, por un capilar de 0.15 mm de dimetro y 50 cm de longitud calentado a 250 oC, se conducen 2.5 ml min-1de gas eluido, que en la prctica resulta suficiente para bombear cualquier sustancia que sale de una columna capilar.Este tipo de acoplamiento permite trabajar bajo condiciones cromatogrficas usuales, estando uno de los extremos de la columna a presin atmosfrica. No requiere ningn montaje especial y cambiar la columna cromatogrfica resulta muy sencillo. En principio se puede utilizar con cualquier tipo de columna.
Consiste en una columna capilar que entra directamente a la fuente de ionizacin del espectrmetro por medio de un conjunto de uniones selladas al vaco, lo que le permite un 100% de rendimiento. El bombeo no resulta problemtico, porque el capilar en necesariamente muy largo. Por ejemplo, para una columna de 0.25 mm de dimetro interior, es necesaria una longitud de al menos 15 m. Dado que la columna es suficientemente larga, la cromatografa se lleva a cabo entre la presin atmosfrica del inyector y el vaco en su otro extremo que entra a la fuente de ionizacin del espectrmetro de masas. El acoplamiento directo tiene los inconvenientes de no permitir la eliminacin del disolvente y que el cambio de columna resulta complicado. Este ltimo inconveniente puede ser reducido conectando un extremo de la columna cromatogrfica a un capilar de vidrio que entre a la fuente de ionizacin a travs de un pasador de tefln de manera que la unin resulte sellada.125Cromatografa Lquida-Espectrometra de Masas (CL/EM)Acoplamiento por interfase de flujo de partculas
Acoplamiento FAB de flujo continuo
interfases entre el cromatgrafo y el espectrmetro de masas
El acoplamiento CL/EM es ms complicado debido principalmente a dos factores: en la Espectrometra de Masas se tienen que producir iones en fase gaseosa y resulta necesario eliminar el disolvente utilizado en la elucin. Dos de los mtodos utilizados para solucionar estos problemas se describen a continuacin.
Se trata de un procedimiento mediante el cual se puede separar, de forma rpida y eficiente, el disolvente de las molculas eluidas en una columna de cromatografa lquida. El eluato cromatogrfico se bombea a travs de un capilar hacia un nebulizador concntrico de vidrio ( Figura 4.33).Seguidamente el eluato se transforma en una nube de gotas que son dispersadas mediante un flujo concntrico de helio. La nube pasa a travs de una cmara de desolvatacin cuyas paredes estn calentadas y en la que existe una presin ligeramente inferior a la atmosfrica. Durante el trayecto, estas gotas sufren una desolvatacin parcial y producen gotas de los compuestos eludos ligeramente solvatadas. Cuando el flujo abandona la cmara de evaporacin, la mezcla de helio, vapor de disolvente y molculas eludas sufre una expansin en la primera etapa de bombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a las molculas eludas. Estas molculas difunden ms lentamente del centro del flujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas perifricas del flujo, de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio son extrados y bombeados mecnicamente fuera del aparato. Este proceso se repite en la segunda etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de partculas enriquecido en las molculas de inters, de lenta difusin, es enviado hacia el espectrmetro de masas sin perturbar el vaco. En las fuentes de ionizacin (EI) o (CI) las partculas inyectadas se vaporizan rpidamente antes de la ionizacin. En la fuente FAB, el flujo de partculas se dirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz, hasta que chocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella.
126Espectrometra de Masas en Sucesin (tndem de masas)Entre las tcnicas de activacin utilizadas con este fin se incluyen las siguientes: disociacin inducida por colisin (Collision-Induced Dissociation : CID), disociacin por captura electrnica (Electron Capter Dissociation: ECD), disociacin por transferencia electrnica (Electron Transfer Dissociation: ETD) , disociacin multifotnica infrarroja (Infrared Multiphoton Dissociation: IFMPD).La Espectrometra de Masas en Sucesin (EM-EM, en ingls MSn) es cualquier sistema que contiene al menos dos etapas de anlisis, separadas por una interfase en la cual los iones procedentes del primer analizador generalmente son activados y se fragmentan. El sistema de tres cuadrupolos ya ha sido tratado en el epgrafe correspondiente.
La Espectrometra de Masas en Sucesin es tambin posible en los equipos de doble enfoque con analizadores magntico y electrosttico, utilizando la tcnica denominada de barrido ligado (linked scan). Esta tcnica consiste en el barrido simultneo de los campos E y B de acuerdo a una expresin matemtica que depende de la geometra empleada, de la regin donde ocurren las fragmentaciones y del tipo de informacin deseada (espectro de iones producto, iones precursores o neutrales).
Mencionaremos los aspectos ms generales de EM-EM.127el primer analizador (EM1) genera el espectro de masas de una sustancia y selecciona los iones correspondientes a un mismo valor de m/z, que se denominan iones precursores. Los iones precursores son activados y se fragmentan, pasando al segundo analizador (EM2), con lo que se obtiene el espectro de masas de los iones precursores seleccionados (barrido de iones fragmento).categoras principales de tndem de espectrmetros EM-EM:en el espacio acoplamiento de instrumentos (cuadrupolo triple) en el tiempo. (por ejemplo en una trampa de iones o la cmara de iones en un ciclotrn)pueden acoplarse sistemas EMn . Hasta ahora se han construido sistemas que incluyen hasta cuatro analizadores de masa acoplados. En la medida en que aumenta el nmero de analizadores acoplados, crecen las capacidades experimentales, tambin la complejidad y por supuesto, el costo del instrumento.Existen dos categoras principales de espectrmetros que permiten realizar experimentos EM-EM: tndem de espectrmetros en el espacio y en el tiempo. El tndem en el espacio es el resultado del acoplamiento de instrumentos (cuadrupolo triple) el tndem en el tiempo es la realizacin de una secuencia apropiada de eventos en un mismo instrumento de almacenamiento de iones (por ejemplo en una trampa de iones o la cmara de iones en un ciclotrn). Nos referiremos a continuacin al primero de los sistemas. El ms simple de los sistemas de Espectrometra de Masas en Sucesin incluye dos analizadores EM/EM o EM2; no existen en principio lmites para el nmero de espectrmetros que pueden acoplarse, es decir, sistemas EMn . Hasta ahora se han construido sistemas que incluyen hasta cuatro analizadores de masa acoplados. En la medida en que aumenta el nmero de analizadores acoplados, crecen las capacidades experimentales, tambin la complejidad y por supuesto, el costo del instrumento.
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La Espectrometra de Masas en Sucesin tambin es til cuando de trata de analizar una mezcla de sustancias. En la Figura 4.35 una mezcla de compuestos A+B+C se introduce a una fuente de ionizacin blanda donde se originan los iones correspondientes A+, B+, C+ , que son iones moleculares. El analizador EM-1 genera el espectro de masas de la mezcla y selecciona el ion que ser fragmentado en cada caso. Mediante el analizador EM-2 se registra el espectro de masas del ion seleccionado. El analizador EM-1 realiza la separacin de los componentes de la mezcla y el espectrmetro EM-2 registra el espectro de masas de cada componente. El sistema EM/EM funciona de manera anloga al sistema cromatografa- masas, pero a una velocidad incomparablemente mayor. La Espectrometra de Masas en Sucesin permite obtener ms informacin que cualquiera de las tcnicas aisladas de Espectrometra de Masas ante un mismo problema, y adems abordar problemas no accesibles a las tcnicas individuales.131
En la Figura 4.36 se muestra el espectro de masas-FAB de una fraccin aislada que contiene varios factores de nodulacin (familia de lipoquitooligosacridos segregados por bacterias) que aparecen a diferentes valores de m/z. El ion de m/z 1244 seleccionado y fragmentado pasa a un analizador B/E (EM) obtenindose su espectro de masas correspondiente. De esta forma resulta identificado. En este sistema el espectrmetro de masas-FAB realiza las funciones de separacin de los componentes de la mezcla y el espectrmetro B/E el espectro de masas del ion seleccionado.132Indicadores de la eficiencia de un espectrmetro de masas(a) Lmite de masas superior o alcance de masas.(b) Poder de resolucin.
(c) Transmisin.
(d) Sensibilidad.
(e) Lmite de deteccin.Como en toda tcnica de medicin, un conjunto de indicadores expresa la eficiencia y confiabilidad de un espectrmetro de masas. Algunos ya han sido definidos previamente al estudiar los analizadores.Lmite de masas superior o alcance de masas: es el valor ms elevado de la razn m/z que puede ser medido. Se expresa en thomson (Th) o unidades atmicas(u) para un portador de una carga elemental.(b) Poder de resolucin. La capacidad del espectrmetro para diferenciar las seales de dos iones con valores de m/z cercanos. Se considera que dos picos estn resueltos cuando el valle entre los mismos tiene una fraccin determinada de la intensidad del pico ms dbil (10% en analizadores magnticos o ICR, 50% en analizadores cuadrupolares). Si dm es la menor diferencia de masas entre dos picos de masa m la resolucin R se define como como:Rm / dm
Transmisin. La razn entre el nmero de iones que llega al detector y el nmero de iones producidos en la fuente de ionizacin. Depende del analizador y es determinante en la sensibilidad.
(d) Sensibilidad. Se define como la razn entre la corriente inica y la cantidad de muestra en la fuente y expresa la capacidad del espectrmetro de masas para detectar las seales de un ion.
(e) Lmite de deteccin. Debe diferenciarse de la sensibilidad. Es la cantidad ms pequea de muestra que produce una seal distinguible del ruido de fondo (generalmente una seal con intensidad diez veces superior al nivel de ruido). Se debe destacar que esta cantidad mnima no tiene que corresponder con la cantidad de muestra necesaria para obtener un espectro de masas interpretable. Por ejemplo, el lmite de deteccin puede ser menor de 1 pg, pero que se necesite 1 ng del compuesto para obtener el espectro. El lmite de deteccin depende considerablemente de la abundancia de la especie inica dependiendo de la abundancia de esta especie respecto al total de iones derivados de la molcula analizada. As, para reducir el lmite de deteccin se debe generar una seal todo lo intensa que sea posible, para lo cual se utilizan mtodos tales como: modificar las condiciones de ionizacin, emplear tcnicas ms suaves de ionizacin, obtener derivados de la muestra para incrementar el nmero de iones producidos en la fuente o reducir sus fragmentaciones.133
