Esercitazioni Metodologie Biochimiche aa 2017-18 Dott. Matilde Forcella “Post-Doc” Dip. BTBS, Biochimica Prof. Stefania Brocca Dip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica Prof. Paola Fusi Dip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica
Esercitazioni Metodologie Biochimiche
aa 2017-18
Dott. Matilde Forcella“Post-Doc”
Dip. BTBS, Biochimica
Prof. Stefania BroccaDip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica
Prof. Paola FusiDip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica
PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE
BIOCHIMICA DI UNA TREALASI DI
INSETTO ESPRESSA COME PROTEINA
ETEROLOGA IN Escherichia coli .
Metodologie biochimiche a.a. 2017-2018
1° giorno: Estrazione e purificazione di trealasi
• Frazionamento proteine solubili, purificazione e dialisi
• Preparazione di campioni analitici per SDS-PAGE
• Preparazione gel
2° giorno: SDS-PAGE, dosaggio proteine
• Elettroforesi
• Dosaggio proteico (metodo di Bradford)
3° giorno: Analisi SDS-PAGE e saggi di attività
• Stima del peso molecolare della trealasi e del grado di purezza
delle preparazioni
• Saggi di attività enzimatica a conc. di substrato saturanti
4° giorno: Cinetica enzimatica
• Cinetica enzimatica e determinazione dei parametri cinetici
5° giorno: Attività enzimatica a diversi pH e denaturazione termica
Metodologie Biochimiche aa 2017-18
Schema delle attività sperimentali
Sampling
Analisi dei
campioni
Preparazione
Elaborazione
dei dati• Concentrazione proteica
• Attività enzimatica
• Attività specifica
(tabella di purificazione)
1a parte
• Analisi SDS-PAGE
• Dosaggio proteico
• Dosaggi di attività
Saggi di attività
(cinetiche enzimatiche)
• Vmax, kcat , kM
• Optimum di pH
• Denaturazione termica
2a parte
estraz. & purificazione Prep.
enzima
Chironomus riparius
➢ Insetto appartenente all’ordine dei Ditteri.
➢ Il ciclo biologico è suddiviso in quattro stadi:
uovo, larva, pupa e adulto.
➢ Le larve possono sopravvivere in condizioni
proibitive quali carenza di ossigeno e presenza di
inquinanti.
Le larve risultano utili per il monitoraggio dello stato di salute dei bacini idrici.
Alcuni insetticidi alterano la concentrazione di
metaboliti e l’attività di enzimi.
TREALASI
Trealasi
Enzima che catalizza l’idrolisi di una molecola di trealosio in due
molecole di glucosio che diventa disponibile come fonte di energia.
TREALOSIO + H2O 2 GLUCOSIO
Funzioni del trealosio negli insetti:
➢ Principale fonte di energia
➢ Crioprotettore
➢ Preserva le proteine labili dalla
denaturazione in condizioni di
disidratazione
Trealasi di vitale importanza
TREALASI di Chironomus riparius:
CLONAGGIO MOLECOLARE DELLA SEQUENZA CODIFICANTE ED
ESPRESSIONE DELLA PROTEINA IN E. coli
Struttura tridimensionale della
trealasi di C. riparius predetta:
(α/α)6-barrel
Ceppo di E.coli BL21 trasformato con il plasmide
pMAL-c5X che porta la resistenza per l’ampicillina e
che contiene, sotto il controllo del promotore Lac, la
sequenza codificante per la proteina trealasi di
Chironomus riparius che verrà prodotta in fusione con
la maltose binding protein.
lacI
Induttore
(lattosio o
IPTG)
Si lega
all’operatore
Pc lacI Pi O Z Y APc= promotore costitutivo
Lac I= gene regolatore
-previene la
trascrizione
-riconosce e lega
la piccola
molecola di
induttore.
Pi= promotore inducibile
O=operatore
Z,Y,A= geni strutturali
(galattosidasi, permeasi,
transacetilasi)
mRNA policistronico
Il lattosio o l’IPTG si lega alla proteina repressore lac
(codificata dal gene lac I) con conseguente inattivazione.
Quando la proteina repressore lac è inattiva, la sequenza a
valle del promotore viene trascritta dalla polimerasi e poi
tradotta in proteina ricombinante. Senza IPTG la proteina
repressore si lega all’operatore e impedisce la trascrizione
della sequenza a valle del promotore.
ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INDOTTA DA IPTG
Purificazione di trealasi da insetto
Localizzazione:
citoplasma necessaria
lisi meccanica della parete
Fonte:
cellule di Escherichia coli
coltura batch in terreno
ricco (Luria Bertani - LB)
Metodo di estrazione:
rottura meccanica
(French press, 25 kpsi)
METODI PER ROMPERE LE CELLULE
- Metodi BLANDI: lisi per osmosi, digestione enzimatica,
solubilizzazione chimica
- Metodi MODERATI: omogeneizzatori a lame, mortaio e
pestello
- Metodi VIGOROSI: sonicazione, french press, rottura
mediante microsfere
Lisato cellulare
Pellet
Debris cellulari e
proteine insolubili
Sovranatante
Proteine solubili
Prelievo camp
analitico
Aliquota risosp.
in SDS-SB
Proteine totali
campione analitico
Purificazione su resina
coniugata con amilosio
Campione preparativoPrelievo camp.
analitico
Centrifugaz. 15’ a 5000 rpm
Prelievo camp
analitico
CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
La cromatografia di affinità non sfrutta delle differenze nelle
proprietà fisiche delle molecole ma si basa su interazioni
biologiche specifiche.
La specificità di queste interazioni spesso coinvolge tipi diversi
di legame.
E’ il tipo di cromatografia più selettivo, può essere utilizzato per
la purificazione sia di proteine che di acidi nucleici.
Matrice: destrano, agarosio, poliacrilamide
La matrice ideale deve avere le seguenti caratteristiche:
• avere gruppi chimici adatti ed in numero sufficiente per il legame
covalente con il ligando
• essere stabile nelle condizioni di legame e nella successiva
eluizione
• minimizzare l’adsorbimento aspecifico
• avere buone proprietà di flusso
• Deve essere in grado di legare specificamente e reversibilmente laproteina target
• Deve avere gruppi chimici modificabili per l’attacco alla matrice,senza distruggere l’attività di binding
• La costante di dissociazione KD tra ligando e proteina target deveessere compresa tra 10-4 e 10-8 M
• Se KD è maggiore di 10-4 l’interazione è troppo debole
• Se KD è più bassa di 10-8 l’interazione sarebbe troppo forte el’eluizione difficoltosa
• Il ligando può avere una specificità assoluta, cioè si lega ad un solocomposto, oppure una selettività di gruppo, ossia si lega a gruppiaffini di composti (ad es. il 5’ AMP che lega le deidrogenasi NAD+dipendenti).
LIGANDO
SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA
• La matrice, accoppiata al ligando, viene impaccata in colonna
• La colonna viene equilibrata
• Dopo aver caricato il campione e raccolto il picco escluso, la
colonna viene lavata con il tampone di equilibramento, per
rimuovere tutto ciò che non si è legato specificatamente
• Si procede con l’eluizione
L’Eluizione del composto di interesse può avvenire in modo
specifico o non specifico:
• L’eluizione aspecifica viene condotta variando il pH o la forza
ionica.
• L’eluizione specifica (per affinità): facendo flussare in colonna
un composto che ha un’affinità per la molecola di interesse
maggiore di quella del ligando.
ELUIZIONE
PROCEDURA SPERIMENTALE
➢ Incubare la frazione citosolica con la resina, precedentemente
equilibrata, per 1 h in agitazione su una ruota a T ambiente
➢ Trasferire la sospensione resina-frazione citosolica nella
colonna chiusa con il tappino e lasciare sedimentare la resina
➢ Raccogliere il picco escluso
➢ Lavare con 5 volumi di colonna con il buffer Tris-HCl 20 mM,
pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM (eliminare)
➢ Eluire 5 frazioni da 1 mL ciascuna utilizzando il buffer Tris- HCl
20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, maltosio
50 mM
Preparare il tampone di LAVAGGIO (10 mL):
Tris- HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM partendo
dalle seguenti soluzioni madre:
Tris- HCl 200 mM pH 7.4
NaCl 1 M
EDTA 100 mM
DTT 100 mM
Preparare il tampone di ELUIZIONE (10 mL):
Tris- HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, maltosio
50 mM partendo dalle seguenti soluzioni madre:
Tris- HCl 200 mM pH 7.4
NaCl 1 M
EDTA 100 mM
DTT 100 mM
Maltosio 500 mM
PREPARZIONE TAMPONI PER LA CROMATOGRAFIA
PREPARAZIONE DEL GEL PER
SDS-PAGE
Il gel viene preparato facendo copolimerizzare l’acrilammide con un
agente in grado di stabilire legami crociati, la bis-acrilamide
LA POLIMERIZZAZIONE
• Avviene attraverso un meccanismo di catalisi radicalica.
• APS (ammonio persolfato) è l’iniziatore
• TEMED (tetrametilendiammina) è il catalizzatore: catalizza la
decomposizione dello ione persolfato, producendo un radicale libero
altamente reattivo:
R*+ A RA*
RA*+ A RAA*
RAA* RAAA*
Gel discontinui (Laemmli gel)
Stacking gel
Running gel
Gel discontinui consentono una più netta separazione delle componenti del
campione. Nello stacking gel, le proteine sono ”impaccate” in una striscia sottile
prima della separazione vera e propria nel running gel.
Si utilizzano tamponi di differente composizione:
Tris-HCl a pH 6.8,
acrilammide 4% (pori larghi)
Tris-HCl a pH 8.8,
acrilammide 12% (pori piccoli)
Buffer elettroforesi
Buffer elettroforesi
II giorno:
Preparazione dei campioni da caricare in
SDS-PAGE
Corsa elettroforetica
Dosaggio proteico
Dialisi
TECNICHE ELETTROFORETICHE
Metodo di separazione basato sulla migrazione di particelle
cariche in un campo elettrico.
Può essere:
1. Analitica – determinazione della massa molecolare, del
punto isoelettrico, di alcune caratteristiche delle proteine
2. Preparativa – purificazione di proteine
L’elettroforesi viene effettuata in una cella elettroforetica,
utilizzando come supporto un gel
Un alimentatore fornisce una corrente continua tra gli elettrodi
SDS-PAGE elettroforesi
Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS; il
detergente è presente:
· nel gel
· nel tampone di corsa
· nell’ SDS-sample buffer
la separazione si basa soltanto sulle DIMENSIONI delle
catene polipeptidiche: per effetto dell’SDS tutte le proteine
acquisiscono un identico rapporto Q/m e hanno la stessa
mobilità elettroforetica.
vengono separate in base all’effetto di setaccio
molecolare
TAMPONE DI CORSA
COMPOSIZIONE: Tris, glicina e SDS
TRIS: tampona le variazioni di pH e fornisce ioni Cl-, che hanno una
mobilita’ superiore al complesso SDS proteina
Glicina: fornisce ioni glicinato
SDS: determina la carica netta negativa delle proteine
PREPARAZIONE DI CAMPIONI PER SDS-PAGE
I campioni da analizzare
- vengono mescolati a “Sample buffer” (SB)
- Incubati a 98 °C per 5 min
❖ Blu di bromofenolo, permette di seguire l’andamento della
corsa elettroforetica
❖ saccarosio o glicerolo, per appesantire il campione
rendendone possibile l’iniezione nel pozzetto di caricamento
❖ b-mercaptoetanolo, per ridurre i ponti disolfuro eventualmente
presenti
❖ SDS, detergente anionico che si lega alle proteine
denaturandole. Questo è presente anche nel tampone del gel e nel
tampone di corsa
“Sample buffer”:
• L’SDS si lega all’incirca ogni 2 aminoacidi, in modo tale che la carica originaria della proteina viene mascherata
• La proteina acquista una carica negativa proporzionale alle sue dimensioni
• Saggi di assorbanza:
a 280 nm
• Saggi colorimetrici:
Lowry
Biureto
Bradford
BCA (Bicinchoninic Acid)
Determinazione della concentrazione proteica
le proteine assorbono a 280 nm, grazie agli aminoacidi aromatici
Saggio a 280 nm
Intervallo di concentrazione:
20 g – 3 mg
Agenti interferenti:
detergenti, acidi nucleici
Strumentazione:
spettrofotometro con lampada UV
e cuvette di quarzo
•Principio: Le proteine in ambiente acido, con i loro gruppi basici stabilizzano la forma anionica del colorante Coomassie blu mediante interazioni idrofobiche ed ioniche, spostando il picco di assorbanza da 465 nm a 595 nm.
•Intervallo di utilizzo: 1-20 μg per il micro saggio e 20-200 μg per il macro saggio
•Accuratezza: buona
•Agenti interferenti: nessuno
•Strumentazione: spettrofotometro e cuvette di plastica
Metodo di Bradford
COOMASSIE (G250) COLORS
pH ~ 0
λ max = 470
Net charge = +1
pH ~ 1
Net charge = 0
λ max = 620
pH = 7
Net charge = -1
λ max = 595
Interaction with proteins
stabilizes the anionic
form even at low pH
Analisi:
1 - Preparare la curva standard (retta di taratura) utilizzando
albumina di siero bovino (BSA) e costruire la retta riportando in
ordinata i valori di assorbimento ottenuti e in ascissa i µg di proteina,.
2 - Ricavare la quantita’ di proteina contenuta nel campione dalla
curva standard.
3 - Determinare la concentrazione proteica del campione
considerando il volume utilizzato per il dosaggio.
• Il metodo del biureto non è influenzato dalla
composizione aminoacidica della proteina, ma è poco
sensibile.
• Tutti gli altri metodi (Bradford, Lowry e BCA) reagiscono
con alcuni particolari aminoacidi e quindi danno una
risposta che dipende dalla composizione aminoacidica
della proteina in esame.
• Sono però metodi più sensibili, in particolare il BCA.
Vantaggi e svantaggi dei diversi metodi
Sorgente luminosa:
lampada al tungsteno regione visibile
lampada al deuterio regione UV
• Monocromatore: sistema ottico in grado di fornire, partendo
da una sorgente di radiazione policromatica, una radiazione
monocromatica, teoricamente una radiazione composta da una
sola lunghezza d’onda (rifrazione con un prisma o diffrazione
con un reticolo)
• Compartimento del campione: sito dove viene alloggiata la
cuvetta
• Rivelatore: in genere si tratta di fotocelle/fotomoltiplicatori,
in grado di convertire i quanti della radiazione in energia
elettrica
TRASMITTANZA
Il fenomeno dell’assorbimento viene espresso in termini
quantitativi, mediante il concetto di trasmittanza
T= I
I0
dove I0 è l’intensità della radiazione
incidente ed I quella della radiazione
uscente dal campione
DIALISI
Le frazioni eluite più ricche in proteine vengono riunite e
dializzate utilizzando una membrana da dialisi con cut off
14000 Da per eliminare il maltosio. Si utilizza 1 L di tampone
Na2HPO4 25 mM, NaCl 75 mM pH 7.4.
III giorno:
Recupero del campione dializzato
Dosaggio proteico dopo dialisi
Dosaggio dell’attività enzimatica
La frazione recuperata dopo dialisi viene dosata nuovamente
utilizzando il metodo di Bradford in modo tale da controllare
eventuali perdite di materiale.
La misura dell’attività enzimatica viene condotta seguendo la
scomparsa del substrato o la comparsa del prodotto.
• temperatura
• pH
• concentrazione enzimatica
• inibitori
• attivatori
• concentrazione di substrati e prodotti
Fattori che influenzano l’attività enzimatica
• Spettrofotometriche
• Fluorimetriche
• Radioisotopiche
• Cromatografiche
• Elettrochimiche
• Manometriche
• Immunochimiche
L’attività enzimatica può essere misurata con
diverse tecniche
L’unità enzimatica è definita come la quantità di
enzima necessario a trasformare 1 mole di substrato
in un minuto
Attività specifica= unità di enzima/mg totali di proteina
Attività enzimatica= unità di enzima/vol
Tutti i saggi enzimatici vanno condotti:
• In eccesso di substrato (10 volte la Km)
• Misurando la velocità iniziale
• Eseguendo una preincubazione alla
temperatura di reazione
• Analizzando volumi diversi della soluzione da
analizzare
v0 = Vmaxx[S]/(Km+[S])
Si utilizza quando nè substrati nè prodotti hanno
caratteristiche rivelabili e misurabili.
Si utilizza una seconda reazione abbinata alla prima che
possa dare una misura della prima:
A B C
Non colorato non colorato colorato
Molto spesso vengono utilizzate delle deidrogenasi
SAGGIO ACCOPPIATO
DOSAGGIO DELL’ENZIMA TREALASI
U/ml= [(Emin-1/340 x d x 2) x (Vtot/Vc )]
La reazione viene fatta partire con l’aggiunta di trealosio
IV giorno:
Cinetica enzimatica
Determinazione massa molecolare
Calcolo della concentrazione molare per il
calcolo della Kcat
Tabella di purificazione
CINETICA ENZIMATICA
Consiste nel valutare l’attività enzimatica in presenza di
concentrazioni crescenti di substrato
Si varia la concentrazione di trealosio: 0.125,
0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM
Si calcolano le corrispondenti U/mL
L’equazione di Michaelis-Menten mette in relazione v0 e [S]:
v0 = Vmax[S]/(Km + [S])
Km è la concentrazione di substrato alla quale la velocità di
reazione è la metà della Vmax ed esprime l’affinità dell’enzima per il
substrato.
TABELLA DI PURIFICAZIONE
Campione Vol.
(mL)
[Prot]
mg/mL
Proteine
totali
mgtot
Attività
U/mL
Attività
totale
Utot
Attività
specifica
Utot/mgtot
Resa
%
Indice
di
purificazione
Estratto
grezzo
Frazione solubile
Cromatografia di
affinità
• temperatura
• pH
• concentrazione enzimatica
• inibitori
• attivatori
• concentrazione di substrati e prodotti
Fattori che influenzano l’attività enzimatica
L’ATTIVITA’ DI UN ENZIMA DIPENDE DAL pH
La maggior parte degli enzimi mostra un'attività MASSIMA ad un
valore del pH ben definito, diverso da un enzima all'altro.
Allontanandosi dal pH ottimale si provoca una diminuzione
dell'attività, che può anche annullarsi: a valori estremi di pH gli
enzimi, come tutte le proteine, si denaturano.
Finchè un enzima è stabile la velocità
della reazione che esso catalizza
AUMENTA CON LA TEMPERATURA
in modo esponenziale. Tuttavia,
superata una certa temperatura, si
osserva un RAPIDO CROLLO
dell'attività, dovuto ad un fenomeno
comune a tutte le proteine: la
DENATURAZIONE TERMICA.
L’ATTIVITA’ DI UN ENZIMA DIPENDE DALLA TEMPERATURA