Aus der Klinik für Pferde und dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin ___________________________________________________________________ Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL aus Bremerhaven Hannover 2003
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Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht
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Aus der Klinik für Pferde und dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen
der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut für Virologie
des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin ___________________________________________________________________
Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit
des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL
aus Bremerhaven
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen PD Dr. rer. nat. K. Borchers 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen 2. Gutachter: Prof. Dr. M.H. Boevé Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 03
meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite 1 Einleitung 15
2 Literaturübersicht 17
2.1. Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea 17 2.2. Entzündliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd 19
2.2.1. Konjunktivitis beim Pferd 19 2.2.2. Keratitis beim Pferd 20
Ferner wurde eine Tupferprobe der Nasenschleimhaut mittels eines sterilen,
trockenen Tupfers innerhalb des Nasenvorhofs proximal von der
Tränennasenkanalmündung entnommen und ebenfalls in Transportmedium
verbracht.
Die Entnahme von Citratvollblut erfolgte aus der Vena jugularis mit einem
Vakuumblutentnahmesystem in Citratblutröhrchen (Vacutainer Systems, Fa. Becton
Dickinson, Frankreich).
Abb. 9: Instrumentarium zur Probengewinnung: a.) Wattetupfer, b.) Cytobrush
49
Material und Methode
3.5 Mikrobiologische Untersuchung
Die mikrobiologischen Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit dem Institut
für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt.
Die entnommenen Tupferproben wurden zunächst zur Anreicherung in einer
Nährbouillion für 10-24 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann folgte die Kultivierung auf
Blutagar, Gassnernährboden und Kochblutagar. Nach einer 48stündigen Inkubation
bei 37°C erfolgte die Spezifizierung der gewachsenen Kolonien.
Zusätzlich wurde im Direktkulturverfahren der mykologische Nachweis auf
Hamburger Testagar bei einer 48stündigen Inkubation mit 37°C durchgeführt.
3.6 Virologische Untersuchung Die virologischen und molekularbiologischen Untersuchungen wurden in
Zusammenarbeit mit PD Dr. K. Borchers aus der Arbeitsgruppe Equine Herpesviren
des Instituts für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin an der freien
Universität Berlin durchgeführt.
3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL)
Zur Isolierung von EHV-2-Genom aus den peripheren Blutleukozyten wurden
zunächst die Citratvollblutproben für 10 min bei 1700 UpM zentrifugiert (Fa. Heraeus,
Minifuge 2, Osterode). Das Plasma wurde dann nahezu vollständig abgenommen
und durch steriles PBS ersetzt. Nach vorsichtigem Durchmischen wurde das
verdünnte Blut auf Ficoll der Dichte 1,077 (Fa. Seromed, Berlin) im Verhältnis
Blut:Ficoll von 3:1 aufgeschichtet und bei 1500 UpM für 20 min zentrifugiert. Der so
entstandene Gradient enthielt eine Schicht aus Erythrozyten und Granulozyten. Über
dieser Schicht stellte sich beige-weiß eine gut abgrenzbare Lymphozyten- und
Monozytenbande dar. Diese wurde mit einer Pipette abgesaugt und in ein neues
Zentrifugenröhrchen überführt.
50
Material und Methode
Nach Auffüllen dieser Zellsuspension mit PBS erfolgte eine erneute Zentrifugation
(Fa. Eppendorf, Zentrifuge 403) für 10 min bei 1700 UpM. Das entstandene Zellpellet
wurde dann noch zweimal in sterilem PBS gewaschen.
Nach der Isolierung der PBL wurden pro Ansatz 101-106 Zellen in 100-200 µl
Proteinase-K Verdauungspuffer 1 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 % Tween)
aufgenommen, mit Proteinase-K (Fa. Böhringer, Mannheim) bis zur
Endkonzentration von 0,2 mg/ml versetzt und im Wasserbad bei 56 °C über Nacht
inkubiert. Dann wurde diese Suspension für 10 min auf 94 °C erhitzt, um die
Proteinase-K zu inaktivieren.
Anschließend wurde die Suspension bei 10000 UpM für 5 min zentrifugiert (Fa.
Eppendorf, Zentrifuge 403) und die DNA-Konzentration im Photometer (Fa.
Shimandzu, UV-1202, Japan) bei 260 nm bestimmt. 1 bis 2 µg Gesamt-DNA wurden
dann in die PCR eingesetzt.
3.6.2 DNA-Präparation aus Augentupfer- und Augencytobrushproben sowie aus Nasentupferproben Die im Transportmedium befindlichen Tupfer und Cytobrushs wurden zunächst
aufgeschüttelt und gründlich ausgedrückt, dann aus dem Eppendorfhütchen
entnommen und verworfen. Anschließend wurde die Probe bei 15000 g zentrifugiert
(Fa. Ole Dich, Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge, Dänemark). Der Überstand
wurde abgegossen und das Zentrifugat in 100 µl Proteinase-K-Verdauungspuffer
resuspendiert. Dann wurde die Probe mit Proteinase-K bei einer Endkonzentration
von 0,2 mg/ml über Nacht inkubiert. Nach Inaktivierung der Proteinase-K durch
Erhitzung auf 96 °C wurden 10 µl in die PCR eingesetzt.
51
Material und Methode
3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2-Genoms Die PCR zum Nachweis des EHV-2-Genoms wurde am Institut für Virologie des
Fachbereich Veterinärmedizin der FU Berlin nach der von Borchers et al. (1997)
beschriebenen Methode durchgeführt. Um die Sensivität und Spezifität der
Nachweismethode zu erhöhen, wurden die Reaktionen als nested PCR (nPCR)
durchgeführt. Dabei wurden bei jedem Virusnachweis nacheinander zwei PCR-
Runden mit zwei verschiedenen Primerpaaren durchgeführt, wobei das erste
Primerpaar die vom zweiten Primerpaar amplifizierte Sequenz mit einschloß. Aus der
ersten Runde der PCR (äußeres Primerpaar) wurde ein Aliquot aus diesem
Reaktionsansatz in die zweite Runde der PCR (inneres Primerpaar) überführt. Zusätzlich wurde eine PCR zur Kontrolle der DNA-Qualität durchgeführt. Diese dient
dazu, falsch-negative Ergebnisse, die auf Inhibitoren in der Probe oder Degradierung
von DNA beruhen, auszuschliessen. Das Prinzip beruht auf dem Nachweis des
Zellstrukturgens, das für das Protein β-Actin kodiert. Dieses kommt in allen
eukaryotischen Zellen vor (Shankar et al. 1992). Deshalb sollte dieses Gen nach
DNA-Präparation aus Geweben und Blut immer nachweisbar sein.
Die PCRs wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Dabei wurden zu 1-2 µg
Gesamt-DNA als Matrize zusätzlich 0,4 µM jeden Primers, 0,2 mM dNTPs (Fa.
Perkin Elmer, Überlingen), 1,5 U Taq-Polymerase (Fa. Quiagen, Hilden) und 1*
Reaktionspuffer (Quiagen, Hilden) pipettiert. Das fehlende Volumen wurde mit
Dnase- und Rnase-freiem Aqua dest. (Fa. Promega, Madison, USA) aufgefüllt und
der Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl (Fa. Sigma, Deisenhofen) überschichtet. Für
den PCR-Ansatz wurde ein Heizblockcycler (MWG, Fa. Biotech, Hybaid omnigene)
nach Protokoll verwendet.
Vom fertigen PCR-Produkt werden 15 µl auf einem 2 %igen Agarosegel (Fa. Life
Technologies, Gaithersburg, USA) aufgetragen, gelelektrophoretisch aufgetrennt und
mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht.
52
Material und Methode
3.6.4 Virus-Anzucht Die Präparation des zweiten Cytobrushs erfolgte auf die gleiche Weise wie zuvor
beschrieben. Es wurden 300 µl des Transportmediums für die Azucht eingesetzt.
In einer 6-Lochplatte wurden 5x105 ED-Zellen mit 4 ml Medium pro Vertiefung
ausgesäht. Es folgt eine 1-2stündige Inkubation bei 37°C und 5% CO2 im
Feuchtbrutschrank.
Nach Anwachsen der Zellen werden pro Vertiefung 2,5 ml Medium entfernt, so dass
die ED-Zellen innigeren Kontakt zu den Zellen aus der Cytobrushpräparation haben.
In jede Vertiefung werden nun 150 µl vom Cytobrushmedium gegeben.
Es folgt eine weitere 24stündige Inkubation, nach der wieder 2,5 ml Medium
hinzugegeben wird.
Anschließend erfolgt mehrmaliges Passagieren der Zellen. Dabei wird zunächst das
Medium abgenommen und Trypsin auf die Zellen gegeben. Nach kurzem
Schwenken wird das Trypsin wieder entfernt und die Zellen bei Raumtemperatur für
10 min stehen gelassen. Dann werden die angelösten Zellen in 2ml Medium
aufgenommen. Davon wird 1 ml wieder verworfen, 1ml wird erneut ausgesäht und
3ml Medium zugegeben.
Die zweite Passage (p2) erfolgt auf einer Petrischale (Durchmesser 5 cm) mit 5ml
Medium nach dem oben beschriebenen Prinzip. Nach 5-7 Tagen erfolgt p3 auf einer
Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm und 10 ml Medium, nach weiteren 3-6
Tagen p4 mit derselben Methode wie p3. Wenn nach 7 Tagen keine Plaques sichtbar
sind, wird der Ansatz verworfen.
53
Material und Methode
3.7 Exfolitive Zytologie Die mikroskopische Auswertung der zytologischen Präparate erfolgte in
Zusammenarbeit mit Prof. Dr. R. Mischke aus der Klinik für kleine Haustiere der
Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Nach Abrollen des Cytobrushs auf Objektträgern wurden diese zunächst
luftgetrocknet. Anschließend erfolgte eine Färbung mit Maygrünwald/Giemsa-
Kombination (Fa. Merck, Darmstadt). Nach Trocknung wurden die Präparate unter
Verwendung von Schnelleindeckmittel (Fa. Merck, Darmstadt) mit Glasplättchen
eingedeckelt.
Bei der mikroskopischen Untersuchung wurde zunächst in einer
Übersichtsvergrößerung (16 x 10) das Präparat meanderförmig nach vorkommenden
Zellarten sowie deren Qualität und Quantität durchgesichtet. Anschließend folgte in
einer Detailvergrößerung (40 x 10 und 100 x 10, Ölimmersion) eine genauere
Betrachtung der vorhandenen Zellen. Die Quantität der vorhandenen
inflammatorischen Zellen wurde durch die Betrachtung von acht Ölimmersions-
Gesichtsfeldern bei einer Vergrößerung von 100 x 10 bestimmt. Dabei wurde
zunächst die Anzahl der untersuchten Zellart pro Gesichtsfeld ausgezählt und dann
daraus ein Mittelwert bestimmt.
54
Material und Methode
3.8 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mittels der Software
SAS® im Rechenzentrum der Tieräztlichen Hochschule Hannover. Die Beratung fand
am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
statt.
Es wurden die Nachweishäufigkeiten von Virusgenom und von Keimgruppen bei den
Gruppen 1 und 2 abhängig von der Stichprobengröße mittels des Fisher-Exact Tests
oder des χ2 –Tests statistisch verglichen. Weiterhin wurden zum Vergleich von
paarigen Stichproben Vierfeldertafeln anhand des McNemar Tests ausgewertet.
Als Signifikanzstufe wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05
angenommen. Die Signifikanzstufen werden wie folgt angegeben:
p > 0,05 nicht signifikant (n.s.)
p < 0,05 schwach signifikant (*)
p < 0,01 signifikant (**)
55
Ergebnisse
4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 4.1.1. Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung Die untersuchten Pferde der Gruppen 1 und 2 wiesen bei der Allgemeinuntersuchung
ein ungestörtes Allgemeinbefinden auf. Pferd Nr. 17 der Gruppe 1 zeigte eine
geringgradige chronische Lungenerkrankung. Pferd Nr. 4 der Gruppe 1 zeigte bei der
Zweituntersuchung eine erhöhte Puls- und Atemfrequenz sowie beginnendes
Schwitzen. Im weiteren Verlauf des Untersuchungstages wurde das Pferd wegen
eines akuten Schockgeschehens behandelt und verstarb spontan unter der
Behandlung. Bei einer durchgeführten Sektion wurde ein rupturiertes
Hämangiosarkom der Milz festgestellt.
4.1.2. Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung
Die klinischen Diagnosen und eine detailierte Auflistung der bei der
ophtalmologischen Untersuchung erhobenen Befunde der Pferde aus Gruppe 1 sind
in Tabelle A1 im Anhang aufgeführt.
Bei allen Pferden war der durchgeführte Drohreflex positiv, die transpalpebrale
Bulbuspalpation ergab bei keinem Pferd Hinweise auf eine auffällige Veränderung
des Augeninnendruckes.
Alle Pferde der Gruppe 2 waren zu beiden Untersuchungszeitpunkten klinisch
augengesund.
In Tabelle 3 sind die klinischen Diagnosen der Pferde aus Gruppe 1 bei der Erst- und
Zweituntersuchung, welche im Abstand von 4 Wochen durchgeführt wurden,
aufgeführt.
56
Ergebnisse
Tab. 3: Gruppe 1 – Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung im Abstand von vier Wochen
klinisch obB 11 0 0 0 0 0 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Kerat. : Keratitis
spf. : superficialis
punct. : punctata
mac. : maculosa
oberfl. : oberflächlich
* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt
obB : ohne besonderen Befund
Trias : Abwehrtrias (Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie)
Bei der Zweituntersuchung wurde noch bei drei von ursprünglich sechs Pferden die
Diagnose einer Keratitis superficialis gestellt. Bei einem dieser Patienten (Nr. 19)
zeigte sich eine Leukombildung, bei den Patienten Nr. 18 und 25 lag noch eine
geringgradige Resttrübung der Hornhaut vor. Keines der Pferde zeigte noch eine
Abwehrtrias oder Gefäßeinsprossung, die bei der Erstuntersuchung vorhanden war.
61
Ergebnisse
Von den Patienten, die an einer Keratitis punctata seu maculosa erkrankt waren,
konnte bei drei Pferden keine Zweituntersuchung durchgeführt werden. Von den zur
Nachuntersuchung vorgestellten Pferden wiesen noch fünf Tiere eine Keratitis
punctata seu maculosa auf. Bei einem Pferd (Nr. 8) konnte eine Leukombildung
festgestellt werden. Alle Augen waren reizfrei, bei Patient Nr. 12 zeigte sich noch
eine oberflächliche Gefäßeinsprossung. Bei den Patienten Nr. 10, 27 und 28 zeigte
sich die Hornhaut auch bei weiteren Nachuntersuchungen im Abstand von mehreren
Wochen unverändert mit punktförmigen Trübungen ohne eine weitere entzündliche
Reaktion des Auges. Patient Nr.1 war bei der Zweituntersuchung unauffällig, wurde
aber 8 Monate später erneut mit der gleichen Symptomatik vorgestellt. Auch dieses
Mal war eine vollständige Ausheilung nach ca. 2 Wochen zu beobachten.
Bei zwei von drei Patienten wurde bei der Zweituntersuchung noch eine Keratitis
vasculosa festgestellt. Bei Pferd Nr. 26 war auch bei einer dritten Nachkontrolle nach
weiteren 4 Wochen noch eine dezente Gefäßeinsprossung festzustellen. Bei einer
vierten Verlaufskontrolle war das Auge unauffällig. Patient Nr. 2 zeigte bei der
Zweituntersuchung keine Befunde mehr. Dieses Pferd wurde nach 13 Monaten
erneut mit derselben klinischen Symptomatik auf dem anderen Auge vorgestellt.
Auch hier war bei einer Zweituntersuchung das Auge wieder unauffällig.
Alle Patienten mit einer Keratitis profunda wiesen auch bei der Zweituntersuchung
noch Befunde auf. Pferd Nr. 11 zeigte eine unveränderte Abwehrtrias sowie weiterhin
eine positive Fluoreszeinprobe. Zusätzlich bestand bei diesem Patienten inzwischen
eine tiefe Gefäßeinsprossung. Trotz intensiver Therapiemaßnahmen verschlechterte
sich der klinische Verlauf weiter, so dass nach weiteren 6 Wochen das Auge entfernt
wurde. Bei Patient Nr. 14 zeigte sich noch eine Hornhauttrübung, sowie eine
oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung, diese waren im Vergleich zur
Erstuntersuchung deutlich zurückgegangen. In weiteren Nachkontrolluntersuchungen
konnte eine vollständige Ausheilung festgestellt werden, es blieb ein Leukom
zurück. Auch bei Patient Nr. 3 kam es zu einer Leukombildung.
Beide Patienten, die bei der Erstuntersuchung eine einseitige Konjunktivitis
aufwiesen, waren bei der Zweituntersuchung klinisch unauffällig.
62
Ergebnisse
Das Pferd mit der bullösen Keratopathie wies bei der Zweituntersuchung
unveränderte Befunde im Vergleich zur Erstuntersuchung auf.
Bei dem Patienten mit der Hornhautabrasion waren in der Zweituntersuchung keine
klinischen Befunde mehr zu erheben.
4.1 Ergebnisse der virologischen Untersuchung 4.1.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR Die Ergebnisse des direkten EHV-2-Nachweises in Verbindung mit den klinischen
Diagnosen bei den untersuchten Gruppen sind in den Tabellen A3, A4 und A5 im
Anhang aufgeführt. In beiden Gruppen wurden diese Untersuchungen 4 Wochen
nach der Erstuntersuchung wiederholt. Bei den Pferden 23, 24 und 25 der Gruppe 1
sowie bei den Pferden 1, 2 und 13 der Gruppe 2 konnte keine Zweituntersuchung
durchgeführt werden.
Tabelle 6 zeigt, bei wie vielen Pferden aus Gruppe 1 und 2 der Nachweis von EHV-2
Genom mittels PCR in den verschiedenen Untersuchungsmaterialien bei der
Erstuntersuchung geführt wurde. Dabei wurde unterschieden, ob bei einem Tier eine
Augenerkrankung vorliegt oder nicht.
63
Ergebnisse
Tab. 6: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei der Erstuntersuchung
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
Bei jeweils dreizehn Pferden der Gruppen 1 und 2 gelang der positive EHV-2
Nachweis im Cytobrush. Bei sieben Pferden der Gruppe 1 sowie vier Pferden der
Gruppe 2 war der Wattetupfer EHV-2 positiv. Bei jeweils einem Pferd der beiden
Gruppen war der Nasentupfer postiv, in den peripheren Blutleukozyten konnte bei
fünf Pferden der Gruppe 1 sowie zwölf Pferden der Gruppe 2 EHV-2 Genom
nachgewiesen werden. Insgesamt gelang ein Nachweis bei 16 Pferden der Gruppe 1
und 18 Pferden der Gruppe 2.
Mit dem Fisher Exact Test wird gezeigt, dass auch zum Zeitpunkt der
Zweituntersuchung keine signifikanten Unterschiede (n.s.) in den untersuchten
Materialien zwischen den an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankten
Pferden und augengesunden Kontrolltieren festgestellt werden können (Abbildung 5).
66
Ergebnisse
02468
101214161820
Gruppe 1Gruppe 2n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
PBL : periphere Blutleukozyten
n.s. : nicht signifikant Abb. 11: Gruppe 1 und 2 - Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR in bei der
Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)
67
Ergebnisse
Tabelle 8 betrachtet die bei der Erst- und Zweituntersuchung geführten Nachweise
von EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush für jedes einzelne Auge der Pferde
aus den Gruppen 1 und 2 zusammengefasst, unabhängig von einer klinischen
Erkrankung.
Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge in Prozent
1. US 2. US Nachweis von
EHV-2 Genom
in % Cytobrush Wattetupfer p- Wert Cytobrush Wattetupfer p- Wert
positiv
35,7% 8,0% < 0,01
(**) 34% 10% < 0,01 (**)
negativ
64,3% 92% < 0,01
(**) 66% 90% < 0,01 (**)
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
(**) : signifikanter Unterschied
Der positive Nachweis von EHV-2 Genom gelang in der Erstuntersuchung bei 35,7%
Cytobrushproben sowie 8% Wattetupferproben. Bei 64,3% der beprobten Augen
blieb der Cytobrush EHV-2 negativ, bei 92% der beprobten Augen waren die
Wattetupfer EHV-2 negativ. In der Zweituntersuchung konnte aus 34% der
Cytobrushproben ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom geführt werden, bei 66%
gelang kein Nachweis von EHV-2. Im Wattetupfer gelang der Nachweis von EHV-2
Genom aus 10% der Augen, 90% der Wattetupfer blieben EHV-2 negativ.
Es besteht kein signifikanter Unterschied in den Nachweishäufigkeiten zwischen der
Erst- und Zweituntersuchung. Im Vergleich von Wattetupfer zu Cytobrush besteht ein
signifikanter Unterschied in der Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom.
68
Ergebnisse
In Tabelle 9 wird die Häufigkeit des positiven EHV-2 Nachweises im Wattetupfer bei
gleichzeitig positivem EHV-2 Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge in der Erst-
und Zweituntersuchung gezeigt.
Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Positiver Nachweis von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge
positiver EHV-2 Nachweis bei
[n Augen] Cytobrush
positiv davon
Wattetupfer positiv p - Wert
Erstuntersuchung 40 7 < 0,01 (**)
Zweituntersuchung 34 6 < 0,01 (**)
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
(**) : signifikanter Unterschied
Hier ist zu sehen, dass in der Erstuntersuchung bei 40 Augen ein positiver EHV-2
Nachweis im Cytobrush gelang. Von diesen gelang bei sieben Augen ein
gleichzeitiger EHV-2 Nachweis im Wattetupfer. In der Zweituntersuchung waren 34
Augen EHV-2 positiv im Cytobrush, davon gelang bei sechs Augen der Nachweis im
Wattetupfer.
Eine statistische Auswertung mittels des McNemar Tests konnte zeigen, dass zu
beiden Untersuchungszeitpunkten ein Nachweis von EHV-2 Genom signifikant
häufiger im Cytobrush als im Wattetupfer gelingt. In Abbildung 12 wird der Vergleich
von positivem EHV-2 Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer graphisch dargestellt.
69
Ergebnisse
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1. US 2.US
Cytobrush pos.davon Tupfer pos.
**
**
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
pos. : positiv
** : signifikanter Unterschied
Abb. 12: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Vergleich von Cytobrush zu Wattetupfer beim positiven EHV-2 Nachweis am einzelnen Auge
70
Ergebnisse
In Tabelle 10 wird der Nachweis von EHV-2 Genom in erkrankten und gesunden
Augen bei den Pferden der Gruppe 1 in Wattetupfer und Cytobrush zum Zeitpunkt
der Erstuntersuchung vergleichend dargestellt.
Tab. 10: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Erstuntersuchung [ n = 28]
EHV-2 Nachweis bei n [Pferden]
Wattetupfer positiv n = 7
Cytobrush positiv n = 16
Cytobrush und Wattetupfer positiv
n = 4 auf erkranktem Auge 4 8 2 auf gesundem Auge 3 6 2
auf beiden Augen 0 2 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Bei vier Pferden war bei der Erstuntersuchung der Wattetupfer ausschließlich auf
dem erkrankten Auge EHV-2 positiv, bei drei Pferden erfolgte der Nachweis im
Wattetupfer nur auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd war der Wattetupfer auf
beiden Augen positiv. Von 16 Pferden, bei denen der Nachweis von EHV-2 im
Cytobrush gelang, wurde bei acht Tieren der Nachweis ausschließlich auf dem
erkrankten Auge geführt. Sechs Pferde waren nur auf dem gesunden Auge positiv,
bei zwei Pferden waren beide Augen im Cytobrush EHV-2 positiv. Bei zwei Pferden
waren sowohl Wattetupfer als auch Cytobrush auf dem erkrankten Auge EHV-2
positiv, ebenso bei zwei Pferden auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd waren
beide Proben auf beiden Augen positiv. Diese Aufstellung zeigt, dass die Nachweise
von EHV-2 Genom in beiden Untersuchungsmethoden zu gleichen Anteilen auf
erkrankten und gesunden Augen erfolgen und kein signifikant häufigerer Nachweis
auf dem erkrankten Auge erfolgte.
Tabelle 11 zeigt den Nachweis von EHV-2 Genom bei den Pferden der Gruppe 1
zum Zeitpunkt der Zweituntersuchung vergleichend auf erkranktem und gesunden
Auge in Wattetupfer und Cytobrush.
71
Ergebnisse
Tab. 11: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Zweituntersuchung [n = 25]
EHV-2 Nachweis bei
n [Pferden] Wattetupfer
positiv n = 7
Cytobrush positiv n = 13
Cytobrush und Wattetupfer positiv
n = 5 auf erkranktem/
ehemals erkranktem Auge 7 6 5
auf gesundem Auge 0 1 0 auf beiden Augen 0 6 0
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Hier ist zu erkennen, dass bei sieben Pferden in der Zweituntersuchung im
Wattetupfer ausschließlich auf dem erkrankten oder ehemals erkrankten Auge ein
positiver EHV-2 Nachweis geführt wurde.
Bei keinem Tier gelang ein Nachweis im Wattetupfer nur auf dem gesunden oder in
beiden Augen. Ein positiver EHV-2 Nachweis im Cytobrush gelang bei sechs Pferden
ausschließlich auf dem erkrankten Auge. Bei einem Pferd erfolgte der Nachweis nur
auf dem gesunden Auge, sechs Pferde waren auf beiden Augen im Cytobrush EHV-
2 positiv. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis auf dem erkrankten Auge in beiden
Proben gleichzeitig.
Die Tabelle 12 zeigt die Anzahl der Pferde in Gruppe 1, bei denen der Nachweis von
EHV-2 in der Erst- und Zweituntersuchung in den verschiedenen Proben geführt
wurde.
72
Ergebnisse
Tab. 12: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen Proben bei Erst- und Zweituntersuchung
Nachweis von EHV-2 Genom bei
n =
Wattetupfer EHV-2 positiv
Cytobrush EHV-2 positiv
Nasentupfer EHV-2 positiv
PBL EHV-2 positiv
1. US n [Pferde] 28 7 16 3 10
2. US n [Pferde] 25 7 13 1 5
1. und 2. US n [Pferde] 53 5 11 0 4
PBL : periphere Blutleukozyten
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
Bei sieben Pferden war der Wattetupfer in der Erstuntersuchung positiv, ebenso bei
sieben Pferden in der Zweituntersuchung. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis
sowohl in der Erst- als auch in der Zweituntersuchung. Bei 16 Pferden gelang in der
Erstuntersuchung der Nachweis von EHV-2 im Cytobrush, bei 13 Pferden war der
Cytobrush in der Zweituntersuchung EHV-2 positiv. Ein wiederholter Nachweis von
EHV-2 Genom im Cytobrush gelang bei elf Pferden.
Der Nasentupfer war in der Erstuntersuchung bei drei Tieren positiv, in der
Zweituntersuchung bei einem Pferd. Ein wiederholter Nachweis gelang bei keinem
Tier.
Die Untersuchung der peripheren Blutleukozyten erbrachte bei zehn Pferden einen
positiven Nachweis in der Erstuntersuchung und bei fünf Pferden in der
Zweituntersuchung. Bei vier Pferden gelang ein wiederholter Nachweis von EHV-2 in
den peripheren Blutleukozyten.
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2
Genom auf dem erkrankten und/oder gesundem Auge und dem gleichzeitigem
Nachweis in Nasentupfer und peripheren Blutleukozyten besteht nicht.
73
Ergebnisse
4.1.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht Der zweite entnommene Cytobrush wurde zur Virusanzucht nach beschriebener
Methode eingesetzt. Dieser Nachweis von vermehrungsfähigem Virusmaterial gelang
jedoch nur in einem einzigen Fall bei einem Pferd der Kontrollgruppe (Nr. 9) zu
beiden Untersuchungszeitpunkten. Bei diesem Pferd lag keine klinische Erkrankung
vor.
Daher kann hier eine Aussage über die klinische Relevanz bei Nachweis von
lebendem Virusmaterial oder die Sensitivität dieser Methode nicht getroffen werden.
74
Ergebnisse
4.2 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung Die mikrobiologischen Untersuchungen der Augentupferproben wurden im Institut für
Mikrobiologie und Tierseuchen der tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
Die nachgewiesenen Keime bei den Pferden der Gruppen 1 und 2 in der Erst- und
Zweituntersuchung sind in den Tabellen A6, A7, A8 und A9 im Anhang aufgeführt.
Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig
und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte
sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,
Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei
zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.
vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in
erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.
In der Tabelle 13 sind Art und Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und
erkrankten Augen der Gruppen 1 und 2 bei der Erstuntersuchung zusammengefasst.
Insgesamt wurden 112 Augen im Abstand von vier Wochen untersucht, davon waren
28 Augen an einer Keratitis oder Kojunktivitis erkrankt.
Die Tabelle zeigt, dass bei der Erstuntersuchung koagulasenegative Staphylokokken
in insgesamt 49 Augen isoliert werden konnten, davon waren 14 Augen klinisch
erkrankt. Der Nachweis von alpha-hämolysierenden Streptokokken wurde bei 14
Augen geführt, davon waren sechs Augen klinisch erkrankt. Acinetobacter spp.
wurde bei 52 Augen isoliert, von denen neun erkrankt waren. In 57 Augen gelang der
Nachweis von Bacillus spp., zwölf Augen wiesen davon eine Erkrankung auf.
Bacillus cereus konnte in 17 gesunden und fünf erkrankten Augen nachgewiesen
werden. Bei 31 gesunden und sechs erkrankten Augen erfolgte der Nachweis von
Pantoea agglomerans. Pseudomonas spp. konnte bei sechs Augen isoliert werden,
von denen drei erkrankt waren, Pseudomonas fluoreszens wurde bei einem
erkrankten Auge nachgewiesen. Bei nur einem erkrankten Auge wurden Sprosspilze
nachgewiesen, bei jeweils zwei gesunden Augen erfolgte der Nachweis von
Sprosspilzen, Schimmelpilzen und niederen Pilzen (Mucor spp.). Aus drei gesunden
Augen konnten Schwärzepilze der Gattung Alternaria spp. isoliert werden.
75
Ergebnisse
Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112
Lymphozyten 7 (25 %) 4 (14,2 %) 6 (21,4 %) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
Es fanden sich in Gruppe 1 bei drei erkrankten Augen (10,7 %) neutrophile
Granulozyten (Pferd Nr. 1, 5 und 17), ebenso bei drei gesunden Augen (10,7 %) aus
der Patientengruppe (Pferd Nr. 1, 17 und 20). In der Kontrollgruppe konnten
ebenfalls in drei Augen (5,4 %) neutrophile Granulozyten gefunden werden, hier
jeweils nur in einem Auge pro Pferd.
85
Ergebnisse
Lymphozyten konnten bei sieben Pferden (25 %) der Gruppe 1 (Nr. 3, 11, 16, 17, 20,
24 und 28) auf dem erkrankten Auge nachgewiesen werden, bei 4 Pferden der
Gruppe 1 (14,2 %) konnten Lymphozyten auf dem gesunden Auge gefunden werden.
In der Gruppe 2 konnten bei sechs Augen (21,4 %) vereinzelte Lymphozyten
gefunden werden, bei einem dieser Pferde auf beiden Augen, bei den anderen
Tieren jeweils nur auf einem Auge.
Eine statistische Auswertung ist hier aufgrund der zu geringen Zahlenwerte nicht
möglich. Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von
Entzündungszellen und einer klinischen Erkrankung der Augen zu bestehen.
Die Quantität der vorkommenden Entzündungszellen bei den einzelnen Augen der
Pferde aus Gruppe 1 zeigt Tabelle 18. Dabei wurden die betroffenen Zellen in acht
Ölimmersions- Gesichtsfeldern (Vergrößerung 100 x 10) zunächst addiert und dann
ein Mittelwert gebildet. Die Werte sind durch einen Schrägstrich für klinisch erkrankte
und gesunde Augen unterteilt.
Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass die Anzahl der vorkommenden
Entzündungszellen bei allen Präparaten sehr gering ist. Bei den Patienten Nr. 1, 17
und 20 aus der Gruppe 1 kommen beide Arten der Entzündungszellen auf einem
Auge vor, dabei bei Patient Nr. 17 auf beiden Augen. Bei Patient Nr. 1 sind in den
Präparaten beider Augen neutrophile Granulozyten zu finden, nur auf dem gesunden
Auge erfolgte hier auch der Nachweis von Lymphozyten. Bei Patient Nr. 20 hingegen
sind in den Präparaten beider Augen Lymphozyten zu finden, ein gemeinschaftliches
Vorkommen mit neutrophilen Granulozyten ist wiederum nur auf dem gesunden
Auge festzustellen.
86
Ergebnisse
Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 1
Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)
Anzahl Lymphozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Patient 1
(erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,5 / 0,8 0 / 0,4
Patient 3 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,8 / 0
Patient 5 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,3 / 0 0 / 0
Patient 11 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,5 / 0
Patient 16 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,4 / 0,8
Patient 17 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,5 / 0,4 1,6 / 1, 5
Patient 20 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0,4 0,8 / 0,8
Patient 22 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0 / 0,5
Patient 24 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,6 / 0
Patient 28 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,5 / 0
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
87
Ergebnisse
In Tabelle 19 ist die durchschnittliche Anzahl der Entzündungszellen bei den Pferden
der Gruppe 2 aufgeführt. Da auch hier teilweise der Nachweis auf beiden Augen
erfolgte, wurde in linkes und rechtes Auge durch einen Teilstrich unterschieden,
beide Augen sind ohne eine klinische Erkrankung.
Der Nachweis von Lymphozyten auf beiden Augen gelingt in Gruppe 2 nur bei
Kontrollpferd Nr. 5. Bei den anderen Pferden, bei denen Entzündungszellen in den
Präparaten der einzelnen Augen gefunden werden, liegen diese jeweils nur auf
einem Auge vor. Auch ein gemeinsames Vorkommen beider Zellarten in einem
Präparat kann nicht festgestellt werden, wohl aber der Nachweis beider Zellarten in
einem Pferd. So sind bei Kontrollpferd Nr. 6 auf dem rechten Auge neutrophile
Granulozyten und auf dem linken Auge Lymphozyten zu finden. Bei Kontrollpferd Nr.
15 finden sich auf dem linken Auge Lymphozyten und auf dem rechten Auge
neutrophile Granulozyten.
Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 2
Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)
Anzahl Lymphozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Kontrollpferd 3 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0,5 / 0 0 / 0
Kontrollpferd 5 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 1,5 / 0,8
Kontrollpferd 6 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0,4 0,8 / 0
Kontrollpferd 9 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 0,8 / 0
Kontrollpferd 13 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 0 / 0,7
Kontrollpferd 15 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0,4 / 0 0 / 0,5
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
88
Ergebnisse
In Tabelle 20 sind die zytologischen Befunde der Augen beider Gruppen den
Ergebnissen der virologischen Untersuchung gegenübergestellt, unabhängig von
einer klinischen Erkrankung.
Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem Vorkommen von Entzündungszellen, unabhängig von einer klinischen Erkrankung
Entzündungszellen bei
n [Augen]
EHV-2 Nachweis im Wattetupfer
EHV-2 Nachweis im Cytobrush
EHV-2 Nachweis in Wattetupfer
und Cytobrush
EHV-2 Nachweis
negativ
neutrophile Granulozyten 0 2 1 6
Lymphozyten 0 3 1 13
Dabei zeigt sich, dass von neun Augen, in deren Präparaten neutrophile
Granulozyten gefunden wurden, in zwei Augen bei der virologischen Untersuchung
EHV-2 Genom im Cytobrush nachgewiesen wurde. In einem Auge gelang der
Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer, sechs Augen blieben im Nachweis von
EHV-2 negativ.
Lymphozyten konnten in den Präparaten von insgesamt 17 Augen gefunden werden.
Davon waren zwölf Augen EHV-2 negativ, bei einem Auge gelang der Nachweis von
EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush, bei drei Augen nur im Cytobrush.
In Präparaten von zehn Augen konnten intranukleäre Einschlusskörperchen erkannt
werden, davon waren vier Augen in der virologischen Untersuchung EHV-2 negativ.
Bei sechs Augen konnte EHV-2 Genom nachgewiesen werden, davon fünfmal im
Cytobrush sowie einmal in Cytobrush und Wattetupfer.
Eine statistische Auswertung kann aufgrund der geringen Zahlenwerte nicht erfolgen.
Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen den einzelnen zytologischen
Befunden und einem Nachweis von EHV-2 Genom erkennbar zu sein.
89
Ergebnisse
Tabelle 21 stellt erkrankte Augen mit und ohne dem Symptom Konjunktivitis den
zytologischen Befunden und dem Nachweis von EHV-2 Genom gegenüber.
Tab. 21: Gruppe 1 – Zytologische Befunde bei erkrankten Augen mit und ohne Begleitsymtom Konjunktivitis in Zusammenhang mit dem Nachweis von EHV-2 Genom
erkrankte Augen mit Konjunktivitis
[n = 19]
erkrankte Augen ohne Konjunktivititis
[n = 9]
Zytologische Befunde bei
n [Augen] EHV-2 pos. EHV-2 neg. EHV-2 pos. EHV-2 neg.
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Dabei zeigt sich, dass bei allen drei erkrankten Augen, in deren Präparate
neutrophile Granulozyten gefunden wurden, eine Konjunktivitis vorgelegen hat. Bei
zwei dieser Augen erfolgte ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom.
Lymphozyten konnten bei jeweils vier erkrankten Augen mit und drei Augen ohne
Konjunktivitis gefunden werden. Alle Augen ohne Konjunktivitis blieben im Nachweis
von EHV-2 negativ, bei einem Auge mit Konjunktivitis konnte EHV-2 Genom
nachgewiesen werden.
Auch hier ist aufgrund der geringen Zahlenwerte keine statistische Auswertung
möglich.
90
Ergebnisse
Auf den folgenden Seiten sind auf den Abbildungen 17 bis 22 beispielhaft
mikroskopische Darstellungen der zytologischen Befunde gezeigt.
91
Ergebnisse
Abb. 17: Epithelzellverband
Kontrollpferd Nr. 13, rechtes Auge;
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
Abb. 18: Lymphozyt (LZ), umgeben von Epithelzellen
Einige Zellkerne der Epithelzellen zeigen bereits eine starke Auflockerung des
Chromatins und Vakuolisierung im Zuge der eingesetzten Lysis.
Kontrollpferd 13, rechtes Auge;
Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion
92
Ergebnisse
Abb. 17
LZ
Abb. 18
93
Ergebnisse
Abb. 19: Einzelne Epithelzellen mit zwei neutrophilen Granulozyten (NG) und einem
Lymphozyten (LZ)
Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen, die neutrophilen
Granulozyten liegen als reife segmentkernige Granulozyten vor.
Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
Abb. 20: Lymphozyt (LZ) neben Epithelzellverband
Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)
Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion
94
Ergebnisse
Abb. 19
Abb. 20
NG
LZ
LZ
95
Ergebnisse
Abb. 21: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen
In den Epithelzellen liegen als Nebenbefund zytoplasmatische Melanineinschlüsse
(M) vor; diese können in einer Vielzahl der Präparate beobachtet werden und haben
keine klinische Relevanz.
Patient Nr. 17, linkes Auge (klinisch gesund);
Vergrößerung 100x 10, Ölimmersion
Abb. 22: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen liegend
Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen.
Kontrollpferd Nr. 9, linkes Auge;
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
96
Ergebnisse
LZ M
Abb. 21
LZ
LZ
Abb. 22
97
Diskussion
5 Diskussion 5.1 Material und Methode In der vorliegenden Arbeit wurden im Zeitraum von April 2001 bis April 2003 in der
Klinik für Pferde der tierärztlichen Hochschule Hannover 56 Pferde untersucht. Diese
wurden in zwei Gruppen unterschieden.
Gruppe 1 (n = 28) beinhaltet Tiere, die klinisch an einer Keratitis, Keratokonjunktivitis
oder Konjunktivitis erkrankt waren. Vier dieser Tiere sind Maultiere, die eine Keratitis
punctata seu maculosa aufwiesen. Maultiere gehören zur Familie der Equiden und
es besteht eine direkte Verwandschaft zum Pferd aufgrund der Züchtung mit
Pferdestute und Eselhengst. Eine Infektion mit equinen Herpesviren ist bei Eseln und
Kreuzungen beider Arten möglich, so dass die Maultiere in die Patientengruppe mit
aufgenommen wurden.
In dieser Gruppe wurden 10 Stuten und 18 Wallache untersucht, das
durchschnittliche Alter beträgt 9,7 Jahre.
Gruppe 2 (n = 28) besteht aus Pferden, die klinisch keine Augenerkrankung
aufwiesen und als Kontrollgruppe untersucht wurden. Es wurden 9 Stuten und 21
Wallache untersucht, das durchschnittliche Alter liegt bei 8,4 Jahren.
In einer ähnlichen Studie, in der 29 Pferde mit Keratitis sowie 21 klinisch
augengesunde Pferde untersucht wurden, konnte VON OPPEN (2000) bereits einen
Zusammenhang vom Nachweis von EHV-2 Genom mit dem Auftreten von
Keratitiden beim Pferd darstellen. Im Gegensatz dazu untersuchte BESTHORN
(2002) in einer jüngeren Studie 96 pathologisch veränderte und 129 klinisch gesunde
Augen von insgesamt 148 Pferden und konnte keinen signifikanten Zusammenhang
zwischen dem Nachweis von EHV-2 oder EHV-5 und Keratitiden beim Pferd
feststellen.
Sonstige Autoren berichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden oder
Keratokonjunktivitiden nur in Fallberichten über Einzeltiere (THEIN und BÖHM 1976,
COLLINSON et al. 1994, MILLER et al. 1990).
98
Diskussion
Die Probenentnahme am Auge für die virologische PCR-Untersuchung wurde sowohl
bei VON OPPEN (2000) als auch bei BESTHORN (2002) durch Entnahme von
Augensekret mittels eines Wattetupfers aus dem Konjunktivalsack durchgeführt.
Diese Methode der Materialgewinnung stellt einen wenig invasiven Eingriff dar, der
die Verletzungsgefahr minimiert. Entnahmen von Hornhautgeschabseln erforderten
aufgrund der Verletzungsgefahr bei Abwehrbewegungen des Pferdes aufwendigere
Zwangsmaßnahmen.
Auch COLLINSON et al. (1994) führte die Probenentnahme am Auge für die
virologische Untersuchung mit Wattetupfern durch.
Der Einsatz des Cytobrushs wird bei BAUER (2001) und WILLIS et al. (1997) zur
Gewinnung von Zellmaterial für zytologische Untersuchungen beschrieben. Auch in
der Humanmedizin wird der Cytobrush unter anderem zur Gewinnung von
Konjunktivalzellen eingesetzt (TSUBOTA et al. 1990). Beim Pferd beschreiben
BOLLIGER et al. (2000) die Gewinnung von zytologischen Präparaten mittels
Cytobrush zur Diagnostik von Keratomykosen.
Eine virologische Untersuchung der gewonnenen Cytobrush- Proben wurde bisher
nicht beschrieben.
In dieser Arbeit wurden für die virologischen Untersuchungen sowohl Wattetupfer als
auch Cytobrush- Proben aus dem Konjunktivalsack des Auges entnommen. Dieser
Vergleich sollte zeigen, ob mit der Gewinnung von mehr Probenmaterial durch den
Cytobrush auch ein zuverlässigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR
möglich ist und damit möglicherweise eine bessere Methode zur virologischen
Diagnostik bei Keratitiden des Pferdes darstellt. Außerdem sollte überprüft werden,
ob mit dieser Methode ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und
einem klinischem Erscheinungsbild erkennbar ist. VON OPPEN (2000) hatte gezeigt,
dass es im Gegensatz zum Menschen und zur Katze bisher kein pathognomonisches
Bild einer „Viruskeratitis“ beim Pferd gibt.
99
Diskussion
Als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen Erkrankungen des Auges
beim Menschen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster
Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis wird als schnelles und wenig aufwendiges
Verfahren die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,
WILHELMS et al. 1986).
Auch beim Kleintier wird die exfoliative Zytologie erfolgreich zur Diagnostik genutzt.
So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden
mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). WILLIS et al. (1997) untersuchten
bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen Erkrankungen des
Auges. Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So
beschreibt KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von
Herpeskeratitiden die Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen
Nachweis von Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000)
beschreiben die Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei
Keratomykosen. KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleichen in einer Studie mit 15
Pferden die Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in
Verbindung mit dem Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im
zytologischen Präparat, konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.
In dieser Arbeit wurden zusätzlich zu den für die virologischen Untersuchungen
entnommenen Cytobrush-Proben jeweils ein weiterer Cytobrush aus dem
Konjunktivalsack entnommen und auf einem Objektträger für die zytologische
Untersuchung ausgerollt.
Die für die mikrobiologischen Untersuchungen aus dem Konjunktivalsack
entnommenen Wattetupfer dienen zum Nachweis des vorhandenen Keimspektrums
vergleichend in gesunden und klinisch erkrankten Augen und wurden, um
Verfälschungen durch Lokalanästhesie und mechanische Manipulation zu
vermeiden, vor den Proben zur virologischen Untersuchung entnommen.
100
Diskussion
5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR Das equine Herpesvirus Typ 2 wird in der Literatur immer wieder als Verursacher von
Keratitiden oder Keratokonjunktivitiden des Pferdes diskutiert (THEIN und BÖHM
1976, MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1996, VON OPPEN 2000). Dabei wird
von vielen Autoren als klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ eine Keratitis punctata
oder Keratitis maculosa vermutet (SCHMIDT 1988, KELLNER 1990, BARNETT
1998). Dabei handelt es sich aber offensichtlich um Analogschlüsse zum Menschen
und Kleintier, für die bisher die Bestätigung fehlt, da beim Pferd bisher im Gegensatz
zu Mensch und Katze kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und
einem klinischen Bild einer „Viruskeratitis“ nachgewiesen werden konnte (VON
OPPEN 2000, KERSHAW et al. 2001). Wurde in früheren Studien zunächst mittels
PCR ein signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom bei Pferden, die an einer
Keratitis erkrankt waren, im Vergleich zu einer augengesunden Kontrollgruppe
geführt (VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001), so kann in einer jüngeren
Studie mittels PCR kein signifikanter Unterschied im Nachweis von EHV-2 bei
augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden dargestellt werden
(BESTHORN 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Probenmaterialien auf das
Vorhandensein von EHV-2 Genom bei an einer Keratitis, Konjunktivitis oder
Keratokonjunktivitis erkrankten Pferden sowie bei einer augengesunden
Kontrollgruppe mittels PCR untersucht.
Dabei wurden in der Erstuntersuchung im Wattetupfer, der aus dem Konjunktivalsack
entnommen wurde, bei 25 % der erkrankten Pferde sowie bei 7, 1 % der
augengesunden Pferde EHV-2 Genom nachgewiesen. Der gleichfalls aus dem
Bindehautsack entnommene Cytobrush war bei 57,1 % der erkrankten Tiere sowie
bei 60,7 % der gesunden Tiere positiv im Nachweis von EHV-2. In der
Zweituntersuchung konnte im Wattetupfer bei 28% der erkrankten sowie bei 14,3 %
der gesunden Pferde ein positiver Nachweis erfolgen. Im Cytobrush gelang der
Nachweis bei 13 % beider Untersuchungsgruppen.
101
Diskussion
Bei diesen Werten werden, ähnlich wie in der Studie von VON OPPEN (2000),
zunächst nicht einzelne Augen unterschieden, der Nachweis auf einem oder beiden
Augen gilt für das Einzeltier als positiv, unabhängig davon, welches Auge erkrankt
war. Sowohl im Wattetupfer als auch im Cytobrush bestehen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich von
erkrankten zu augengesunden Tieren, wobei der Nachweis im Wattetupfer bei der
Erstuntersuchung im Vergleich der erkrankten und gesunden Tiere auf den ersten
Blick auffällig erscheint, statistisch hier jedoch keine Signifikanz nachzuweisen ist.
Auch in den weiterhin untersuchten Proben (Nasentupfer, periphere Blutleukozyten)
konnten weder in der Erst- noch in der Zweituntersuchung signifikante Unterschiede
im Nachweis von EHV-2 zwischen beiden Untersuchungsgruppen dargestellt
werden.
Insgesamt wurden mit den verschiedenen untersuchten Probenmaterialien in der
Erstuntersuchung bei 67, 9 % der erkrankten und 82, 1 % der gesunden Pferde EHV-
2 Genom nachgewiesen. In der Zweituntersuchung wurden bei 64 % der erkrankten
und 72 % der gesunden Pferde der Nachweis von EHV-2 Genom geführt.
Diese Ergebnisse sind abweichend von Ergebnissen früherer Studien (VON OPPEN
2000, KRÜDEWAGEN 2001), in denen bei erkrankten Pferden der Nachweis von
EHV-2 signifikant häufiger geführt werden konnte. Sie bestätigen jedoch eine jüngere
Studie, in der ebenfalls kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2
Genom und dem Vorliegen einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis festgestellt
werden konnte (BESTHORN 2002).
Im Vergleich der untersuchten Proben untereinander interessierte vor allem die
Nachweishäufigkeit von EHV-2 im Wattetupfer vergleichend zur Nachweishäufigkeit
im Cytobrush. Dabei wurde nicht in klinisch erkrankte und gesunde Augen
unterschieden, sondern nur in positiven und negativen EHV-2 Nachweis mittels PCR.
Beide Proben wurden durch vorsichtiges Drehen im Bindehautsack zur Aufnahme
von Augensekret und Zellmaterial gewonnen. Dabei gelang zu beiden
Untersuchungszeitpunkten ein signifikant (p< 0,01) häufigerer Nachweis im
Cytobrush als im gleichzeitig entnommenen Wattetupfer. In der Erstuntersuchung
war in beiden Gruppen zusammengefasst der Cytobrush bei 40 Augen positiv im
102
Diskussion
Nachweis von EHV-2, während von diesen Augen nur sieben mal der Wattetupfer
ebenfalls einen positiven Nachweis erbrachte. Von 72 Augen, die im Cytobrush EHV-
2 negativ blieben, waren 70 auch im Wattetupfer EHV-2 negativ. In der
Zweituntersuchung wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. So blieben von 34 Augen,
die im Cytobrush EHV-2 positiv waren, 28 Augen im Wattetupfer EHV-2 negativ.
Diese Zahlen zeigen, dass der Cytobrush offensichtlich eine wesentlich sensitivere
Methode der Probenentnahme zum Nachweis von EHV-2 Genom darstellt. Da der
Cytobrush in der Probengewinnung immer erst nach dem Wattetupfer eingesetzt
wurde, kann der Grund dafür nicht in bereits entfernten Sekret- und Zellbestandteilen
durch vorangegangene Probenentnahmen liegen. Durch die Nylonborsten des
Cytobrushs können jedoch wesentlich mehr Sekret und Zellbestandteile gewonnen
werden als mit dem herkömmlichen Wattetupfer.
Für EHV-2 werden für die Viruslatenz verschiedene Orte vermutet, so unter anderem
Leukozyten, Lungenmakrophagen und das Ziliar- und Trigeminusganglion
(BROWNING und STUDDERT 1987, REUBEL et al. 1995, BORCHERS et al. 1997
RIZVI et al. 1997). Möglicherweise besteht für EHV-2 eine Viruslatenz auch in den
Epithelzellen der Konjunktiva, so dass durch die vermehrte Aufnahme von
Zellmaterial, auch aus den tieferen und damit „jüngeren“ Epithelschichten, hier ein
derartig signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR im
Cytobrush gelang.
Diese Arbeit zeigt, dass durch die signifikant höhere Nachweisrate von EHV-2 mittels
des Cytobrushs sowohl in erkrankten als auch in gesunden Augen zwar eine
offensichtlich sensitivere Methode beschrieben wird, die klinische Relevanz des
EHV-2 jedoch bei Keratitiden des Pferdes zumindest als alleiniger Verursacher in
Frage gestellt werden muss.
103
Diskussion
5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht Die für die Virusanzucht bestimmten Cytobrush- Proben wurden in dem gleichen
Verfahren gewonnen wie die Proben für die PCR Untersuchung.
Die Anzucht von EHV-2 gelang nur in einem Fall bei einem augengesunden
Kontrolltier.
Der Nachweis von vermehrungsfähigem EHV-2 mittels Anzuchtverfahren stellt
bereits im Vorfeld deutlich höhere Ansprüche an die Probenverarbeitung. Exogene
Einflüsse wie Transportdauer, Temperatur, Kontamination des Probenmaterials etc.
können bereits im Vorfeld zu ausreichender Schädigung des eventuell vorhandenen
vermehrungsfähigen Virusmaterials führen. Weiterhin ist in der relativ langen
Inkubationszeit des Anzuchtverfahrens ausreichend Raum für weitere schädigende
Faktoren. Dieses Verfahren stellt damit eine für äußere Einflüsse wesentlich
anfälligere Methode dar als die zum Nachweis von Virusgenom eingesetzte PCR.
Dennoch wäre es wissenschaftlich interessant, wenn durch Anzuchtverfahren eine
genauere Spezifizierung der EHV-2 Stämme in erkrankten und gesunden Augen
gelingen könnte. Dies könnte dann vielleicht in weiteren Untersuchungen eine
genauere Beurteilung der Pathogenität einzelner Stämme erlauben.
5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen Das Milieu des Bindehautsackes ist physiologischerweise nicht steril. Bereits in
vorangegangenen Studien wurden bei augengesunden Tieren vor allem
Staphylokokken, Corynebakterien, Streptokokken sowie Bacillus spp., Nesseria spp.
und Enterobacteriaceae nachgewiesen (WHITLEY et al. 1983, BARNETT et
al.1998). Bei BARNETT et al. (1998) werden als häufig aus erkrankten Augen
isolierte Keime ebenfalls Staphylokokken, Streptokokken, Pseudomonaden,
Moraxellen sowie Bacillus spp. aufgeführt, diese benötigen jedoch begünstigende
Faktoren, um pathogen zu wirken.
104
Diskussion
Auch Pilze können in einer Studie von SAMUELSON et al. (1984) bei 95 %
augengesunder Tiere gefunden werden. BARNETT et al. (1998) geben an, dass
gramnegative Keime häufiger von erkrankten als gesunden Augen isoliert werden
können. Auch MOORE et al. (1983) wiesen in 37 Fällen mit ulzerativen Keratitiden
überwiegen gramnegative Keime nach.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass grampositive Kokken in 59,5 %
der gesunden und 82,1 % der erkrankten Augen zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung
nachgewiesen werden konnten. Bei der Zweituntersuchung erfolgte der Nachweis
grampositiver Kokken in 37,3 % der gesunden und 64 % der erkrankten bzw.
ehemals erkrankten Augen. Diese Werte zeigen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten einen schwach signifikant höheren Nachweis
grampositiver Kokken in erkrankten Augen.
Der Nachweis von grampositiven aerob sporenbildenden Stäbchen, gramnegativen
aeroben sowie fakultativ anaeroben Stäbchen, coryneformen Bakterien, Fadenpilzen,
Sprosspilzen und niederen Pilzen erfolgte in beiden Untersuchungsgruppen mit
keinem signifikanten Unterschied.
Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig
und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte
sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,
Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei
zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.
vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in
erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.
Die Art und prozentuale Verteilung der nachgewiesenen Keime bestätigen zum
großen Teil die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen. Allerdings lässt sich
in dieser Studie bei erkrankten Augen nicht, wie beschrieben, ein häufigerer
Nachweis gramnegativer Bakterien führen. Vielmehr sind hier in erkrankten Augen
Staphylokokken und Streptokokken schwach signifikant häufiger als in gesunden
Augen nachzuweisen. Die klinische Relevanz an einer bestehenden
Hornhauterkrankung lässt sich daraus jedoch nicht ohne weiteres ableiten. Alle hier
105
Diskussion
nachgewiesenen Keime sind nur fakultativ pathogen und brauchen begünstigende
Faktoren, um maßgeblich an einer Erkrankung der Hornhaut und/oder Konjunktiva
beteiligt zu sein. Im Gegensatz dazu ist beim Rind und Schaf die infektiöse
Keratokonjunktivitis (Weidekeratitis) beschrieben, als dessen wichtigster primärer
Erreger Moraxella bovis angesehen wird (ROLLE und MAYR, 1993). In den USA ist
eine primäre Konjunktivitis durch Moraxella equi beschrieben (BARNETT et al.
1998).
Begünstigende Faktoren können in einer wegbereitenden Virusinfektion, in einer
Immunsupression, eventuell durch eine systemische Erkrankung oder durch
vorangegangene lokale Cortikoid- Behandlungen, oder in einer Vorschädigung der
Hornhaut durch mechanische Verletzung o. ä. liegen.
Auch die Menge der fakultativ pathogen wirkenden Keime kann einen Einfluss auf
die klinische Erkrankung haben. Hierbei ist auch der klimatische Einfluss
beispielsweise bei sehr warmer oder feuchter Witterung von Bedeutung, die
ebenfalls eine Auswirkung auf die Keimmenge ausüben können und durch die
Verbreitung über Vektoren wie beispielsweise Weidefliegen einen zusätzlichen
Keimdruck verursachen können.
Eine Entnahme von mikrobiologischen Tupferproben aus dem Bindehautsack ist, wie
diese Arbeit zeigt, häufig sehr unspezifisch und lässt auch bei klinisch erkrankten
Augen nicht immer einen Rückschluss auf die tatsächlich an einer Erkrankung
beteiligten Keime zu. Sinnvoller wäre bei Vorliegen einer ulzerativen
Hornhauterkrankung die Probenentnahme direkt von den erkrankten Bereichen der
Kornea, um beispielsweise bei Nachweisen von kollagenasebildenden Bakterien
(z.B. Pseudomonaden) mit einem Antibiogramm gezielter eine Therapie einleiten zu
können. Auch sollte die nachgewiesene Keimmenge in der Beurteilung der
mikrobiologischen Ergebnisse unter Berücksichtigung klimatischer Faktoren und
eventueller antibiotischer Vorbehandlungen mit einbezogen werden.
Auch der Nachweis von Pilzen in der Kultur lässt keinesfalls bereits die Diagnose
einer Hornhautmykose zu. Erst der Nachweis von Pilzmycel im zytologischen
Präparat (BOLLIGER et al. 2001) kann eine derartige Diagnose bestätigen.
106
Diskussion
Diese Arbeit bestätigt einmal mehr, dass die Auswertung eines mikrobiologischen
Tupfers aus dem Konjunktivalsack keinesfalls einen direkten Rückschluss auf die
Ursache einer vorliegenden Augenerkrankung zulässt und deswegen immer
differenziert betrachtet und beurteilt werden sollte.
5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen
Beim Menschen wird als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen
Augenerkrankungen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster
Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis als schnelle und wenig aufwendige
Methode die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,
WILHELMS et al. 1986).
Auch beim Kleintier wird die exfolitive Zytologie erfolgreich zur Diagnostik eingesetzt.
So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden
mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). Auch WILLIS et al. (1997)
untersuchten bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen
Erkrankungen des Auges und konnten dabei signifikante Unterschiede in
Zellquantität und –qualität feststellen, sowohl im Vergleich der Patienten- und
Kontrollgruppen als auch im Vergleich der Spezies Hund und Katze.
Bei einigen Katzen erfolgte der Nachweis von Chlamydien im Präparat, bei einem
Hund konnte das Staupevirus in Form von intranukleären Einschlusskörperchen
nachgewiesen werden (WILLIS et al. 1997).
Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So beschreibt
KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von Herpeskeratitiden die
Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen Nachweis von
Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000) beschreiben die
Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei Keratomykosen.
KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleicht in einer Studie mit 30 Pferden die
Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in Verbindung mit dem
Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im zytologischen Präparat,
konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.
107
Diskussion
Die Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei
Pferden, die an einer Keratitis erkrankt waren, sehr wenig inflammatorische Zellen im
Präparat zu finden sind, selbst dann, wenn eine begleitende Konjunktivitis
vorgelegen hat. Es ließen sich keine auffälligen Unterschiede beim Vergleich der
Präparate zwischen den klinisch erkrankten und klinisch gesunden Augen feststellen.
In der Literatur beschriebene intranukleäre Einschlusskörperchen (KELLNER 1990,
KRÜDEWAGEN et al. 2001) ließen sich nicht mit Sicherheit nachweisen. Bei
wenigen Pferden wäre der Verdacht auf solche Einschlusskörperchen möglich
gewesen, eine Unterscheidung zu Kernkörperchen (Nukleoli) oder
Chromatinverdichtungen bei lytischen Zellen konnte hier aber nicht mit Sicherheit
erfolgen.
Eine mögliche Erklärung für das nur vereinzelte Auftreten von Entzündungszellen
(neutrophile Granulozyten und Lymphozyten) lässt sich vielleicht darin finden, dass
hier nicht die erkrankte Kornea, sondern die Conjunctiva palpebralis beprobt wurde.
Selbst beim Vorliegen einer klinischen Konjunktivitis äußert sich diese hauptsächlich
in einer Hyperämie und damit zwar mit einer Rötung und Schwellung der Bindehäute,
aber eine wirkliche mukopurulente Exsudation bleibt in vielen Fällen aus, der
Charakter des Augenausflusses wird meist als serös bis seromukös beschrieben. Im
Gegensatz dazu wird beim Kleintier häufig bei Vorliegen einer Keratokonjunktivitis
eine oft starke mukopurulente Exsudation beobachtet.
Wenn bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pferden Epiphora vorgelegen
hat, so äußerte sich diese meist mit serösem bis seromukösem Augenausfluss. Dies
lässt zwar auf eine eventuell durch die Hyperämie und den Schmerzreiz verursachte
vermehrte Sekretion der Tränendrüsen (seröse Komponente), Meibomschen Drüsen
(Fettkomponente) und Becherzellen der Konjunktiva (muköse Komponente)
schließen, eine durch verschiedene Mediatoren bedingte massive Auswanderung der
Entzündungszellen aus den kapillären Blutgefäßen ins umliegende epitheliale
Gewebe scheint jedoch hier auszubleiben. Hierbei bleibt außerdem zu beachten,
dass ein Großteil der erkrankten Pferde als Überweisungspatienten bereits längere
Zeit erkrankt waren und somit bereits ein chronischer Erkrankungszustand vorlag.
108
Diskussion
Offenbar handelt es sich beim Pferd im Gegensatz zum Kleintier häufig um einen
lokal auf die Hornhaut konzentrierten Entzündungsprozess, so dass die klinisch oft
beobachtete begleitende Konjunktivitis überwiegend auf eine Rötung durch
reflektorische Hyperämie zu erklären ist.
Die exfoliative Zytologie von der Conjunctiva palpebralis kann den Ergebnissen
dieser Arbeit zur Folge als Routinediagnostik von möglicherweise viral bedingten
Keratitiden bisher nicht eingesetzt werden. Beim Vorliegen von bestimmten
Erkrankungen des Auges wie beispielsweise der Keratomykose, eosinophilen
Granulomen oder Neoplasien im Bereich der Hornhaut und Konjunktiva (z. B.
Plattenepithelkarzinom) stellt sie jedoch ein sicheres und schnelles Verfahren zur
Sicherung einer Verdachtsdiagnose dar.
5.6 Schlussfolgerung Die Ergebnisse dieser Arbeit geben keine Hinweise auf eine tatsächlich bestehende
ätiologische Rolle des EHV-2 bei Keratitiden des Pferdes. Auch konnte kein
klinisches Bild einer vermeintlichen „Viruskeratitis“ mit einem vermehrten Nachweis
von EHV-2 in Zusammenhang gebracht werden. In früheren Studien durchgeführte
Infektionsversuche mit EHV-2 haben bis jetzt nicht ergeben, dass sich eine Keratitis
entwickeln könnte. WILCOX und RAIDAL (2001) diagnostizierten nur milde
respiratorische Symptome, BORCHERS et al. (1998) stellten bei zwei infizierten
Ponies eine Konjunktivitis fest. Allerdings kann in Verbindung mit jeder
Allgemeininfektion eine Hyperämie der Bindehäute auftreten (LAVACH 1992,
BROOKS 1998).
Diese Ergebnisse der virologischen Untersuchungen stehen im Gegensatz zu
früheren Untersuchungen, in denen bei Pferden mit einer Keratitis ein signifikant
häufigerer Nachweis von EHV-2 gelang als bei augengesunden Kontrollpferden
(VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001).
109
Diskussion
In einer jüngeren Arbeit von BESTHORN (2002) konnten jedoch ähnliche Ergebnisse
wie in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Sonstige Autoren berichten nur in
einzelnen Fallberichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden (THEIN und
BÖHM 1976, MILLER 1990, COLLINSON 1994). Da auch in dieser Arbeit in einem
großen Prozentsatz der gesunden Pferde EHV-2 Genom aus dem Auge isoliert
werden konnte, stellt sich die Frage, ob der Nachweis in Einzelfällen nur zufällig
zusammen mit einer klinischen Erkrankung der Hornhaut erfolgte.
Weiterhin wäre auch die mögliche ätiologische Beteiligung anderer Faktoren zu
untersuchen. So werden beispielsweise beim Menschen Adenoviren für klinische
Veränderungen der Hornhaut im Sinne einer Keratitis punctata verantwortlich
gemacht (SUNDMACHER et al. 2001). Beim Pferd werden Adenoviren bisher eher
mit respiratorischen Symptomen in Zusammenhang gebracht (ROLLE u. MAYR
1993). Auch sollten andere epitheliotrope Herpesviren wie beispielsweise EHV-1 und
EHV-4 beachtet werden, deren Pathogenität bereits in anderen klinischen
Zusammenhängen nachgewiesen ist. In der Literatur finden sich hier einzelne
Berichte, die Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Infektionen mit EHV-1
und – 4 und der Beteiligung an Augenerkrankungen liefern. So zeigte ein intranasal
mit EHV-1 infiziertes SPF-Fohlen nach 28 Tagen schwere Chorioretinopathien,
postmortal konnte im Augengewebe EHV-1 Genom nachgewiesen werden (SLATER
et al. 1992). RIIS (1981) beschreibt EHV-1 als Ursache für eine Keratitis. Neben der
Isolierung aus Geweben des Respirationstraktes gelang auch die Isolierung von
EHV-4 aus Kornea und Konjunktiven von Fohlen, die in der akuten Phase einer
experimentellen Infektion getötet wurden (PATEL et al. 1982).
Auch wäre eine mögliche Beteiligung von Chlamydien oder Mykoplasmen, wie sie
beim Menschen oder der Katze bereits diskutiert werden, zu untersuchen. Da eine
Vielzahl der Fälle bei der Behandlung mit Virostatika eine schnelle klinische
Besserung zeigt (BARNETT et al. 1993), ist es durchaus auch denkbar, dass erst
durch Co- Faktoren eine klinische Erkrankung durch EHV-2 ausgelöst wird. Auch
eine Bestimmung der Virusmenge im Probenmaterial oder eine nähere
Spezifizierung des Virustammes könnte in Relation zum klinischen Bild gesetzt
werden.
110
Diskussion
Letztlich könnten auch immunologische Mechanismen beispielsweise durch
vermehrte Expression von inflammatorischen Zytokinen oder Komplexbildungen in
der Hornhaut auslösend für eine klinische Erkrankung sein. Dieser Mechanismus ist
beim Menschen bereits beim Vorhandensein chronischer rheumatischer
Erkrankungen und dem rezidivierenden Auftreten von Hornhautulzera beschrieben
(PRADA et al. 2003).
Die exfoliative Zytologie könnte trotz der bisher ungenügenden Ergebnisse
weitergeführt werden. Es wäre beispielsweise möglich, durch Spezialfärbungen
Chlamydien oder Mykoplasmen nachzuweisen, oder mit Immunfluoreszenzmethoden
möglicherweise vorliegende Viruseinschlusskörperchen zuverlässig zu identifizieren.
Zur Sicherung spezieller Verdachtsdiagnosen wie beispielsweise einer
Keratomykose oder eosinophilen Keratitis stellt diese Methode ein sicheres, wenig
aufwendiges und wenig invasives Verfahren dar.
Insgesamt bleibt die Ätiologie der Keratitiden des Pferdes nach wie vor unklar und
sollte in zukünftigen Untersuchungen weiter erforscht werden, ohne sich dabei
jedoch zu sehr auf den alleinigen Nachweis von EHV-2 zu konzentrieren. Auch das
equine Herpesvirus Typ 5 (EHV-5) wurde bereits in einigen Studien ohne erkennbare
Beteiligung an einer Hornhauterkrankung nachgewiesen (KRÜDEWAGEN et al.
2001, BESTHORN 2002) und scheint bei Keratitiden keine klinische Relevanz zu
haben.
Für die virologischen Untersuchungen bleibt anzumerken, dass statt eines
Wattetupfers der Einsatz des Cytobrushs deutliche Vorteile aufgrund der höheren
Sensitivität im Nachweis von Virusmaterial aufweist. Da die Probenentnahme keine
größeren Schwierigkeiten als die Entnahme eines Wattetupfers aus dem
Bindehautsack darstellt, sollte man diese Methode dem Wattetupfer vorziehen, um
zuverlässigere Nachweisergebnisse zu erzielen.
111
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Myriam von Borstel (2003): Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) Bei verschiedenen Formen von Keratitiden oder Keratopathien des Pferdes wird in
vielen Fällen eine virale Ätiologie vermutet. In der Literatur wird dabei als möglicher
Verursacher das equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) diskutiert. Bisher konnte jedoch
kein spezifisches klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ mit dem Nachweis von EHV-2
in Zusammenhang gebracht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde bei 28 Pferden mit einer Keratitis,
Keratokonjunktivitis oder Konjunktivitis (Gruppe 1) sowie 28 Kontrollpferden ohne
klinische Augenerkrankung (Gruppe 2) zweimal im Abstand von vier Wochen eine
klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle ophthalmologische Untersuchung
durchgeführt. Dabei wurden jeweils aus dem Konjunktivalsack beider Augen
Wattetupfer zur mikrobiologischen Untersuchung sowie Wattetupfer und
Cytobrushproben zur virologischen Untersuchung auf EHV-2 Genom mittels nPCR
entnommen. Ferner wurden noch Nasentupfer und periphere Blutleukozyten mittels
nPCR auf EHV-2 Genom untersucht. Außerdem wurde bei der Erstuntersuchung
mittels Cytobrush ein zytologischer Abstrich aus dem Konjunktivalsack angefertigt
und mikroskopisch untersucht.
Im Vergleich der Pferde der Gruppe 1 zu den augengesunden Kontrolltieren der
Gruppe 2 konnte in keiner der untersuchten Proben ein signifikanter Unterschied im
Nachweis von EHV-2 Genom mittels nPCR festgestellt werden.
Bei den aus dem Konjunktivalsack entnommenen Proben konnte zu beiden
Untersuchungszeitpunkten im Cytobrush signifikant (p < 0,01) häufiger der Nachweis
von EHV-2 Genom im Vergleich zum ebenfalls entnommenen Wattetupfer geführt
werden.
112
Zusammenfassung
Bei den mikrobiologischen Untersuchungen konnte in erkrankten Augen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten ein schwach signifikant (p < 0,05) häufigerer Nachweis
von grampositiven Kokken erfolgen. Die Auswertungen der mikrobiologischen
Untersuchungen zeigen, dass eine große Vielzahl verschiedener Keime sowohl in
erkrankten als auch in klinisch gesunden Augen nachzuweisen sind und eine
Auswertung eines mikrobiologischen Konjunktivaltupfers immer unter
Berücksichtigung des klinischen Erscheinungsbildes erfolgen sollte, da keine der
nachgewiesenen Keime als obligat pathogen einzustufen sind.
Bei den mikroskopischen Untersuchungen der zytologischen Präparate sind auch in
den erkrankten Augen, welche eine begleitende klinische Konjunktivitis aufwiesen,
nur sehr wenig inflammatorische Zellen zu finden. Nur in wenigen Fällen konnten
vereinzelte Lymphozyten oder neutrophile Granulozyten gefunden werden, dabei ließ
sich kein Unterschied im Vergleich von erkrankten und gesunden Augen feststellen.
Eine Korrelation zum Nachweis von EHV-2 Genom in der virologischen
Untersuchung konnte ebenfalls nicht hergestellt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine ursächliche Beteiligung des EHV-2 an
Keratitiden des Pferdes nicht nachgewiesen werden. Bei den virologischen
Untersuchungen mittels nPCR stellt der Cytobrush jedoch eine signifikant sensitivere
Methode der Probenentnahme dar.
113
Summary
7 Summary
Myriam von Borstel (2003): Advanced diagnostic methods for keratitis in horses with particular consideration of the detection of equine herpesvirus type 2 (EHV-2)
Different forms of keratitis or keratopathies in the horse are associated with a viral
aetiology. A review of the literature showed that EHV-2 is suspected as the causitive
agent, but no specific clinical signs corresponding to the detection of EHV-2 have
been determined.
In this study 28 horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis (group
1) were examined for their general state of health and subjected to a detailed
ophtalmological examination, as were 28 horses with no ocular disease (group 2). In
addition, samples of the conjunctiva were taken with cotton wool swabs for
microbiologic examination; for the detection of EHV-2 genome with nested PCR,
samples were taken with cotton wool swabs and cytobrushes. Cotton wool swab
samples from the nasal mucosa and isolated peripheral blood leukocytes were also
taken and examined by nested PCR for presence of the EHV-2 genome. These
investigations were carried out twice over a course of four weeks. Furthermore,
conjunctival scrapings were taken with the cytobrush during the first examination for
cytological evaluation.
Comparison of the horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis with
those without ocular diseases showed no significant difference in any of the samples
examined for the presence of the EHV-2 genome. For both examination times, the
rate of detection of the EHV-2 genome in the samples taken with cytobrushes was
significantly higher than in those taken with cotton wool swabs (p < 0,01).
The microbiological examination showed a slightly significantly higher rate of
detection of gram-positive cocci in the diseased eyes (p < 0,05). Microbiological
114
Summary
examination revealed a wide variety of different infective agents in both diseased
and healthy eyes. As none of the infective agents found are obligatorily pathogenic, a
microbiological swab from the conjunctiva must always be assessed in consideration
of the clinical signs.
Microscopic examination of the cytological preparations revealed only a few
inflammatory cells, even in the diseased eyes with conjunctivitis. Lymphocytes and
neutrophile granulocytes were found in only a few cases, with no difference between
diseased and healthy eyes, nor was there a correlation of these findings with the
detection of the EHV-2 genome.
No aetiological participation of EHV-2 in keratitis in horses was determined in this
study. Use of the cytobrush was found to be a significantly more sensitive sampling
method for virological examination.
115
Literaturverzeichnis
8 Literaturverzeichnis
ADAMS, G.G.W., P.N. DILLY u. C.M. KIRKNESS (1988):
Monitoring Ocular Disease by Impression Cytology
Eye 2, 506 – 516
AGIUS, C.T., u. M.J. STUDDERT (1994):
Equine herpesviruses 2 and 5: comparisons with other members of the subfamily
Gammaherpesvirinae
Adv. Virus Res. 44, 357 – 379
BARNETT, K.C., S.M. CRISPIN, J.D. LAVACH u. A.G. MATTHEWS (1998):
Augenkrankheiten beim Pferd
Verlag Schlütersche, Hannover
BAUER, G.A. (1999):
Exfoliative cytology of the cornea and conjunctiva of domestic animals
Zürich, Universität, Veterinär-Chirurgische Klinik, Diss.
BAUER, G.A., B.M. SPIESS u. H. LUTZ (1996):
Exfoliative Cytology of Conjunctiva and Cornea in Domestic Animals: A Comparison
of Four Collecting Techniques
Vet. & Comp. Ophtalmol. 6 (3), 181 - 186
BELÁK, S., V. PÁLFI, S. TUBOLY u. L. BARTHA (1980):
Passive Immunization of foals to prevent respiratory disease caused by equine
herpesvirus type 2
Zbl. Vet. Med., Reihe B 27, 826 – 830
116
Literaturverzeichnis
BESTHORN, C. (2002):
Keratitiden des Pferdes und Nachweishäufigkeit der DNS der Equinen Herpesviren
Typ 2 (EHV-2) und Typ 5 (EHV-5) mittels Polymerasekettenreaktion
München, Ludwig-Maximilians-Universität, Innere Medizin und Chirurgie Pferd, Diss.
BOLLIGER, J.O., M.B. RUEHLI u. B.M. SPIESS (2000):
Zur Keratomykose beim Pferd
Pferdeheilkunde 16, 465 – 472
BORCHERS, K., u. K. FRÖHLICH (1997):
Antibodies against equine herpesvirus in free ranging mountain zebras from Namibia
Journal of Wildlife Diseases 33 (4), 812 – 817
BORCHERS, K., K. FRÖLICH u. H. LUDWIG (1999):
Detection of equine herpesvirus type 2 and 5 (EHV-2 and EHV-5) in Przewalski´s
wild horses
Arch. Virol. 144, 771 – 780
BORCHERS, K., U. WOLFINGER, M. GOLTZ, H. BROLL u. H. LUDWIG (1997):
Distribution and relevance of equine herpesvirus type 2 (EHV-2) infections
Arch. Virol. 142, 917 – 928
BORCHERS, K., U. WOLFINGER, H. LUDWIG, P. THEIN, S. BAXI, H.J. FIELD u.
J. SLATER (1998):
Virological and molecular biological investigations into equine herpes virus type 2
(EHV-2) experimental infections
Virus Research 55, 101 - 106
BRANDT, K., R. HIPP, P. WOHLSEIN u. E. DEEGEN (1995):
Die eosinophile Keratokonjunktivitis bei drei Pferden – Symptomatik und
laserchirurgisch unterstützte Therapie
Pferdeheilkunde 11, 405 – 410
117
Literaturverzeichnis
BROWNING, F., u. C.T. AGIUS (1996):
Equine herpesvirus 2 and 5 (equine gammaherpesviruses) and asine herpesvirus 2
infections
In: Virus infections of vertebrates, Vol. 6: Virus infections of equines
Elsevier Science, Amsterdam, Netherlands, 47 - 60
BROWNING, G.F., u. M.J. STUDDERT (1987):
Epidemiology of Equine Herpesvirus 2 (Equine Cytomegalovirus)
J. Clin. Microbiol. 25, 13 – 18
COLLINSON, P.N., J.L. O´REILLY, N. FICORILLI u. M. STUDDERT (1994):
isolation of equine herpesvirus type 2 (equine gammaherpesvirus 2) from foals with
keratokonjunctivitis
J. Am. Vet. Med. Assoc. 205, 329 – 331
DAVIDSON, M.G. (1991):
Equine Ophtalmology
In: Gelatt, K.N. (Hrsg.): Veterinary Ophtalmology
Lea & Febiger, Pennisylvania
DE ROJAS, M.V., M.T. RODRIGUEZ, J.A. CES BLANCO, M.S. SALORIO (993) :
Impression Cytology in Patients with Keratoconjunctivitis Sicca
Cytopathology 4 (6), 347 – 355
GEDECK, B., O.R. KAADEN, H. MAHNEL u. A. MAYR (1993):
Equine Herpesvirusinfektionen
In: ROLLE / MAYR (Hrsg.): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und
Seuchenlehre
6. Auflage, F. Enke Verlag, Stuttgart
118
Literaturverzeichnis
GLEESON, L.J., u. M.J. STUDDERT (1977):
Equine herpesviruses: experimental infection of a foetus with type 2
Austr. Vet. J. 53, 360 – 362
HOLLWICH, F. (1988):
Augenheilkunde
11. Auflage, Verlag Thieme, Stuttgart, New York
KELLNER, S.J. (1990):
Hornhauterkrankungen beim Pferd
Pferdeheilkunde 6, 163 – 168
KEMENEY, L., u. J.E. PEARSON (1970):
Isolation of herpesvirus from equine leukocytes: comparison with equine
rhinopneumonitis virus
Can. J. Comp. Med. 34, 59 – 65
KERSHAW, O., T. VON OPPEN, F. GLITZ, E. DEEGEN, H. LUDWIG, K.
BORCHERS (2001):
Detection of equine herpesvirus type 2 (EHV-2) in horses with keratoconjunctivitis
Virus Research 80, 93 - 99
KRÜDEWAGEN, E.V., H.-J. BALZER u. S.J. KELLNER (2001):
Nachweishäufigkeit von Equinen Herpesviren 2 und 5 am Pferdeauge – Vergleich
der Nachweismöglichkeiten mittels exfoliativer Zytologie und
Polymerasekettenreaktion
Pferdeheilkunde 17, 444 – 452
LAVACH, J.D. (1990):
Large animal ophtalmology
C.V. Mosby, Philadelphia
119
Literaturverzeichnis
MARTIN, L. (1994):
Augenkrankheiten bei Hund und Katze ( Pferd, Wiederkäuer)
Verlag M.& H. Schaper, Alfeld-Hannover
MASKIN, S.L., K.F. HEITMAN, A.W. LAWTON u. R.W. YEE (1989):
Diagnostic Impression Cytology for External Eye Disease
Cornea 8 (4), 270 – 273
MILLER, T.R., J.M. GASKIN, R.D. WHITLEY u. M.L. WITTCOFF (1990):
Herpetic keratitis in a horse
Equine Vet. J. 10, 15 – 17
MOORE, C.P., W.H. FALES, P. WHITTINGTON u. L. BAUER (1983):
Bacterial and fungal isolates from equidae with ulcerative keratitis
Danksagung Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen möchte ich an dieser Stelle ganz herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und die jederzeit gewährte freundliche und unkomplizierte Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit danken. Bei Frau PD Dr. rer. nat. Kerstin Borchers und ihren Mitarbeitern möchte ich mich für die freundliche Aufnahme im Labor des Instituts für Virologie des FB Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin und die stets gewährte, engagierte und unkomplizierte Unterstützung danken. Ebenso danke ich Prof. Dr. G. Amtsberg und den Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der TiHo Hannover für die Betreuung der Arbeit und die zuverlässige und schnelle mikrobiologische Diagnostik. Prof. Dr. R. Mischke danke ich für die stets freundliche und engagierte Unterstützung bei der Auswertung der zytologischen Präparate. Besonders danke ich Marco Ebert für die hervorragende Zusammenarbeit und Hilfe. Ich wünsche ihm einen guten Endspurt für die Fertigstellung seiner eigenen Dissertation. Dr. Tassilo von Oppen möchte ich ganz besonders herzlich danken für sein Engagement, die fachliche Betreuung, Unterstützung und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit, und nicht zuletzt für die nette Zusammenarbeit. Vielen Dank! Dr. Frauke Glitz danke ich ganz herzlich für dafür, dass sie den Stein für diese Dissertation überhaupt erst ins Rollen gebracht hat. Ohne Dich wäre wahrscheinlich keine ophthalmologische Thematik für die Anfertigung einer Dissertation in Frage gekommen, Danke! Ich möchte allen Mitarbeitern der Klinik für Pferde der TiHo Hannover danken für gute Zusammenarbeit und geleistete Hilfe. Besonders danke ich Astrid für ihre konstruktiven Kritiken und Korrekturen sowie der moralischen Unterstützung während der „Endphase“, für die ich ebenso Kirstin, Viola und Bianka danke. Claus danke ich für die Beprobung der Maultiere, Robert und Rolf für diverse Erste-Hilfe-Leistungen bei Computernotfällen. Für geistigen Beistand und konstruktive „Teestunden“ möchte ich außerdem Angela und Sarah danken. Bei Dr. Karl Rohn aus dem Institut für Biometrie und Statistik der TiHo bedanke ich mich für die Beratung und Durchführung der statistischen Untersuchungen. Nicht zuletzt danke ich Sascha, der geduldig jede Phase der Doktorarbeitszeit „ertragen“ hat, für sein Verständnis, seine Unterstützung und seine Liebe!