97 PACLITAXEL (TAXOL ’un) ANTİ-KANSER ETKİ MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ Dr. Erhan Süleymanoğlu Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hipodrom, 06330-Ankara ANKARA 2007
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
97
PACLITAXEL (TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE
MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ
Dr. Erhan Süleymanoğlu
Gazi Üniversitesi,
Eczacılık Fakültesi,
Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı,
Hipodrom,
06330-Ankara
ANKARA
2007
98
İÇİNDEKİLER
Proje Özet Bilgi Formu…………………………………………………………………………………….1 Proje ile ilgili Genel Hususlar……………………………………………………………………………3 Motivasyon ve Ankara’da Bulunan Araştırma Olanakları…………………………………….4
1. Giriş……………………………………………………………………………………………………..7 1.1. Kanser……………………………………………………………………………………….…….7 1.2. Kanserin Tedavi Şemaları……………………………………………………………………………8 1.2.1. Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri…………………………………………………………..8 1.2.2. Kemoterapinin Prensipleri…………………………………………………………………………..9 1.2.3. Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri…………………………….19 1.2.4. Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü………………………………………………22 1.2.5. Gen Tedavisi ve Gen Nakli………………………………………………………………………….24 1.2.6. DNA Kompaktizasyonu ve Nanoparçacık Oluşumunu
Meydana Getiren Bileşenler………………………………………………………………………..33 1.3. Taxol® (Paclitaxel)…………………………………………………….……………………………….43 1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®‘un Rolü…………………….43 1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı……………………………………………..…..46 1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması……………………………………………………………………….54 1.3.5. Projemin Bilimsel Dayanağı………………………………………………………………………..58 1.3.6. Literatür Özeti…………………………………………………………………………………………...60 2. Gereç ve Yöntem..………………………………………………………………………………………….61 2.1. Hücre Membranın Yapısı…………………………………………………………………………………61 2.1.1. Biyomembranların İçeriği……………………………………………………………………………..61 2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri………………………………………………….66 2.2.1. Lipid Çift Katman…………………………………………………………………………………………66 2.2.2. Membranın Fizikokmyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler…………………………….67 2.2.3. Lipid Fazlarını Etkileyen Faktörler ve Biyosistemlerdeki Önemi……………………….70 2.2.4. İlâçların Biyomembran Akışkanlığı Üzerine Etkisi…………………………………………..71 2.2.5. Biyomembran Akışkanlığının Anlamı……………………………………………………………..73 2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında
Kullanılan Başlıca Yöntemler……………………………………………………………………………..80 2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler……………………………………………………………………………………81 2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler……………………………………………………………………………..81 2.3.1.2. Difference Spectroscopy………………………………………………………………………………84 2.3.1.3. Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi………………………………………84 2.3.1.4. Raman Spektroskopisi………………………………………………………………………………..85 2.4. Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi…………………………………………………………….85 2.4.1. Yüzeysel Gerilimin Wilhelmy Plate Yöntemiyle Ölçülmesi…………………………………87 2.4.2. Lipid Tek Katmanların Özelliklerinin İzoterm Yöntemiyle İncelenmesi……………..88 2.4.3. Sub-fazda Madde-Lipid Etkileşmelerinin İncelenmesi ve Lipid Moleküllerinin İşgal Etileri Alanın Ölçülmesi……………………………………………..88 2.4.4. Tek Katmanda Yer Alan Maddeler Arasındaki Etkileşmelerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………….89 2.4.5. Tek Katmanlarda Maddelerin Karışım Oluşturma Özelliklerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………………90 2.4.6. Tek Katmanlarda Bulunan Moleküllerin Yapısal Değişikliklerinin İncelenmesi……………………………………………………………………………..91 2.4.7. Tek Katmanın Sabitlilik ve Deformasyon Özelliklerinin Hesaplanması……………….92 2.4.8. İzoterm Şekillerinin Analizi ve Yorumlanması…………………………………………………92 2.4.9. Projemdeki Deneysel Tasarım………………………………………………………………………..93 2.4.10. Projemde Geliştirilen Yeni Deneysel Protokol………………………………………………..93 2.4.10.1. Kimyasallar………………………………………………………………………………………………93
99
2.4.10.2. Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması………………………………………..94 2.4.10.3. Yüzey Basınç-alan (π-A) İzotermler…………………………………………………………….97 2.4.10.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri…………………………………………………….95 2.4.10.5. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi……………………………………..95 3. Bulgular……………………………………………………………………………………………………………..97 3.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………..98 3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri……………………………………………………112 3.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri………………………………………………………..119 4. Tartışma…………………………………………………………………………………………………………..163 4.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………163 4.2. DSC Ölçümleri……………………………………………………………………………………………….173 4.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri……………………………………………………….175 4.3.1. Bu Projede Yapılan Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümlerinin Daha Önce Başka Bir Cihazla Yaptığım Ölçümlerle Kıyaslanması…………………………177 4.4. Taxol®-Fosfolipid Membran Arasında Oluşan Yapı……………………………………………186 4.5. Biyoteknolojik Boyut……………………………………………………………………………………….187 4.6. Hücresel ve Moleküler Biyolojik Boyut……………………………………………………………..192 4.7. Projemde Geliştirilen Tasarımın Diğer Analitik Uygulamalardaki Yeri………………..202 4.7.1. İlâç Ligandlarıın Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom Kromatografisinin Geliştirilmesi………………………………………….202 4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak Çalışmalar……………………..207 4.7.3. Öncü Hipotez………………………………………………………………………………………………209 4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim…………………………………………….213 5. Sonuç……………………………………………………………………………………………………………….216 Eklerα…………………………………………………………………………………………………………………217
α Birçok Ek belge niteliğinde olduğundan bunlara sayfa numarası verilmemiştir.
100
PROJE ÖZET BİLGİ FORMU
Proje Kodu: 02/2005-15
Proje Başlığı: PACLITAXEL (TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ
MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT
BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE MOLEKÜLER DÜZEYDE
İNCELENMESİ
Proje Yürütücüsü ve Yardımcı Araştırmacılar:
Dr. Erhan Süleymanoğlu
Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Gazi Üniversitesi, Eczacılık
Fakültesi, Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı,
Hipodrom, 06330-Ankara
Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi: Gazi Üniversitesi, Bilimsel
Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığı
Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri: Ekim-2005-Ekim-2007
Türkçe Özet: Bu çalışmada, kemoterapide yoğun olarak kullanılan Taxol® (Paclitaxel) ile farklı
zincir yapılarına ve elektrostatik özelliklerine sahip fosfolipidler arasında oluşan moleküler
etkileşmeler Langmuir-Blodgett tek katman, FTIR ve DSC ölçümleriyle incelenmiştir. Sınır
yüzeylerde oluşturulan lipid tek katman ve lipid veziküllerinde (lipozom) yer alan lipid çift
katmanlar model hücre zarları olarak uygulanmıştır. Neticeler, Taxol® konsantrasyonuna, pH,
T°C, tampon sistemine, hidrofobik ve elektrostatik ortama bağlı olarak açıklanmıştır. İlâç ile farklı
fosfolipid molekülleri arasındaki etkileşmelerinin sonucu olarak meydana gelen “self-assembly”
agregatlarının sekonder yapısal değişiklikleri FTIR spektroskopisi ile incelenmiştir. Elde edilen
veriler, karbonil, fosfat, kolin ve CH2 gruplar seviyesinde değerlendirilmiştir. Tek katmanda
meydana gelen ilâç-fosfolipid etkileşmeleri ara yüzeydeki lipidlerin moleküler alanlarına
bağımlılık göstermektedir. Taxol®’un, fosfatidilkolin türü zwitteriyonik lipidler ile termodinamik
olarak sabit yapılar oluşturduğu DSC ölçümleri ile ortaya çıkarılmıştır. Tek katmanda oluşan söz
konusu yapıları Brewster Angle (BAM), atomik kuvvet (AFM), floresan ve Raman mikroskopi
yöntemleriyle de görüntülemeyi ümit ediyoruz. Bu farmasötik nanoformülasyonlarının in vivo
101
ortamda hücre zarı akışkanlığı üzerindeki muhtemel etki mekanizması ile ilgili yeni bir hipotez de
sunulmuştur.
Bu çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Daire Başkanlığı tarafından
İngilizce Özet:
Abstract: Introduction: The current study reports our last results of recent project on the role of biomembranes in cancer therapeutics.
Aim: The objective is to emphasize their relevant physicochemical features in depicting molecular mechanisms of action of antineoplastic agents with further implications in drug design.
Methods: Langmuir-Blodgett monolayers were used to simulate lipid surface of cell membranes of both normal and cancer cells trying to approach surface forces governing molecular interactions between various phospholipids and Paclitaxel (Taxol®)-a widely used anticancer drug. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy was applied for following subsequent changes in lipids after drug recognition trying to relate this to its fluidizing effect. This was further studied by Differential Scanning Calorimetric (DSC) measurements, which showed further thermodynamic characteristics of drug-lipid interaction.
Results and Discussion: Biophysical analysis showed that miscible drug-lipid complexes form at air/water interface, followed by instability of the monolayer due to their interaction. Spectroscopic and thermodynaic measurements showed the phase separation, the extend of liquid-condensed phases, as well as microdomain formation in monolayers. We are also trying to apply Atomic Force Microscopy (AFM), Brewster-Angle Microscopy (BAM) and Raman Microscopy to extend our previously proposed model of the role of phospholipid specificity of Taxol® and its cellular effects. Relevant physicochemical reasoning and models will be presented in more detail.
Acknowledgements: This work was supported by Gazi University Research Fund (Project
No: 02/2005-15).
Anahtar Kelimeler: Paclitaxel (Taxol®), Model ve Biyomembranlar, Tümör Hücre
Projeden Kaynaklanan Yayınlar: 2 makale ve 4 poster sunumunun
yapılması plânlanmıştır. Tüm bunlar hazırlanma aşamasındadır.
Bilim Dalı: İnterdisipliner
Doçentlik B. Dalı Kodu: Yok G. Ü. Akademik Yükseltilme
ve Atanma Ölçütlerine göre puan durumum: 835
102
Proje ile ilgili genel hususlar.
İlâçlarla organizma arasındaki oluşan karmaşık tepkimeler ve yolaklar
hücresel ve moleküler düzeyde yapılan incelemelerinin önemini artırmıştır. Hücre ile
ilâçlar arasında ilk temas noktası biyolojik lipid zarlardır. Bu bağlamda, çeşitli ilâç-
hücre etkileşmelerindeki lipid zarların rolü küçümsenemez ve bunlarla ilgili elde
edilen veriler son derece önemlidir. Bu verilere dayanarak çeşitli ilâçların etki
mekanizmalarının daha iyi anlaşılması sağlanmaktadır. Günümüzde kullanılan
birçok farmasötik formülasyon amfifilik veya katamfifiliktir ve bu özellikler sayesinde
biyolojik zarlarla tepkimelere girmektedirler.
Çeşitli antibiyotiklererin, anti-enflamatuarların ve anestetiklerin model ve
biyolojik membranlar üzerinde etkileri uzun yıllar önce araştırmacıların dikkatini
çekmiş ve ayrıntılı olarak farklı düzeneklerde incelenmiştir. Bu araştırmalar
sayesinde, örneğin anestetiklerin etki mekanizması ile ilgili, halâ geçerliliğini
yitirmemiş lipid teoriler ortaya atılmıştır1 ve birçok farmakodinamik modeller bu
teorilerine dayanmaktadır. Söz konusu modeller farklı ilâçların etki mekanizmalarına
da uyarlanmaya çalıştırmıştır. Diğer yandan, normal hücre ile kanser hücrenin
akışkanlığında önemli farklılıklar ortaya çıkarılmıştır ve bu buluşlar anti-kanser
ilâçların membran üzerinden çalışan bileşenler olarak algılanması gerektiği
konusunu da gündeme getirmiştir.
Sunduğum bu projede de, kemoterapilerde yoğun olarak kullanılan Taxol
(Paclitaxel) ile kanser hücreyi2 modelleyen çeşitli membran modelleri arasında
oluşan etkileşmeler ele alınmıştır. Projemin iki boyutu vurgulanmıştır. Bunlardan ilki
biyoteknolojik boyut olup, çeşitli lipidlere dayalı kontrollü salınım sistemlerdeki
Taxol-fosfolipid komplekslerinin oluşumu üzerine durmaktadır. Günümüzde
kullanılan birçok çok halkalı (heterosiklik) farmasötik formülasyonların hidrofobik
özelliklerinden dolayı çözünürlülük sorunu ortaya çıkmıştır ve bunların biyolojik
1 Bu öncü teoriler için Bk.: Trudell JR. A unitary theory of anesthesia based on lateral phase separations in nerve membranes. Anesthesiology. 1977 Jan;46(1):5-10. Seelig A, Allegrini PR, Seelig J. Partitioning of local anesthetics into membranes: surface charge effects monitored by the phospholipid head-group.Biochim Biophys Acta. 1988 Apr 7;939(2):267-76. Suezaki Y, Tatara T, Kaminoh Y, Kamaya H, Ueda I. A solid-solution theory of anesthetic interaction with lipid membranes: temperature span of the main phase transition. Biochim Biophys Acta. 1990 Nov 2;1029(1):143-8; Jibu M. Theory of cell membrane organizers and pressure reversal of anesthesia. Med Hypotheses. 2001, Jan;56(1):26-32. 2 Kanser hücre yüzeyini (cancer cell surface) olarak ifade edilmesi çok daha doğru olacaktır.
103
sıvılarda uygulama etkinliğini olumsuz etkilemektedir. Bu yüzden, çözünürlülük
sorununu bazı kontrollü salınım sistemleri ile çözmeye çalışılmaktadır. Ancak, bunun
için ilâç-lipid kompleks oluşumunun ön incelemesi gerekmektedir ve bu önemli konu
projemde de ele alınıp değerlendirilmiştir. Bu tür fizikokimyasal verilere dayanarak
daha sonraki ilâç geliştirme aşamalarında yeni, tedavi potansiyeli ve özellikleri
iyileştirilmiş anti-kanser formülasyonlarının geliştirilmesini mümkün kılmaktadır.
Projemin ikinci boyutu ise bu anti-neoplastik ajanın hücre seviyesindeki etki
mekanizması ile ilgilenmekte ve böylece daha fundamental moleküler biyolojik
vurguları içermektedir. Örneğin, günümüzde geçerli olan depolimerizasyona karşı
hücre mikrotübüllerin stabilizasyonunu sağladığı mekanizması3, Taxol‘un tüm
moleküler düzeyde gösterdiği etkileri açıklamak için yeterli değildir. Örneğin, bir
membran proteini olan ve kemoterapiye direnç mekanizmalarının ortaya çıkmasında
sorunlu olan P-glikoprotein (P-gp) tam olarak nasıl çalıştığını ve etki ettiğini
anlayabilmek için, çeşitli anti-neoplastik ilâçların bu gibi ortamda nasıl davrandıkları
konusunun önemini artırmaktadır. Başka bir deyişle, moleküler düzeyde herhangi bir
anti-kanser terapinin geliştirilmesi için bu ilâçlarla kanser hücre membranları
arasında oluşan etkileşmelerinin ortaya çıkarılmasını gerektirmektedir. Bu bağlamda,
Taxol ile fosfolipidler arasındaki moleküler bağlar, güçler ve etkileşmeler
vurgulanmıştır. Bu olayların daha iyi anlaşılması amacıyla ilk önce bu projemin kesin
raporunda geniş bir giriş bölümüne yer verilmiştir. Söz konusu bu bölüm, projemi
inceleyecek olanlara yukarıda bahsedilen bu 2 ayrı boyutu da daha iyi
algılayabilmelerini sağlayacaktır.
Motivasyon ve Ankara’da bulunan araştırma olanakları.
Sunduğum projede, özellikle nanoteknolojik boyut vurgulanmıştır. Bunun için
de çok sağlam dayanaklarım ve ciddi sebeplerim vardı. Her şeyden önce, arzu ettiğim
cihazların yerine Ankara’da mevcut olan imkânları ve üniversitemizin çok kısıtlı proje
bütçesini göz önünde bulundurarak proje konusunu kararlaştırdım. Bu bağlamda,
Fakültemizde çok yetersiz bir altyapı ortamında ve tek başıma yürütebileceğim bir
projeyi tasarladım4. Sonuç olarak, bu proje sayesinde nanoteknolojinin temellerini
3 Taxol‘un etki mekanizmasına aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak yer verilmiştir. 4 Fakültemizde göreve başlar başlamaz daha 04 Şubat 2004 tarihinde yapılan bir Fakülte toplantısında yönetim tarafından benden ve diğer 2 uzman arkadaşımızdan tek başımıza proje çalışması çıkarmamız istenmiştir. Bu toplantıda ayrıca Üniversitemizin herhangi bir uluslararası boyutu olmadığı ve ulusal sıralamada bile yeri
104
oluşturan “self-assembly” olarak meydana getirilen biyomakromolekül komplekslerin
araştırıldığı ve fizikte, kimyada, malzeme biliminde, tıpta ve biyonanoteknolojide
uygulama potansiyeli olan orijinal bir cihaz Fakültemize alınmıştır. Bunun için de
ulusal yükseköğretim stratejileri (Bk.:
http://www.yok.gov.tr/duyuru/strateji_gorus.htm) ve üniversitemizin strateji plan
geliştirme programı (http://www.strateji.gazi.edu.tr/) esas alınmıştır. Projemdeki bu
vurgu uluslararası proje destek programlarına katılmamız bakımından da önemlidir,
çünkü Avrupa Birliği’nin gerek 6cı, gerekse 7ci çerçeve programlarında öncelikli konu
başlıklarına önem verileceği ayrıca vurgulanmaktadır (Bk.: www.fp7.org.tr). Söz
konusu başlıklar arasında genom bilimler ve nanoteknolojiler başı çekmektedir ( Bk.:
Ancak bu proje destek programlarına Türkiye’den çok az sayıda proje gönderilmiştir.
Bu arada, ülkemizde de ulusal nanoteknoloji stratejileri geliştirilmiştir5. Bu tür
nanoteknoloji çalışmaları da en ileri düzeyde Ankara’da yapılmaktadır. Bunun için de
gereken altyapıyı ve AR-GE olanakları kurulmuştur. Örneğin, O. D. T. Ü.’inde birkaç
seneden bu yana Nanoteknoloji Merkezi faaliyet göstermektedir. Ayrıca, aynı
üniversite Avrupa Birliği kaynaklarından 1.5 milyon EU’luk subvansiyon sayesinde
Merkez Laboratuvaru kurmuştur (Bk.: www.centrallab.metu.edu.tr). Bu Merkez
Laboratuvarın Ocak-2006 tarihinde kurulmuş olup, asıl amacı üniversitelere ve
sanayi kuruluşlarına bilimsel destek ve yürütülmekte olan projelerde öçlüm
olanakları sağlamaktır. Avrupa Birliğinden akreditasyon alan tek kuruluş O. D. T. Ü.
Merkez Laboratuvarıdır. Bu projemin ön ölçüm kısmını oluşturan FTIR ve DSC
ölçümlerini bu laboratuvarda yaptım.
Bunun dışında, Bilkent Üniversitesinde Devlet Plânlama Teşkilâtından alınan
25 Milyon Dolarlık proje ile büyük bir alana yayılmış Ulusal Nanoteknoloji Merkezi
(Bk.: www.nano.bilkent.edu.tr) kurulmuştur ve bunun da 2 yıla kadar tamamlanması
beklenilmektedir. Hacettepe Üniversitesi Beytepe kampüsünde de birçok
nanoteknolojik projenin yürütüldüğü BİYOMEDTEK Merkezi kurulmuştur
(www.biyomedtek.com). Yakın bir tarihte de, Teknopark açılacaktır
(www.teknopark.hacettepe.edu.tr). Buna paralel olarak, Ankara Üniversitesi 5 sene
önce Devlet Plânlama Teşkilâtından almış olduğu 8 Milyon Dolarlık proje desteği ile
istenilen düzeyde olmadığı (bunun için bk.: Ek-1 ve Ek-2) ve Fakültemizde cihazların son derece demode ve eski olduğu gerekçe gösterilerek tarafımdan orijinal proje çıkarmam rica edilmiştir. 5 Bk.: Ek-3.
105
Biyoteknoloji Enstitüsü kurmuştur. Daha sonra, bu enstitüye bağlı Merkez
Laboratuarı da kurulmuştur (Bk.: http://www.biotek.ankara.edu.tr/).
Görüldüğü gibi, Ankara’da bulunan diğer üniversitelerde bu tür büyük
yatırımlar yapılırken üniversitemizde bu ölçekte henüz daha herhangi bir girişim
olmamıştır. Ancak, son yıllarda üniversitemizde de büyük gelişmeler kaydedilmiştir.
Şöyle ki, Yarıiletken Araştırma Merkezine bağlı bir Nano-Club faaliyete başlamıştır.
Ancak, bu birimin biyonanoteknolojiye hitap etmemektedir, daha ziyade mühendislik
bilimleriyle ilgilenmektedir. Ancak, bunun dışında, yakında çok önemli olan Ulusal
Nanotıp Konsorsiyumu üniversitemizde kurulmuştur (Yarıntılı bilgi için Bk: Ek-4) ki,
bu çok isabetli bir gelişmedir. Üniversitemizin6 Teknoparkı da tamamlandığında
uluslararası düzeyde nanoteknolojik araştırmaların yapılabileceği ümit edilmektedir.
Ancak, bu tür merkezleri diğer araştırma merkezlerle yarışabilir düzeyde
tutabilmek için büyük ölçekli, sürekli ve uzun vadeli projeler çıkarmak
gerekmektedir. Projemi de bu amaçla sundum. Şimdiye kadar Fakültemizde herhangi
bir nanoteknoloji başlıklı proje çıkarılmadığı gibi laboratuvar donanımı da son derece
yetersizdir. Projemi de bu iki hususu göz önünde bulundurarak yazdım. Bu
doğrultuda, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje teklifi sunulmuştur. Tüm
zorluklara rağmen, projemi tamamlamış bulunmaktayım. Ancak, bu aşamadan sonra
bunun devamı da gelmelidir. Bu yüzden daha şimdiden ulusal ve uluslararası proje
destekleme kuruşlarına çok daha kapsamlı bir projemi daha sunmak üzereyim (Bk.:
Ek-16).
6 Üniversitemizin büyük çabaları ve girişimleri sayesinde ayrıca Ulusal Kızılötesi ve Sinhrotron Araştırma Merkezi de kurulma aşamasındadır.
106
1. Giriş.
1.1. Kanser7.
Kanser terimi ile, bu projemin kesin raporunun kapsamına ve amacına uygun
olarak hücresel büyümedeki düzenleme mekanizmalarında meydana gelen önemli
hasarlar gösteren birçok hastalık kastedilmektedir. Bu konu son derece hızlı
geliştiğinden ve çok geniş olduğundan, kanser ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için
aşağıdaki dipnotta vermiş olduğum geniş ve güncel kaynakçaya başvurulmalıdır.
Tarihsel olarak, kanser araştırmaları bir hayli deskriptiv olmuştur. Başka bir
deyişle, birçok araştırmacı normal hücrelerle onkogenik hücreler arasında
gözledikleri farklılıkları kataloglaştırmışlardır. Uzun yıllar boyunca hastalığın etkileri
nedenlerinden çok daha iyi incelenmiştir. Son yıllarda, birkaç kanser türü üzerinde
moleküler düzeyde yapılan araştırmalar sayesinde metastaz oluşum mekanizmaları,
tümörlerin bağışıklık sisteminden tanınmaları ve yok edilmeleri gibi çok önemli olan
konular bağlamında, tümör hücrelerinin bazı özelliklerinin anlaşılmasını mümkün
communication) mekanizmalarında birtakım hasarları içerdiklerinden, bunların
patolojik davranışlarındaki plazma membranının8 da muhtemel rol oynayabileceği
tahmin edilmektedir (Petty, H. R., 1993). Gerçekten de, projemde anti-neoplastik
ilâçların biyoteknolojik uygulamaları dışında, tümör hücre membran akışkanlığı
7 Bu bölümle ilgili daha ayrıntılı bilgiler için özellikle bk.:
1. Advances in Molecular Oncology (Advances in Experimental Medicine and Biology) (Advances in Experimental Medicine and Biology), by Fabrizio d'Adda di Fagagna (Editor), Susanna Chiocca (Editor), Fraser McBlane (Editor), Ugo Cavallaro (Editor); Springer; 1 edition (July 12, 2007).
2. Targeted Molecular Imaging in Oncology, by E. Edmund Kim and David J. Yang (Editors), Springer; 1 edition (January 15, 2001).
3. Principles of Molecular Oncology, by Miguel H. Bronchud, MaryAnn Foote, Giuseppe Giaccone, Olufunmilayo I. Olopade, Paul Workman (Editors), Humana Press; 3rd ed. edition (November 30, 2007).
4. The Molecular Biology of Cancer, by Michael Khan, Stella Pelengaris (Editors), Wiley-Blackwell; 1 edition (February 28, 2006).
5. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics,by Lauren Pecorino, Oxford University Press, USA; 1 edition (May 21, 2005).
6. F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York.
7. The Biology of Cancer, by Robert A. Weinberg, Garland Science; 1 edition (June 9, 2006). 8 Projemin de hücresel boyutu söz konusu model normal ve tümör plazma membran (zar) akışkanlığı üzerinde odaklanmaktadır. Bunun için özgün bir de öncü hipotez geliştirilmiştir. Daha ayrıntılı bilgiler için bu proje kesin raporumun yorumlar bölümünde yer almaktadır.
107
üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Onkogenler ve kansere yol açan
genlerin ürünleri ligandlar, reseptörler ve sitozolik sinyalleşme aygıtlar gibi normal
büyümeyi sağlayan transmembran sinyal iletim elemanlarının farklı şekillerinden
ibarettir. Bu gen ürünleri, sinyal iletiminin şu ana kadar geliştirilmiş en iyi, ancak
henüz daha yetersiz olan modelini teşkil etmektedir. Bazı tümör hücrelerin membran
taşıyıcıları bunları kemoterapötik ilâçlara karşı korumaktadır. Adherence-promoting
membran proteinlerinin yetersiz ekspresyonu metastaza yol açmaktadır (Petty, H. R.,
1993). Tümör antijenlerinin intraselüler aktarımları ve bunu takiben plazma
membranlardaki ekspresyonları immün sistem trafından indüklenen destrüksyonu
ortaya çıkarmaktadır (Petty, H. R., 1993; Cereijido M, et al., 2007; Chidgey M,
Dawson C., 2007; Ma DW., 2007; Song RX., 2007; Baritaki S. et al., 2007)9. Bu konu,
projemin yorum bölümünde ölçümlerden elde edilen neticeler doğrultusunda tekrar
ele alınmıştır.
1.2. Kanserin Tedavi Şemaları.
1.2.1. Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri
Büyüme mekanizmalarının da kontrolden çıkmasını takiben muhtemel olarak
tek hücreden veya birkaç hücreden ortaya çıkan malign tümör genel olarak heterojen
tümör popülasyonundan ibarettir. Bu hücreler daha sonra komşu dokulara göç
ederek bunların da malign tarnsformasyonuna neden olup, kendi vaskülatürünü
geliştirip lenfatik ve hematolojik dağılım göstermek suretiyle metastazlara neden
olmaktadır. Metastaz olan hastalarda kanserin bir sistemik hastalık olarak ele
alınması gerektiği ve cerrahi veya radyoterapi gibi konvansyonel yaklaşımların
yetersiz olacağı açıktır. Bu bağlamda, günümüzde kanser hastaların bakımı cerrahi,
radyoterapi ve sistemik tedavilerini de içeren multidisipliner bir yaklaşımı gerektirir
(Sliifer S ve Stoter G. , 2005).
9 Bk. özellikle: Chapter 9: Membranes in Cancer, In: Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes-Structure and Function, Plenum Pres, New York and London, 1993, pp. 353-377; Cereijido M, Contreras RG, Flores-Benítez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz A, Shoshani L. New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med Res. 2007 Jul;38(5):465-78; Chidgey M, Dawson C. Desmosomes: a role in cancer? Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1783-7; Ma DW. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007, Jun;32(3):341-50; Baritaki S, Apostolakis S, Kanellou P, Dimanche-Boitrel MT, Spandidos DA, Bonavida B. Reversal of tumor resistance to apoptotic stimuli by alteration of membrane fluidity: therapeutic implications. Adv Cancer Res. 2007;98:149-90 ve Song RX. Membrane-initiated steroid signaling action of estrogen and breast cancer. Semin Reprod Med. 2007 May;25(3):187-97.
108
Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu
kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde
sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil
edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers
adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer
S ve Stoter G., 2005)10. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi,
farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi
stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı
kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin
sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı
toksisitelerinin de önemi artmıştır.
1.2.2. Kemoterapinin Prensipleri.
Kemoterapötik ilâçların önemli bir özelliği hızlı bölünen hücrelere hasar
vererek hücre ölümüne yol açmalarıdır. Hücre hasarı farklı etki mekanizmalarına
sahip birkaç tür sitotoksik ilâçlar tarafından meydana getirilir (Bk.: Tablo-1 ve Şekil
1.1)11.
10 Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514. 11 Projem güncel olan ve çok yoğun olarak kullanılan Taxol® ile ilgilidir. Ancak kemoterapilerde kullanılan birçok antikanser ilâcı daha mevcuttur. Tüm bunlarla ilgili okuyuculara daha ayrıntılı bilgi vermek amacıyla bu kesin raporumun sonunda Ek-14 verilmiştir.
109
Tablo-1: Bazı sitotoksik ilâçlar.
(Kaynak: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F.
Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and
Francis, New York, pp. 35-49).
110
Şekil 1.1. Bazı popüler anti-kanser ilâçların etki mekanizmaları (Bk.:
www.chemotherapy.com; Ayrıca bk.: Danimarka Kraliyet Kanser Araştırmaları
Enstitüsü- www.cancer.dk)12.
12 Kemoterapinin hücresel boyutu ile ilgili aşağıdaki kaynaklara başvurulmalıdır:
1. Gossage L, Madhusudan S., Cancer pharmacogenomics: role of DNA repair genetic polymorphisms in individualizing cancer therapy. Mol Diagn Ther. 2007;11(6):361-80.
3. Hamm C, Verma S, Petrella T, Bak K, Charette M; On behalf of the Melanoma Disease Site Group of Cancer Care Ontario’s Program in Evidence-based Care. Biochemotherapy for the treatment of metastatic malignant melanoma: A systematic review. Cancer Treat Rev. 2007.
4. Cordes N, Park CC., β1 integrin as a molecular therapeutic target. Int J Radiat Biol. 2007;83(11):753-760.
5. Nicolson GL, Conklin KA. Reversing mitochondrial dysfunction, fatigue and the adverse effects of chemotherapy of metastatic disease by molecular replacement therapy. Clin Exp Metastasis. 2007 Dec 5.
7. Cellular Oncology, Mol Diagn Ther. ve Cancer dergileri son derece faydalı bilgiler içermektedir.
8. Vattemi E, Claudio PP. Tumor suppressor genes as cancer therapeutics. Drug News Perspect. 2007 Oct;20(8):511-20.
9. Xi Y, Edwards JR, Ju J. Investigation of miRNA Biology by Bioinformatic Tools and Impact of miRNAs in Colorectal Cancer-Regulatory Relationship of c-Myc and p53 with miRNAs. Cancer Inform. 2007;3:245-253.
10. Hoskin DW, Ramamoorthy A., Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 22.
11. Cuzick J, Cafferty FH, Edwards R, Møller H, Duffy SW. Surrogate endpoints for cancer screening trials: general principles and an illustration using the UK Flexible Sigmoidoscopy Screening Trial. J Med Screen. 2007;14(4):178-85.
12. Singh VK, Jia Z. Targeting synuclein-gamma to counteract drug resistance in cancer. Expert Opin Ther Targets. 2008 Jan;12(1):59-68.
111
Söz konusu sitotoksil ajanların bu hücre hasarını hangi boyutta ve şiddette
meydana getirdikleri ise genel olarak hücresel ve farmakolojik özelliklere bağlıdır.
Sitotoksik tedaviye karşı bazı tümörlerin duyarlılığını etkileyen faktörler arasında
şunlar sıralanabilir:
- Hücre döngüsü zamanı ve “doubling time”.
- Büyüme fraksiyonu
- Sitotoksik ilâçlara karşı duyarlılık
- Tümör heterojenliği.
Bir ilâcın anti-tümör etkinliğini tayin eden farmakolojik özellikler ise
şunlardır:
- İlâç konsantrasyonu
- İlâca maruziyet zamanı.
Başlangıçta, kemoterapinin tümör hücrelerini nasıl etkilediği konusunda
lösemi L1210 deneysel sıçan (murine) modeli kullanılarak önemli veriler elde
edilmiştir (Skipper H. E., 1979). Bu modele göre, bir tümör eksponensiyel olarak sabit
bir “doubling time” ile ilerler ve yarı logaritmik kağıt üzerine büyüme hızı çizildiğinde
Şekil 1.2-(A)’daki eğriyi oluşturur.
13. Johansson Swartling F. Identifying candidate genes involved in brain tumor formation. Ups J Med Sci.
2008;113(1):32-71. 14. Cheng HY, Obrietan K. Revealing a Role of MicroRNAs in the Regulation of the Biological Clock.
Cell Cycle. 2007 Oct 1;6(24). 15. Lo AS, Zhu Q, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) and their therapeutic potential.
Handb Exp Pharmacol. 2008;(181):343-73. 16. Namiki M, Ueno S, Kitagawa Y, Konaka H, Mizokami A, Koh E, Fukagai T. Hormonal therapy. Int J
Clin Oncol. 2007 Dec;12(6):427-32. 17. Keeble JA, Gilmore AP. Apoptosis commitment--translating survival signals into decisions on
mitochondria. Cell Res. 2007 Dec;17(12):976-84. 18. Tejpar S. The use of molecular markers in the diagnosis and treatment of colorectal cancer. Best Pract
Res Clin Gastroenterol. 2007;21(6):1071-87. 19. McGrogan BT, Gilmartin B, Carney DN, McCann A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast
cancer. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 12. 20. Jacob K, Sollier C, Jabado N. Circulating tumor cells: detection, molecular profiling and future
prospects. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):741-56. 21. Kischel P, Waltregny D, Castronovo V. Identification of accessible human cancer biomarkers using ex
vivo chemical proteomic strategies. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):727-39.
112
Şekil 1.2. (A): Yarı logaritmik kağıt üzerine çizilmiş eksponensiyel tümör
büyüme kinetiği. (B): Bu şekilde büyüyen bir tümörün antineoplastik ilâçla
muamelesi. Ok işaretleri ilâcın uygulanma sıklığını göstermektedir (Bk.: Sliifer
S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H.
Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis,
New York, pp. 35-49).
Şekil 1.2.’de, tümörlerin beli bir yüzdeliğinin öldürüldüğünü göstermektedir ve
bu olay “fractional cell killing” olarak adlandırılır. Bu şekilde, ilâç konsantrasyonunun
yükseltilmesi öldürülen tümörlerin yüzdeliğini de etkilemektedir. Bu modele göre,
öldürülen hücrelerin oranı tümör hücrelerin toplam sayısına bağımlılık
göstermektedir. Bu modele göre, ilâç uygulaması yeterli miktarda ve sıklıkta yapıldığı
takdirde, bir tümörü tamamen yok etmek mümkündür.
Ancak, daha sonra, bu model, hastalar için pek uygun olmadığı ortaya
çıkmıştır (Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F.
Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and
Francis, New York, pp. 35-49). Sitostatik ilâçların genelde hızla bölünen hücreler
fraksiyonuna karşı çok etkili olduklarından, tümör hücrelerinin önemli bir bölümü
etkilenmeyecektir. Prensip olarak, tümör hücre büyüme faktörlerinin uygulanması
113
tümör hücre bölünmesini de artıracaktır ki, bu olaya “recruitment” veya “priming of
tumor cells” adı verilmektedir.
L1210 modeli ile katı tümörler arasındaki ikinci önemli fark ise büyüme
fraksyonu ile “doubling time” arasındaki ilişki sabit olmadığı ve tümör büyüklüğüne
göre farklılaştığı gözleminden ileri gelmektedir.
İlk başta, bir tümör L1210 modelinde olduğu gibi eksponensiyel büyüme hızı
gösterir. Ancak, daha sonra, tümörün büyüklüğü artığında henüz daha
açıklanamayan nedenlerden dolayı büyüme hızı durur. Büyüme hızı ile zaman
arasındaki bu tür ilişki, Gompertz tipi olarak da adlandırırılan sigmoidal eğri ile ifade
edilmektedir (Şekil 1.3-A). Büyüme hızı ile tümör büyülüğü arasındaki bu ilişki
kemoterapi şemalarının geliştirilmesinde önemli bir motivasyon sebebini
sahip bir tümörün belli bir ilâç dozuyla uyarlanması. Kemoterapiden kaynaklanan
tümör büyüklüğündeki azalma, büyüme fraksyonu artırmakta ve geriye kalan
tümörlerin büyüme hızındaki artış meydana gelmektedir (Bk.: Sliifer S ve Stoter G.
Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye
(Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).
Kemoterapinin etkinliğini etkileyen başka bir faktör de tümör hücrelerinin
konsantrasyonudur (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic
114
Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical
Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). İlâçlara karşı direncin meydana
gelmesi birkaç mekanizmayla açıklanmaktadır. Tümör hücrelerinde P-glikoprotein ve
multidrug-related protein (MRP) gibi ilâç pompalarının ekspresyonu kemoterapiye
karşı direncin gelişmesindeki başlıca nedenidir. Diğer direnç mekanizmaları tümör
hücrelerince alınan ilâç miktarındaki düşüş, ilâç detoksifikasyonu veya tümör
hücrelerinin kemoterapiden kaynaklanan DNA hasarını onarım kapasitesini
artırmaları sayesinde meydana gelmektedir (Bk.: Tablo-2).
Tablo-2. Hücresel İlâç Direncinin ve etkilenen Sitotoksik İlâçların Etki
Mekanizmaları (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy.
In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor
and Francis, New York, pp. 35-49 ).
Ancak, şimdiye kadar sıralanan mekanizmalardan, en önemlisi apoptoza13 yol
açan hücresel yolaklardaki patolojilerdir. Son yıllarda kemoterapiden kaynaklanan
programlanmış hücre ölümünü14 indükleyen mekanizmalar hakkında önemli bilgiler
13 Programlanmış hücre ölümü. 14 Programlanmış hücre ölümü kavramı 1989li yıllarda Almanya’da Heidelberg Üniversitesinde Catastrophy
Theory’nin bir matematiksel modeline dayanmaktadır. İlk önce normal hücre döngüsünde scenescence
doğrultusunda ilerleyen hücre bölünme olaylarını açıklamak için ele alınmıştır. Daha sonra İskoçya’da Glasgow Üniversitesinde Dr. Renato Baserga’nın ve diğer birçok araştırmacının geliştirdiği kanser hücre kültürü düzenekleri sayesinde bu hücresel olay kanser gibi patolojik olaykara da aktarılmıştır. Bu konuda yığınlarca yayın bulunmaktadır. Ancak bu kesin raporun amacı için şunlara başvurulması tavsiye edilebilir:
115
elde edilmiştir. Kemoterapiden kaynaklanan ilk olay çoğu kez tümör hücresinin DNA
hasarıdır (Gossage, L. ve Madhusudan, S., 2007), ancak mikrotübüller gibi diğer
hücresel makromoleküller de hasarın hedefi olabilmektedir (McGrogan et al., 2007).
Tümör hücresi tarafından bu hasar tespit edildiğinde, ancak hasarın
oranılmadığında, kaspazlar, Bcl-2 grubu proteinleri veya p53 onkogenlerin önemli rol
oynadığı birkaç yolak aktive edilir (Vattemi, E. ve Claudio, PP., 2007 ). Bu olaylarda
mitokondrinin de rol oynadığı ortaya çıkarılmıştır (Nicolson, GL ve Conklin, KA.,
2007; Xi, Y. Ve Edwards, JR, 2007; Keeble, JA ve Gilmor, AP, 2007). DNA’yı
parçalayan endonükleazların aktivasyonundan sonra (Gossage, L. ve Madhusudan,
S., 2007), hücrede kromatin kondenzasyonu ve hücresel fragmentasyon gibi olaylar
meydana gelmektedir°.
Bu projemin de temelini oluşturan kemoterapi ile bağlantılı olarak gelişen
apoptoza özgü hücresel membran bleb15 oluşumları son yıllarda araştırmacılarının
1. Eberle J, Kurbanov BM, Hossini AM, Trefzer U, Fecker LF. Overcoming apoptosis deficiency of melanoma-Hope for new therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 2007 Dec 1. 2. Kooistra K, Zhang YH, Noteborn MH. Viral elements sense tumorigenic processes: approaching selective cancer therapy. Mini Rev Med Chem. 2007 Nov;7(11):1155-65. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi ile ilgilidir. 3. Ohnishi T. The role of the p53 molecule in cancer therapies with radiation and/or hyperthermia. J Cancer Res
Ther. 2005 Jul-Sep;1(3):147-50. 4. McConkey DJ. Therapy-induced apoptosis in primary tumors. Adv Exp Med Biol. 2007;608:31-51. 5. Seynhaeve AL, Eggermont AM, ten Hagen TL. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 2008 Jan 1;13:3034-45. 6. Klampfer L. The role of signal transducers and activators of transcription in colon cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2888-99. 7. Bertazza L, Mocellin S. Tumor necrosis factor (TNF) biology and cell death. Front Biosci. 2008 Jan. 1;13:2736-43. 8. Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, Shoshan MC, Linder S. Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an "off-target" effect? Mini Rev Med Chem. 2007 Oct;7(10):1035-9. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ile ilgilidir. 9. Van Brocklyn JR. Sphingolipid signaling pathways as potential therapeutic targets in gliomas. Mini Rev Med
Chem. 2007 Oct;7(10):984-90. Bu derleme özellikle projeminin de temelini oluşturduğu kanserde fosfolipidlerin rolüüzerine odaklanmaktadır. Projemde yoğun olarak ben de glikosfingolipidleri uyguladım. Bunun için Bk.: bu proje metninin Neticeler bölümünü. 10. Moran E, Nencioni A. The role of proteasome in malignant diseases. J BUON. 2007 Sep;12 Suppl 1:S95-9. ° Bu konu ile ilgili bk.: Sjakste N, Sjakste T. Possible involvement of DNA strand breaks in regulation of cell differentiation. Eur J Histochem. 2007 Apr-Jun;51(2):81-94.; Evenson DP, Kasperson K, Wixon RL. Analysis of sperm DNA fragmentation using flow cytometry and other techniques. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;65:93-113; Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007;35(4):495-516; Yoshida A, Pommier Y, Ueda T. Endonuclease activation and chromosomal DNA fragmentation during apoptosis in leukemia cells. Int J Hematol. 2006 Jul;84(1):31-7; Hewitson TD, Bisucci T, Darby IA. Histochemical localization of apoptosis with in situ labeling of fragmented DNA. Methods Mol Biol. 2006;326:227-34. 15 Apoptoza bağlı olarak gelişen membran bleb’lerle ilgili bk.:
1. Larsen AK, Lametsch R, Elce JS, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA, Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem J. 2007 Dec 12.
116
dikkatini çekmektedir. Önümüzdeki yıllarda da apoptotik membran bleb oluşumları
moleküler onkolojik araştırmalarının önemli bir bölümünü teşkil edeceği açıktır.
Tümörlerin kemosensitivesini (kemoterapiye karşı duyarlılığını) etkileyen
diğer faktör ise genomik instabilitedirϒ. Muhtemelen bir tümörün tek bir hücreden
ortaya çıktığı bilinse de, bir tümörün genomik instabiliteden kaynaklanan
sebeplerden dolayı, birkaç hücre döngüsünden sonra, çok heterojen bir tümör hücre
popülasyonunu oluşturduğu ortaya çıkmıştır. Bu gibi çeşitli hücrelerden oluşan
popülasyonuna kemoterapi uygulandığında, duyarlı olan tümör hücreleri apoptoza
zorlanacaklardır, daha az duyarlı hücreler ise büyüme hızını devam ettireceklerdir.
Kemoterapi birkaç kez tekrar edildiğinde, tedavi etkinliği sıfırlanacak, çünkü tümör
popülasyonu tamamen ilâca-dirençli hücrelerden oluşacaktır. Bu gerçek de çok iyi
çalışan matematiksel modellerle kanıtlanmıştır (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2:
Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.):
Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).
3. Özellikle bk.: Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. Life and Times of a Cellular Bleb. Biophys J. 2007 Oct 5.
4. Schultz H, Hume J, Zhang de S, Gioannini TL, Weiss JP. A novel role for the bactericidal/permeability increasing protein in interactions of gram-negative bacterial outer membrane blebs with dendritic cells. J
Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2477-84. 5. Sheetz MP, Sable JE, Döbereiner HG. Continuous membrane-cytoskeleton adhesion requires
continuous accommodation to lipid and cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006;35:417-34.
6. Nusbaum P, Lainé C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing and vesicle release, CD43 and CD16 down-regulation and phosphatidylserine externalization. Biochem Soc Trans. 2004 Jun;32(Pt3):477-9.
7. Martínez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Plasma membrane remodelling and cell stimulation. Med
Sci (Paris). 2004 Feb;20(2):189-95. 8. Hamill OP, McBride DW Jr. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-
clamp recording. Annu Rev Physiol. 1997;59:621-31. 9. Uchiyama Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Arch Histol Cytol. 1995 Jun;58(2):127-
37. 10. Verkleij AJ, Post JA. Physico-chemical properties and organization of lipids in membranes: their
possible role in myocardial injury. Basic Res Cardiol. 1987;82 Suppl 1:85-91. 11.
ϒ Bu konu ile ilgili olarak daha ayrıntılı bilgi için bk.: Calcagnile O, Gisselsson D. Telomere dysfunction and telomerase activation in cancer--a pathological paradox? Cytogenet Genome Res. 2007;118(2-4):270-6; Wang Y. Chromosome instability in yeast and its implications to the study of human cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2091-102; Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2075-90; Gasparini P, Sozzi G, Pierotti MA. The role of chromosomal alterations in human cancer development. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):320-31; Oberdoerffer P, Sinclair DA. The role of nuclear architecture in genomic instability and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Sep;8(9):692-702. Venkitaraman AR. Chromosomal instability in cancer: causality and interdependence. Cell Cycle. 2007 Aug;6(19):2341-3. 2007 Jul 18.
117
Kemosensitivite, anti-tümör aktivitesinin prognostik gösterge olduğundan, bu
aktiviteyi önceden belirlemek amacıyla birçok yönteminin geliştirilmesi günümüzde
büyük bir önem taşımaktadır. Bu konuda sitopatolojik, moleküler genetik ve
moleküler onkolojik, mikroskopik vs. moleküler tıp konularına giren yığınlarca
yöntem mevcuttur16. Tümörlerin kemosensitivitesini etkileyen diğer önemli faktörler
arasında farmakolojik özellikler başı çekmektedir. Bunlar arasında, göğüs ve prostat
16 Ancak, projem bunlarla ilgilenmemektedir. Sunduğum proje, biyoteknolojik boyutu
dışında, daha fundamental hücresel etki mekanizmalarının modellemesi üzerine odaklanmaktadır.
Böyle bir yaklaşımın çok daha rasyonel olduğu açıktır. Bunun da sebepleri şunlardır. Her şeyden
önce yukarıda adı geçen moleküler yöntemleri Fakültemizde uygulayabilmek için uzun vadeli proje
desteğine, özellikle buradaki araştırmacı statümün özerkliğine ve en önemlisi uluslararası
ortaklarımın katılımlarına ve katkılarına ihtiyaç vardır. Ülkemizde her ne kadar da moleküler
genetik yöntemlerinin gerçekleştirilmesi için gereken birtakım cihazlar alınmışsa da, bunların çoğu
çalıştırılamamaktadır. TÜBİTAK çalıştaylarında bu gerçekler defalarca dile getirilmiştir.
Fakültemizdeki durum da pek farklı değildir. Fakültemizde maddî olanaksızlardan dolayı bu olmasa
da, diğer üniversitelerde bu yüzden yurt dışından çok büyük paralar ödenerek pratik seminerlerde
bu yöntemleri göstermek amacıyla firma temsilcileri getirilmektedir. Bu konuda eğitilmiş ve bu
konularda bağımsız olarak proje yürütebilecek akademisyenlerin sayısı da bir hayli yetersizdir.
Avrupa Birliği destekli FP7 çerçeveye veya TÜBİTAK proje destekleme birimlerine gönderilen
moleküler genetik konulu proje sayısına bakacak olursak bu gerçek de ortaya çıkacaktır. En önemli
engel ise, bu yöntemlerin dayanağı olan tümör hücre kültürü düzenekleri ise Fakültemizde mevcut
olmamasıdır. Mevcut olsaydı bile, son birkaç sene yaşanan bitmek tükenmek bilmeyen elektrik
kesintileri ve özel hücre kültürünün gerektirdiği basınçlı kapılarla donatılmış aseptik ortamın
bulunduğu laboratuvarlarının olmaması yüzünden bunları çalıştırmak zaten imkânsızdır. Bunların
Fakültemizde kurulabilmesi için şu anda tam olarak nasıl olacağı kestirilemeyen uzun vadeli parasal
ve teknik desteğe ihtiyaç vardır. Fakültemizde hücre kültürü düzeneğini kurulması için, sadece bir
düzeneğin kurulması yeterli değil, bir de söz konusu hücrenin hangi hücre döngüsü evresinde
bulunduğunu tespit etmek için henüz daha ne flow sitometre (akım sitometresi), ne fluorescently
activated cell sorter (FACS), ne de başka güvenilir bir cihaz vardır. Bu bağlamda, bu yöntem ve
yaklaşımlarının seçiminde büyük zorlukların yaşanacağı aşikârdır, çünkü bu yaklaşımların birçoğu
biopsiden alınan ve buradan üretilen tümör hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır. Ayıca da,
Fakültemizdeki sıfatım gereği şu anda bu projeyi bu tür uluslararası boyuta hedeflendirmeyi
mümkün kılmıyor. Bu bağlamda, tarafıma sadece yazılı olarak görev verildiği ve projeme müdahale
edilmeyeceği sözü yazılı olarak verildiği takdirde bu proje konusunu da moleküler genetik
boyutunda gerçekleştirmeyi uygun görüyorum. Çünkü bu konuda yurt dışında ihtisas yaptım. Yurt
dışından tarafıma doktora bursu verilirken de mezun olduktan sonra Türkiye’de bu yeni teknolojiyi
ancak oturttuğum kaydıyla verilmiştir.
118
kanser vakalarda olduğu gibi endokrin terapilerin rolünü vurgulamak gerekir. Bunun
dışında, immünoterapi, adjuvant systemic treatment (kemoradyoterapi ve
kemoimmünoterapi, kemoterapi ile paralel hipertermi) vs. terapi programları
uygulanmaktadır. Bu çok önemli konulara bu kesin raporumun bu giriş bölümünü
daha fazla uzatmamak amacıyla burada yer verilmemiştir. Ancak, bu konularla ilgili
daha ayrıntılı bilgi www.chemotherapy.com sitesinden ve ilgili güncel kitaplardan
edinilebilir (Bk. örneğin: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic
Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical
Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).
1.2.3. Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri.
Son yıllarda sistemik kanser tedavileri17 sitotoksik kemoterapinin kullanımına
dayandırılmıştır. Bu tedavilerin prensiplerine bir önceki bölümde yer verilmiştir.
Seçiciliğin (selectivity) olmadığından, kemoterapi sadece kanser hücrelerini değil,
normal hücreleri ve dokuları da öldürüp, geniş spektrumlu yan etkilere yol
açmaktadır.
Biyolojik ve moleküler araştırmalar hücre çekirdeğinin dışında bulunan ve
karsinojenezde ve kanser oluşumlarında çok önemli rol oynayan birçok olayı ortaya
17 Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bk.:
1. Sharma SV, Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes Dev. 2007 Dec 15;21(24):3214-31.
2. Bianco R, Damiano V, Gelardi T, Daniele G, Ciardiello F, Tortora G. Rational combination of targeted therapies as a strategy to overcome the mechanisms of resistance to inhibitors of EGFR signaling. Curr Pharm Des. 2007;13(33):3358-67.
3. Hideshima T, Anderson KC. Preclinical studies of novel targeted therapies. Hematol Oncol Clin North Am. 2007 Dec;21(6):1071-91.
4. Rojo F, Dalmases A, Corominas JM, Albanell J. Pharmacodynamics: biological activity of targeted therapies in clinical trials. Clin Transl Oncol. 2007 Oct;9(10):634-44.
5. Bhatti M, Yahioglu G, Milgrom LR, Garcia-Maya M, Chester KA, Deonarain MP. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. Int J Cancer. 2007 Oct 31.
6. Voltz E, Gronemeyer H. A new era of cancer therapy: Cancer cell targeted therapies are coming of age. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(1):1-8.
7. Goldenberg DM. "Targeted therapy with monoclonal antibodies: the new generation of pharmaceuticals". Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006;1:nil21-2.
8. Garman KS, Nevins JR, Potti A. Genomic strategies for personalized cancer therapy. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R226-32.
9. Dittmer DP, Krown SE. Targeted therapy for Kaposi's sarcoma and Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Curr Opin Oncol. 2007 Sep;19(5):452-7.
10. Korfel A, Thiel E. Targeted therapy and blood-brain barrier. Recent Results Cancer Res. 2007;176:123-33.
11. Kalyn R. Overview of targeted therapies in Oncology. J Oncol Pharm Pract. 2007 Dec;13(4):199-205.
119
çıkarmıştır. Bu olaylar hücre sitoplazmasında, hücre membranında18 veya
ekstraselüler ortamda meydana gelmektedir. Şu ana kadar gösterildiği üzere, bu
olayların normal fizyolojik şartlar altında fazla görülmemeleri veya aktivitelerinin çok
düşük düzeylerde olmasına karşın, kanserde önemli rol oynadıkları tespit edilmiş, bu
olayları spesifik olarak baskılayan ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ise bir
sonraki anti-kanser ilâç jenerasyonun (neslinin) tasarımlarında büyük önem
kazanacaktır (Bk.: Şekil 1.4).
Şekil 1.4. Hedeflendirilmiş Tedavilerinin genel gösterimi (Bk.: Ferry A. I. M.
Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of Systemic Molecular
Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of
Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51).
Eğer moleküler hedeflendirilmiş terapiler seçici ve spesifik olarak bu kansere
özgü olaylara müdahale edebilseydi ve böylece spesifik olmayan sitotoksik
18Söz konusu projemin hücresel boyutu da membranlarla ilgilidir, ancak apoptozdan çok antineoplastik ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Bu konuda da ilgili öncü hipotez ve model sunulmuştur. Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Yorum bölümüne başvurulmalıdır.
120
kemoterapilerin yan etkiler engellenebilseydi, anti-kanser tedavilerinin çok daha
başarılı yapılabileceği açıktır.
Bu konu çok geniş olduğundan buna bu kesin raporumda daha fazla yer
verilmeyecektir. Ancak bu çok önemli konu ile ilgili son derece güncel bilgiler için
Bk.: Ferry A. I. M. Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of
Systemic Molecular Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye
(Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51.
Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu
kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde
sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil
edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers
adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer
S ve Stoter G., 2005)19. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi,
farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi
stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı
kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin
sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı
toksisitelerinin de önemi artmıştır.
Sitotoksik terapiden farklı olarak, kansere özgü olayların işlevsel ve yapısal
özelliklerinin ortaya çıkarılması, bu olayları spesifik olarak baskılayan ajanların
rasyonel olarak geliştirilmesiyle sonuçlandırılacak hedefe-bağlı (a target-based
approach) bir yaklaşımı mümkün kılmaktadır.
Şimdiye kadar ortaya çıkarılan hedefler arasında varlıkları sayesine kontrolden
çıkan hücre bölünmesine (proliferasyona) yol açan genelde proteinler veya işlevi
hasar gören reseptörler veya sinyal proteinleri başı çekmektedir. Moleküler
hedeflendirilmiş tedaviler kanser hücreye özgü bir hedef ile buna bağlı olarak ve
rasyonel olarak tasarlanan ilâçlar arasında spesifik tepkimenin ortaya çıkmasına
19 Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514.
121
bağlıdır ve bu şekilde normal hücreleri görmeyip, sadece kanser hücrelerini seçici
olarak etkilemeleri amacıyla gündeme getirilmiştir20.
Moleküler hedeflendirilmiş tedaviler RNA ve DNA replikasyonu
etkilemediğinden, aküt hücre ölümü olmamaktadır, ancak hücrelerin kontrol dışı
proliferativ aktiviteleri baskılanmaktadır ve bunlar “quiescence”21 denilen duruma
geçmektedir. Bu hedefe-bağlı kavram seçici olmayan ve tersinir olmayan DNA
hasarının meydana geldiği ve aküt hücre ölümünün gerçekleştiği normal ve kanser
hücrelerinin eşit olarak etkilendiği (Bk.: bir önceki bölüm) konvansiyonel sitotoksik
anti-kanser yaklaşımından tamamen farklıdır.
1.2.4. Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü
İnsan gen tedavisi, birçok otoimmün ve kalıtsal hastalıkların ve kanser
patolojilerinin tedavisinde şimdiye kadar uygulanan konvansyonel yaklaşımlar
dışında bu hastalıkların tedavilerinde yeni bir umut olarak ortaya çıkmıştır
MEIDAN, 2006; PELISEK, et. al. 2006) . Gen tedavisi, son yıllarda moleküler biyoloji
ve biyoteknolojideki gelişmeler sayesinde mümkün olmuştur. Olağanüstü öneme
sahip ve uluslararası boyutta olan insan genomun gen dizilişinin ortaya çıkarılması
projesi (Human Genome Sequencing Project) bu yeni tedavi yöntemini, birçok
hastalığın moleküler düzeyde incelenmesini gerçekleştirerek bu doğrultuda yeni
veriler ortaya çıkararak desteklemektedir. Bu gibi çok değerli genetik bilgilerin elde
edilmesiyle, gen tedavisinin yakın gelecekte moleküler tıp alanında önemli
yöntemlerden birini oluşturacağı inanılmaktadır. Gen tedavisinin amacı hastalığa
neden olan genetik bozukluklarının tedavi edilmesidir (TEMPLETON, 2003).
20 Bk.: Chapter 3. Ferry , A. L. M,, Eskens and Jaap Verweij, Principles and examples of systemic molecular targeted therapies, In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, 2005). 21 Apoptoz olaylarının önemli bir bölümünü teşkil eden “scenescence” olayı doğrultusunda ortaya çıkmaktadır.
122
DNA dizilişindeki nokta mutasyonları teorik olarak tedavisi mümkün olan
birçok hastalığa neden olmaktadır. Genomlarda, nokta mutasyonlarını ortadan
kaldırmak için çok sayıda yaklaşım uygulanmaktadır. Bunlardan hibrid (veya
chimeric) RNA-DNA oligonükleotid veya söz konusu DNA dizilişinin kesilmesi
(deletion of DNA sequences) her ne kadar gelecek vaat eden yöntemler olarak
sunulmuşsa da frekans olarak meydana gelme olasılıkları çok düşük olduğundan,
henüz daha uygulamaları söz konusu değildir. Sonuç olarak, gen tedavisinin amacı
genetik düzenlemelerinin gerçekleştirilmesi olduğundan ve bu da klinik ortamlarda
yapılması bir hayli zor olduğundan, günümüzde gen tedavi yaklaşımların birçoğu
işlevsel genlerin ortama katılmasına dayanmaktadır. Bu yaklaşımda, terapötik genler
farmasötik bileşenler olarak tasarlanırlar ve ortama verilirler. Söz konusu genlerin
hedeflendirildikleri hücre içi bölgeye ulaşma yollarındaki olağanüstü sitoplazmik
engellerin bulunduğundan, in vivo ortamda, yeni ve kontrolü mümkün olan özellikler
taşıyan, güvenilir ve tekrarlanabilir gen tedavi deneysel protokollerin geliştirilmesi
gerekmektedir. Gen yer değişimi tedavinin (Gene Replacement Therapy) dışında, in
vivo gen naklindeki başarı, antijenik proteinin optimal imün cevaba neden olacak
şeklinde naklinin gerçekleştirildiği, DNA aşıların geliştirilmesini de mümkün
bakımdan, gen nakli için retrovirüsler, adenovirüsler, adeno-associated virüsler
(AAV) gibi birçok virüs türü gen nakli için birçok araştırmacı tarafından klinik
uygulamaya konulmuştur (Şekil 1.7). Gen naklini çok etkili bir şekilde
23
Son iki şemada gösterilen DNA genelde plazmid DNA, oligonükleotid, poliribonükleotid veya diğer model DNA’lardan biridir. Bu nükleik asit türleri arasında her ne kadar moleküler ağırlık ve konformasyon bakımından farklılıklar bulunsa da diğer bileşenlerle kompleks oluşumundaki fizikokimyasal etkenler genelde aynıdır. Bu şemalar, bu yüzden herhangi bir nükleik asit (bunlara antisense ribonukleotid tedavisi veya small interference RNA (siRNA)’ya dayalı tedavilerde olduğu gibi, RNA da dahil olmak üzere) için geçerlidir.
131
başarabildiklerine karşın, viral partiküller bağışıklık sistemini tetiklemekte ve antikor
ve diğer önemli proteinlerin sentezlenmesine neden olmaktadırlar (KAPLITT, et. al.,
Şekil 1.20: Lineer ve zincirli poli-L-lizinin kimyasal yapıları
(SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).
Polimerler.
Kitosan (Chitosan) doğal bir polimer olup glikozidik bağlarla birbirleriyle
bağlanan D-glükozamin ve N-asetil-D-glükozamin moleküllerini içeren iki alt
141
biriminden oluşmaktadır (Şekil 1.21). Nispeten daha az toksiktir ve DNA
nanopartikül oluşmasını takiben transfeksyon etkinliği oldukça yüksektir. Böylece,
kitosan ve çeşitli türevleri gen nakli konusunda gelecek vaat eden bileşikler olarak
görülmektedir.
Şekil 1.21: Kitosan (Chitosan)’ın kimyasal yapısı (SANTHAKUMARAN, et. al.,
2005).
Poli(etilen glikol) (PEG) ve poli(etilen oksid) (PEO) gibi nötr polimerler de
yüksek pI’de DNA kondanzasyonuna neden olmaktadır. Bu yük taşımayan ve esnek
polimerler “excluded volume mechanism” adıyla bilinen mekanizma ile etki
gösterirler. DNA kondanzasyonunun satbilitesini ve transfeksyon etkinliğini artırmak
amacıyla, çoğu zaman PEG PEI, folat reseptörleri ve poli-L-lizin ile konjuge edeilir
(SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).
Sonuç olarak, üniversitelerde ve sanayii kuruluşlarının araştırma-geliştirme
(AR-GE) merkezlerinde, DNA ile reaksyona giren ve DNA nanoparçacıkların
oluşumuna neden olan çok sayıda sentetik veya doğal bileşenin viral olmayan gen
taşıyıcıların tasarlanmasındaki kullanım olasılıkları yoğun olarak araştırılmaktadır.
142
1.3. Taxol® (Paclitaxel).
1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®’un
Rolü
Konvansiyonel ilâç geliştirmesi genelde deneysel hayvanların ve hücre kültürü
düzeneklerinin kullanıldığı faz-1, faz-2 ve faz-3 olarak adlandırılan aşamaları içeren
klinik öncesi araştırmaları takip etmektedir. Genel olarak da, faz-3 çok sayıda
gönüllünün iştirak ettiği klinik deneylerinden ibarettir. Söz konusu aşamalı prosedür
çoğu zaman komplementer veya alternativ tedavilerle sonuçlanmamaktadır. Buna
ilâve olarak, etkili konsantrasyonları önceden ayarlanabilen total olarak sentezlenmiş
bileşenler dışında, doğal bitkisel kökenli malzemeden izole edilen aktiv olan etken
madde miktarları genelde çok düşüktür. Aynı şekilde, komplementer ve alternativ
terapilerle sonuçlanabilecek klinik öncesi araştırmalar çok nadir olup, double-blind
klinik araştırmalar da son derece nadir olarak uygulanmaktadır (Stohs, S.J., 2005).
Bu tür komplementer ve alternativ terapilerin izlediği aşama ve gelişmelerden farklı
olarak porsuk ağacından (Pacific Yew Tree, Taxus brevifolia, bk. Şekil No: 1.22) izole
edilen ve günümüzde antikanser tedavierinde çok başarılı bir şekilde yoğun olarak
kullanılan Taxol® (Paclitaxel24)’in buluşu ve geliştirilmesi olmuştur.
24 Jenerik ismi (Bk.: Stohs, S.J., 2005). Bu raporumda her iki (ticari ve jenerik) isim de kullanılmıştır.
143
Şekil 1.22.: Porsuk ağacının farklı türleri, Taxus brevifolia, Taxus baccata vs. (www.turkforum.net; www.conifers.co.nz; home.scarlet.be ve çok prestijli Max-Plank
Taxol®‘un saflaştırılması, karakterizasyonu, klinik öncesi ve klinik araştırma
süreçleri Food and Drug Administration (FDA)’nın konvansiyonel ilâç geliştirme ve
piyasaya sunma stratejilierini takip etmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Harlan,
Jr., W.R., 2001; Stohs, S.J., 2005)25.
1960’larda, National Cancer Institute (NCI) U. S. Department of Agriculture
(USDA) tarafından rastgele bitkisel kökenli örneklerin toplandığı ve bunların
antineoplastik aktivitelerinin tarandığı bir program başlatmıştır. Toplanan bitkiler
arasında, Washington Eyaletinden getirilen T. brevifolia’nın gövdesinden kısımlar,
yapraklar ve meyveler de bulunmaktaydı (Stohs, S.J., 2005). Bunlarla yapılan ilk
taramalar çeşitli neoplastik hücrelere karşı potansiyel aktivite endeksi olarak da
25 Bk.: Harlan, Jr. W. R., New opportunities and proven approaches in complementary and altenative medicine research at the National Institutes of Health. J. Altern. Compl. Med., 7, S53, 2001; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: discovery to clinic (13th Bruce F. Caine Memorial Award Lecture), Cancer Res., 55, 753, 1995; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: from discovery to clinic. J. Ethopharmacol., 51, 239, 1995- Taxol® ‘un geliştirme tarihçesini ve klinik kullanımını özetleyen bir derlemedir.
144
kabul edilen, T. brevifolia ekstraktlarının 9KB hücrelere karşı yüksek bir
sitotoksisiteye sahip olduğu saptanmıştır (Stohs, S.J., 2005)26.
1964 yılında, Research Triangle Institute, Research Triangle Park, N. C.,’da
bulunan Wall’un laboratuvarı, National Cancer Institute tarafından gönderilen ilk T.
brevifolia bitkisel malzemeleri incelemek üzere kabul etmiştir. Saflaştırma ve
sitotoksisite prensipleri Walker WM katı tümör inhibisyonunu içeren biyoaktivite
göstergeleri kullanarak yapılmıştır (Stohs, S.J., 2005). Kasım 1966’dan itibaren, Wall
ve Wani (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995) bu bitkiden çok yüksek sitotoksik aktiviteye
sahip bir fraksyon izole etmişlerdir. 2 yıllık bir saflaştırma sürecini takiben, standart
etanol ekstraksyonu, H2O ile kloroform arasında oluşan etanol kısmının faz ayrımını
sonucu counter current dağlımını içeren aktiv bileşen izole edilmiştir. Taxol ismi, söz
konusu molekülün hidroksil grupları içerdiği (-ol) ve taxane çekirdeğinin bulunduğu
yapıya dayanarak (Bk.: Şekil 1.26.), T. brevifolia’dan izole edilmiş bileşene verilen bir
isimdir.
Taxol®‘un yapısal analizi, ultraviyole (UV; morötesi), kızılötesi (IR) ve kütle
spektrometresi ölçümleriyle yapılmıştır ve 1971 yılında (Wani et al., 1971) bu yapı
ayrıntılı olarak aydınlatılmıştır27. Taxol®‘un (Paclitaxel’in) yapısı Şekil 1.26’da
verilmiştir. 1960’lı yıllarda yapılan araştırmalarda Taxol®‘un L1210 ve 1534 türü
lösemi hücrelere karşı aktivitesi bulunduğu gösterilmiştir. Taxol®‘un ayrıca birçok
katı tümöre karşı aktiv olduğu gösterilmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Stohs,
S.J., 2005).
Taxol®‘un etki mekanizmasının aydınlatılması, bu sitotoksik ajanın klinik
araştırmalarda kullanılmasında önem taşımıştır. İlk araştırmalar, bir mitotik
inhibitör olarak etki ettiği ve böylece yeni ve daha başka örneği bulunmayan bir
mekanizma söz konusu olduğunu kanıtlamıştır28. Taxol®‘un yapısı ve fizikokimyasal
özellikleri Ek-7 verilmiştir. Daha ayrıntılı bilgi için Ek-7’e başvurulmalıdır.
26 Bk.: Stohs, S.J., Taxol in CCncer Treatment and Chemoprevention. In: Phytopharmaceuticals in Cancer Chemoprevention, Debasis Bagchi and harry G. Preuss (Eds.), CRC Pres, Boca Raton, London, New York, Washington D. C., 2005, pp. 519-524. 27 Bk.: Wani, M.E., Taylor, H.L. Wall, M.E., Coggan, P. and Mc Phail, A.T., Plant antitumor agents VI: the isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971. 28 Bk.: Fuchs, D. A ve Johnson, R. K. Cytologic evidence that taxol, an antineoplastic from Taxus brevifolia, acts as a mitotic spindle poison, Cancer Treat. Rep., 62, 1219, 1978.
145
Ancak, daha sonraki araştırmalar söz konusu mekanizmanın mikrotübülleri
stabilize ettiğinden ve bunların tekrar tübüline geri depolimerizasyonunu
engellediğinden, yani kolisin, vinkristin, vinblastin ve podofilotoksin gibi diğer
antimitotik ajanların etki mekanizmalarının aksine çok farklı bir yol takip ettiğini
göstermiştir (Schiff, P. B., et al. 1979; Horwitz, S. B., 1992)29.
Hayvanlar üzerinde deneyler 1982 yılında yapılmış olup, faz-1 klinik aşaması
1983-84, faz-2 ise 1983-86 yıllarında tamamlanmıştır (Wall, M. E. ve Wani, M. C.,
1995; Stohs, S. J., 2005). ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) 1991 yılında yeni ilâç
uygulama şemasını elde ettiğinden dolayı Cooperative Research and Development
Award (CRADA) adlı ödülü Bristol-Myers Squibb şirketine vermiştir.
Taxol® ilk olarak son derece yavaş büyüyen Taxus brevifolia’nın kabuğundan
izole edilmiştir. Taxol® çok düşük miktarlarda bu ağacın kabuğunda bulunmaktadır
ve bundan dolayı uzun süre klinik kullanımı sorun olmuştur. Bu sorun, başka taxus
türlerinde, örneğin T. baccata’nın yapraklarında çok daha yüksek miktarlarda
bulunan baccatin III veya 10-deacetylbaccatin III’ten Taxol®’un yarısentezini
Taxol®’un total sentezi ile ilgili bk.: Ek-8. Taxol®’un total sentezi iki ayrı grup
tarafından yapılmıştır. Yapısından da anlaşılacağı üzere (Şekil 1.26), çok sayıdaki
asimetrik C-atomu total sentezi son derece güçleştirmektedir. Taxol®’un söz konusu
total sentezi bu ilâcın pratik olarak stoklanması anlamına gelmemesine rağmen, o
yıllarda Taxol®’un kimyası hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bunun dışında,
Taxol®’un analoğu olan Taxotere™ (Docataxel) (Şekil 1.27) hazırlanmıştır, test
edilmiştir ve her ikisinin de klinik olarak kullanılabilecekleri kararına varılmıştır
(Stohs, S. J., 2005).
1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı.
Rahim karsinom ve non-small-cell lung kanser vakalarında radyoterapi veya
cerrahi müdahalelerin uygun görülmediği hastalarda cisplatin ile birlikte Taxol® ilk
başvurulan çok etkili bir ilâçtır (Bk.: Şekil 1.25). Aynı şekilde, refraktor metastatik
29 Bk.: Schiff, P. B., Fant, J. ve Horwitz, S. B., Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol, Nature, 22, 665, 1979: Horwitz, S. B., Mechanism of action of taxol, Trends Pharmacol. Sci., 13, 134, 1992.
146
rahim karsinom vakalarında ve kombinasyon terapinin başarısızlıkla
sonuçlandığında metastatik hastalık için veya adjuvant kemoterapi sonrası dönemler
için bu ilâç birinci derecede önem kazanmıştır. Bunun dışında, AIDS’e bağlı Kaposi
sarkomlarda ikinci derecede önemlidir (Stohs, S. J., 2005).
Ayrıca, standard tedavi yöntemlerden şimdiye kadar üstünlüğü kanıtlanmış olsa
bile, head and neck karsinomlarda Taxol®’un yine etkili bir şekilde kullanılmaktadır.
4-hidroksitamoxifen ile birlikte kullanıldığında, estrojen-reseptör-negativ barsak
kanserine ve akciğer kanser hücre kültürlerinde etkili olduğu gösterilmiştir (Stohs, S.
J., 2005). Bu kombinasyon, tek başına kullanıldığı zaman gösterdiği etkiden çok daha
yüksek bir potansiyeli olduğu gösterilmiştir (Stohs, S. J., 2005).
Taxol®’un çok sitotoksik olduğundan, bu ilâçla tedavi edilen hastalarda yan
etkilerinin de görülmesi beklenmektedir. Tek başına Taxol® ile tedavi edilen katı
tümörlü hastalaın 90%’nında nötropeni ve lökopeni gibi omur iliği baskılanmaları
görülmüştür. Bu ilâçla tedavi edilen hastaların 75%’inde ise anemi görülmektedir.
Sonuç olarak, Taxol®’un fizikokimyasal özelliklerini optimize etmek suretiyle bu yan
etkileri azaltmak mümkün olacaktır. Bu amaçla, bu ilâçın çeşitli kontrollü salınım
sistemleriyle denenmesi gerekmektedir. Projemde yer alan Taxol®-fosfolipid
kompleks oluşumunun incelenmesi de bu hususu vurgulamaktadır. Bu tür lipide
(lipozomal) bağlı formülasyonlarının geliştirebilmesi kuşkusuz Taxol® ‘un yan etkileri
ve çözünürlülük problemleri çok daha azaltılmış olarak uygulama fırsatı yaratacaktır.
147
Şekil 1.23. Taxol’un popülaritesini gösteren bir şekil. Dünya üniversitelerin 80%’inde kullanılan Genel Kimya ders kitabının kapağında yer almaktadır (Bk.: General, Organic, and Biochemistry (Hardcover); by Katherine J Denniston, Joseph J
Topping, Robert L Caret, McGraw-Hill Science/Engineering/Math; 4 edition (Mar 4 2003).
148
1.24. Bristol-Myers Squibb tarafından yayımlanan monografi (Kaynak: www.ja-text.de/Print.php).
1.25. Üst kısım: Kuzey Amerika’da klinik kullanımda olan en popüler ilâçları gösteren bir kıyaslama tablosu. Alt kısım: Taxol® tedavisinin etkinliği (Kaynak: www.rmj.ru/articles_3834.htm)31. Bu şekil daha önce verilen Şekil 1.2 ve 1.3 ile
kıyaslanmalıdır.
30 Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442.
151
15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279. 18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13. 31 Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442. 15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279.
152
Şekil: 1.26. Taxol®‘un kimyasal yapısı. Molekülün diterpen kısmı sarı renkle gösterilmiştir. Daha iyi renkli bir görünüm için bu proje raporumla
birlikte sunduğun CD’ye bakınız. Bu diğer şekiller için de geçerlidir.
Şekil 2.27. Docataxel veya Taxotere™ (Kaynak: chimie.scola.ac-paris.fr/Sitedechimie/chi_org...).
18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13.
153
1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması.
Taxol®’un hücresel mikrotübüllerdeki32 bağlanma bölgesi hücresel işlevi
bilinmeyen bir farmakolojik hedeftir. Mikobakteri kaynaklı epotilonlar, deniz yosunu
kaynaklı diskodermolidler ve yumuşak mercanlardan elde edilen elenterobinler ibi
doğal bileşenler, mikrotübüllerdeki bağlanma bölgesine yerleşerek Taxol®’un
sitotoksik etkilerine benzer etki göstermektedirler. Mikrotübülleri stabilize eden
bileşenler adı verilen bu moleküller, mikrotübüllere bağlanarak dinamiklerini bloke
etmekte ve böylece hücre bölünmesini sonlandırmaktadırlar (Bk.: Şekil 1.28-1.31).
Taxol® ve türevleri yumurtalık kanseri, metastatik göğüs kanseri, head and neck
kanseri ve böbrek kanseri tedavilerinde başvurulan başlıca ilâçtır (Bk. özellikle Şekil
1.25. Ayrıca bk.: Şekil 1.2 ve 1.3). GTP aracılıyla Taxol®’un mikrotübüllere bağlanma
noktası olarak mikrotübül lumeninin (boşluğunun) β – tubulin altbirimi
belirlenmiştir (Bk.: Şekil 1.31).
Taxol®’un bağlanma kinetiğini ve ligandlara karşı afininitesini incelemek için
en duyarlı yöntem olarak floresan işaretli taxoid Flutax-2’in kullanılması olmuştur
(Şekil 1.32). Görüldüğü üzere, floresan mikroskopik inceleme taxoidlerin çözeltideki
mikrotübüllere doğrudan bağlandığını göstermektedir. Cyclostreptin hücre
mikrotübülleri stabilize eden ilk moleküldür ve bunlara kovalent olarak bağlanarak
tersinir olmayan bir etki yapmaktadır. Bu ligandı kullanarak, Taxol®’un
mikrotübüllere bağlanma mekanizması ve ayrıca da biden fazla bağlanma noktası
bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu kovalent bağlanma, P-glikoproteini eksprese
eden hücre kültürlerinde bu ilâcı aktiv hale getirmektedir.
32 Hücre mikrotübülleri hakkında daha ayrıntılı bilgi için Moleküler Hücre Biyolojisi ders kitaplarına başvurulmalıdır.
154
Şekil. 1.28. Taxol®’un hücre bölünmesi üzerine etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).
Şekil 1. 29. Taxol®’un mikrotübül dinamiği üzerindeki etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).
155
Şekil 1. 30. Taxol®’un hücre mikrotübüller üzerinde ve programlanmış hücre ölümüne (apoptoza) yol açan çeşitli etkileri. (Kaynak: biologyofcells.blogspot.com/2007/12/microtubu...).
156
Şekil 1.31. Taxol®’un mikrotübül dimerlerine bağlanma şekli (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).
157
Şekil 1.32. Mikrotübül stabilize edici moleküllerin hüceresl mekanizmaları. PtK2 hücrelri during 7 saat boyunca cyclostreptin yokluğunda (A) veya 5 µM (B) ve 10 µM paclitaxel (C) varlığında. Hücreler daha sonra yıkanıp, bu hücre kültüründe 16 saat boyunca bu şekilde bırakılmışlardır, kontrol (D), 5 µM cyclostreptin (E) ve 10 µM
Yukarıda ayrıntılı olarak verilen Taxol® etki mekanizması uyarınca,
mikrotübüllerin iç yüzeyinde meydana gelen bu tür üç boyutlu bağlanma şekli,
prensip olarak uzay geometrisi engelleri bakımından bağlanmayı çok zor bir hale
getirmektedir. Bu yüzden Taxol®‘un bağlanma afinitesi, kinetiğini ve üç boyutlu
şekilleri hakkında ek bilgilere ihtiyaç vardır. Çünkü bu tür bilgiler daha ileriki
aşamalarda Taxol®‘un hem daha etkili farmasötik terapötik formülasyonlarının
geliştirilmesini, hem de hücre seviyesindeki Taxol®‘un etki mekanizmasını çok daha
iyi bir şekilde anlaşılmasını mümkün kılacaktır. Bu her iki nokta da projemde
özellikle vurgulanmıştır. Bu bağlamda da, şu ana kadar teklif edilen etki
mekanizmasına muhtemel alternativler sunulmalıdır. Tarihsel olarak da zaten, aynı
mantık ve düşünce tarzı anestetiklerin etki mekanizmaları için de izlenmiştir.
Örneğin, anestetiklerin33 etkileri sadece Meyer veya Overton yasalarına dayanarak
Octanol-Water Partitioning sabitlerini hesaplayarak açıklanamamıştır. Çok daha
33 Aynı gerekçeler diğer ilâçlar için de geçerlidir.
158
sonraları bunların etki mekanizmalarına projemde de olduğu gibi lipid teorileri dahil
edilmiştir34.
Bu projemde de zaten Taxol®‘un bu etki mekanizmalarını aydınlatacak niteliği
taşıyan ek bir öncü hipotez sunulmuştur. Çünkü söz konusu etki mekanizması,
kullanılan tümör hücre kültürü türüne göre de farklılıklar göstermektedir. Projemde
öncü hipotez olarak Taxol®‘un hücre zarının akışkanlığını düzenleyerek ve dolayısıyla
da buradaki ilâç difüzyonlarını ve reseptörlerin dinamiğini kontrol ederek etki
mekanizması teklif edilmiştir. Literatür taraması da gösteriyor ki35, şu ana kadar
böyle bir bağlantı çalışılmamıştır. Bu bakımdan projemin orijinalliği tartışılamaz hale
getirilmiştir. Bu hususları Bilimsel Araştırma Proje Birimine daha projemin ilk sunuş
metninde açıkça ifade edilmiştir. Daha çok ayrıntı için bu proje teklifim
incelenmelidir. Söz konusu hipotezim de normal hücrelerle tümör hücreleri
arasındaki membran akışkanlığında gözlenen farklılıklarına dayanmaktadır36. Bu
konuya ayrıca Yorum bölümünde de ayrıntılı olarak değenilmiştir.
Multidrug Resistance (MDR) adı verilen antineoplastik ajanlara karşı gelişen
direnç mekanizmalarının ortaya çıkması sonucu Taxol® ile gerçekleştirilen
kemoterapilerde her zaman tatmin edici sonuçlar alınmamaktadır. Söz konusu MDR
olayları P-glikoprotein (P-gp) gibi membran pompapalarının aşırı ekspresyonu
sonucu meydana gelmektedir ve kemoterapötik ilâçları sitoplazmadan hücre dışına
pompalayarak bunların intraselüler konsantrasyonunu ve böylece de kemoterapilerin
etkinliğini düşürmektedir. P-gp de membran glikoproteini olduğundan Taxol® ile
hücre zarları arasında oluşan moleküleretkileşmelerinin önemini vurgulamaktadır.
Projemde de bu etkileşmeler çeşitli fosfolipid molekülleri kullanarak model hücre zarı
yüzeyleri ile modellenmiştir. MDR hücre türlerini öldürebilen Taxol® ligandlarını
bulmak için bu projemde elde edilen verilere dayanarak daha sonraki aşamalarda bu
modelleri dirençli ve dirençsiz hücre kültürleri üzerinde denenebilir. Bu amaçla, bu
projemde geliştirilen etkileşme modellerine dayanarak Taxol®’un bazı tümör hücre
kültürlerinin hücre mikrotübülleri üzerinde, hücre bölünmesi ve hücre döngüleri
üzerindeki etkileri incelenebilir. Ancak bu şekilde bu ligandların afinitelerinden yola
34 Bu konularla ilgili özellikle bk.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. J. K.
Seydel and . Wiese (Eds.)., Methods and Principles in Medicinal Chemistry, Vol. 15, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany, 2002, 35 Bk.: Ek-5 ve Ek-6. 36 Bu çok önemli konu için bk.: Chapter 9: Membranes in Cancer. In: Howard R. Petty, Molecular Biology of
Membranes. Structure and Function, Plenum Press, New York and London, 1993, pp. 353-374.
159
çıkarak araştırılan maddelerin Taxol® ve türevlerinin bağlanma noktasındaki
sitotoksisitelerini ortaya çıkaracaktır ve böylece yüksek afiniteli bileşenlerinin
tasarımını ve sentezini mümkün kılacaktır. Bu hususlar projemin moleküler hücresel
boyutunu teşkil etmektedir.
Bunun dışında projemin bir de daha pratik biyoteknolojik boyutu da vardır.
Sunduğum projenin nanofarmasötik biyoteknolojik boyutu olarak, model hücre
yüzeyi - Taxol® nanometrik bileşenlerin fizikokimyasal özelliklerinin yeni bir
laboratuvar protokolü geliştirerek şu ana kadar çok az uygulanan Langmuir-Blodgett
tek katman (lipid monolayer) düzeneği ile incelenmesi ile ilgilidir. Şimdiye kadar
yayımlanan deneysel tasarımlardan farklıdır ve kanımca orijinal bir yaklaşımdır. Şu
ana kadar yayımlanmış çalışmalarda, Taxol® - hücre membran lipid modellerini
teşkil eden antineoplastik ajan veya bir başka model terapötik formülasyon ve
katiyonik lipidlerle girdikleri tepkimeler neticesinde elde edilen bileşenlerin daha
sonraki intraselüler penetrasyon deneyler esnasında hücre kültüründe terapötik
bileşenlerin uygun bir şekilde taşınma kapasiteleri ile ilgili olarak, ön biyofiziksel
ölçümlere ve bunu takip eden morfolojik karakterizasyonlardan ibarettir. Ancak, söz
konusu katiyonik lipidler sitotoksik olduklarından, in vivo ortamda serum
stabiliteleri son derece düşüktür. Sunduğum projede ise, orijinal bir alternativ olarak
katiyonik lipidler yerine zwitteriyonik (nötr) fosfolipidlerin kullanılmasını
önermekteyim. Bunlar arasında aynı amaçla tasarlanan nükleik asitlere dayalı
formülasyonlarının fizikokimyasal sabitlilikleri ve termodinamik özellikleri
yayımlanmıştır. Ancak, aynı modelin daha küçük hacimli antineoplastik ajanlar ile de
geçerli olup olmadığı henüz daha araştırılmamıştır. Ayrıca, sekonder yapıları ve bu
dinamik yapılardaki meydana gelen değişikliklerin hücre içi geçiş yaparak hücre
çekirdeğindeki DNA’ya bağlanma potansiyellerini nasıl etkilediği konusu henüz daha
bilinmemektedir.
1.3.6. Literatür Özeti
Taxol®’un etki mekanizmasıyla ve tedavi potansiyeli ile bir hayli fazla yayın
bulunmaktadır. Bunların en güncel olanları Ek-5’te verilmiştir. Bunun dışında ilâç
tedavilerine paralel olarak son yıllarda çok popüler olan gen aktarım yöntemleriyle
kanser tedavi profilleri de Ek-6’da verilmiştir.
160
2. GEREÇ VE YÖNTEM
Bu projemde Taxol® (Paclitaxel) ile model hücre yüzeyleri arasında oluşan
moleküler etkileşmelerin simüle edilmesini mümkün kılan bir düzeneğin
tasarlanması amaçlanmıştır. Söz konusu düzeneği anlayabilmek için yüzey kimya ve
kolloid kimya kavramlarını çok iyi bilmek lâzım. Özellikle hücre membranın yapısı ve
fizikokimyasal özellikleri ile yüzeysel aktivite kavramları çok önemlidir. Bu amaçla,
bu proje raporumu inceleyecek olanlara yardımcı olmak amacıyla aşağıdaki bölümde
ilk önce hücre membran yapısı ile ilgili güncel bilgiler verilmiştir. Daha sonra da
projemde geliştirilen deneysel protokole ayrıntılı olarak yer verilmiştir. Bu protokole
dayanarak, başka ilâçların da membran afiniteleri incelenebilir.
2.1. HÜCRE MEMBRAN YAPISI
2.1.1. Biyomembranların İçeriği
Membranlar hücre işlevlerinin yerine getirilmesinde hayati bir rol oynar.
Plazma membranı hücreyi çevrileyerek iç hacminde bulunan sitozol ile dış çevre
arasındaki önemli farklılıklarını muhafaza eder. Hücre içi ortamda farklı bileşen, yapı
ve işleve sahip birçok organel ve cisimcik bulunur. Organeller yerine getirdikleri
işlevlerine göre farklı olarak isimlendirilirler ve böylece eukaryot hücrelerde
endoplazmik retikulum, Golgi cismi, mitokondri, kloroplastlar ve membrana-bağlı
organeller ayırt edilmektedir (Şekil 2.1).
161
Şekil 2.1. Hücre membranı (www.microscopy-uk.org.uk/.../membranes.html
sitesinden alınmıştır).
Membranlar her organelin iç hacmindeki içeriği ile sitozol arasında bulunan
karakteristik farklılıkları muhafaza eder. Hücre membran yapısının kavramı Singer
ve Nicholson tarafından (Şeki 2.2) teklif edilen ve sıvı-akışkan veya “fluid-mozaic”
membran modeli olarak da adlandırılan lipid çift katman (lipid bilayer) yapıya
dayanmaktadır. Günümüzde hücre membranı kavramı karbonhidratlar, pigmentler,
antikorlar, reseptörler ve diğer proteinleri de içerecek şeklinde geliştirilmesine
rağmen (Şekil 2.3), hala geçerliliğini koruyan fluid-mozaic membran modeline göre,
hücre membranlarını oluşturan fosfolipidler amfipatik olup suya afinitesi yüksek olan
(hidrofilik) ve sudan uzaklaştırılan (hidrofobik) kısımları içerir.
162
Şekil 2.2. Biyomembranların günümüzde geçerli olan Singer ve Nicholson modeli
(www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).
163
Şekil 2.3. Biyolojik membranların yapısı
(www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).
Şekil 2.4. Biyomembran yapısında yer alan fosfolipidlerden tipik bir görünüm (Bk.:
www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm ve
www.agen.ufl.edu/.../lect/lect_06/lect_06.).
Bu makromoleküller birçok hayvan hücre membran hacminin yarısını
oluşturup, geriye kalanı ise proteinlerden oluştuğu bilinmektedir. Fosfolipidlerin
çift katmanlar (bilayers, Şekil 2.4) söz konusu lipidlerin bu amfipatik doğasından ve
şekillerinden kaynaklanmaktadır. Böylece, lipid moleküllerin su tarafından
çevrildiklerinde hidrofobik kısımlarının iç hacminde ve hidrofilik başlar da suya
doğru yer alacak şekilde çeşitli agregatlar ve toplaşımlar (self-assemblies) meydana
getirirler.
164
Hücre membranların lipid çift katmanları (Şekiller 2.2-2.4) fosfolipidler,
kolesterol ve glikolipidler gibi üç ayrı çeşit membran lipid molekülü içermektedir.
Hücre membranının iç ve dış tek katmanları (monolayers) lipid içeriği bakımından
birbirinden farklıdır. Buna benzer farklı lipid karışımları eukaryotik hücrelerin
çeşitli organel membranlarında da mevcuttur. Böyle bir asimetrik membran lipid
çift katman modeli söz konusu lipidlerin iki boyutlu lipid molekülleri içinde
yerleşmiş membran proteinlerin bulunduğu yapısal tasarımına dayanmaktadır.
Böylece, bazı membran proteinleri işlevlerini yerine getirmek için spesifik baş
gruplarına ihtiyaç duyar. Aynı şekilde, suyun proteinler için bir üç-boyutlu çözücü
rölü oynar ki böylece birçok enzim bu çözeltilerde aktiviteleri için seçici olarak bir
metal iyona gereksinim duyar.
Biyolojik membranların temel yapısı lipid çift katmana dayanmasına rağmen,
spesifik işlevlerin çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. Bu doğrultuda,
membranda yer alan proteinlerin miktarı ve türü geniş sınırlar içinde
değişmektedir. Sinir hücresi aksonlarda elektrik yalıtkanlığı görevi yapan proteinler
membran kütlesinin 25%’den daha düşük bir miktarı oluştururken, mitokondrinin
ve kloroplastlarda iç membranların enerji iletimi görevi üstlenen zarda ise ~75%’i
proteindir. Genel olarak, plazma membranın içeriğinin 50% proteinlere düşer.
Protein moleküllere kıyasla lipid molekülleri daha küçük olduklarından her zaman
hücresel ortamlarda proteinlerden daha fazla oranda lipid molekülleri bulunur. Bu
oranı genelde membranlarda her proteine karşılık olarak 50 lipid molekülün
bulunduğu gerçeğiyle de açıklanır.
Membran proteinleri birçok işlev görür. Plazma membranında dış uyarılara
sensör cevabını gerçekleştiren proteinler bulunur. Bu şekilde bu protein sensörleri
veya reseptörleri bilgi taşınımında da görev yapar. Diğer membran proteinleri
zarlar arasındaki iyon gradyantlarını meydana getirir. Bu gradyantlar ATP
sentezinde, önceden seçilmiş maddelerin transmembran taşınımında, veya kas ve
sinir hücrelerinde elektrik sinyallerin iletiminde kullanılır. Değişik işlevlerine
rağmen, tüm biyolojik membranlar genel bir yapıya sahiptir-her biri lipid ve protein
moleküllerince oluşturulan ince film tabakasıdır (Şekiller 2.2-2.4).
165
Biyolojik membranların iki boyutlu akışkanlar olduğu kavramı membranın
yapı-aktivite ilişkisinin ortaya çıkarılmasında büyük bir rol oynamıştır. Ancak,
membranı sadece lipid denizinde serbestçe yüzen proteinlere dayanan model bir
hayli basitleştirilmiş olduğu ortaya çıkmıştır. Birçok hücre meydana getireceği
işlevin kolaylaştırılması doğrultusunda birçok lipid ve protein molekülü lipid çift
katmanı üzerindeki belli bir yüzeyde yoğunlaştırır. Böylece membran domenler ve
membran dinamiği kavramları geliştirilmiştir. Bu kavramlar, şimdiye kadar
vurgulanan membran proteinlerin öneminin yanı sıra membran lipid türlerinin
oluşturduğu domenlere (lipid rafts) dikkati çekmektedir. Örneğin, birçok lipid
molekülü membran proteinlerden farklı olarak çift katmanı oluşturan iki ayrı tek
katmanlar arasında yer değiştirmektedir. Membran proteinleri ise membran içinde
lateral olarak hareket eder. Sonuç olarak, hem lipidlerin hem de proteinlerin bu
hareketliliği membranın çok dinamik bir yapı olduğu ve hücre membran
akışkanlığının biyolojik önemini ortaya koymuştur. Örneğin, çift katman
viskozitesini laboratuvar deneylerinde suni olarak belli bir seviyenin üzerine
çıkartarak tamamen ortadan kalktığı gözlenmiştir. Lipid çift katmanın akışkanlığı
lipidlerin içeriğine ve ortam ısısına bağlıdır. Böylece, çift katmanın sıvı fazdan jel
faza geçişini gösteren karakteristik freeze noktasında daha kısa hidrokarbon
zincirlerinin veya çift bağ içerildiğinde bu nokta daha düşüktür.
2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri
2.2.1. Lipid Çift Katman
Lipid-protein çift katman hidrofobik etkileşmeler sayesinde meydana gelen bir
supramoleküler yapıdır. Bu etkileşmeler molekülleri imobilize etmek için yeterince
güçlü olmadıklarından çift katman fizyolojik ortamda sıvı özellikleri gösteren, aynı
zamanda da yapısal olarak kristal şekilleri alabilmektedir. Söz konusu sıvı kristal
fazı tüm molekülleri kapsamamaktadır. Sıvı kristal fazını oluşturan moleküller
genelde uzun zincirli olup moleküler ağırlıkları MW=200-500 Da’dan birkaç bin Da
arasında değişmektedir. ESR spektroskopisini kullanarak ilk defa Hubbel ve
McConnel37 çift katmanın üst ve alt kısmında bulunan lipid hidrokarbon zincirinin
hareketliliğinin yüksekliğini gözlemişlerdir. Bu olay daha sonra Levine ve Seelig
tarafından 2H- ve 13C-NMR spektroskopisi kullanarak teyit edilmiştir. Bu
37 Hubbel, W. L. and McConnel, H. M. (1971): Molecular Motion in Spin-Labelled Phospholipids and Membranes, J. Amer. Chem. Soc., 93: 314-326.
166
araştırmalar neticesinde yağ asitlerinin son kısmında bulunan metil gruplarının
hareketli olduğunu ortaya çıkarılmıştır.
2.2.2. Membranın Fizikokimyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler
Fosfolipidler, glikolipidler ve diğer basit amfifiller faz değişimi ısısı (phase
transition temperature veya Tm) adı verilen bir ısı seviyesinde endotermik sıvı
kristal↔katı (jel) faz değişimine uğrarlar (Şekiller 2.5-2.6 ve Tablo-4).
167
Şekil 2.5. (A) Fosfolipid faz değişim geçişleri (phase transitions) ve bunlara
kolesterolün etkisni gösteren bir diferansiyel taramalı kalorimetrik (DSC)
termogram; (B) Fosfolipid konfigürasyonlarının katı ve sıvı fazları.
Lipidlerin katı fazda düzenli, sıvı-kristal fazda ise nispeten düzensiz
olduklarından, bu ısı noktasına ayrıca düzen-düzensizlik geçiş noktası (order-
disorder transition temperature) adı da verilmektedir. Her lipidin kendine özgü bir
Tm değeri vardır (Bk. Tablo-2.1).
Şekil 2.6. Bir maddenin faz değişimleri.
168
Tablo-2.1. Biyomembranlarda Bulunan Bazı Fosfolipidlerin Faz Değişim Isıları.
169
Lipidlerin sıvı-kristal şekilleri Lα fazını oluştururlar. Katı fazı ise Lβ şekli olarak
adlandırılır. Lβ şeklinde moleküller çift katman eksenine doğru hidrokarbon
zincirlerin tam olarak uzunluğunu muhafaza edip all-trans konfigürasyonu ve
transferi esnasında DMPE tek katmanın kondanze olduğu noktada basınç
değişimi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir.
175
Şekil 2.9. Langmuir-Blodgett tek katmanlardaki bir fosfolipidin uğradığı faz
değişimleri. Tipik bir izoterm gösterilmiştir. Yüzey üzerindeki fosfolipid
moleküllerin hareketliliği açıkça gözükmektedir.
Şekil 2.10. Langmuir-Blodgett tek katmanlarda Wihelmy plate ile ölçülen
yüzey basınç yönteminin bir görünümü.
176
Şekil 2.11. Farklı Langmuir-Blodgett tek katman ve çok katman düzenekleri.
177
Tek katman ( Bk.: Şekiller 2.7-2.11)39, birtakım organik moleküllerin sıvı ara
fazına uygulanmasıyla oluşturulur. Projemde uygulanan fosfolipidler genelde
Şekil 2.10 ve Şekil 2.13 gösterildiği şekilde hidrofilik baş kısımları su fazına
doğru, hidrofobik kuyruk kısımları ise gaz (hava) faza doğru yerleşir ve tek
katman bu şekilde oluşturulur. Söz konusu moleküller su yüzeyine40 ilk olarak
uygulandıklarında çok fazla serbestliğe sahip olarak yüksek bir hareketlilik
gösterirler. Bu su üzerinde her moleküle düşen alan çok fazladır ve yüzey
basınç düşüktür. Bu yüzey basınç genelde sensör sistemine bağlı Wilhelmy
palte (Bk.: Şekil 2.10 ve Şekil 2.11) adı verilen düzenekle ölçülür. Yüzeysel
basınç hesaplamalarının matematiksel ifadeleri için özellikle bk.:
www.kibron.com, www.ksvltd.com, www.nima.co.uk43,44. Bu yüzeysel basınç birbirine
karşı hareket ettirilen 2 bariyer sayesinde yükseltilmektedir (Şekiller 2.7-2.11).
Yüzey basıncın çok fazla yükselmeye başladığı bir noktaya varılır ki bu lipidin
sıvı faza geçişini göstermektedir (Bk.: Şekil 2.8 ve Şekil 2.9). Bariyerlerin
birbirine karşı istikamette daha ileri hareket ettirildiklerinde, katı fazın
değişikliğe uğradığı, yüzey basıncın daha hızlı bir şekildeki artışından da
gözlenmektedir (Şekil 2.8).
39 Bu bölümde, bu proje raporumu inceleyenlere kolaylık sağlanması amacıyla, fosfolipidlerle oluşturulan tek katmanlarla ilgili çok kısa ön bilgiler verilmiştir. Ancak, fosfolipid yüzey kimya ve kolloid teorileri matematiksel olarak da karmaşık olduğundan, bu konu ile ilgili çok daha ayrıntılı bilgilere ulaşmak için bk.: Ek-13. 40 Projemde elde edilen neticelerin tekrarlanabilirliğini test edilmesi bakımından suya ek olarak 2 ayrı tampon da denenmiştir. 41 Ayrıca Bk.: Ek-13. 42 Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece
uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar
üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve
buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir. 43 Ayrıca Bk.: Ek-13. 44 Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece
uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar
üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve
buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir.
178
Şekil 2.12. Bir reseptörün Langmuir-Blodgett tek katman üzerinde
imobilizasyonu.
Langmuir-Blodgett tek katmanların farklı düzenekleri yukarıdaki şekillerde
gösterilmiştir. Şekil 2.12 ise Langmuir-Blodgett tek katmanların farmakolojik ve
biyolojik anlamı çok daha yüksek olan bir düzeneği-bir reseptörün oluşturulan
fosfolipid tek katman üzerinde imobilizasyonunu göstermektedir. Bu şekilde
imobilize edilen reseptörlerin bunlarla bağlanan ilâç ve diğer ligandlarının bağlanma
kinetiğinin ölçülmesinde çok orijinal bir ölçüm imkânı vermektedir. Bu projemde bu
boyut amaçlanmamıştır. Çünkü böyle bir düzeneğinin kurulması için ek cihazlara
ihtiyaç vardır. Ancak fakültemizdeki bundan sonraki projelerim böyle bir düzeneğin
kurulmasını kapsamaktadır. Bu hususlara ayrıntılı olarak Ek-16’da yer verilmiştir.
179
2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında Kullanılan
Başlıca Yöntemler45
Günümüzde, biyomembran ve yapay membran modelleri araştırmalarında
birçok fizikokimyasal, moleküler biyolojik ve biyokimyasal yaklaşımlar
uygulanmaktadır. Bunlardan fizikokimyasal yöntemler çeşitli spektroskopik
ölçümlerden ibarettir. Bunlar hem biyomembran, hem model membranlarla
gerçekleştirilmektedir. Moleküler biyolojik yöntemler genelde biyomembranların ve
membran kanal proteinlerinin cDNA dizilişini ortaya çıkararak voltage-gated iyon
kanal ölçümleri veya tek kanal üzerinden geçişi takip eden patch-clamp tekniği gibi
yöntemlerin de yardımıyla membran gözeneklerinden gerçekleşen çeşitli iyon
geçişlerini hücre kültürleri üzerinde göstererek ortaya koyan yaklaşımlara dayanır.
Biyokimyasal yaklaşımlar da buna benzer şekilde membran yapısında yer alan ve
araştırılması istenilen makromoleküllerin saflaştırılıp tekrar yapay membran
modeline rekonstitüe edilmesine dayanır. Böyle bir in vitro rekonstitüsyon yöntemi
biyolojik sistemin in vitro ortamlarda da çalıştırıldığı takdirde incelenen biyosistemin
gerçek etki mekanizmasını ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birçok reseptör-ligand
bağlanma kinetiğinin ortaya çıkarılması, söz konusu reseptörlerin biyolojik hücreden
saflaştırılıp yapay membranlara rekonstitüe edilip ligand bağlanma afinitelerini
takibine dayanır. Yapay membran sistemleri genelde üç gruba ayrılır. Bunlardan
biyomembranlara ilk yaklaşım olarak lipid monolayer (Langmuir-Blodgett film-bk.:
Şekil 2.13-üst kısım) düzeneği geliştirilmiştir. Bu iki boyutlu membran yaklaşımı
birçok biyolojik ve farmakolojik etkisi olan moleküllerin model hücre üzerinden
intraselüler penetrasyon mekanizması incelenmektedir. Diğer bir iki boyutlu model
sistemi ise Black Lipid Membrane (BLM) sistemidir. Bu düzenekte dikey Pt veya
teflon plâkaları arasında bulunan boşlukta çift katman oluşturulmaktadır (Bk.: Şekil
2.13-orta kısım ve özellikle Şekil 2.14). Bu yöntem tarihsel olarak büyük önem
taşımıştır. Örneğin, ilk membran elektrofizyolojik olayları bu yaklaşımla ortaya
çıkarılmıştır. Ancak, bu yöntem çok karmaşık mikroskopik incelemelerini de
gerektirdiğinden, son derece deneyimli personelin çalışmasına bağlıdır. Üçüncü
yaklaşım ise lipid veziküllerin (lipozomların) kullanımına dayanır (Bk.: Şekil 2.13 alt
45 Bu bölümde projemi inceleyecek olanlara sadece çok kısa ön bilgilerin verilmesi amaçlanmıştır. Biyomembran düzenekleri ile daha ayrıntılı bilgi edinmek için Moleküler Hücre Biyolojisi, Hücre Fizyolojisi ve Biyofizik ders kitaplarına başvurulmalıdır.
180
kısım ve Şekil 2.15)46. Bu veziküller bir üç boyut kazandırdığından, yine üç boyutlu
olan doğal hücreye diğer iki model membran sisteminden çok daha iyi bir yaklaşım
teşkil etmektedir. Biyomembran incelemelerine geçmeden önce, araştırılmakta olan
makromoleküllerin ilk önce saflaştırılmış şekillerinin fizikokimyasal özelliklerinin
takip edilmesi gerekmektedir. Bu da çeşitli fizikokimyasal ve biyofiziksel
yaklaşımlarının önemini vurgulamaktadır. Bunlara aşağıda kısaca değinilmiştir.
2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler
2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler
Aşağıda adı geçen spektroskopik yöntemler biyomembran araştırmalarda
membran bileşenlerinin yapı ve aktiviteleri ile ilgili bilgilerin elde edilmesinde çok
önemli rol oynamıştır. Bu yöntemler hızlı ve invaziv veya destrüktiv değildir. Bu
bakımdan bunların tümü fizyolojik ortamlara yaklaşan ve bu sistemleri simüle eden
koşullarda uygulanabilmektedir. Ayrıca, bunlarla membranlarda meydana gelen çok
hızlı tepkimelerin ve konformasyon değişikliklerinin kinetiğini de incelemek
mümkündür.
46 Lipozomlarla ilgili çok ayrıntılı ve güncel bilgilere Ek-9’da yer verilmiştir.
181
Şekil 2.13. Kolloid ve yüzey kimyasal araştırmalarda bir hücre yüzeyini
modellemek için kullanılan düzenekler. Sırasıyla Langmuir-Blodgett tek
katman (monolayer), Black Lipid Films (BLMs) ve lipozom sistmleri
gösterlmiştir.
182
Şekil 2.14. Biyomembran araştırmalarda bir hücre yüzeyini modellemek için
kullanılan düzenekler. Çeşitli tek katmanlı ve çok katmanlı fosfolipid
düzenekleri gösterilmiştir. Burada özellikle farklı BLM formasyonları
vurgulanmıştır.
183
Şekil 2.15. Lipozomların genel yapısı.
2.3.1.2. Difference Spectroscopy
Bazı durumlarda belli bir membran kromoforun ve çevresindeki
moleküllerin absorbsyon spektrumunda meydana gelen spektral değişikliklerinin söz
konusu olduğunda kromoforun tek başına gösterdiği konformasyon değişikliğinden
ziyade, tüm toplam spektrumdaki değişikliklerin ölçülmesi daha uygundur. Bu işlem
çift-ışınlı spektrofotometre ile yapılmaktadır. Bu yöntemle meydana gelen
tepkimelerin kinetiğinin ölçülmesi elektron taşıyıcılarının indirgenme-oksitlenme
olaylarına bağlı olduğu gibi, NMR, ESR ve termodinamik yöntemlerinden farklı
olarak moleküllerin konformasyonu hakkında çok kısıtlı bilgiler vermektedir. Ancak,
bu yöntemi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma afinitesi ve kinetiği hakkında
CH2 gruplarına ait bandlar ise gittikçe yükselen Taxol® konsantrasyonlarda tamamen
yok olmaktadır (Bk.: Şekil 3.7). İlâcın tek başına ve fosfolipid kompleksindeki IR
spektrumları kıyaslandığında, 1647 cm-1’dekiC=C ve C=C’un shoulder yok olmakta ve
pik hafifçe daralmaktadır. Bu muhtemelen ilâç ile bağ yapması neticesinde, fosfolipid
tarafından alınan konformasyonlarda bir kısıtlamanın meydana geldiğinin işaretidir.
Bu da, Taxol®’un esnkeliğinde (flexibility) bir düşüşün olduğunun göstergesidir.
Ancak, bu bölgede henüz daha açıklanmayan ilâç yapılarının meydana gelebileceğini
de göstermektedir. Bu durumda, bu spektrum bölgesindeki değişikliklerden yola
çıkarak çok sağlıklı bir aypabilmek için “ağı su” (D2O) FTIR ölçüm yöntemi
uygulanmalıdır105.
Sonuç olarak, projemde kullanılan KBr tablet yöntemindeki suyun
uzaklaştırılması sonucu ilâç ile fosfolipid arasında kompleks oluşmasında genelde
fosfolipidin –CH ve –CH2 grupları ve H-bağlı yüzey OH grupları önemli ölçüde rol
oynamaktadır. İlâcın da PO2-, C=O, C=C ve CH2 grupları da bağ oluşumunda yer
almakatdır. Taxol® ile fosfolipid arasındaki kompleks oluşumundan sonra hidroksil
bandların değişikliğe uğraması, önceden varolan H-bağların koptuğunu ve bu da ilâç-
lipid kompleksinin oluştuğunun yeni bir kanıtı olarak kabul edilebilmeltedir.
Şekil 3.13. biyolojik önemi çok büyük olan lipid-metal katyon kompleks
oluşumunu göstermektedir. Burada metal katyonlar membran akışkanlığını
tetikleyen faktörler olarak incelenmiştir. Görüleceği üzere, Mg2+ ‘un sırasıyla fosfat,
105 Bu konunun önemi için Bk.: Helene Gaussier, Thierry Lefevre, and Muriel Subirade, Binding of Pediocin PA-1 with Anionic Lipid Induces Model Membrane Destabilization. Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2003, Vol. 69, No. 11, 6777–6784.
210
karbonil ve CH2 titreşimlerine etkilerini daha iyi bir şekilde yansıtılması amacıyla üç
ayrı IR spektral bölgeye yer verilmiştir. Bu ilk iki etki, şeklin üst ve orta kısmında yer
almaktadır. Burada fosfatidilkolin üzerinde (1000-1175 cm-1) çok az bir etki
görülmektedir. Bundan farklı olarak H-bağlar ve bağlanmış ve bağlanmamış karbonil
gruplar üzerindeki etki (1635.3 ve 1734.5 cm-1 ‘de) çok daha belirgindir. Karboniller
üzerinde bu etki, karbonil grupların su moleküleriyle azalan etkileşmelere bir cevap
olarak H-bağlardaki azalmalardan kaynaklanmaktadır. Fosfat titreşim bölgesini
takiben 1467.6 cm-1 ‘de yeni bir band ortaya çıkmaktadır. Bu band, heksagonal
paketlemeye geçişi işaret eden önceden daha yüksek olan bağ frekansının
düşürülmesindeki Mg2+ iyonların etkisini göstermektedir. Şeklin alt kısmında yer
alan spektrum, 720 cm-1 ‘de görülen ve değişime uğramamış CH2 rocking
hareketlerine özgü ve lipid zincirin hareketliliğini düşürüldüğünün ve zincir düzenin
artırdığının göstergesi olan sinyalin görülmesine rağmen, lipid CH2 sinyallerinde
sadece çok hafif bir değişiminin meydana geldiğini ve lipid zincir düzeni ile ilgili
bunlardan çok az bilgi alınabileceğini göstermektedir (BINDER ve ZSCHÖRNIG,
2002). Jel fazda bulunan νas PO2- üzerindeki Mg2+’un fosfat gruplarını dehadrasyona
uğratma doğrultusundaki beklenilen etkisi burada görülmemektedir. Bu, 1115 ve 1137
cm-1 ‘de çıkması beklenilen sinyallerin yokluğundan ortaya çıkmaktadır (HAUSER,
1991; BINDER ve ZSCHÖRNIG, 2002). Fosfatidilkolinin karbonil grubunun
absorpsyon spektrumu üzerine ilginç etkilerin meydana geldiği görülmektedir. 1736.6
cm-1 ‘de görülen pik su ile etkileşmeye giren H-bağ ile bağlanmış karbonillerin
bulunduğunu göstermektedir. Mg2+ iyonları νC=O daha düşük dalga numaralarına
doğru götürmektedir. Bu etki, karbonil gruplarının iyonların hidrasyon tabakalarında
yer almalarından dolayı su molekülleri tarafından daha kolayca ulaşabilmelerinden
kaynaklanmaktadır. Buna bir alternativ olarak, bu etkinin lipidlerin polar fazlar arası
bölgede bulunduğundan, beraberinde lipid yapılarının faz değişimlerini de getirdiği,
karbonil gruplarında etkeleşme neticesinde meydana gelen konformasyonel
değişikliklerinden kaynakalanabileceği fikri de geçerli olabilir.
Mg2+ ile bağlanma, ayrıca lipidteki CH2 titreşimlerine de etki eder. Yukarıda
bahsedildiği üzere, yüzeysel su oluşumu, lipid-metal katyon ikilisinin oluşuşumunun
da önemli bir parçasıdır ve etkisi söz konusu spektrumda 3000-4000 cm-1
aralığındaki piklerden görülmektedir. Bu IR absorpsyonu, bu yüzeysel su oluşumuna
211
bağlıdır (POHLE, et. al., 2000). Lipid örneğinde kalan suyun etkisi, L-α-
fosfatidilkolinin difaransiyel taramalı kalorimetrik (DSC) termogramı ile de teyit
edilmiştir106.
Şekil 4.1. Taxol®’un çeşitli katı faz şekilleri. (Bk.:Jeong Hoon Lee, Un-Sook Gi, Jin-Hyun
Kim, Yongae Kim, Seon-Ho Kim, Hunseung Oh, and Bumchan Min. Preparation and
Characterization of Solvent Induced Dihydrated, Anhydrous, and Amorphous
106 Termodinamik teyit ile ilgili yorum ayrıca bu projenin ara raporunda da yer almaktadır.
212
Lipid yapısındaki polar kısmına özgü sinyaller veren C-H absorpsyon
bandlarıyla polar olmayan bölgede bulunan C-H grup titreşimlerinden kaynaklanan
sinyallerin birbiriyle örtüştüğünden, yaklaşımımda söz konusu spektrum
kıyaslamaları sadece Taxol® ve L-α-fosfatidilkolinin sinyallerinin (fosfat, karbonil ve
CH titreşimleri) çakışmadığı IR bölgelerinde yapılmıştır. Bu şekilde ayrıca, ikili
kompleks iki ayrı kompleks oluşumu ile (Taxol®-fosfolipid ve fosfolipid-Mg2+)
karşılaştırılmıştır. Tüm ikili kompleks oluşum IR absorpsyon spektrumları Şekil 3.2-
3.7 ve Tablo-4.1’de verilmiştir.
FTIR ölçümlerinde katı fazda ve sıvı fazda hazırlanan örneklerle çekilen
spektrumlarının kıyaslanması gerektiğine dair gerekçelerden daha önce
bahsedilmişti. KBr yönteminin ortamdan yan sinyallere neden olan suyun
uzaklaştırması gerektiğinden, bu tür FTIR ölçümlerinde önemli br yeri vardır.
Bunların geçerliliği ile ilgili hususlara daha önce verdiğim projemin ara raporlarında
yorumlar bölümünde de değinilmiştir. Projemizde şimdiye kadar yer verdiğim
neticeler KBr tablet yöntemiyle hazırlanan örneklerle elde edilmiştir. Ancak, hücresel
ortam katı değildir. Söz konusu hücresel ortamın sıvı ve akışkan olduğunu göz
önünde bulundurarak, tasarımımda yer alan aynı ölçümleri sıvı örneklerle kontrollü
nem ortamında hazırlanan ince tabaka lipid filmi ile çekilen FTIR spektral
analizleriyle devam etmek arzusundayım. Sıvı örnekleri için: Characterization of a
Cationic Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2,
4642-4650, (2000)., FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein
Struture in KBr Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141,
(1998) yayınlarda yer alan prosedürleri bir sonraki projemde esas alarak uygulamak
gerekmektedir107.
107 FTIR ölçümlerinde KBr pellet (tablet) ve sıvı örneklerin önemini vurgulayan ve birbirini tutmaları konusunda yapılan deneylerle ilgili şu kaynaklarda çok önemli protokol ayrıntıları bulunmaktadır: ANCHORDOQUY, T. J., Dean Allison, S., Molina, M. D. C., Girouard, L. G., and Carson, T. K., Physical
Stability of DNA-Based Therapeutics, Drug Disc. Today, 6, 463-470, (2001).
BANYAY, M., Sarkar, M. and Gräslund, A., A Library of IR Bands of Nucleic Acids in Solution,
Biophys. Chem., 104, 477-488, (2003).
213
BINDER, H., and Zschörnig, O., The Effect of Metal Cations on the Phase Behavior and Hydration
Charactersitics of Phospholipid Membranes, Chem. Phys. Lipids, 115, 39-61, (2002).
BLOOMFIELD, V. A., Crothers, D. M., and Tinoco, I. Jr., Nucleic Acids-Structures, Properties, and
Functions. University Science Books, Sausalito, CA 94965 (2000), Pp: 210-212.
BRUNI, P., Cingolani, F., Iacussi, M., Pierfederici, F. , and Tosi, G., The Effect of Bivalent Metal Ions
on Complexes DNA-Liposome: a FT-IR Study, 565-566, 237-245, (2001).
CLEMENT, J., Keifer, K., Kimpfler, A., Garidel, P., and Peschka-Süss, R., Large-Scale Production of
Lipoplexes With Long Shelf-Life, Eur. J. Pharmaceut. Biopharm., 59, 35-43, (2005).
FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr Pellets by Infrared
Söz konusu lipid fazın içeriğini doğal hücre membranlarda bulunan bileşiklere
benzerlik gösterecek şekilde seçerek ve tampon içeriğini, pH, pI ve T°C gibi
fizikokimyasal parametreleri de bu doğal hücre ortamında ölçülen değerlerde tutarak,
çeşitli lipid’e-bağlı ilâç konformasyonları araştırılabilir. Bu şekilde kovalent olarak
imobilize edilmiş lipozomların stabiliteleri, çeşitli ilâç ve terapötik nükleik asitlerin111
membranlara bağlanma afiniteleri ve fosfolipidlere bağlı nükleik asitlerin
kompaktizasyon özellikleri incelenmektedir. Bu tasarımımız, çok katmanlı
(multilamellar vesicles, MLV) veya tek katmanlı (unilamellar vesicles, ULV)
lipozomların veya veziküllerin kromatografik kolon jel matriksine (chromatographic
gel beads) kovalent bağlama süretiyle enjektör, pompa ve UV-detektör ile donatılmış
yüksek performanslı sıvı kromatografisi (high perfomance liquid chromatography,
HPLC) ile söz konusu fizikokimyasal parametrelerinin incelenmesine dayanmaktadır.
Bu şekilde kovalent112 olarak stabilize edilmiş fosfolipid vezikülleri çok daha
akışkandır ve doğal hücre membranlarına çok daha iyi bir yaklaşım ve modeli teşkil
edip, ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki etkilerini incelemek için çok daha
uygun bir sistemdir. Fosfolipidler, jel’e fosfatlarıyla fosfodiester bağ ve aktiv grubun
karbonat kısmıyla nükleofilik fosfat katalizi ile bağlanmaktadır. Biyomembran
ortamına yaklaştığı için imobilize edilmiş veziküllerde heterojen lipid katmanın elde
edilmesi tercih sebebidir. Bu tasarımda, tek lipid veya birkaç lipid karışımının
kullanıldığında genelde elektrostatik ve hidrofobik etkileşmeler meydana
gelmektedir. Böylece, bu tasarım sayesinde membran-ilâç arasında oluşan
kompleksin oluşma kinetiğini de incelemek mümkündür. Ayrıca, bu tasarım, serbest
iyonların ve membrana bağlı olarak işlev yapan çeşitli yüklü deterjanların nükleik asit
kondanzasyonu ve kompaktizasyonu gerçekleştiren ajanlar olarak lipid’e bağlı gen
taşıyıcı tasarımlarda da, fizikokimyasal özellikleri iyileştirilmiş moleküller olarak
111 Günümüzde birçok uluslararası bilimsel terminolojide olduğu gibi, bu projemizde de ilâç ile terapötik nükleik asit kavramları eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. 112 Kovalent bağlanma adı altında burada sadece kromatografik jel matriksine lipozomların bağlanması kastedilmektedir. Bu yöntem ile ilgili çok sayıda protokol ve tasarım vardır. Projemizde ise yenilik olarak bu tasarıma dayanarak kovalent olarak imobilize edilmiş lipozomal stasyoner faza bir de elektrostatik veya hafif kuvvetler veya hidrofobik etkileşmeleri kullanarak çeşitli katyonlar varlığında ilgili ligandları (ilâç, nükleik asit, protein vs.) bağlayarak elüasyonlarını sağlayarak spesifik olarak bu makromolekülleri saflaştırılması yer almaktadır.
249
diziliş ve konformasyon’a bağlı nükleik asitlerin saflaştırmasındaki yeri de
incelenebilmektedir.
Bu konu özellikle gen aktarımı öncesi yüksek miktarlarda saflaştırılması
gereken plazmid türleri için geçerlidir. Farmasötik formülasyonlarda kullanımları
için büyük ölçüde, miktarda ve saflıkta plazmid DNA’nın üretilmesi insan gen
tedavisi gibi birçok biyoteknolojik uygulamalar için esastır. Özellikle plazmid DNA
saflığı söz konusu olunca, plazmidleri daha yüksek bir dinamik bağlama kapasitesine
sahip ve iyileştirilmiş ve optimize edilmiş kromatografik kolon matrikslerinin
tasarımı çok büyük bir önem kazanır. Şu ana kadar saflştırma amacıyla uygulanmakta
olan poröz matrikslere bir alternativ olarak tasarımımızda geleneksel malzemelere
nazaran iyileştirilmiş hidrodinamik özelliklere sahip membran özellikli matrikslerin
uygulamaya yönelik hususlar vurgulamaktadır. Bu bağlamda, çeşitli nükleik asit
konformasyonları fizikokimyasal ve stereokimyasal olarak ayrıştırabilen kontrollü
DNA presipitasyonlarını gerçekleştirerek tasarımımızda tek ve çift zincirli DNA’ların
saflaştırmasına da yer verilmiştir. Böylece DNA işlevsel yüzeyin yaratılmasında ve
daha sonra bu lipozomal yüzeyinde nükleik asit imobilizasyonu için kullanılabilir.
Genomik ve plazmid DNA veya RNA arasındaki ayrışım kullanılan katyona bağlı
olarak farklı kompaktizasyon globülü meydana geleceğinden mümkün olmaktadır. Bu
tasarım, yine negativ yüklü DNA ile yüksüz (nötr) veya pozitiv yüklü lipidleri çift
valanslı katyonlar (Mg2+, Ca2+, vs.) aracılıyla bir araya getiren elektrostatik
etkileşmelerinin uygulanmasına dayanmaktadır. Diğer yandan, elektrostatik
kuvvetler dışında DNA-lipid oluşumu bazlarla matriksteki ligand-taşıyan gruplar
arasında hidrofobik etkileşmeler sayesinde de meydana gelidiğinden söz konusu
konformasyonlar arası ayrışım ters-fazlı sıvı kromatografisi (Reverse Phase Liquid
Chromatography, RPLC) ile de inclenebilinmektedir. Bu durumda, bağlı olan
polinükleotidler hidrofobik bir özellik olan yükselen hidrofobisiteye göre elüe
olmaktadırlar. Böylece, daha yüksek moleküler ağırlığa sahip nükleik asitler RPLC
kolonunda daha uzun bir süre kalacaklardır. Sonuç olarak, bu tasarım sayesinde tek
sarmallı DNA’yı plazmid DNA’dan ve çift sarmallı DNA’dan saflaştırmak mümkün
olur. Süpersarmallı plazmid DNAlar genelde gen nakli için en uygun malzeme
olduklarından kromatografik yaklaşımların en önemli amacı bu konformasyonu diğer
plazmid konformasyonlardan ayrıştırmak ve saflaştırmaktır.
veya fosfat kısmındaki çeşitli pozisyonlarda bağlanmaktadır. Gen transkripsiyonu, ve
translasyounu, virüs-hücre etkileşmeleri, nükleositoplazmik transport ve hücre
bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda rol oynayan proteinlerin büyük bir
bölümü öncelikli olarak tek zincirli veya çift zincirli nükleik asit dizilişlerine
bağlanmayı tercih ederler. Bu olaylarda önemli rol oynayan makromoleküller
membrana-bağlı olarak işlev yapmaktadır. Böylece, bu olayların moleküler
mekanizmalarını ortaya çıkarmak, bu kilit moleküllerin saflaştırmasına bağlıdır. Bu
da yeni nükleotid dizilişi ve konformasyona spesifiklik gösteren kromatografik
nükleik asit saflaştırma tasarımlarını zorunlu kılar. Mekanizmaya özgü bir afinite
kromatografi tasarımını şematik olarak geliştirebilmek son derece önemlidir.
İmobilize afinite lipozom-ilaç ve lipozom-nükleik asit kromatografisi konusunda
çalışmalarım yoğun olarak devam etmektedir ve yeni bir araştırma projesi olarak
sunulacaktır.
251
4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak
Çalışmalar
Bu projemle ortaya çıkarılan Taxol®-membran fosfolipid etkileşmelerinden
yola çıkarak burada sunulan modelleri in vivo ortamda denemek. Amacım, bu şekilde
karakterize edilen antikanser ilâç-lipid bileşenlerinin fizikokimyasal parametrelerine
dayanarak bu kontrollü ilâç taşıyıcı tasarımını lipidler aracılıyla gerçekleştirilen in
vivo deneylerde denemek suretiyle iyi ve güvenilir bir model terapötik Taxol®
formülasyonu elde etmek. Bunun için uluslararası düzeyde ortak çalışmalara girmeyi
ümit etmekteyim. Ancak, in vitro ve in vivo ortamda söz konusu formülasyon
çalışmalara girmenin koşulu ilk önce bu formülasyonların fizikokimyasal
karakterizasyonudur ki bunu da projemiz yüzey kimyasal, kolloid ve biyofiziksel
yaklaşımlar kullanarak başarıldığını inanmaktayım. Bu ön verilere dayanarak bu
konuyu çok daha iddialı boyutlara taşımayı arzuluyorum. İleriye yönelik yurt dışı
ortaklarımızla yapmayı planladığımız deneyler kısaca şunlardır:
• Öncelikle, fakültemizde şu ana kadar atık sorunu tehlikesi yüzünden
radyoaktiv bileşenlerle çalışmaların mümkün olmadığından, sözü edilen lipozom-
hücre etkileşmelerinin radyoaktiv lipid markerleri kullanarak incelemeyi
planlamaktayım. Örneğin, lipozomları radyoaktiv [3H]kolesteril ester ve kolesteril
[14C]-oleat işaretleriyle çifte işaretleyerek lipozomların intraselüler akıbeti hakkında
çok önmeli bilgiler elde edilebilir. Radyoaktiv işaretleme yöntemine bir alternativ
olarak piyasada uzun yıllardan beri bulunan lipidlere spesifik floresan işaretler
kullanılabilinir. Ayrıca, lipozomların iç hacminde enkapsüle edilmiş şekilde bulunan
DNA’nın kompaktizasyonu konvansyonel floresan mikroskopisi ile veya konfokal
lazer taramalı mikroskopisi (confocal laser scanning microscopy) ile incelemek çok
önemli bilgiler vermektedir. Örneğin, lipozom lipidlere spesifik olan FM 4-64
uygulandığında bu biyomoleküllerin dinamiği hakkında bilgiler vermektedir
(SÜLEYMANOĞLU, 2002).
• Projemin bir sonraki aşaması hücre kültürlerinin kullanılması ile ilgilidir.
Ancak, bu konu ile ilgili uygulanacak olan protokol hücre türüne göre spesifiklik
252
gösterdiğinden, in situ olarak elde edilecek olan neticeleri çok dikkatlice
değerlendirilmeli, çünkü her hücre türü kendine özgü ilâç internalizasyon kinetiği
göstermektedir. Diğer yandan, hücre kültürlerinin kullanılmasının büyük avantajı bu
hücre kültürlerini piyasadan edinebilme kolaylığı ve yapılmakta olan deneylerin
kontrol edilebilme fırsatıdır. Örneğin, hücre kültürü düzeneğini kullanarak kan ve
kan bileşenlerinin (serum, plazma ve çeşitli proteinler) veya farklı reseptörlerin
lipozom-hücre etkileşmelerine etkilerini ortaya çıkarmayı planlamaktayım.
• Bu projemde, nötr fosfolipidlerlerin yanı sıra negativ yüklü fosfatidilserin-
veya fosfatidilgliserol içeren lipozomların çeşitli hücre kültürleri ve türleri ile yapılan
araştırmalarca farklı hücre-lipozom etkileşmelerinin ve özellikle bağlanma
afinitelerin söz konusu olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzden bu projede yapılan tüm
ön fizikokimyasal ölçümlerini farklı yük taşıyan lipidleri kullanarak lipozom
bileşenlerinin bağlanma afiniteleri, intraselüler salınımları ve hücre içi akıbetlerini
incelemeyi hedefliyorum.
• In vitro protokoller ortam sıcaklığına göre son derece duyarlıdır ve anlamlı
deneylerin yapılabilmesi için ortam sıcaklığının optimize edilmesi gerekmektedir.
Örneğin, bazı hücre kültürleri 4°C en etkili ilâç internalizasyon oranı gösterirken
diğer hücre türleri 37°C’de en yüksek oran gösterirler. Bu bakımdan, in vitro
deneylerini farklı ortam sıcaklığında gerçekleştirerek termodinamik olarak en etkili
transfeksyon ortamını tespit etmeyi düşünmekteyim. Bu kısmen bu projemde de
sirkülatörlü su pompasının alınmasıyla yapılmıştır.
• Ortaklarımızla müşterek olarak yapmayı planladığım projemizin ileriye
dönük boyutlardan biri de elde edilen in vitro verilerini in vivo ortamda denemektir
ve böylece in vitro – in vivo korelasyonlarını incelemektir. Bunun için sıçan ve rat
modellerini kullanarak in vivo ortamda lipozomların klirıns hızı ile ilgili
farmakokinetik veriler elde edilebilinir. Bunun için bröşürü Ek-17’e verilen in vivo
imaging cihazlarının alımı da uygun görülmüştür.
• Bir sonraki aşama olarak, projenin gidişatına göre lipozomların kinetiğini ve
doku dağılımlarını ve intra-organ dağılımlarını radyoaktiv ve/veya floresan işaretleri
kullanarak araştırmayı hedefliyorum.
253
Bu uzun vadeli çalışmalara dahil edilebilmemiz için bir önkoşul olan söz
konusu bileşenlerinin fizikokimyasal karakterizasyonu doğrultusunda, ilâç-lipid
kompleks oluşumunun daha mütevazı ancak çok orijinal bir yaklaşım olan FTIR
spektroskopisi, termodinamik ve yüzey kimyasal ölçümleri kullanarak elde etmiş
bulunmaktayım. Bu ölçümlere dayanarak, daha uzun vadeli ve uluslararası boyutu
olan projelere katılmayı ümit ediyorum. Bu konuda daha önce çalıştığım çok iyi
laboratuvar donanımlı araştırma grupları ile temas edilmiş ve çok olumlu yanıtlar
alınmıştır∇. Böylece, projemin ara raporunda da bahsedildiği gibi çalışmalarımızın
nanoteknolojik boyutuna ulaşılmış olunacak ki, bu Avrupa Birliğinin 7ci Çerçeve
Programında proje öncelik sıralamasında ilk yerlerde bulunan bir konu olarak bize
uluslararası projelere de dahil edilmemizi sağlayacaktır ∏.
4.7.3. Öncü Hipotez
Projemde geliştirilen hipotez ile ilgili burada sadece genel bilgiler
verilmektedir. Bu hipotezin dayanaklarına burada geniş olarak yer verildiği takdirde
bu raporun hacmi çok fazla artacaktır. Ancak, buradaki kısa bilgiler bile bu hipotezin
iyi anlaşılmasına yeterli olacağı kanısındayım.
Bu projemde geliştirilen Taxol®-hücre membranı etkileşme modellerine
dayanarak bu ilâcın yeni etki mekanizmalarının ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Bu
bağlamdai bu antikanser ilâcın membran akışkanlığını düzenleyerek başka bir etki
mekanizmasının daha mümkün olabileceği öngörülmektedir. Bunun için, bu ilâcın
sitotoksisitesini wild-type ve multidrug resistant (MDR) hayvan hücrelerinde
inceleyerek önemli kemoduyarlılık mekanizmalarının ortaya çıkarabilme imkânlarına
bağlıdır. Bu bağlamda, hipotez modelini oluşturmak için önce literatürde bulunan
mevcut bulgulara dayanarak ve ileride bu tür düzeneklerin Fakültemizde de
kurulmasıyla bu tür modellerin geçerliliğini inceleme fırsatı bulunacaktır. Örneğin,
hipoteze göre, Taxol®’un P-glikoprotein (Şekil 4.28) üzerinden değil de, farklı bir
mekanizma ile kemoduyarlılık sitotosisitenin meydana gelmesinde rol oynamaktadır.
∇ Bu konu ile ilgili çok kapsamlı uluslararası projem Ek-16’da verilmiştir. ∏ Projemizin uluslararası boyutu ve bu konuda hedeflerimiz ve beklentilerimiz ile ilgili ayrıntılı gerekçelere ayrıca ara raporumuzda yer verilmişti.
254
Bu modeli test etmek için reserpine ve verapamil gibi birçok kemoduyarlılığı
meydana getiren molekül kullanılabilir. Eğer bunların uygulanması, P-gp
bulundurmayan karsinom hücrelerindeki Taxol®’un birikmesine yol açtıkları tespit
edilebilirse bu teklif edilen mekanizmanın bir kanıtı olarak sunulabilecektir. Çünkü
bu bulgular, kemoduyarlılık yolları üzerinden etki gösteren ve P-gp’inden bağmsız
olarak ortaya çıkan membran geçirgenliğinin artmasına ilişkin başka verilele de
desteklenecektir. Ancak, bunu ortaya çıkarmak çok iyi çalışılmış Taxol®-
biyomembran etkileme incelemelerine dayanmaktadır. Bunların bir başlangıç
nktasını bu proje ile başlamış bulunmkatayız. Bu projemde vurgulanan hususlar
doğrultusunda membran akışkanlığını arttıran bazı moleküller gibi kemoduyarlılığı
arttıran moleküller (chemosensitizers) de doza ve konsantrasyona bağlı olarak söz
konusu akışkanlığının artmasına neden olmaktadır. Bu olgu, örneğin DPH
polarizasyon gibi floresan spektroskopik yöntemlerle hem lipozomlarda hem d ewild-
type ve MDR hayvan ve insan hücre membranları üzerinde test edilebilir. Böylece, bu
tür chemosntitizer moleküllerin lipid katmanlatın geçirgenliğini arttırıcı etkileri ile
anti-kanser ilâçlar karşı başlattıkları sitotoksiste arasında önemli korelasyonlar
bulunmaktadır. Sonuç olarak, bu hipotezde chemosentisizerler aracılıyla
biyomembranların yapılarında akışkanlığın değişime uğraması ve geçirgenliklerinin
artması gibi olayların, bu tür hücrelerde Taxol®’un sitotoksisitesini ortaya
çıkmasında önemli rol oynayabildiklerini teklif edilmeltedir. Bu konuda yapılacak lan
ek incelemelerin yeni tedavi profillerinin de geliştirilmesine katkı sağalayacaktır
(Şekil 4.29).
255
Şekil 4.28. P-glikoprotein (P-gp) membran üzerinden hücre dışına ilâç
moleküllerini pompalayarak kemotedavilerinin etkinliğini önemli ölçüde
düşürmetedir.
256
Şekil 4.29. Antikanser ilâç-tümör hücre etkileşmeleri.
257
4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim
Fakültemizde göreve başladığım tarihten hemen sonra, 04.Şubat.2004 günü
bir Fakülte toplantısı düzenlenmiş, bu toplantıda o zamanki yönetim tarafından
tarafıma ve beraber çalıştığım diğer 2 uzman arkadaşıma mevcut laboratuvar
durumumuzun çok kötü olduğundan somut projeler üretmemiz konusunda talimatlar
verilmiştir. Ayrıca da, bu projelerde suiistimalleri engellemek amacıyla kesinlikle
öğretim üyelerinin yazılmaması gerektiği talimatı da tarafımıza verilmiştir. Bana
verilen bu talimatları aynen uygulayıp bu proje hazırlanmıştır. Fakültemizdeki tüm
kürsülerimize hizmet veren Merkez Laboratuvarın mevcut altyapısını güçlendirmek
amacıyla, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje olmasına özen gösterilmiştir.
Cihaz seçiminde de son derece dikkatli davranılmıştır. Her kürsünün istifade
edebileceği bir cihaz projesi hazırlanmıştır. Bu benim Türkiye’de ilk projem
olduğundan daha kısa süreli bir proje olarak hazırlanıp, bu projede elde edilen
bulgulara dayanarak çok daha kapsamlı, uzun vadeli, yüksek bütçeli ve uluslararası
katılımlı bir proje daha hazırlanmıştır (Bk.: Ek-16). Bunun için tarafıma yurt içinden
ve yurt dışından yapılan ortak çalışma başvurularını da (Bk.: Ek-15) değerlendirip
ulusal ve uluslararası proje sponsorlarına başvurulması uygun görülmekteyim. Ancak
bu şekilde, uzun vadeli bir proje desteği ile şu andaki durum (Bk.: Ek-1 ve Ek-2)
iyileştirilebilecektir. Bu doğrultuda, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett cihazına
eklenebilecek bazı cihazların alımı ile bu çalışmalarımın niteliği yükseltilebilecektir.
Bu bağlamda, daha 2 sene önce bu cihaza eklemek üzere yine yüzey analizlerde yoğun
olarak kullanılan Atomik Kuvvet Mikroskopu (Atomic Force Microscopy-AFM) veya
yüzeylerde faz değişimlerinin araştırılmasında kullanılan Brewster Angle Microscopy
(BAM) sistemlerinin alınması ile ilgili projeler hazırladım. Ancak, söz konusu
mikroskopi sistemleri temiz bir ortama bağlı olarak çalıştırılmaktadır. Oysa
Fakültemizde henüz daha temiz (tozsuz) bir odamız yoktur. Bu yüzden bu projelerimi
böyle bir odanın yapımından sonrası için ertelenmiştir. O zamana kadar Fakültemize
daha faydalı olabilecek ve çok orijinal alternativler üzerinde çalıştım ve bundan böyle
geliştirmek istediğim laboratuvar donanımını şöyle sıralamaktayım. Tüm ilgili
bröşürler sırasıyla E-17’de verilmiştir.
İlk önce, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett sistemine ek olarak bir Dip
Coaters parçalarının alınması uygun olur. Söz konusu parçalar, çalışılan düzenek
258
çözeltilerine son derece hassas olarak substratların uygulanmasını sağlamaktadır.
Böyle bir ek sistemin monte edilmesi çalışmalarımızdaki hassasiyeti arttıracaktır.
Çalışmalarımıza termodinamik boyut kazandırmak amacıyla termal analiz
cihazlarının getirilmesi için gereken girişimlerde bulunulmuştur. Bu doğrultuda bir
Isothermal Titration Calorimeter cihazın alınması için başka bir proje
hazırlanacaktır. Söz konusu cihaz şu ana kadar kullandığım Differential Scanning
Calorimetry cihazlarından çok önemli üstünlüğü vardır. Örneğin, Isotehrmal
Titration Calorimetry ile ligand bağlama kinetiği ölçülmektedir ve bu çok önemli
bilgiler vermektedir.
Bir sonraki proje hedefim bir Confocal Fluorescence Microscopy
sistemidir. Söz konusu mikroskopi sistemi, bu proje ile alınan Langmuir-Blodgett tek
katman sistemine inverted versiyonu olarak eklenebilmektedir. Bu sisteme ayrıca
da Epifluorescence Microscopy sistemi de eklenebilmektedir. Bu
mikroskopilerin eklenmesi model tek katman membran çalışmalarında son derece
önemli bilgiler verecektir, çünkü bu sistemler uygun floresan işaretlerin yardımıyla
doğrudan fosfolipid akışkanlığının incelenmesini mümkün kılacaktır. Bunun bilimsel
gerekçeleri de şöyle sıralanabilir. Daha 1960lı yıllarda Almanya’da Ruska’nın
keşfettiği elektron mikroskopisi hücre biyolojisinde çok önemli rol oynamıştır.
Örneğin, virüs ve fajların bakteri yüzeyindeki yapılarını incelenmesini mümkün
kılmıştır ve birçok intraselüler organellin yapısını aydınlatmıştır. Ultrasantrifüjün
kullanıma girmesiyle bu mikroskopi yöntemi moleküler hücre biyolojisinin ve
biyokimyanın gelişmesine olağanüstü bir katkıda bulunmuştur. Ancak daha sonraları
araştırıcılar tarafından bazı uygulamaları kuşku uyandırmıştır. Örneğin, bu
mikroskopi sisteminde kullanılan sert muameleler (-94°C ortamı ve OsO4 ile
fiksaksiyon işlemleri) birçok biyolojik molekülleri olumsuz etkilemektedir. Çünkü
doğada böyle ortamlar zaten yoktur. Her nekadar elektron mikroskopisinin TEM
(Transmission Electron Microscopy) versiyonu özellikle boyut analizi için günümüzde
de kullanılıyorsa da, bu mikroskopilerle elde edilen görüntüler bu sebeplerden dolayı
artefakttır (yapaydır). Buna karşılık, floresan mikroskopisinin çok önemli üstünlüğü
bulunmaktadır. Örneğin, Gren Fluorescence Protein (GFP)-plazmidlerle klonlanan ve
hücresel ekspresyonu gerçekleştirilen bir proteinin söz konusu hücreyi hiç
öldürmeden hücre kültürü ortamında protein dinamiğini live cell imaging olarak
259
görüntülemek mümkündür. Anlaşılacağı üzere yaşayan hücrelerle çalışmak çok
önemlidir. Ayrıca da, BODIPY türü gibi lipid floresan işaretler kullanarak fosfolipid
veziküllerin (lipozomların) (Bk.: Ek-9) şeklini ve akışkanlığını incelemek mümkün
olmaktadır. Şimdiye kadar adı geçen cihazlar Langmuir-Blodgett tek katman
sistemine doğrudan eklenebilinmektedir. Bu sistem ile elde edilen veriler ve
geliştirilen modeller daha sonra in vivo ortamda uygulanabilmelidir ve geçerlilikleri
ispat edilmelidir.
Bu bakımdan, Fakültemizde bir hücre kültürü düzeneğinin kurumasından
sonraki proje amacım Raman Mikroskopi sisteminin getirilmesi. Bunu da, uzun
vadeli proje desteği ve Avrupa’daki eski hocalarımın da projelere katılımıyla bir İlâç-
Hücre Etkileşmeleri konulu uluslararası proje kapsamında getirilmesini uygun
görmekteyim, çünkü böyle bir sistem 220 000 Avro’luk bir desteği de gerektirecektir.
Ancak bu pahalı sistemin çok önemli avantajları vardır. Örneğin, her ne kadar
floresan mikroskopisi yaşayan hücredeki yapıları görüntülüyor olsa da bu yöntemde
ortaya çıkan “photobleaching” olayı tek başına hücreleri öldürebilmektedir. Bu
yüzden, bir yapı görüntülenir görüntülenmez hemen başka bir bölgeye mikroskopi
okularının yönlendirilmesi gerekmektedir. Dolayısıyla da deneyimli personele ihtiyaç
vardır. Kanımca, buna alternativ olarak böyle bir sorunu olmayan Raman
Mikroskopisi teklif edilmelidir.
Buraya kadar adı geçen cihazların her biriyle ilgili uluslararası tecrübem
bulunmaktadır ve herhangi bir eğitim için zaman kaybedilmeyecektir (Ek-18). Ancak,
tüm bu projelerin başarıyla tamamlanması Fakültemizdeki statümün özerkliğine ve
suiistimallerin engellenebilmesine bağlıdır. Herkesin projelere müdahale ettiği ve
suiistimal etmeye çalıştığı bir noktada zaten Avrupa’daki ortaklarımın bunlara
katkıda bulunmaları söz konusu olamaz.
260
5. SONUÇ
Bu projemde, kemoterapilrde yoğun olarak kullanılan Taxol®’un (Paclitaxel’in)
model olarak uygulanan fosfolipid yapılarıyla etkileşmeleri moleküler düzeyde
incelenmiştir. Yüzeyin fizikokimyasal karakterizasyonu ve farklı ilâç-lipid
bileşimlerinin yapı ve termodinamik özelliklerinin aydınlatılması için Langmuir-
Blodgett tek katman, Fourier Transfrom Infrared (FTIR) Spektroskopi ve
Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik ölçümlerinde yararlanılmıştır. Örneğin
hazırlanmasının, lipid türünün, ilâç konsantrasyonunun gözlemlenen bu özellikler
üzerinde belirleyici etkileri vardır. Fosfatidilkolin tarafından Taxol®’un tanınması,
lipid baş gruplarınca yüzeyin tanınması, başlangıç, değişim öncesi ve ana faz değişim
dereceleri ve açil zincir gruplaşması gibi sonuçlara yol açarak model membran
yüzeylerinin fiziksel parametreleri üzerinde sıvılaştırıcı ve akışkanlığı arttırıcı etkileri
olduğu ortaya çıkarılmıştır.
Projemdeki vurgu Taxol®’un model hücre membranlar üzerindeki etkileri
hakkında yoğunlaşmış olmasına rağmen, tümör tedavisi denemelerinde hayati önem
taşıyan ilâcın etki mekanizmasındaki biyofiziksel olguların anlaşmasına katkı
sağlayabilecek sonuçlar elde edildiğini ümit etmekteyim. Bu iki yaklaşımın doğasına
uygun olarak kullanılan deneysel tasarıma uygun düşen bir öncü hipotez ve öneriler
de ayrıca tanımlanmıştır.
Projemi de önceden öngörülen zaman içerisinde gecikme yaşanmaksızın
tamamlamış bulunmaktayım. Benden kaynaklanan herhangi bir gecikme söz konusu
değildir. Tüm eksikliklere ve özellikle de temiz (tozsuz) ortamın olmamasına rağmen,
projemin başarıyla tamamlanmış olması da buaradaki neticelerin, bu raporumda yer
verdiğim ve daha önce böyle tozsuz ortamda yapmış olduğum ölçümlerle
kıyaslamalarından da görülmektedir. Sonuç olarak, yapılması son derece zor olan
ölçümler tamamlanmış olup, yeni bir düzenek Fakültemize başarıyla kurulmuştur ve
sadece Fakültemizde değil, Ankara’da bulunan diğer araştırmacılara da hizmet
vermek üzere hazır tutulmaktadır.
261
Ekler Listesi
Ek-1: Öğretim Elemanı Başına Düşen Makale Sayısına Göre Üniversite Sıralamasındaki Üniversitemizin Yeri Ek-2: Bologna Süreci Durum Değerlendirme Raporu, 2005-2007 Ek-3: Tübitak Avrupa Birliği 7. Çerçeve Programı: Nanobilimler, Nanoteknolojiler, Malzemeler ve Yeni Üretim Teknolojileri Ek-4: Gazi Üniversitesinde Nanotıp Üssünün Kurulması ile ilgili Karar Ek-5: Taxol® (Paclitaxel) ile ilgili Güncel Referanslar Ek-6: Gen Aktarımı ile ilgili Güncel Referanslar Ek-7 Taxol® (Paclitaxel’in) Fizikokimyasal Özellikleri Ek-8 Taxol®’un Sentezi Ek-9 Lipozom Hazırlama Yöntemleri Ek-10 Tek Katmanlı Lipozomların Hacmi, Çapı, Sayıları, Alanları ve Lipid Ağırlığı Arasındaki İlişkiyi Gösteren Bir Nomogram Ek-11 NIMA Technology Ltd.’in ürettiği Langmuir-Blodgett cihazları Ek-12 Langmuir-Blodgett Tek Katman Cihazın Teknik Özellikleri
Ek-13 Langmuir-Blodgett Yüzey Kimyasal ve Kolloid Düzeneklerin Teorisi
Ek-14 Kemoterapilerde Kullanılmakta Olan Diğer Güncel Anti-Kanser İlâçlar
Ek-15 Tarafıma Yurt İçinden Ve Yurtdışından Gelen Ortak Çalışma Başvuruları
Ek-16 Avrupa Birliği Destekli Proje Çerçevesine Hazırladığım Çok Katılımlı
Uluslararası Ve Uzun Vadeli Proje
Ek-17 Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim
BOUSSIF O., Lezoualc’h F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B.,
et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and
in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad Sci USA, 92(16), 7297–301, (1995). [10]
BRAUN C. S., Vetro J. A., Tomalia D. A., Koe G. S., Koe J. G., Russell Middaugh C.,
Structure/function relationships of polyamidoamine/DNA dendrimers. as gene
delivery vehicles. J Pharm Sci , 94 (2), 423–36, (2005). [11] WANG J., Zhang P. C.,
Mao H. Q., Leong K. W., Enhanced gene expression in mouse muscle by sustained
release of plasmid DNA using PPE-EA as a carrier, Gene Ther,9 (18), 1254–61,
(2002). [12] AKINC A., Lynn D. M., Anderson D. G., Langer R., Parallel synthesis and
biophysical characterization of a degradable polymer library for gene delivery, J Am
Chem Soc, 125 (18), 5316–23, (2003). [13] NEU M., Fischer D., Kissel T., Recent
advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and
its derivatives, J Gene Med, 7 (8), 992–1009, (2005). [14] SCHAFFER D. V.,
Fidelman N. A., Dan N., Lauffenburger D. A.. Vector unpacking as a potential barrier
for receptor-mediated polyplex gene delivery, Biotechnol Bioeng., 67(5), 598–606,
(2000). [15] AGARWAL A., Unfer R., Mallapragada S. K., Novel cationic pentablock
copolymers as non-viral vectors for gene therapy. J Control Release,;103 (1), 245–58,
(2005). [16] REINEKE T. M., Davis M. E., Structural effects of carbohydrate-
containing polycations on gene delivery. 1. Carbohydrate size and its distance from
charge centers, Bioconjug Chem, 14 (1), 247–54, (2003). [17] POPIELARSKI S. R.,
Mishra S., Davis M. E.. Structural effects of carbohydrate-containing polycations on
gene delivery. 3. Cyclodextrin type and functionalization, Bioconjug Chem,14 (3),
672–8, (2003).
Ek-9 LİPOZOM HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ63,64
63
Bu bölümde lipozomlarla ilgili sadece genel bilgiler yer almaktadır. Modern farmasötik biliminde çok sayıda kullanım alanlarıyla ilgili güncel makalelerin ve derlemelerin de bulunduğu Referanslar listesine başvurulmalıdır.
307
Lipid Vezikülleri (Lipozom) Hazırlama Yöntemleri
Lipozomlar veya veziküller üç boyutlu olmaları itibariyle doğal hücrelere
benzeyen fosfolipidler gibi amfifilik (Şekil E5.1) moleküllerin kendi kendine
oluşturdukları (self-assembling) yapılara sahip yuvarlak agregatlardır. Lipozomlar ilk
olarak A. D. Bangham65,66 1960lı yıllarda keşfedildiler. Yüksek biyoyararlılıkları ve
çeşitli molekül ve maddelerin vezikül hacmi içinde yüksek miktarda enkapsüle
64 Bu bölümün hazırlanmasında: Wang, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery:
Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons,
Inc., (2005), Pp: 411-434; Kobayashi, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery,
In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John
Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318; Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug
Delivery: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005)’dan yararlanılmıştır.
65
Bangham, A. D., Horne, R. W., Nature, 196, (1962), 952-953. 66
Bangham, A. D., Horne, R. W., J. Mol. Biol., 8, (1964), 660-668.
308
edilebilmeleri bakımından, lipid vezikülleri o yıllarda mükemmel bir ilâç taşıma aracı
olarak değerlendirilmişlerdir.
Lipozomların çeşitli türleri (MLV, SUV, LUV, FRV) uygulanmakta olan birçok
yöntemi kullanarak hazırlamak mümkündür (Şekil E5.2 ve E5.6). Projemizde çok
popüler bir yöntem olan “hand-shaken vesicles preparation” yöntemi uygulanmıştır.
Lipozomların herhangi bir formülasyonunu hazırlamak için lipid moleküllerini önce
sıvı ortamına aktarmak gerekmektedir. Orijinal prosedüre uygun olarak, ince tabaka
lipid filmi yuvarlak balon jojeye konulmak suretiyle bunların daha sonra sıvı
ortamında çalkalanması ve çözülmesi sağlanmaktadır (Şekil E5.3 ve E5.4).
İlâç formülasyonları, gen taşıyıcıları ve kanser tedavilerinde kullanılan çeşitli
farmasötik bileşenlerinin enkapsülasyonu gibi alanlardaki uygulanmaları dışında,
lamelar veziküller biyomembran modelleri olarak da çok önem kazanmışlardır
özellikle bağışıklık sisteminin fagositlerine yönelik ilâç hedeflendirilmesinde etkilidir.
Lipozomlara dayalı ilâç taşıyıcısistemleri terapötik endeksi ve biyoyararlılığı
iyileştirebildikleri gibi, kontrollü salınım sistemlerinin etkinliğini artırırlar ve
toksisiteyi düşürürler. Bu bileşenler, antikanser, DNA ve proteinlerin, diabet ve
kardiyovasküler hastalıklara karşı ilâçların taşıyıcıları olarak kullanılmışlardır.
Keşfedildiklerinden itibaren, birçok lipozomal formülasyon klinik araştırmalarda
uygulanmıştır ve birkaç başarılı lipozom’a dayalı ilâç formülasyonu patent olarak
Food and Drug Administration (FDA) tarafından kabul edilmiş ve
ruhsatlandırılmıştır. Bunlar arasında doxorubicin (Doxil ve Myocet), daunorubicin
(DaunoXome) gibi antikanser ilâçları ve mantarlara karşı kullanılan amphotericin B
(AmBisome, Amphotect, ABELCET) formülasyonları örnek olarak verilebilir. Bu
ilâçların lipozomal formülasyonları önemli ölçüde toksisiteyi düşürmüşlerdir ve etken
maddelerin etkinliğini korumuş veya yükseltmişlerdir.
Son yıllarda lipozomlar viral olmayan gen taşıyıcı tasarımlarında da yoğun
olarak yer almakta ve uygulanmaktadır67.
67 Bkz: Referanslar listesini.
309
Ancak, lipozomal ilâç ve gen taşıyıcı sistemlerinin terapötik potansiyellerine tam
olarak henüz daha ulaşılamamıştır. Bunun nedenlerinden biri, bu taşıyıcı sistemlerle
karşılaşılan birçok tasarım ve uygulama sorunlarının olmasıdır. Bu sorunlar arasında
sabitlilik, salınım zamanı ve hızı, formülasyon maaliyeti, kısa süren biyoyararlılık ve
birçok ilâçla etkisiz etkileşmelerin olduğu durumlar sayılabilir. Ayrıca, sirkülasyonda
sabitliliğini destekleyerek aynı zamanda söz konusu ilâçın hedef dokudaki
biyoyararlılığını seçici olarak artırmak çok güçtür (WANG, 2005).
1. Vezikül Oluşumunun Mekanizması.
Lipozomlar (lipid vezikülleri) ince tabaka lipid filmlerinin veya diğer lipid
yüzeylerinin hidrasyonu sonucu oluşurlar (Şekil E5.1). Bu yapılarda sıvı kristal
şeklinde bulunan lipid katmanları akışkan hale gelir. Hidrasyonu meydana gelmiş
lipid katmanların agitasyon ve çalkalama esnasında bulundukları balon jojenin veya
kabbın iç yüzeyinden ayrılırlar ve daha büyük yuvarlak çok katmanlı veziküller (Large
Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur. Kenarlarda katmanın hidrokarbon kısmının su
ile etkileşmeleri engellendiğinden, bu yapı termodinamik açıdan da bakılacak olursa
çok sağlam ve sabittir. Parçacıkların oluşumundan sonra boyutlarının
düşürülmesisonik enerjinin (sonication) veya mekanik enerjinin (extrusion)
harcanmasını gerektirmektedir.
2. Lipozom Hazırlama Yöntemleri.
Lipid formülasyonların özellikleri lipid içeriğine (katyonik, anyonik veya nötr
lipidler) bağlıdır, ancak, aynı hazırlama prosedürü tüm lipid veziküllerin
hazırlanmasında lipid türü önem taşımaksızın uygulanabilmektedir (Şekil E5.2).
Genel olarak, prosedür hidrasyon için lipidin hazırlanması, eşzamanlı
gerçekleştirilen hidrasyon, agitasyon ve çalkalama ve veziküllerin homojen
dağlımının sağlanması için yapılan boyutlandırma aşamalarından ibarettir.
310
Şekil E5.1: Lipozomların genel yapısı. Kaynak: www.cem.msu.edu/~reusch/
VirtualText/lipids.htm
Şekil E5.2: Çeşitli lipozom formülasyonlarının hazırlama yöntemlerini özetleyen
genel klasifikasyon. SUV, small unilamellar vesicles; MLV, multilamellar vesicles;
LUV, large unilamellar vesicles; FRV, freeze-drying rehydration vesicles. Kaynak:
LASCH, J. Weissig, V. and Brandl, M. Preparation of liposomes, In: Liposomes. A
311
Practical Approach, 2nd Ed. (Torchilin Vl. P. And Weissig, V., Eds.), Oxford
University Press, (2003), Pp: 3-29.
a. Hidrasyon İşlemi.
Lipid karışımlarından oluşan lipozomları hazırlarken, lipidler ilk önce organik
çözgende çözülmeli ve homojen lipid karışımının elde edilmesi için iyice
karıştırılmalıdır. Genelde, bu işlem kloroform veya kloroform:metanol karışımı
kullanılarak gerçekleştirilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Burada amaç, lipidlerin tam
olarak karışımını sağlamak için temiz lipid çözeltinin elde edilmesidir. Genel olarak,
lipid çözeltileri 10-20 mg lipid/ml organik çözgen konsantrasyonunda hazırlanır.
Ancak, lipid çözünürlülüğü veya lipidlerin tam olarak karışımı isteniliyorsa, daha
yüksek konsantrasyonlarla çalışmak avantajlıdır (TORCHILIN, et. al., 2003). Organik
çözgende lipidlerin çözülmesinden sonra, bu çözücüyü azot veya argon gazı ile
uzaklaştırarak ince lipid filmi elde edilir. Daha küçük organik çözgen hacimleri ile
çalışılıyorsa (<1 ml), bu işlem iyi neticeler verir (TORCHILIN, et. al., 2003). Daha
büyük organik çözgen hacimlerinin söz konusu olduğunda ise uzaklaştırma işlemi
rotary evaporator ile gerçekleştirilir. Her iki işlem sonucunda da balon jojenin
dibinde ince lipid filmi veya tabakası oluşmaktadır. Muhtemelen bu ortamda kalan
organik çözgeni uzaklaştırmak amacıyla, bu film daha sonra bir gece boyunca vaküm
pompa ile kurutulur. Kloroform kullanımı tercih edilmiyorsa, onun yerine lipidleri
tersiyer butanol veyasikloheksanda çözmek de mümkündür. Lipid çözeltisi kaplara
aktarılır ve kuru buz veya kuru buz-aseton karışımıyla veya alkol (etanol veya
metanol) banyosuna konularak dondurulur. Banyoda konulduğu takdirde, ani ısı
değişiklerinden kaynaklanabilecek olan muhtemel kap çatlamasını engellemek için
dikkat edilmeli. Tam olarak dondurulduktan sonra, lipidin içinde bulunduğu kap
vaküm pompaya bağlanır ve lipid filminin kuruyuncaya kadar liyofilize edilir. Bu
işlem elde edilmesi istenilen lipid hacmine göre değişir ve genelde 1 ile 3 gün arasında
sürer. Bunun ardından, kurutulmuş lipid filmi bulunduran balon joje vaküm
pompadan çıkarılır ve tekrar bir sonraki hidrasyon için dondurulmuş vaziyette
muhafaza edilir.
b. Lipid Filminin Hidrasyonu.
Kuru lipid filminin hidrasyonu basitçe sıvı ortamın veya tampon çözeltisinin
lipidin bulunduğu balon jojeye katarak ve çalkalayarak gerçekleştirilir. Hidrasyon
312
ortamının ısısı kullanılan lipidin genel jel-sıvı kristal faz geçiş ısısından (Tc veya Tm)
daha yüksek olmalı. Bu işlemden sonra lipid süspansiyonu, bulunduğu kendi ortam
ısısının söz konusu Tm ‘in üzerinde olacak şekilde muhafaza edilmelidir. Yüksek faz
geçişine sahip lipidler için bu işlemi balon joje içinde bulunan lipidleri rotary
evaporator sistemine bağlayarak vaküm kullanılmaksızın gerçekleştirmek
mümkündür. Daha sonra, bu balon jojeyi yine önceden lipid süspansyon ısısısnın
üzerinde bulunan bir ısı ortamında ısıtılmış su banyosuna aktarılarak ve çalkalayarak
lipidin hidrasyonunu gerçekleştirerek lipidlerin akışkan fazı elde edilmiş olur. Lipid
türüne bağlı olarak hidrasyon için gereken zaman değişmekte, ancak bu işlemin
çalkalama ve vorteksleme zamanları ile birlikte, genelde bir saati aşmamasına özen
gösterilir. Bazı durumlarda, veziküllerin boyut dağılımı ve homojeniteleri
iyileştirildiğinden, bundan sonraki aşama olan vezikül boyutlandırma işlemine
geçmeden önce, lipid süspansyonu bu şekilde bir gece bekletilir68.
Hidrasyon ortamını genelde lipid veziküllerin uygulama amacı tayin eder. Uygun
hidrasyon ortamı, distile su, tampon çözeltileri, tuzları, ve şeker çözeltileri gibi
elektrolit olmayan bileşenleri içerir. In vivo uygulamalar için fizyolojik osmolalitede
(290 mOsm/kg) çalışmak tavsiye edilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Bu
gereksinimleri karşılayan genel olarak kullanılan bir çözelti: 0.9% tuz, 5% dekstroz ve
10% sukroz’u içerir. Hidrasyon esnasında, bazı lipidler yapılarına özgü kompleksler
oluştururlar. Yüksek düzeyde yük taşıyan lipidlerin hidrasyonları esnasında ve düşük
pI’e sahip çözeltilerde, vis köz jel oluşturdukları görülmüştür (TORCHILIN, et. al.,
2003). Bu sorun, ortama tuzların katılması veya vezikül boyutlarının düşürülmesiyle
giderilebilir. Fosfatidiletanolamin gibi hidrasyonu zor olan lipidler kendi kendine
agregatlar oluştururlar. >60% fosfatidiletanolamin içeren veziküller vezikül etrafında
oluşan düşük hidrasyon tabakasına sahiptir. Bu durumda bu fosfolipidten oluşan
veziküller arasında uzaklaştırıcı kuvvetlerin zayıflaması sonucu birbirine çok yaklaşıp
birbirleri bağlanarak daha büyük agregatlar oluştururlar (). Bu parçacıklar çözeltide
daha büyük dispers flokülasyonlar olarak meydana gelir. Hidrasyonun sonucunda,
büyük çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur.
Katmanlar arasında bulunan lipid yüzeyleri su katmanı ile çevrilidir. Aralarında
oluşan mesafe lipid katmanlarındaki lipid içeriğine bağlıdır. Örneğin, polihidre 68
Bu olay “aging” olarak da adlandırılmaktadır. Ancak, lipid hidrolizinin meydana gelme olasılığının yüksek derecelerde artığından, bu işlem yüksek faz geçişine sahip lipidlere uygulanması tercih edilmez (TORCHILIN, et. al., 2003).
313
katmanlar, elektrostatik uzaklaştırma neticesinde oluşan yüklü lipid katmanlarına
göre birbirine daha yakın bir mesafede oluşurlar. Sabit, hidrasyonu gerçekleştirilmiş
çok katmanlı veziküllerin (Large Multilamellar Vesicles, LMV) elde edilmesinden
sonra, bu parçacıkların boyutları sonication ve extrusion gibi birçok yöntem
kullanılarak düşürülür (TORCHILIN, et. al., 2003).
c. Lipid Süspansyonlarının Boyutlandırılması
Sonication
LMV süspansyonlarının sonik enerji (sonication) kullanarak parçalanması
tipik olarak çapları 15-50 nm arasında değişen küçük, tek katmanlı veziküllerin (SUV)
oluşmuuna neden olur. Bunu gerçekleştirmek için kullanılan cihazlar “probe tip
sonicators” olarak bilinmektedir. Ancak bu yöntem birçok tercih edilmeyen yan
etkilere de sahiptir. Örneğin, bu yöntemi kullanarak elde edilen küçük tek katmanlı
veziküller sabit değildir ve zamanla agregasyonlar neticesinde çapları daha büyük
olan agregatlara dönüşürler. Sonuç olarak, elde edilen lipozom formülasyonları son
derece heterojendir. Ayrıca, sonikasyon lipid peroksidasyonlara da neden olmuştur.
Bu peroksidasyonları engellemek amacıyla araştırmacılar lipozom formülasyonlarına
lipid koruyucu ve antioksidan etkilerine sahip α-tokoferol (Vitamin E) katmışlardır.
Ancak bu vitaminin büyük hacmi lipozomların daha sonraki boyut incelemelerini ve
spektroskopik araştırmalarını çok sayıda yan sinyal verdiklerinden olumsuz olarak
etkilemştir. Bu yüzden günümüzde tek katmanlı lipid veziküllerinin elde edilmesinde
kullanılan diğer bir yöntem olan extrusion yöntemi tercih edilmektedir.
Extrusion
Bu yöntemde lipid süspansyonu önceden bilinen ve tercih edilen por
büyüklüğüne sahip 2 polikarbonat filtre üzerinden 10 defa geçirilerek bu por
büyüklüğüne yakın boyuttaki tek katmanlı veziküller elde edilir. Bu yöntem
sayesinde ortalama olarak söz konusu tek katmanlı veziküllerin boyut dağlımı son
derece homojendir. Şimdiye kadar bahsedilen tüm diğer lipozom boyutunun
düşürülmesinde kullanılan yöntemlerde olduğu gibi burada da bu işlem lipidin faz
geçiş derecesinin üzerinde bir değerde çalışılması gerekmektedir. Aksi takdirde, bu
derecenin altında lipidlerin rijid olduklarından ve bu yüzden de polikarbonat
filtresindeki porlara yapışıp tıkanmalarına neden olduklarından, bu işlem
314
başarısızlıkla sonuçlanacaktır. 100 nm por büyüklüğüne sahip filtreden
geçirildiklerinde MLV genelde ortalama olarak çapları 120-140 nm arasında değişen
büyük, tek katmanlı (large unilamellar vesicles (LUV))’i meydana getirir. Bu işlem
sunucunda, elde edilen lipozomların boyutu particle sizer cihazıyla teyit edilir. Bu
ortalama partikül boyutu ayrıca lipid içeriğine bağlıdır ancak son derece
tekrarlanabilir bir prosedürdür.
Şekil E5.3 Çok katmanlı veziküllerin hazırlanması enasında oluşan fosfolipid yapıları.
Kaynak: http://www.avantilipids.com
315
Şekil E5.4 MLV’lerin hazırlanmasındaki üç aşamanın şematik gösterimi. 1: Önceden
oluşturulan kurutulmuş ince tabaka lipidlere sıvı fazın katılması; 2: Balon jojeyi
çalkalama ve ısıtma neticesinde lipid filmin erimesi ve çözülmesi; 3: Ekvilibre edilmiş
17. Karl Skriner, Wolfgang Hueber, Erhan Süleymanoglu, Elisabeth Höfler, Veit Kren,
Josef Smolen and Günter Steiner, The Regulator of TNFα mRNA Decay AU-rich
Element Binding Factor 1 is Targeted by Autoantibodies of Patients with Systemic
Rheumatic Diseases, (accepted for publication in Rheumatism and Arthritis-2007).
Books:
Hayriye S. Yenisoy, Nergiz Aksoy and Erhan Süleymanoglu, Contemprorary
Bulgarian, published by Kurmay Yayınevi (www.kurmayyayinevi.com)-2007.
Conferences and Workshops Attended:
1. Intensive Course on Protein Structure, Function and Stability, April 18-22, 1994,
Ankara - Turkey; Organized by Middle East Technical University - Ankara, Turkey
and University of Bath - United Kingdom.
2. Turbidimetric Study of Interaction Between Polyribonucleotides,
Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO Advanced Study Institute:
Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular Sorting to Membrane
Fusion, June 19-30, 1994, Espinho, Portugal.
3. Spectrophotometric Study of the Interaction Between Polyribonucleotides,
Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, VIth National Biophysical Congress,
September 28-30, 1994, Silivri - Istanbul, Turkey.
4. Calcium/Magnesium Specificity in Modulation of Phospholipid Phase Transition
Induced by Tamoxifen, NATO Advanced Study Institute: Molecular Dynamics of
Biomembranes, June 19 - July 1, 1995, Cargese, Corsica, France.
5. Self-Assembly of Lipid Vesicles and Polyribonucleotides - An Inorganic
Perspectives for the Origin of Life, NATO Advanced Study Institute: Solvents and
Self-Organization of Polymers, July 23, 1995, Belek, Antalya, Turkey.
326
6. Self-Assembly of Lipid Droplets and Polyribonucleotides or Primordial Soup
Revisited, ISSOL'96: International Conference on The Origin of Life, July 7 - 12,
1996, Orleans, France.
7. Self-Association of Melittin with Model Membranes, Winter School of Biophysics:
Biophysical Aspects of Protein Folding; Organized by Stockholm Graduate School in
Biophysics, as a joint programme between The Karolinska Institute, The Royal
Institute of Technology and Stockholm University, April 1 - 4, 1997.
8. International Workshop on Modern Spectroscopic Techniques in Biophysics, June
1 - 5, 1998, Neptun, Romania.
9. 1998 Joint Meeting and Symposium of Clinical Biochemistry: New Trends in
Clinical Biochemistry of Transplantation, Artis Tower Hotel - Vienna, Austria;
Organized by Austrian Society for Clinical Chemistry and Instituto di Semiotica
Medica, Universita degli Studi Padova - Italia and Society Italiana Di Biochemica
Clinica.
10. The hnRNP-D/AUF Proteins - A Novel Group of Autoantigens in Rheumatology,
National Scientific Meeting, Arthritis and Rheumatism - Abstract Supplement, Vol.
41, No: 9, Sept. S349, November 8-12, 1998, San Diego, California, U.S.A.
11. The hnRNP-D/AUF Proteins - a Novel Group of Autoantigens in SLE, MCTD and
RA, XVIII European Workshop for Rheumatology Research, March 12 - 15, 1998,
Athens, Greece.
12. ISPPP98 - 18th International Symposium on the Separation and Analysis of
Proteins, Peptides and Polynucleotides, November 1 - 4, 1998, Hilton Hotel - Vienna,
Austria.
13. The hnRNP A/B type proteins - major molecular targets in rheumatic
autoimmune disease, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27
June, 1999, University of Edinburgh, Scotland.
14. Cloning of a novel hnRNP A/B type protein highly homologous to hnRNP-A3
from X. laevis, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June,
1999, University of Edinburgh, Scotland.
327
15. Identification of a novel autoantigen highly related to hnRNP-A2/RA33, The
19th European Workshop for Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.
16. Epitope Mapping of hnRNP-D/AUF-1 proteins, The 19th European Workshop for
Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.
17. The hnRNP-D/AUF-1 Proteins - Novel Autoantigens in Rheumatology, 4th
European Conference on Systemic Lupus Erythematosus; Organized by Vienna
Academy of Postgraduate Medical Education and Research, January 23 - 26, 1999,
Vienna, Austria.
18. Thermodynamics of nucleic acid-membrane-self-assembly as a precellular
precursors and the emerging role of Ca2+ and Mg2+ as condensing agents, 12th
International Conference on the Origin of Life and 9th ISSOL Meeting, 11-16, 1999,
San Diego, California, U.S.A.
19. Are mRNA stability complexes target structures in systemic autoimmunity?,
14th European Immunology Meeting, EFIS, Sept. 23-27, 2000, Poznań, Poland.
20. Confocal Light Microscopy: Fundamentals and Biological Applications;
BioCentrum Course with practical training; University of Amsterdam, May 8-12,
2000, Amsterdam, The Netherlands.
21. Visualizing Cellular Processes, 8 June, 2000, Free University of Amsterdam,
Amsterdam, The Netherlands.
22. Analysis of Compaction Forces and Supercoil Content of Isolated E. coli
nucleoids, International Summer School on DNA and Chromosomes: Physical and
Biological Approaches, July 31 - August 12, 2000, Cargese, Corsica, France.
23. Analysis of DNA Compaction within the Bacterial Cell, EMBO Workshop: The
Cell Cycle and Nucleoid Organization in Bacteria; Netherlands Institute for Sea
Research (NIOZ), September 2-6, 2000, Island of Texel, The Netherlands.
24. AiK (The Association for Physics Students) Symposium: Complex Systems,
November 3, 2000, Free University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.
328
25. Fall Symposium of The Dutch Society for Biochemistry and Molecular Biology:
Into the Living Cell and Beyond, November 7, 2000, BioCentrum Amsterdam - Free
University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.
26. Autoantibodies to the mRNA destabilizing protein hnRNP-D/AUF1 in patients with systemic autoimmune diseases, 21st European Workshop for Rheumatology Research, Parkhotel Schönbrunn, Vienna, Austria. 1-4 March 2001, published in Arthritis Res. 2001, 3(Suppl A): P012.
26. Symposium on Live Cell Imaging; Organized by PerkinElmer Life Sciences and
hold at Institute of Molecular Pathology, April 10, 2001, Vienna, Austria.
27. IMMPC - 1: First International Meeting on Medical and Pharmaceutical
Chemistry, September 25-28, 2002, Hotel Ankara Dedeman - Ankara, Turkey.
28. Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy of RNA - Protein Folding
Patterns and Their Role in Autoimmune Diseases, The Inaugural Austral - Asian
Biospectroscopy Conference: Organized by Monash University - Australia and hold at
the Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima (Korat) - Thailand,
February 3-7, 2003.
29. Fluorescence Microscopy of Polymer - Induced Phase Separation and Divalent
Cation - Dependent Compaction and Structural Integrity of Bacterial Chromosome,
Bionanotechnology - EuroConference on Biomolecular Devices - Granada, Spain, 9-
14 July, 2003.
30. Macromolecular Crowding and Bacterial DNA Cytoarchitecture - Conference
for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on Moleculur Biology and
Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30 anniversary of the
Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of
Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.
31. Adiabatic Differential Scanning Microcalorimetric Study of Divalent Cation -
Induced Neutral Lipid - DNA Nanocondensate Formation Assambled for Gene
Delivery - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on
Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30
329
anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy
of Sciences of Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.
32. Light Microscopy of Polyethylene Glycol-Induced Phase Separation and
Divalent Cation-Dependent Compaction of Prokaryotic Nucleoids - ELSO-2003:
European Life Scientist Organization - 2003, Dresden, Germany.
33. On-line Dissolution, Advanced Detection Methods and Authomated Method
Development. Workshop organized by Waters Corporation (U.S.A.), Gazi University,
Faculty of Pharmacy 11.03.2004, Ankara, Turkey.
34. Biophysical Aspects of RNA-protein Folding Features in A/B Type hnRNP
Proteins and Their Implications in Human Systemic Autoimmune Pathology, 30th
FEBS Congress and 9th IUBMB Conference - The Protein World, 2 - 7 July, 2005,
Budapest, Hungary.
35. Workshops of Middle East Technical University-Central Laboratory, 1.
Rheological Characterization of Materials; 2. Particle Size Measurement Using
Laser Diffraction Technique; 3. Particle Size Measurement Using Dynamic Light
Scattering Techniques and Zeta Potential Measurement; 4. Thermal Analysis
Techniques, 30.11.2005-21.12.2005, Ankara, Turkey.
36. Thermal Analysis and Rheological Applications in Polymer Field, Workshop
organized by TA Instruments (UK), Gazi University, Faculty of Pharmacy, 21.12.2005,
Ankara, Turkey.
37. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with Langmuir-Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry, 1st Multidisciplinary Cancer Research Symposium, Uludağ-Bursa, Turkey, 2006.
38. Preparation and Physicochemical Characterization of Biomolecular DNA-
Zwitterionic Phospholipid Self-Assemblies and Their Implications in
Chemicopharmaceutical Design of Liposome Based Gene Delivery
Nanoformulation, NanoTR-II: NanoScience and NanoTechnology 2006, 3-5 May
2006, Middle East Technical University, Ankara, Turkey.
39. Assessment of Structures of Poly(ribo)nucleotide-Phospholipid Self-Assemblies and Their Implıcations in Gene Transfection and DNA Chromatography, 8th
330
International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), 13-16 June, 2006, Ankara, Turkey.
40. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with Langmuir-
Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential