Tierärztliche Hochschule Hannover Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE (Dr. med. vet.) vorgelegt von Anne Riesenberg Steinheim / Westfalen Hannover 2016
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Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur ... · Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. Junior Scientist Symposium
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens
zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
von Rhodococcus equi
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Anne Riesenberg
Steinheim / Westfalen
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee
PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg
1. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee
PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg
2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. Diana Meemken, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2016
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten
Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review) veröffentlicht
oder sind zur Veröffentlichung angenommen:
1. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN, L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68, 2173-5.
2. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.
STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69, 1045-9.
3. RIESENBERG, A., H, KASPAR, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, S.
SCHWARZ: Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test. Vet. Microbiol. 2015 Nov 26, doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden bei folgenden
Fachtagungen im In- und Ausland in Form einer Posterpräsentation
oder eines Vortrages präsentiert:
1. RIESENBERG, A.*, K. KADLEC, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, D.
KLARMANN, S. SCHWARZ (2012): Development of guidelines for the susceptibility testing of veterinary pathogens. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 10.–11.8.2012, Germany, Vortrag.
2. RIESENBERG, A., L. KREIENBROCK, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D.
KLARMANN, S. SCHWARZ*, C. WERCKENTHIN (2013): Development of susceptibility testing standards for Rhodococcus equi as a veterinary pathogen. Meeting of the CLSI-Subcommittee on Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST), 10. - 11.01.2013, Tampa, FL, USA, Vortrag.
3. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D. KLARMANN, S.
SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2013): Revised recommendation for susceptibility testing of Rhodococcus equi. 16. Internationales Symposium der World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 05. - 08.06.2013, Berlin, Germany, Poster.
4. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. 5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Ghent, Belgium, Poster.
5. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 21. - 24.08.2013, Jena, Germany, Poster.
6. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2014): Development of a new protocol for antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi by broth microdilution. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26. - 28.05.2014, Freising, Germany, Poster.
7. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I. STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, S. SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2014):
Minimum Inhibitory Concentrations of 200 Rhodococcus equi Isolates to 32 Antimicrobial Agents. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26.–28.05.2014, Freising, Germany, Poster.
8. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.
STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ* (2014): Susceptibility of 200 Rhodococcus equi isolates from North America and Europe to 32 antimicrobial agents. Tagung “Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine (AAVM)”, 16.–19.09.2014, Berlin, Germany, Vortrag.
9. RIESENBERG, A.*, C. WERCKENTHIN, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, H.
KASPAR, L. KREIENBROCK, S. SCHWARZ (2015): Erarbeitung standardisierter Verfahren zur Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi, Trueperella pyogenes und Arcobacter spp. 34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe AVID, 09. - 11.09.2015, Bad Staffelstein, Germany, Vortrag.
* Präsentierender Autor
Mr. X. has a sore throat.
He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill the
streptococci, but enough to educate them to resist penicillin.
He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin.
As the streptococci are now resistant to penicillin, the treatment fails.
Die Unterschiede in den MHK-Werten, die von den verschiedenen Studien
ermittelt wurden, sind teils deutlich, teils auch nur gering ausgeprägt. Die möglichen
Gründe hierfür sind vielfältig. Möglich ist eine unterschiedliche Empfindlichkeit der
jeweiligen Testpopulationen. Auch ein Einfluss der Methodik (Medium-Zusätze,
Inkubationstemperatur und Inkubationsdauer) ist eine mögliche Erklärung. Die
Verwendung von geeigneten Stämmen zur Qualitätskontrolle der verwendeten
antimikrobiellen Wirkstoffe sowie die Anwendung einer einheitlichen, wie der von uns
Diskussion
23
publizierten und vom CLSI anerkannten Methodik (KAPITEL 2) sind notwendig, um
durch die Methode bedingte Einflüsse ausschließen zu können.
5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber
Rifampicin
Da sechs Isolate unseres Stammkollektivs eine verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin aufwiesen, wurde der genetische Hintergrund hierzu näher
untersucht. Von mehreren Autoren wurde über Mutationen im rpoB-Gen als Ursache
für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin in verschiedenen
bakteriellen Organismen berichtet (CRUCHAGA et al. 2003, KADLEC et al. 2011,
ZACZEK et al. 2009). Auch bei R. equi sind Mutationen in diesem Gen bereits als
Ursache für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin beschrieben
worden (ASOH et al. 2003, FINES et al. 2001). ASOH et al. (2003) beschreiben die
Mutationen Ser531Trp und His256Tyr als ursächlich für eine High-Level-Resistenz
(MHK ≥ 128 mg/L), sowie Ser531Leu für eine Low-Level-Resistenz (MHK 8 mg/L).
Es macht laut ASOH et al. (2003) einen merklichen Unterschied, welche Aminosäure
an Position 531 das Serin ersetzt.
In der Studie von FINES et al. (2001) wurde der Aminosäureaustausch
His526Tyr mit einem MHK-Wert von ≥256 mg/L in Verbindung gebracht, während
His526Asp einen MHK-Wert von 128 mg/L und His526Asn einen MHK-Wert von
8 mg/L zur Folge hatten. Auch hier hat demnach die das Histidin ersetzende
Aminosäure einen deutlichen Einfluss auf die MHK-Werte gegenüber Rifampicin.
Mutationen Ser531Leu führten auch diesen Autoren zufolge zu einem MHK-Wert von
8 mg/L und eine Mutation Asp516Val zu einem Wert von 2 mg/L.
In unseren Untersuchungen (KAPITEL 3) konnten wir die Ergebnisse von
FINES et al. 2001 bestätigen, denen zufolge eine Mutation His526Asp zu einem
hohen MHK-Wert gegenüber Rifampicin (256 mg/L) führt. Ebenfalls bestätigen
konnten wir die in derselben Studie beschriebene geringe Erhöhung des MHK-
Wertes (4 mg/L) bei Vorliegen einer Mutation Asp516Val. Unsere Studie ergab
darüber hinaus einen Zusammenhang zwischen einer Mutation Gln513Leu und
einem Rifampicin-MHK-Wert von 64 mg/L. Eine Mutation an dieser Lokalisation ist
bei R. equi bisher nicht beschrieben worden.
Diskussion
24
Auch konnten wir mit unserer Studie die Annahme von ASOH et al. 2003
bestätigen, dass die Mutation Ser531Leu eine verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin bedingt. Zwei unserer Isolate mit erhöhten MHK-Werten
gegenüber Rifampicin wiesen diese Mutation auf, ihre MHK-Werte waren jedoch
unterschiedlich (8 bzw. 128 mg/L), sodass wir einen zusätzlichen, bislang
unbekannten Resistenzmechanismus als Ursache für die unterschiedlich hohen
MHK-Werte bei gleicher Mutation im rpoB-Gen vermuten. Die These eines weiteren,
bisher unbekannten Resistenzmechanismusses wird vom Auftreten eines Isolates
mit einem Rifampicin-MHK-Wert von 8 mg/L gestützt, bei dem keine Mutation im
rpoB-Gen festgestellt werden konnte. Welcher Mechanismus zusätzlich bzw.
alternativ zu Mutationen im rpoB-Gen für die Erhöhung des MHK-Wertes gegenüber
Rifampicin verantwortlich ist, konnte in dieser Studie nicht festgestellt werden.
5.4 Laborvergleichsuntersuchung
In einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung wurde die erarbeitete
Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi an zwei Isolaten
(einem R. equi Feldisolat und dem Typstamm R. equi ATCC® 25729) in 18
verschiedenen, in der Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger erfahrenen
Laboratorien angewendet (KAPITEL 4). Als Qualitätskontrolle wurde der E. coli-
Stamm ATCC® 25922 verwendet. Das Ziel der Laborvergleichsuntersuchung war es,
zu überprüfen, ob die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik praktikabel ist,
und ob die von den verschiedenen Laboren übermittelten MHK-Werte innerhalb
eines akzeptablen Bereiches liegen. Dieser akzeptable Bereich wurde - analog zur
Studie von WALLMANN et al. (2006) - auf den am häufigsten angegebenen MHK-
Wert ± 1 Verdünnungsstufe festgelegt.
In der Laborvergleichsuntersuchung zeigte sich, dass die Labore die von uns
erarbeitete Methode problemlos anwenden konnten. Als Grenze für eine erfolgreiche
Teilnahme der Labore wurde festgelegt, dass 80 % aller übermittelten MHK-Werte
innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen sollten (WALLMANN et al. 2006).
Insgesamt waren für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 98,3 %
aller MHK-Werte im akzeptablen Bereich. Die beiden R. equi-Stämme wiesen
Diskussion
25
durchschnittlich 92,2 % (ATCC® 25729) und 94,8 % (R. equi-Feldisolat) aller
übermittelten MHK-Werte im akzeptablen Bereich auf. Für eines der Labore und den
R. equi ATCC®25729 lagen nur 72,2 % aller übermittelten Werte im akzeptablen
Bereich. Da dieses Labor keine Probleme mit der Testung des R. equi-Feldisolates
hatte (91,7 % der MHK-Werte im akzeptablen Bereich) und auch die Testung des E.
coli ATCC® 25922 problemlos verlief (93,8 % der MHK-Werte im akzeptablen
Bereich), ist die Ursache hierfür nicht geklärt.
Bei Betrachtung der Ergebnisse für die einzelnen Wirkstoffe ergab sich die
schlechteste Übereinstimmung mit dem akzeptablen MHK-Bereich bei beiden R.
equi-Stämmen für Ceftiofur und Cefotaxim (R. equi ATCC® 25729 79,6 % und
75,9 %; R. equi-Feldisolat 88,9 % und 87,0 %). Die Testung des E. coli ATCC®
25922 mit diesen Wirkstoffen verlief problemlos (100 % bzw 98,1 %); was zu den
Problemen bei der Testung der R. equi-Isolate geführt hat, konnte retrospektiv nicht
geklärt werden. Die beste Übereinstimmungen mit dem akzeptablen Bereich zeigten
sich bei R. equi ATCC®25729 für Gentamicin, Oxacillin und Vancomycin (jeweils 100
%). Für das R. equi-Feldisolat wiesen Enrofloxacin, Marbofloxacin, Oxacillin, Tylosin
und Vancomycin die beste Übereinstimmung mit dem akzeptablen Bereich auf
(jeweils 100 %).
Abschließend lässt sich sagen, dass die Laborvergleichsuntersuchung
erfolgreich verlaufen ist; die Methode war problemlos von allen 18 Laboren
anzuwenden und die von den Laboren übermittelten MHK-Werte wiesen verglichen
mit den für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 übermittelten MHK-
Werten eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden akzeptablen Bereichen
auf.
5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI
Die im Rahmen der Studie vorgestellte Methode wurde dem CLSI-Subkomitee
Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST) am 11.01.2013 vorgestellt. Die
neue Methode der Testung unter Verwendung von CAMHB + 2 % (v/v) LHB und
einer Inkubationszeit von 24 h wurde als neue Methode akzeptiert und wurde in die
erste Auflage des neuen CLSI-Dokuments VET06-A („Methods for Antimicrobial
Diskussion
26
Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria Isolated from
Animals“), das noch im Jahr 2016 erscheinen soll, aufgenommen.
Schlußfolgerungen
27
KAPITEL 6 Schlußfolgerungen
Der Vergleich verschiedener in der Literatur beschriebener Medien für die
antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution
zeigte, dass die bisher verwendeten Medien prinzipiell geeignet waren, um eine
Empfindlichkeitsprüfung durchzuführen. Die Ablesbarkeit war bei beiden
verwendeten Medien [CAMHB mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] sowohl nach
24 h als auch nach 48 h möglich, beim Einsatz von LHB aber deutlich besser. Die
statistische Auswertung einer wiederholten Empfindlichkeitsprüfung zeigte, dass die
Kombination aus einem Zusatz von 2 % (v/v) LHB zur CAMHB und einer Ablesung
der MHK-Werte nach 24 h die homogensten Ergebnisse ergab.
Die Testung eines Stammkollektivs von 200 R. equi-Stämmen verschiedenen
Ursprungs verlief mit dieser Methode problemlos. Die MHK-Werte für die meisten
Wirkstoffe waren normalverteilt und nur wenige Isolate wiesen eine verminderte
Empfindlichkeit gegenüber einem oder mehreren Wirkstoffen auf. Ein Isolat zeigte
eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber den Makrolid-Antibiotika Azithromycin,
Clarithromycin und Erythromycin. Insgesamt sechs Isolate wiesen unterschiedlich
stark erhöhte MHK-Werte gegenüber Rifampicin auf. Bei fünf dieser Isolate konnte
eine Mutation im rpoB-Gen als Ursache für die verminderte Empfindlichkeit
festgestellt werden. Jedoch zeigt die Studie, dass es neben Mutationen im rpoB-Gen
mindestens einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von
R. equi gegenüber Rifampicin beeinflusst.
Eine Laborvergleichsuntersuchung mit 18 teilnehmenden Laboren zeigte, dass
die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik geeignet ist. Die Ergebnisse der
MHK-Testung in den verschiedenen Laboren zeigten eine gute Übereinstimmung.
Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelte Methode wurde zudem dem CLSI
vorgestellt, als Methode für die Empfindlichkeitstestung von R. equi anerkannt und in
das neue CLSI-Dokument VET06-A aufgenommen.
Zusammenfassung
28
KAPITEL 7 Zusammenfassung
Anne Riesenberg: Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur
antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von
Rhodococcus equi
Als Erreger purulenter Bronchopneumonien beim Fohlen ist Rhodococcus equi
schon lange bekannt. Da der Erreger beim Fohlen schwerwiegende Erkrankungen
hervorruft und auch bei anderen Tierarten und beim Menschen Erkrankungen
auslösen kann, ist eine erfolgreiche Therapie der Rhodokokkose von großer
Bedeutung. Um einen Therapieerfolg sicherzustellen; sollte der Erreger vor Beginn
der Therapie auf seine antimikrobielle Empfindlichkeit getestet werden. Dies ist
insbesondere deshalb von Bedeutung, weil für das therapeutisch relevante
Rifampicin, sowie die ebenfalls häufig verwendeten Makrolide, bereits Isolate mit
verminderter Empfindlichkeit beschrieben wurden. Um die Ergebnisse verschiedener
Studien zur Empfindlichkeitsbestimmung von R. equi vergleichen zu können, ist es
notwendig, die Methodik der Testung zu standardisieren. Um dieses Ziel zu
erreichen, wurden zwei verschiedene in der Literatur beschriebene Medien [CAMHB
mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution für eine vergleichende
Empfindlichkeitsprüfung verwendet; die MHK-Werte wurden nach 24 und 48 Stunden
abgelesen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wiederholter
Empfindlichkeitsprüfungen zeigte, dass bei Verwendung von CAMHB mit 2 % (v/v)
LHB und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 Stunden die Wahrscheinlichkeit,
homogene MHK-Werte für das gleiche R. equi Isolat zu erzielen, am höchsten ist.
Mit dieser Methode wurde die Empfindlichkeit von 200 R. equi Isolaten
gegenüber 32 antimikrobiellen Wirkstoffen und Wirkstoff-Kombinationen getestet. Es
zeigten nur wenige Isolate erhöhte MHK-Werte für einige Wirkstoffe. Eines dieser
Isolate wies für die therapeutisch relevanten Makrolid-Antibiotika Erythromycin,
Clarithromycin und Azithromycin moderat erhöhte MHK-Werte auf. Weitere sechs
Isolate zeigten eine unterschiedlich stark ausgeprägte verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin. Bei der molekularen Untersuchung letzterer Isolate zeigte
sich, dass es zusätzlich zu Mutationen im rpoB-Gen, die dafür bekannt sind, die
Zusammenfassung
29
Empfindlichkeit von verschiedenen Bakterien gegenüber Rifampicin zu vermindern,
einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von R. equi
gegenüber Rifampicin vermindert.
Das Ergebnis einer Laborvergleichsuntersuchung, an der 18 deutsche
Laboratorien beteiligt waren, bestätigte, dass die von uns publizierte Methode zur
antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung probemlos von den Laboren angewendet
werden kann. Die Ergebnisse der MHK-Testung der verschiedenen Labore zeigten
eine gute Übereinstimmung.
Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung mittels Bouillon-Mikrodilution von R.
equi in CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit Inkubation in aerobem Milieu bei 35 ± 2 °C für 24
h ist eine zuverlässige, praxistaugliche Methode. Sie wurde vom Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Testung von R. equi Isolaten von Tieren
anerkannt und stellt nach Aufnahme in das CLSI-Dokument VET06-A die künftige
Standardmethode zur Empfindlichkeitsprüfung von R. equi dar.
Summary
30
KAPITEL 8 Summary
Anne Riesenberg: Development of a standardised method for the
antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi
As a causative agent of purulent bronchopneumonia in foals, Rhodococcus
equi is known a fairly long time. As the pathogen causes severe infections in foals
and is furthermore capable of infecting other animals and humans, a successful
therapy is of utmost importance. To ensure therapeutical success the pathogen
should be tested for antimicrobial resistance before starting the treatment. This is of
particular importance since isolates with a reduced susceptibility have been reported
previously for the therapeutically relevant drug rifampicin as well as for the commonly
used macrolides. In order to allow a comparison of the results from different studies,
it is necessary to standardize the antimicrobial susceptibility testing of R. equi. To
achieve this goal, two media that were described in literature (CAMHB with and
without supplementation with 2 % (v/v) LHB) were used for antimicrobial
susceptibility testing of R. equi via broth microdilution; MIC values were read after 24
and 48 hours. Statistical analysis of repeated susceptibility testing showed, that the
probability to achieve homogenous MIC values was highest when using CAMHB with
2 % (v/v) LHB and reading the MIC values after 24 hours.
With this method we determined the susceptibility of 200 R. equi isolates
against 32 antimicrobial agents and combinations of agents. Only few isolates
showed elevated MIC values for one or few antimicrobial agents. One of these
isolates displayed moderately elevated MIC values against erythromycin,
clarithromycin and azithromycin. Further six isolates showed a reduced susceptibility
to rifampicin. Investigation of the molecular background of these six isolates showed,
that in addition to mutations in the rpoB-gene, that are well-known for their influence
on the susceptibility of different bacteria against rifampicin, there must be an
additional mechanism that influences the susceptibility of R. equi to rifampicin.
The results of an interlaboratory test, in which 18 German laboratories
participated, confirmed that our standardized method for the antimicrobial
susceptibility testing of R. equi could be applied without any problems and the results
of the MIC testing showed a good concordance.
Summary
31
The antimicrobial susceptibility testing of R. equi via broth microdilution using
CAMHB + 2 % (v/v) LHB and incubation in an aerobic atmosphere at 35 ± 2 °C für 24
hours is a reliable and applicable method. It has been approved by the Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) for testing of R. equi from animal origin, will be
included in the forthcoming CLSI-document Vet06-A and will therefore become the
future standard method for antimicrobial susceptibility testing of R. equi.
Literaturverzeichnis
32
KAPITEL 9 Literaturverzeichnis
ASOH N., WATANABE H., FINES-GUYON M., WATANABE K., OISHI K., KOSITSAKULCHAI W., SANCHAI T., KUNSUIKMENGRAI K., KAHINTAPONG S., KHANTAWA B., THARAVICHITKUL P., SIRISANTHANA T., NAGATAKE T. (2003): Emergence of rifampin-resistant Rhodococcus equi with several types of mutations in the rpoB gene among AIDS patients in northern Thailand. J. Clin. Microbiol. 41, 2337-2340. BACH, N. (2011): Behandlung von Fohlen mit Tulathromycin (Draxxin®) zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-Pneumonie: Klinische Wirksamkeit, Verträglichkeit und Ausscheidung des Erregers. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. BARTON, M. D., FULTON, I. C. (1980): Antibiotic sensitivity of Corynebacterium equi. Aust. Vet. J. 56, 339-342. BOWERSOCK, T. L., SALMON, S. A., PORTIS, E. S., PRESCOTT, J. F., ROBISON, D. A., FORD, C. W., WATTS, J. L. (2000): MICs of oxazolidinones for Rhodococcus equi strains isolated from humans and animals. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1367-1369. BOYEN, F., PASMANS, F., HAESEBROUCK, F. (2011): Acquired antimicrobial resistance in equine Rhodococcus equi isolates. Vet. Rec. 168,101a. BUCKLEY, T., MCMANAMON E., STANBRIDGE S. (2007). Resistance studies of erythromycin and rifampin for Rhodococcus equi over a 10-year period. Ir. Vet. J. 60, 728-731. BUNDESTIERÄRZTEKAMMER (2015): Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln – mit Erläuterungen –. Beilage zum Dtsch. Tierärztebl. 3/2015 BURTON, A. J., GIGUÈRE, S., STURGILL, T. L., BERGHAUS, L. J., SLOVIS, N. M., WHITMAN, J. L., LEVERING, C., KUSKIE, K. R., COHEN, N.D. (2013): Macrolide- and rifampin-resistant Rhodococcus equi on a horse breeding farm, Kentucky, USA. Emerg. Infect. Dis. 19, 282-285. CARLSON, K. L., KUSKIE, K. R., CHAFFIN, K. M., LIBAL, M. C., GIGUÈRE, S., LAWHON, S. D., COHEN, N.D. (2010): Antimicrobial activity of tulathromycin and 14 other antimicrobials against virulent Rhodococcus equi in vitro. Vet. Ther. 11, E1-9.
Literaturverzeichnis
33
CARMAN, M. G., HODGES, R. T. (1987): Distribution of Rhodococcus equi in animals, birds and from the environment. N. Z. Vet. J. 35, 114-115. CLSI (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE) (2011): Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard-Second Edition. CLSI document M24-A2. CLSI, Wayne, PA, USA. CLSI (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE) (2013): Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Fourth Edition. CLSI document VET01-A4. CLSI, Wayne, PA, USA. CLSI (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE) (2015): Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals, CLSI Document VET01-S. 3rd ed. CLSI, Wayne, PA, USA. CRUCHAGA, S., PÉREZ-VÁZQUEZ, M., ROMÁN, F., CAMPOS, J. (2003): Molecular basis of rifampicin resistance in Haemophilus influenzae. J. Antimicrob. Chemother. 52, 1011-1014. FEY, K., Schmid, P., (1995): Empfindlichkeit bakterieller Krankheitserreger aus dem Respirationstrakt von Pferden gegenüber Trimethoprim, Sulfadoxin, Sulfadimethoxin und Kombinationen dieser Wirkstoffe. Tierärztl. Prax. 23, 148-154 FINES, M., PRONOST, S., MAILLARD, K., TAOUJI, S., LECLERCQ, R. (2001): Characterization of mutations in the rpoB gene associated with rifampin resistance in Rhodococcus equi isolated from foals. J. Clin. Microbiol. 39, 2784-2787. GIACOMETTI, A., CIRIONI, O., ANCARANI, F., DEL PRETE. M. S., FORTUNA, M., SCALISE, G. (1999): In vitro activities of polycationic peptides alone and in combination with clinically used antimicrobial agents against Rhodococcus equi. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 2093-2096. GIGUÈRE, S., HONDALUS, M. K., YAGER, J. A., DARRAH, P., MOSSER, D. M., PRESCOTT, J. F. (1999): Role of the 85-kilobase plasmid and plasmid-encoded virulence-associated protein A in intracellular survival and virulence of Rhodococcus equi. Infect. Immun. 67, 3548-3557. GIGUÈRE, S., JACKS, S., ROBERTS, G. D., HERNANDEZ, J., LONG, M. T., ELLIS, C. (2004): Retrospective comparison of azithromycin, clarithromycin, and erythromycin for the treatment of foals with Rhodococcus equi pneumonia. J. Vet. Intern. Med. 18, 568-573.
Literaturverzeichnis
34
HOLLBERG, A. (2011): Untersuchung zur Antibiotika-Resistenzsituation von Rhodococcus equi bei Fohlen deutscher Pferdebestände. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. JACKS, S. S., GIGUÈRE, S., NGUYEN, A. (2003): In vitro susceptibilities of Rhodococcus equi and other common equine pathogens to azithromycin, clarithromycin, and 20 other antimicrobials. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 1742-1745. KADLEC, K., VAN DUIJKEREN, E., WAGENAAR, J. A., SCHWARZ, S. (2011): Molecular basis of rifampicin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius isolates from dogs. J. Antimicrob. Chemother. 66, 1236-1242. KEDLAYA, I., ING, M. B., WONG, S. S. (2001): Rhodococcus equi infections in immunocompetent hosts: case report and review. Clin. Infect. Dis. 32, E39-46. MAGNUSSON, H. (1923): Spezifische infektiöse Pneumonie beim Fohlen. Ein neuer Eitererreger beim Pferde. Arch. Wiss. Prakt. Tierheilk. 50, 22-38. MCNEIL, M. M., BROWN, J. M. (1992): Distribution and antimicrobial susceptibility of Rhodococcus equi from clinical specimens. Eur. J. Epidemiol. 8, 437-443. MEYER, E., GASTMEIER, P., DEJA, M., SCHWAB, F. (2013): Antibiotic consumption and resistance: Data from Europe and Germany. Int. J. Med. Microbiol. 303, 388-395.
MEYER-HAMME, M. B. (2004): Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus aus Nasentupfern und Tracheobronchialsekret von lungenkranken Fohlen. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. NIWA, H., HOBO, S., ANZAI, T, HIGUCHI, T. (2005): Antimicrobial Susceptibility of 616 Rhodococcus equi Strains Isolated from Tracheobronchial aspirates of foals suffering from respiratory disease in Japan. J. Equine Sci. 16, 99-104. NORDMANN, P., RONCO, E. (1992): In-vitro antimicrobial susceptibility of Rhodococcus equi. J. Antimicrob. Chemother. 29,383-393. PRESCOTT, J. F. (1981): The susceptibility of isolates of Corynebacterium equi to antimicrobial drugs. J. Vet. Pharmacol. Ther. 4, 27-31. PRESCOTT, J. F. (1991): Rhodococcus equi: an animal and human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 4, 20-34.
Literaturverzeichnis
35
PRESCOTT, J. F., HOFFMAN, A. M. (1993): Rhodococcus equi. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 9, 375-384. ROTHAAR, E. (2006) Zur Entwicklung der Empfindlichkeit von Rhodococcus equi gegenüber Antibiotika. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. SCHWARZ, S., SILLEY, P., SIMJEE, S., WOODFORD, N., VAN DUIJKEREN, E., JOHNSON, A. P., GAASTRA, W. (2010): Editorial: Assessing the antimicrobial susceptibility of bacteria obtained from animals. J. Antimicrob. Chemother. 65, 601-604. SINGER, R. S., FINCH, R., WEGENER, H. C., BYWATER, R., WALTERS, J., LIPSITCH, M. (2003): Antibiotic resistance - the interplay between antibiotic use in animals and human beings. Lancet Infect. Dis. 3, 47-51. SPARKS, S: E:, JONES, R. L., KILGORE, W. R. (1988): In vitro susceptibility of bacteria to a ticarcillin-clavulanic acid combination. Am. J. Vet. Res. 49, 2038-240 SWEENEY, C. R., SWEENEY, R. W., DIVERS, T. J. (1987): Rhodococcus equi pneumonia in 48 foals: Response to antimicrobial therapy. Vet. Microbiol. 14, 329-336. TAKAI, S., TAKEUCHI, T., TSUBAKI, S. (1986): Isolation of Rhodococcus (Corynebacterium) equi and atypical mycobacteria from the lymph nodes of healthy pigs. Nihon. Juigaku. Zasshi. 48, 445-448. TAKAI, S., SASAKI, Y., TSUBAKI, S. (1995): Rhodococcus equi Infection in Foals - Current Concepts and Implication for Future Research. J. Equine Sci. 6, 105-119 VENNER, M. (2009): Untersuchungen zur Rhodococcus equi-Pneumonie des Fohlens: Diagnostik, Therapie, Prävention. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Habil. VENNER, M., CREDNER, N., LÄMMER, M., GIGUÈRE, S. (2013): Comparison of tulathromycin, azithromycin and azithromycin-rifampin for the treatment of mild pneumonia associated with Rhodococcus equi. Vet. Rec. 173, 397.
Literaturverzeichnis
36
WALLMANN, J., BÖTTNER, A., GOOSSENS, L., HAFEZ, H. M., HARTMANN, K., KASPAR, H., KEHRENBERG, C., KIETZMANN, M., KLARMANN, D., KLEIN, G., KRABISCH, P., KÜHN, T., LUHOFER, G., RICHTER, A., SCHULZ, B., SCHWARZ, S., SIGGE, C., TRAEDER, W., WALDMANN, K.-H., WERCKENTHIN, C.; WORKING GROUP ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF THE GERMAN VETERINARY SOCIETY, ZSCHIESCHE, E. (2006): Results of an interlaboratory test on antimicrobial susceptibility testing of bacteria from animals by broth microdilution. Int. J. Antimicrob. Agents. 27, 482-490. WILSON, M. M. (1955): A study of Corynebacterium equi infection in a stud of thoroughbred horses in Victoria. Aus. Vet. J. 31, 175-181. WOOLCOCK, J. B., MUTIMER, M. D. (1980): Corynebacterium equi: in vitro susceptibility to twenty-six antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 18, 976-977. YAGER, J. A. (1987): The pathogenesis of Rhodococcus equi pneumonia in foals. Vet. Microbiol. 14, 225-232. ZACZEK, A., BRZOSTEK, A., AUGUSTYNOWICZ-KOPEC, E., ZWOLSKA, Z., DZIADEK, J. (2009): Genetic evaluation of relationship between mutations in rpoB and resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampin. BMC Microbiol. 9, 10.
MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für verschiedene Wirkstoffe: Ergebnisse
verschiedener Studien
Danksagung
Ganz besonderer Dank gilt Prof. Dr. Stefan Schwarz und PD Dr. Christiane
Werckenthin, die mir die Bearbeitung dieses Projektes anvertraut haben. Danke für Eure Unterstützung, die Hilfestellung bei Problemen jeglicher Art und die vielen sehr fruchtbaren Gespräche.
Sehr dankbar bin ich auch Andrea Feßler, PhD, für ihr außergewöhnlich großes Engagement und Herz. Du hattest zu jeder Tages- und Nachtzeit ein offenes Ohr für meine Probleme und meist auch eine Lösung. Deine unglaubliche Sorgfalt bei der Durchsicht von Manuskripten ist trotz der Nerven, die sie uns beide gekostet hat, unbezahlbar!
Prof. Dr. Heiner Niemann danke ich für die freundliche Aufnahme ins Institut für Nutztiergenetik, Friedrich-Loeffler-Institut, in Neustadt-Mariensee und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes.
Die Laborvergleichsuntersuchung, deren Auswertung Teil dieser Arbeit ist, hat Dr.
Heike Kaspar organisiert und mir die Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Neben dieser fachlichen Unterstützung danke ich Dir aber auch für Deine fröhliche und unkomplizierte Art, die mir so machen Nervenzusammenbruch erspart hat.
Danke an das gesamte Laborteam der MMA in Mariensee für die Einarbeitung in die Mikrobiologie sowie Eure zahlreichen Ratschläge bei jeglichen Kapriolen meiner Rhodokokken. Im Besonderen danke ich Vivian Hensel für die Begleitung meiner ersten Schritte im Labor und für ihr Radio; Ina Ott für ihre großartige Hilfe bei der Massenabfertigung und ‚Hakuna Matata’ und Regina Ronge für die Herstellung absurder Mengen Flüssigmedien und Agarplatten sowie ihre unermüdliche Arbeit in der Spülküche.
Dr. Dieter Klarmann gebührt nicht nur ein Dankeschön für die freundliche Aufnahme im LVI Oldenburg. Darüber hinaus hat er mit den zahlreichen fachlichen Gesprächen, die unter anderem beim Einhalten der Kühlkette entstanden sind, meinen Horizont erweitert.
Das Diagnostik-Team des LVI Oldenburg hat bereits im Vorfeld meiner Arbeit unermüdlich Arcobacter- und Trueperella-Isolate gesammelt und asserviert – Danke dafür, auch wenn sie nun kein Teil dieser Dissertation geworden sind. Trotz Eures eigenen Routine-Stresses habt ihr all meine Fragen immer freundlich beantwortet, mir geholfen, wo ihr nur konntet, mich ab und zu in meinem Container-Exil besucht und mir zugehört, wenn ich mal Probleme loswerden musste. Danke an Euch alle für die wunderbare Zeit in Oldenburg!
Auch dem fröhlichen PCR-Team des LVI Oldenburg möchte ich einen Dank aussprechen. Ihr habt mir sehr geholfen und mich darin bestätigt, dass nicht ich zu blöd bin, sondern meine PCR.
Ein großes Dankeschön geht an Erdal Erol PhD, Dr. Ellen Prenger-Berninghoff,
Dr. Ivonne Stamm, Dr. Anton Heusinger und Dr. Reinhard Böse. Die vielen Rhodokokken, die all diese Kollegen mir zur Verfügung gestellt haben, waren die Basis meiner Arbeit und somit wäre ohne Sie alle diese Arbeit nie zustande gekommen.
Sarah, Moni, Sonja, Kristina und Carmen: Ihr seid absolut wundervolle Kolleginnen! Dank Eurer guten Laune und Verrücktheit, Euren jederzeit offenen Ohren und Türen, und vielen fachlichen und privaten Gesprächen war meine Zeit in Mariensee großartig. Doktor-Schwestern for life!
Andreas, Ralf, Sven und Boyung, sowie allen ‚Nebendarstellern’ unserer Laufgruppe danke ich für den gemeinsamen Kampf gegen den inneren Schweinehund und den Ausgleich zur Laborarbeit.
Für Ablenkung zur rechten Zeit, motivierende Worte, kleine und große Abenteuer und für’s Zuhören, obwohl ihr nicht immer alles versteht, was ich so ‚blubbere’, danke ich all meinen Freundinnen – im besonderen Kerstin, Sarah, Lotte, Anita und Catherina – und meinen WGs, sowie Klaus.
Das riesenbergigste Dankeschön von allen geht an meine Familie. Euer Glaube an mich, Eure Unterstützung in allen Belangen und Euer Optimismus sind wertvollst. Ihr habt mich zu dem gemacht, was ich heute bin – danke dafür!
Der Beste kommt zum Schluss: Ich bin Dir unendlich dankbar für Deine Rücksichtnahme auf dieses Projekt und Deine Unterstützung dabei, für zahlreiche Motivationen, für’s Zuhören und für’s Reden. Mit Dir an meiner Seite ist der Alltag kunterbunt. Danke für Alles!