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의료관련감염균의 동정 및 감수성 시험법
원광의대 진단검사의학과
조지현 1. 의료관련감염균
2. 배양 동정과 감수성 검사 기본 원리와 실제
3. 표현형검사와 유전형검사
4. 그람양성구균 (MRSA, VRSA/VISA, CoNS, VRE)
: 감수성 판독기준, 감수성검사 실제와 문제점, Screening test
5. 그람음성간균 (CRE, MRPA, MRAB)
: 내성기전, 감수성 판독기준 및 기준의 변천, Carbapenemase 확인검사와 문제점
6. 질병관리본부의 자료소개
7. 실제감염관리
: 감염과 보균의 차이, 감시배양이란, 실제 어떻게? 크롬배지
* 참고자료
1) CLSI 2015 M100-S25 Performance Standards for AST
2) 질병관리본부. 의료관련감염병 표본감시안내 지침 2012.
3) 질병관리본부. 의료관련감염균 검사실 표준진단법 2012.
4) 질병관리본부. 카바페넴내성 장내세균속 감염관리지침 2012.
의료관련감염에서 분리된 균주 분포
① MRSA (Oxacillin >=4, Cefoxitin >=8ug/mL, mecA) - methicillin R S. aureus
② VRSA (>= 16 ug/mL), VISA (=> 4, =< 8 ug/mL) - vancomycin R S. aureus
③ VRE (>=32 ug/mL or vanA/vanB) - vancomycin R Enterococci
④ MRPA [(imipenem or meropenem or doripenem) - multiple R P. aeruginosa
& (gentamicin or tobramycin or amikacin)
& (ciprofloxacin or levofloxacin)]
⑤ MRAB [(imipenem or meropenem) - multiple R A. baumannii
& (gentamicin or tobramycin or amikacin)
& (ciprofloxacin or levofloxacin)]
⑥ CRE (imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem) - carbapenem R Enterobacteriaceae
* CRE vs CPE (carbapenase producing Enterobacteriaceae)
무균 검체 상재균 (+) 검체
종 류 혈액, 체액, 상처, 농 분변, 객담, 피부, 소변
채집과 운반
모든 과정을 무균 조작하여 오염을 허용하지 않음 - 증식 가능한 조건을 유지
오염은 불가피, 최소한의 오염만을 허용 - 증식은 억제하고 viability 유지
접 종 채취에서 접종까지 시간은 짧을수록 좋으나 일반적으로는 1-2시간이내.
단 혐기성 배양의 경우에는 즉시 접종하여야 함.
지체시 보관
세균이 견디지 못할 정도로 아주 오랜 시간이 지체되지 않는다면 오염을 피하여 실온에 보관할 수 있다(세균증식에 유리한 상태를 유지).
상재균의 증식을 피하기 위하여 냉장보관. 단, 병원균이 냉장온도에서 견딜 수 없는 경우는 제외.
배지 종류 및 선택
. 일반적으로 평판배지(agar) 2장 + 일반 액체 증균배지(broth) 1개 평판배지: Blood agar plate(그람양성, 음성모두), MacConkey agar(그람음성만 성장) 액체배지: thioglycollate broth-혐기성을 포함한 일반 세균의 증균(무균검체만 사용). . 상재균 존재검체에서는 목적세균에 합당한 선택증균 액체배지를 사용함. . 검체에서 주로 분리되는 세균에 의존하며, 추정되는 세균에 따라 추가할 수 있음.
배양법 및
기간
. 평판배지에서는 2일까지 관찰 후 완료.
. 액체 증균배지(thioglycololate broth)는 매일 관찰하여 균의 성장이 관찰되면 평판배지에 접종, 7일째에도 균성장 없으면 완료한다.
. 선택증균 액체배지를 이용하여 목적 세균만 증균 후 에 평판배지에 접종. . 선택평판배지를 사용하여 배양 1-2일에 목적 세균이 관찰되지 않으면 완료.
판정
• 미생물이 분리된 검체는 극히 일부 예외를 제외하고는 ‘microbiologically pathogen'으로 판정
• predominant microorganisms or known pathogen을 선택
1. Basic media – nutrient agar/broth 2. Enriched media – blood agar, chocolate agar, trypticase soy broth, thioglycollate broth 3. Enrichment media – selenite F broth 4. Selective media – SS agar, TCBS agar, Chrome agar 5. Differential media – MacConkey agar, TCBS, Chrome agar 6. Transport media – Cary Blair medium
< < C : \ D o k u m e n t e u n d E in s t e llu n g e n \ m . e r h a r d \ E ig e n e D a t e ie n \ A n a g n o s T e c - d c \ Z w is c h e n a b la g e \ D o k u m e n t B a n n e r . t x t > > S p e c [ B P = 3
3775
7075
8074
8744
10939
9453
9994
7980
10347
5015
7863
11572
7092
5931
9654
3581
6837
9330
7367
10226
8450
10608
11906
Power Ionising Vacuum NegativePower Ionising Vacuum NegativePower Ionising Vacuum Negative
The Acinetobacter baumannii group : a systemic review, Zhang et al. World Emerg Med, vol 4, No 3, 169-174, 2013
Characteristics of carbapenem-resistant Acinetobacter spp. other than A. baumannii in South Korea. Park YK et al. Int J Antimicrob Agents 2012;81-5. (Bacteremia 2003-2010)
Table 1. The distribution of the Acinetobacter baumannii group in clinical isolates
표현형 검사 vs 유전자형 검사: 상호 보완적 관계
표현형 (phenotype)
전체를 파악할 수 있다.
원인을 모른다.
보이는 것이 전부라고 할 수 없다.
시간이 걸린다(선택할 수 없다).
유전자형(Genotype)
아는 것만 확인할 수 있다.
모르는 것은 확인할 수 없다.
시간이 짧기도/길기도 하다.
비싸다.
Gram(+) Cocci MRSA VRSA/VISA, CoNS VRE
Staphylococcus b-lactam 감수성 검사
Test Results 해 석 (Susceptible to)
Penicillin Oxacillin (cefoxitin)
S
S
All Penicillins (penicillinasenase-labile, stable) B-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Cephems, Carbapenems
Low affinity penicillin-binding protein, PBP2a R to all currently available b-lactams (except ceftaroline, ceftobiprole)
Borderline resistance S. aureus (BORSA)
Hyperproduction of normal staphylococcal b-lactamases
Modified, normal PBPs with reduced affinity for b-lactams (MODSA) mecC (mecA homologue) modified, normal PBPs with reduced affinity Not always Oxacillin-R and Cefoxitin-R (oxacillin < cefoxitin) Not detected by tests directed at mecA or PBP2a
MRSA, Oxacillin/Cefoxitin 판독기준
Oxacillin disk (unreliable) -> Cefoxitin disk
Oxacillin Cefoxitin
For S. aureus & S. Lugdunensis
For CoNS except S. lugdunensis
Oxacillin Cefoxitin
Oxacillin MIC overcall resistance, 특히 non-S. epidermidis 중증감염 MIC 0.5-2.0 ug/mL -> mecA/PBP 2a or cefoxitin disk.
Screening Tests for MRSA in Staphylococcus species
Transmitted light . > 1 colony . light film of growth => MRSA
Tests for MRSA Detection Use of Vitek 2 antimicrobial Susceptibility Profile To Identify mecC in MRSA,
Cartwright et al. J Clin Microbiol, 2732-2734, 2013
Table 1. Results of Vitek 2 antimicrobial susceptibility testing of S. aureus isolates
Oxacillin MIC for CoNS
* Overcall Resistance for some species other than S. epidermidis. 특히 non-S. epidermidis 중증감염 (sterile sites) MIC 0.5-2.0 ug/mL
-> mecA/PBP 2a or cefoxitin disk.
VISA/VRSA
VRSA/VISA 중요성 Limited treatment options Resistant to oxacillin (MRSA) & other antimicrobial agents. Transmissible (?)
1,085 IGlycopeptides
Teicoplanin 0.1Vancomycin 0.1
SAU (%)
For CoNS
For S. aureus
Interpretive standards for Vancomycin/Teicoplanin
Vancomycin Disk test : Not differentiate VS-VI S. aureus, nor differentiate VS-VI-VR CoNS (유사한 억제대). VRSA는 no zone, >=7mm 이면 MIC 확인해야 함. MIC ≥ 8ug/mL S. aureus, ≥ 32ug/mL CoNS : reference Lab으로 보내기. For S. aureus, VSSA may become VI during the course of prolonged therapy. All VRSA = MRSA, Most VISA = MRSA
Teicoplanin Disk test : TR- & TI from TS is not known because of no reevaluation currently.
VRSA Concern: large outbreaks of VRSA acquiring vanA gene from enterococci
1st Case in USA 2002, 그후 많지 않은 수에서 발생
Not evolving or spreading rapidly
주요 관심대상이지만 발생이 낮고, 일반 검사실에서 검출 가능.
VRSA ≥ 16ug/mL
hVISA (heteroresistant VISA)
≤0.25 0.5 1 2 16 ≥32 4 8
VSSA ≤ 2ug/mL
VISA 4-8ug/mL
hVISA
Naturally 1/105-106 cells, Not possess vanA(or vanB, vanC) from VRE
Vancomycin MIC 8-16ug/mL (Vancomycin screen agar to detect, Disk diffusion will miss).
이전 vancomycin Tx
Vancomycin 치료에 실패
일부 Vancomycin MIC 1-2ug/mL, MRSA
heteroresistant VISA (hVISA)
Population Analysis Profiles-Area Under the Curve (PAP-AUC)
Modified PAP/AUC (Mu3 AUC)
E-test macrodilution
Disk-agar method
E-test GRD (glycopeptide resistance detection)
Standard E-test
: phenotypically susceptible to vancomycin using routine laboratory methods but contain vancomycin-intermediate subpopulations on culture,
hVISA, VISA review. Howden PB. Clin Microbiol Rev, Jan. 2010, p. 99–139
VRSA (& VRE) screening tests (≥ 8ug/mL)
Validated MIC method로 MIC confirm. MIC 4ug/mL fail to grow 가능성 부담.
35±2℃, ambient air.
6 ug/mL vancomycin
24 hours
Preferably, using a micropipette,
spot a 10-uL drop onto agar spot a 1-10uL drop onto agar
≤ 4 8-16 ≥ 32 ≤ 2 4-8 ≥ 16
일반 검사실방법으로 VISA/VRSA가 검출되는가? : 모든 검사방법이 VISA 와 VRSA를 검출하지는 못한다. VRSA are detected by
reference broth microdilution, agar dilution, Etest®, MicroScan® overnight and Synergies plus™; BD Phoenix™ system, Vitek2™ system, Vancomycin screen agar plate (BHI agar containing 6 µg/ml of vancomycin) Disk diffusion test
VRSA(vanA)는 no zone, >=7mm 이면 MIC 확인해야 함. Not differentiate VS-VI S. aureus, nor differentiate VS-VI-VR CoNS (유사한 억제대).
VISA are detected by non-automated MIC methods including
reference broth microdilution, agar dilution, and Etest® using a 0.5 McFarland standard inoculum.
Vancomycin screen agar plates: detect VISA (MICs 8 µg/ml), but ……(MICs 4 µg/ml). Automated methods: detect VISA (MICs 8 µg/ml), but …… (MICs 4 µg/ml).
hVISA ???
2 4 8
CoNS with Decreased Susceptibility to Glycopeptides
CoNS 중요성 difficult to determine the significance, increasing numbers of healthcare-associated infections
CoNS 의 Decreased Susceptibility to Glycopeptides 중요성 Limited treatment options. Detection can be difficult.
heteroresistance.
Identifying CoNS to species level about 20 CoNS species (S. haemolyticus and S. epidermidis) some species are more resistant outbreak recognition & tracking resistance trends
Can routine susceptibility tests detect these isolates? Not all methods.
Should be reported to infection control? Yes!
VRE : Enterococci 에서 2 가지 Vancomycin 내성양상
Intrinsic resistance
Enterococcus gallinarum, E. casseliflavus/E. flavescens
low-level resistance
vanC (intrinsic) low vancomycin MICs of 2 to 16 µg/ml, S to teicoplanin
Acquired resistance.
E. faecium, E. faecalis
vanA, vanB, vanC, vanD, vanE
그외 E. raffinosus, E. avium, E. durans,
기타 enterococcal spp. vanA high vancomycin (>128 µg/ml) & teicoplanin (≥16 µg/ml)
vanB lower vancomycin (MICs 16 to 64 µg/ml), S to teicoplanin (MICs ≤1 µg/ml).
Aids : In confirming intrinsic (vanC) or acquired resistance (vanA or vanB).
감염관리에서 중요성 vanA and vanB : transferable, spread from organism to organism. vanC genes : not transferable, less serious infections, no outbreaks.
감별: Motility, Yellow pigment, Susceptibility profile E. faecium, E. faecalis : non-motile, no pigment, E. casseliflavus/E. flavescens : motile, yellow E. Gallinarum : motile, no pigment
Vitek II: Van R, TPN S, but vanA(+)! => 처음 검출되었을 때에 유전자 검사
For VRE detection, a full 24hr incubation needed. Transmitted light: a haze or any growth in inhibition zone => confirm MIC MIC 8-16ug/mL: species identification
Test/Report Group
Antimicrobial Agent
Disk Content
Zone diameter Interpretive Criteria (nearest whole mm)
MIC Interpretive Criteria
(ug/mL)
S I R S I R
B Vancomycin 30ug ≥ 17 15-16 ≤ 14 ≤ 4 8-16 ≥ 32
Inv. Teicoplanin 30ug ≥ 14 11-13 ≤ 10 ≤ 8 16 ≥ 32
Enterococci, Vancomycin 판독기준
(VRSA &) VRE screening tests (≥ 8ug/mL)
35±2℃, ambient air.
6 ug/mL vancomycin
24 hours
≤ 2 4-8 ≥ 16 ≤ 4 8-16 ≥ 32
Preferably, using a micropipette,
spot a 10-uL drop onto agar spot a 1-10uL drop onto agar
Validated MIC method로 MIC confirm. Motility & Pigment procedure E. casseliflavus, E. gallinarum; vanC, 8-16ug/mL
Gram(-) bacilli CRE MRPA, MRAB
중요성 Treat a variety of serious infections by highly resistant organisms Treat nosocomial and mixed bacterial infections. R Limits therapeutic options, Transmissible
Activity : species dependent. Ertapenem - Enterobacteriaceae Meropenem - slightly more active than imipenem against G(-)
Acinetobacter spp. Cephalosporinase + Porin loss Carbapenemase
> 1 enzyme & > 1 porin modification : high MIC (>16 µg/ml). porin changes alone : lower MICs (2-8 µg/ml). AmpC-type enzyme or an ESBL, combined with porin loss.
Carbapenem resistant vs Carbpenemase producing Carbapenemase (outbreak, transmissible) vs non-carbapenemase producing
과거 입원(3개월 이내)에서 균이 분리되어 선제 격리된 환자는 감시배양에서 2-3회 음성(1-2일 간격)이면 격리 해제
환자의 퇴원여부에 대해서는 임상판단에 따르며, 다제내성균의 보균상태로 인해 퇴원을 연기할 근거는 없음. 다만 퇴원 시 접촉주의지침에 대한 교육을 시행하고, 타 의료시설로 전원할 경우 전원 대상시설에 다제내성균에 관한 정보 제공.
CRE
Carbapenemase 생성 CRE 감염관리 지침
HOW
HOW
HOW
Carbapenemase 생성 CRE 감염관리 지침
1. 과거 입원(3개월 이내) 당시 균이 분리되었던 사실이 확인되는 경우에는
즉시 격리조치를 취하고 선별검사(1-2일 간격)를 실시
vs 가능한 격리조치를 취하고
2. 능동감시대상 (선별검사 대상) 지정
3. 집단감염발생 시 관리
CRE/카바페넴분해효소 생성 CRE 감시배양 질병관리본부
Carbapenemase 생성 CRE에 대한 검사실내 감시지침
병원에서 적절한 선택 Vancomycin R Enterococcus
Bile-esculin broth
(VAN. 6µg/ml)
ChromID-VRE E. Faecalis E. faecium
Rectal swab Stool
배양
Multiplex PCR vanA, vanB,
vanC
Any Specimen
동정, 감수성
보균자 환 자
정의: Culture media for the simple and fast detection of bacteria The chromogenic mixture contains chromogenic substrates Certain enzymes, produced by some bacteria, cleave substrates -> coloration of colonies. Easy to read, Reliable sensitivity/specificity/confirmation, In 18-24 hours