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ENZIMI
Tutti gli enzimi sono PROTEINE che funzionano da
catalizzatori
biologici nelle reazioni cellulari (sono in grado di aumentare
la
velocità delle reazioni biologiche anche di 1020 volte).
Gli enzimi catalizzano le reazioni con una Specificità molto
elevata: quando un enzima funziona correttamente non si formano
mai
prodotti secondari di reazione (che potrebbero essere
potenzialmente tossici per la cellula)
Durante la reazione l’enzima può essere temporaneamente
modificato ma
alla fine del processo ritorna nel suo stato originario, un
enzima viene
«riciclato» in modo da poter prendere parte alla stessa reazione
numerose
volte.
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Affinché un enzima funzioni correttamente è essenziale:1) Che
conservi la sua conformazione nativa: struttura proteica
tridimensionale biologicamente attiva
2) Condizioni appropriate di temperatura e pH, che influenzano
la stabilità della struttura proteica degli enzimi e quindi la loro
attività catalitica. Ogni enzima possiede un intervallo ideale di
valori di temperatura e pH all’interno del quale è attivo.
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3D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, Fondamenti di biochimica,
Zanichelli editore 2017
3) La presenza di gruppi funzionali specifici che partecipano
alla catalisi (quelli delle catene laterali dei suoi residui
amminoacidici e/o quelli di cofattori)
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CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI
1. OSSIDORIDUTTASI (CATALASI, OSSIGENASI, IDROSSILASI,
DEIDROGENASI, OSSIDASI, REDUTTASI, PEROSSIDASI)
Reazioni di ossidoriduzione
2. TRASFERASI (TRANSALDOLASI, TRANSCHETOLASI, ACIL-, METIL-
GLUSOSIL-, FOSFORIL-TRASFERASI,CHINASI, FOSFOMUTASI)
Reazioni di trasferimento di gruppi chimici da un substrato ad
un altro
3. IDROLASI (ESTERASI, GLICOSIDASI, PEPTIDASI, FOSFATASI,
TIOLASI, FOSFOLIPASI, AMIDASI,DEAMMINASI, RIBONUCLEASI)
Reazioni di idrolisi, di rottura di legami tramite l’acqua
4. LIASI (DECARBOSSILASI, ALDOLASI, IDRAATSI, DEIDRATASI,
SINTASI, LIASI)Reazioni di scissione di un legame C-C, o C-N, o
eliminazione di CO2 o di formazione diun nuovo legame
5. ISOMERASI (ISOMERASI, MUTASI, RACEMASI, EPIMERASI)Reazioni di
spostamento di un gruppo o di un doppio legame all’interno di una
stessamolecola
6. LIGASI (SINTETASI, CARBOSSILASI)Reazioni di formazione di un
nuovo legame C-C che richiedono l’intervento dell’ATP
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L’enzima partecipa alla reazione che catalizza senza modificare
lo stato di equilibrio della reazione. L’enzima non modifica la
variazione di energia libera tra reagenti e
prodotti che si verifica durante la reazione.L’enzima accelera i
tempi con cui reagenti e prodotti raggiungono l’equilibrio.
ΔG0 = variazione di energia libera della reazione (rende conto
della spontaneità dellareazione, non della sua velocità)ΔG0 < 0
= reazione esoergonica (spontanea) (A→B)ΔG0 > 0 = reazione
endoergonica (non spontanea) (è spontanea la reazione inversa
B→A)
Per es.: A B
GA = Energia libera reagentiGB = Energia libera prodotti
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A BΔG1
0‡ = Eatt della reazione direttaΔG-1
0‡ = Eatt della reazione inversa
Affinché avvenga la trasformazione dei reagenti in prodotti è
necessario superare
un dislivello energetico: ENERGIA DI ATTIVAZIONE
(ΔG0‡)
STATO DI TRANSIZIONE: è il momento più difficile della reazione,
in cui lemolecole sono orientate, avvicinate e subiscono
distorsioni,contemporaneamente si rompono alcuni legami e se ne
formano degli altri.
È l’energia necessaria a raggiungere e superare lo stato di
transizione della reazione.
Ostacoli da superare1) URTI MOLECOLARI2) ORIENTAMENTO3) FORZE
REPULSIVE4) DESOLVATAZIONE
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L’energia di cui necessitano le molecole di reagente per essere
trasformate inprodotto è fornita dalla En. cinetica che le molecole
stesse possiedono.
L’En. cinetica è convertita in energia libera G: le molecole di
reagente che hannoun’En. cinetica > all’Eatt superano lo STATO
DI TRANSIZIONE e si trasformano inprodotto.
Se l’Eatt è BASSA: un gran numero di molecole avrà l’en.
cinetica media≥ all’Eatt
Se l’Eatt è ALTA: un piccolo numero di molecole avrà l’en.
cinetica media≥ all’Eatt
LA VELOCITÀ DELLA REAZIONE è inversamente proporzionale
all’ENERGIA DI ATTIVAZIONE
La reazione sarà VELOCE
La reazione sarà LENTA
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8D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, Fondamenti di biochimica,
Zanichelli editore 2017
Cosa cambia in una reazione catalizzata?
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L’ENZIMA AGISCE ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE Modifica il
meccanismo della reazione e crea un ambiente in cui i reagenti
nonincontrano ostacoli alla reazione. Promuove direttamente
l’evento cataliticorilasciando il prodotto e ritornando inalterato
nel suo stato originario.
E + S
ΔG0‡ ES
ES‡
ES
EP‡
ΔG0‡ EP
E + P
S‡ (in assenza di enzima)
Stato intermedio della reazione che si trova ad un minimo
energetico
Substrato(reagente)
ProdottoComplesso
Enzima/substrato
Complessi transitori
S + E ES E + P
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S + E ES E + PS + E ES E + P
L’interazione fra enzima e substrato (o più substrati) è
reversibile. La formazione del complesso ES comporta il legame fra
il SITO ATTIVO
dell’enzima e il substrato/i.
Tasca della proteina in cui sporgono le catene laterali di
alcuni residuiamminoacidici che costituiscono il sito di legame per
il substrato (responsabiledella specificità) e di altri residui
amminoacidici, o cofattori che costituiscono il sitocatalitico
(responsabile dell’evento catalitico)
La formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il
substrato è un processo esoergonico: libera ENERGIA DI LEGAME che
va ad abbassare
la barriera costituita dall’Enatt.
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
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EP
Quando il substrato si lega al sito attivo dell’enzima (ES),
viene bloccato nella corretta posizione
(La specificità di legame fa si che il complesso ES si formi
molto facilmente).
S = substrato da scindere
stato di transizione
Il substrato viene desolvatato e nel sito attivo subisce
distorsioni in modo che gli atomi che
devono reagire sono avvicinati.
Le interazioni fra sito attivo di un enzima e substrato
diventano ottimali
solo quando è raggiunto lo stato di transizione del passaggio ES
→ E + P
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6 | 12Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER,
Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014
Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato
la reazione non procederebbe
Substrato
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La specificità del legame enzima/substrato può essere spiegata
col modello chiave-serratura di Fisher
Il sito attivo possiede dei punti di ancoraggio specifici per i
gruppi funzionali del substrato
Il potere catalitico di un enzima può essere spiegato col
modello dell’adattamento indotto di Koshland
L’enzima ha un sito che può alloggiare in modo specifico un
substratoma questo sito diventacomplementare al substratosolo nello
stato di transizionee solo attraverso uncambiamento
conformazionaledell’enzima stesso
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Quando si forma il complesso ES, nel distorcere il substrato,
l’enzimastesso cambia conformazione adattando perfettamente la
forma delsito catalitico allo stato di transizione del substrato e
presentando adesso i suoi gruppi catalitici.
esochinasi (è una trasferasi: trasferisce sul C-6 del glucosio
un gruppo fosfato donato dall’ATP e produce glucosio-6-fosfato)
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velocità di reazione
Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione
enzimatica
Optimum di temperatura: è diverso per i diversi enzimi
La velocità di reazione aumenta all’aumentare della temperatura
sino a raggiungere un valore massimo (Mantenendo costanti pH, [E] e
[S])
A T° superiori a quella ottimale:
- sono alterate le interazioni che consentono la formazione di
ES;
- l’enzima va incontro a modificazioni strutturali del
sito attivo (rottura dei legami deboli, denaturazione)
Temperatura (C°)
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Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica
Da ricollegare al diverso stato di protonazione delle catene
laterali di residui amminoacidici che costituiscono il sito
catalitico e il sito di legame per il substrato.
Vel
oci
tà d
i rea
zio
ne
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CINETICA ENZIMATICAGli esperimenti di cinetica enzimatica si
basano sulla determinazione della velocità
di reazione, misurata come variazioni della concentrazione del
prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo.
S → P[P] = aumenta nel tempo[S]= diminuisce nel tempo
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
All’inizio della reazione la velocità è molto elevata. Ma col
procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la
velocità
non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e
la reazione tenderà a
raggiungere l’equilibrio.
[S] [P]
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S → P v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
Problema: se miscelo un enzima con diverseconcentrazioni di
substrato (5, 10 o 20 mM,per es…), come varia la velocità
dellareazione alle diverse concentrazioni disubstrato
utilizzate?
[P][S] =5 mM
[P][S] =10 mM[P][S] =20 mM
Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45
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Devo misurare la velocità della reazione alMOMENTO INIZIALE
(entro i primi 30-50 sec),quando la quantità di prodotto formato è
moltobassa e la concentrazione del substrato ha unvalore preciso e
noto (quello iniziale stabilito dallosperimentatore).
In questo modo posso associare al valore di [S] utilizzata un
dato valore di V0 (velocità iniziale)
tempo
[P][S]La velocità della reazione aumenta
all’aumentare della [S], ma per avere un valore preciso devo
considerare la VELOCITA’
INIZIALE di reazione
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Substrato [S] = 1 mM
enzimaProdotto
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
[S] = 1 mM
[S] = 5 mM
Substrato [S] = 5 mM
Substrato [S] = 2 mM
[S] = 2 mM
Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1
solo stadio intermedio):1) miscelo l’enzima con il suo substrato,
lavoro a temperatura e pH costanti,2) Preparo un certo numero di
miscele di reazione in cui la [E] è inalterata, ma la [S] è
diversa: per ogni esperimento misuro come varia la
concentrazione del prodotto che siforma nel tempo.
COME DETERMINO LA VELOCITA’ INIZIALE?
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v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
-1/Δt = k(costante di
velocità specifica per ogni reazione)
-Reazione di 1°ordine-
3) Osservo che a velocità di reazione aumenta all’aumentare
della concentrazionedel substrato utilizzata come in una reazione
di 1° ordine.
v = k [S]
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt
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v0 (3)
(4)
v0 (2)
v0 (1)
- La v0 aumenta all’aumentare della concentrazione di
reagente[Substrato] usata per la reazione.- La dipendenza di v0
dalla [S] è descritta da una curva iperbolica(Modello cinetico di
Micaelis-Menten)
VELOCITA’ INIZIALE (v0) è calcolata come pendenza della tangente
alla curva cinetica.Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a
diverse [S] viene calcolata la v0
4) Calcolo il valore della velocità di reazione nello stadio
iniziale (v0) alle diverse [S].
Ogni punto rappresenta un diverso esperimento, ed è definito da
due parametri: v0 e [S]
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Leonor Micaelis1875-1949
Maud Menten1879-1960
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ENZIMI CHE SEGUONO IL MODELLO CINETICO DI MICHAELIS-MENTEN
Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v0) dalla
concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO.
Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice
prevede:1 prima tappa veloce e reversibile (ΔG‡ minore e k
maggiore)
S + E ES
1 seconda tappa lenta e irreversibile (ΔG‡ maggiore e k minore)
che determina la velocità globale di reazione
ES E + P
k1
k-1
k2
k-2
k1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ESk-1 =
cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E +
Sk2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in
E + Pk-2 = talmente piccola da essere trascurabile
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Inserendo in un grafico i valori di v0 ottenuti per le diverse
[S] utilizzate ottengo una curva iperbolica
Concentrazione substrato [S] (mM) V
elo
cità
iniz
iale
v0
(μM
/min
)
Alte [S] = la v0 non varia molto alvariare di [S], l’enzima è
quasicompletamente saturato, vieneraggiunta asintoticamente una
velocitàdi reazione massima. La v0 nondipende più da [S].
Basse [S] = la velocità di reazione v0dipende strettamente dalla
[S],aumenta all’aumentare della [S]
Posso spiegare questo comportamento con un’equazione che correla
la v0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)
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S + E ES E + Pk1k-1
k2S + E ES E + Pk1k-1
k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1k-1
k21a tappa: Passaggio rapido
2a tappa: Passaggio lento
v = k2 [ES]
La v0 GLOBALE della reazione enzimatica dipende da [ES]
v = k1 [E] [S]
v = k-1 [ES]
v0 = k2 [ES]Questa equazione non è sufficiente a spiegare la
relazione iperbolica esistente tra v0 e [S].
[ES] = non è facilmentemisurabile, e k2 non è nota
Bisogna ricavare un’equazione alternativa partendo dalla
considerazione che la [ES] rimane costante nel tempo della
reazione, e che la 1a tappa della reazione enzimatica raggiunge
rapidamente lo STATO STAZIONARIO
S + E ESk1
k-1
S + E ESk1
k-1
k1
k-1
-
STATO STAZIONARIO
La concentrazione dell’enzima libero[E] in soluzione diminuisce
manmano che va a formare il complesso[ES].
Ma poiché il complesso ES èdemolito continuamente (in E + S o
inE + P), l’ENZIMA è di nuovo resolibero.
COMPLESSIVAMENTE [ES] RIMANE COSTANTE NEL TEMPO
Tempo
[P][S]
[ES]
[E]
-
[E] = [E]TOT – [ES] poiché la concentrazione TOTALE di Enzima è
[E]TOT = [E] + [ES]
Velocità di Formazione di ES (E + S → ES): V = k1 [E] [S] = k1
([E]TOT—[ES]) [S]
[ES] rimane costante: la velocità della sua formazione è uguale
alla velocità della sua demolizione
S + E ES E + Pk1k-1
k2S + E ES E + Pk1k-1
k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1k-1
k2
Velocità di Demolizione di ES (ES → S + E …..ES → P + E): V =
k-1 [ES] + k2 [ES]V = [ES] (k-1 + k2 )
V formazione ES = V demolizione ES
k1 ([E]TOT—[ES]) [S] = [ES] (k-1 + k2 )
Riarrangiando l’equazione tramite operazioni algebriche si
ottiene che:
Se è raggiunto lo stato stazionario posso dire che:
([E]TOT — [ES]) [S] = ( k-1 + k2)[ES] k1
k-1 + k2k1
Costante di Michaelis-Menten
Km =
-
Il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES
e quella della sua
formazione è uguale alla COSTANTE DI DISSOCIAZIONE DEL COMPLESSO
ES
k-1 + k2k1
Costante di Michaelis-Menten
Km =
Semplificando i termini dell’equazione precedente si ottiene
che:
[ES] Km = [E]TOT [S] — [ES][S]
[E]TOT [S][ES] =
[S] + Km
[ES] Km + [ES][S] = [E]TOT [S]
[ES] (Km +[S]) = [E]TOT [S]
[E]TOT [S] — [ES][S] = [ES] Km
([E]TOT — [ES]) [S] = Km[ES]
-
[E]TOT [S][ES] =
[S] + Km
Poiché la v0 globale di reazione è :
v0 = k2 [ES] e quindi:[ES] = v0 / k2
k2[E]TOT [S]v0 =
[S] + Km
k2 [E]TOT = Vmax
Introduciamo un altro parametro importante: la Velocità massima
di reazione. Quando sono presenti nella miscela di reazione
concentrazioni saturanti di
substrato, allora, tutto l’enzima è complessato col substrato e
la [E]TOT = [ES]La velocità globale di reazione non dipende più
dalla concentrazione di
substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell’enzima:
v0 = k2 [ES] diventa Vmax = k2 [E]TOT
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Il valore della Km si può determinaresperimentalmente =
Corrisponde alla[S] alla quale raggiungo la metà dellaVmax. Ha le
unità di misura di unaconcentrazione
[S] (mM)
v 0(μ
M/m
in)
Equazione di Michaelis-Menten
La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S]
in modo iperbolico ed è correlata allaVmax (= k2[E]tot) e alla
Km
v0 = ½ VmaxKm + [S] = 2 [S]
Km = [S]
Vmax [S]v0 =
Km + [S]
Vmax [S]v0 =
Km + [S]
S + E ES E + Pk1
k-1
k2S + E ES E + Pk1
k-1
k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1
k-1
k2
Vmax [S]=
[S] + Km
Vmax [S]=
[S] + Km
1 [S]=
2 [S] + Km
1 [S]=
2 [S] + KmSolo se v0 = ½ Vmax
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La Km fornisce informazioni sull’affinità che un enzima ha nei
confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima
nei confronti di un dato substrato.Più è grande, minore sarà
l’affinità dell’enzima per il substrato (maggiore sarà la costante
di dissociazione del complesso ES, k-1 > k1)
Più è piccola maggiore sarà l’affinità (minore la costante di
dissociazione di ES, k1 > k-1)
k-1Km =
k1
k-1Km =
k1
(k2
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Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright
© 2007
La Km fornisce informazioni sulla efficienza della catalisi e
sul controllo della velocitàse [S] >> 10 Km → concentrazioni
saturanti di substrato, la reazione è molto efficienteperché quasi
a Vmax, ma non controllabile variando la [S]se [S] > 10 Km
[S]