CURSUL 6
CURSUL 6
ENZIME UTILIZATE N TEHNOLOGIA ADN RECOMBINATTehnologia ADN
recombinat sau altfel intitulat clonare genic sau molecular este o
denumire general care cuprinde o serie de protocoale experimentale
ce conduc la transferul informaiei genetice (ADN) de la un organism
la altul. n practic sunt mai multe metode care conduc la acest
obiectiv, totui un experiment n urma cruia se obine un ADN
recombinat are paii generali descrii n figura 6.1.
Figura 6.1 Obinerea ADN recombinat (clonare). A) vector
clonare-plasmid (ADN int cu dimensiuni mici) i B) vector de clonare
bacteriofag (ADN int cu dimensiuni mari). ADN int este tiat cu
enzime de restricie iar vectorul este tiat cu acelai tip de enzime
de restricie sau cu enzime care conduc la formarea unor capete
complementare cu ale ADN int. Cele dou tipuri de fragmente ADN cu
capete complementare sunt sudate n prezena ADN ligazelor lund
natere un ADN recombinat.ADN-ul (ADN ce urmeaz a fi clonat, ADN
inserat, ADN int sau ADN strin) de la un organism donor este
extras, tiat (digerat) enzimatic i legat (inserat) la un alt ADN
(vector de clonare) formnd o nou molecul ADN recombinat sau ADN
construct. Apoi ADN recombinat este transferat i meninut ntr-o
celul gazd. Procesul prin care are loc transferarea unui ADN ntr-o
bacterie poart numele de transformare. Celulele ce conin ADN
recombinat (transformate) sunt identificate i selectate (separate
sau izolate de cele ce nu conin ADN recombinat pe baza unei
proprieti) iar ADN int este clonat.Tehnologia ADN recombinat s-a
dezvoltat pe baza descoperirilor din biologia molecular,
enzimologia acizilor nucleici i genetica microrganismelor (att a
virusurilor ct i a bacterilor). Totui, tehnologia ADN recombinat nu
ar fi existat fr enzimele care recunosc secvene dublu catenare ADN
i care au capacitatea de a tia ADN la nivelul ambelor catene
denumite generic enzime de restricie sau endonucleaze de restricie.
6.1. Endonucleaze de restricie n cazul tehnicii de clonare
molecular, att sursa ADN ce conine ADN int ct i vectorul de clonare
trebuie tiate n fragmente discrete i reproductibile. Acest fapt a
fost posibil numai dup descoperirea unor enzime de origine
bacterian care au capacitatea de recunoate o anumit secven ADN i de
a tia moleculele de ADN la nivelul aceleiai secvene sau la nivelul
unor secvene aflate fie n aval fie n amonte fa de situsul de
recunoatere. Aceste enzime au fost formal numite endonucleaze de
restricie de tip II sau simplu enzime de restricie. n cadrul
acestui grup de enzime fac parte i alte tipuri de endonucleaze de
restricie fiind ncadrate n cadrul tipului I, III i IV. Endonucleaze
de restricie/metilare de tipul II a fost pentru prima oar observate
atunci cnd s-a analizat atacul bacteriofagilor asupra bacteriilor
obsevndu-se c un anumit bacteriofag poate infecta un anumit tip de
tulpin bacterian putnd urma ciclul litic (Fig.6.2). ns dac fagii
care au fost propagai pe o anumit tulpin bacterian (tulpina 1) sunt
transferai pe o alta (tulpina 2), ADN-ul bacteriofagului este
digerat de enzimele de restricie ale noii gazde (tulpina 2),
deoarece nu mai prezint acelai model de modificare ca i ADN-ul noii
tulpini sau altfel spus, fagul este restricionat la o anumit tulpin
bacterian.
Figura 6.2. Ciclul lizogenic i ciclul litic al fagului
Bacteriile prezint sisteme specifice de restricie-metilare formate
fie din endonuleaze i metilaze distincte (tipul II) care au aceeai
specificitate de secven (Fig.6.2), fie aceeai enzim are o funcie
dual de restricie-metilare (tipul I i III). Metilaza are
capacitatea de a metila un rest de citozin sau adenin din cadrul
secvenei recunoscut de enzima de restricie. Astfel, n urma
modificrii prin metilare situsul int devine rezistent la
restricie.
Figura 6.2. Sistemul restricie-metilare EcoRISistemul de
restricie-metilare ajut tulpina bacterien s fac distincia ntre
ADN-ul self i ADN non-self(fagic, plasmidial, cromosomal) pe care l
atac i l taie cu enzimele de restricie. Prima endonucleaz de
restricie de tip II caracterizat a fost izolat din Escherichia coli
i a fost denumit EcoRI (prima liter desemneaz genul, iar celelalte
dou specia bacterian, fiind scrise italic iar cea de a patra n
format normal provine de la tulpina bacterian; numerele romane
indic ordinea n care au fost descoperite sistemele de restricie ale
unei tulpini). Endonucleaza EcoRI este o protein homodimeric
(format din dou subuniti proteice identice) care se leag la o
regiune ADN ce prezint o secven palindromic (secven celor dou
catene complementare este identic dac este citit ntr-un singur sens
5-3). Secvena recunoscut de EcoRI este format din 6 pb i este tiat
ntre resturile de guanin i adenin pe fiecare caten (Figura 6.2).
EcoRI hidrolizeaz legtura fosfoesteric dintre oxigenul carbonului 3
al deoxiribozei nucleotidei ce areca baza azotat guanidine i
gruparea fosfat ataat la carbonul 5 al deoxiribozei nucleotidei
adiacente. Clivarea simetric a catenelor complementare a secvenei
palindromice ADN formeaz dou monocatene complementare avnd fiecare
ctre captul 5 o extensie de 4 nucleotide care se termin ntr-un rest
de fosfat, denumite capete coezive sau lipicioase (Figura 6.2
a).
De la izolarea endonucleazei EcoRI au fost caracterizate mai
mult de 3700 endonucleaze de restricie de tipul II cu peste 250 de
situsuri de recunoatere diferite din variate tipuri bacteriene.
Nomenclatura acestor enzime de restricie pstreaz aceleai reguli ca
cele utilizate pentru EcoRI. n plus la ora actual se dorete
renunarea scrierii italice a denumirii enzimelor de restricie.
Astfel genul bacteriei este scris cu litere mari,urmtoarele dou
litere scrise cu minuscule desemneaz specia bacterian. Tipul
bacteriei este ocazional trecut cu litere mari ca R n EcoRI iar
serotipul este desemnat cu o liter mic precum d n HindIII. Numerele
romane sunt utilizate pentru a desemna ordinea n care au fost
caracterizate enzimele de restricie provenite de la aceeai
bacterie. De exemplu HapI i HapII sunt prima i a doua enzim de
restricie de tip II izolat de la Haemophilus parainfluenzae.
Secvenele palindromice unde majoritatea enzimelor de restricie
de tipul II se leag i taie molecula de ADN sunt n interiorul
situsului de recunoatere. Unele endonucleaze de restricie cliveaz
molecula de ADN genernd extensii monocatenare la captul 5 fosfat
(capete coezive) (Figura 6.3 a), altele genereaz capete coezive la
captul 3 (Figura 6.3 b) iar unele genereaz capete oarbe, tind
simetric cele dou catene ADN complementare (Figura 6.3 c).
Figura 6.3. Enzime de restricie de tip II care genereaz capete
a) 5 coezive, b) 3 coezive i c) oarbe
Lungimea situsului de recunoatere pentru diferite enzime poate
fi de patru, cinci, ase, opt sau mai multe pb (Tabelul 6.1).
Datorit frecvenei mari n care apar n molecula de ADN, enzimele de
restricie care taie la nivelul situsurilor de patru i ase pb sunt
cele mai utilizate n tehnicile de clonare.
Tabelul 6.1 Situsurile de recunoatere ale unor endonucleaze de
restricie de tipII
EndonucleazSitusul de restricieTipul captului
BamHI
5coezive
PstI
3coezive
Sau3AI
5coezive
HaeIII
oarbe
NotI
5coezive
Tipul IIS de endonucleaze de restricie formeaz un subgrup aparte
al tipului II de enzime de restricie care sunt utilizate ocazional
n strategii de clonare sau n secvenierea multiplex. Aceste enzime
taie molecula de ADN la nivelul ambelor catene la un numar fix de
nucleotide fa de situsul de recunoatere. De exemplu, endonucleaza
de restricie FokI de leag la secvena i taie dup 9 nucleotide la
nivelul catenei 5-3 i la 13 dup situsul de recunoatere la nivelul
catenei 3-5, reprezentarea schematic a situsului de recunoatere i a
modului de tiere este: , formnd un capt coeziv de 4 nucleotide la
captul 5 (unde N poate fi A, C, G sau T). Pe scurt acest motiv
poate fi notat astfel: . Exemple de endonucleaze de restricie de
tipul IIS sunt redate n tabelul 6.2. Unele dintre aceste tipuri de
endonucleaze pot cliva molecula de ADN att n aval ct i n amonte fa
de situsul de recunoatere.Tabelul 6.2 Endonucleaze de restricie de
tip IIS
Endonucleaz de restricie IISSitus de recunoatere
AcuI
BfuAI
BsmBI
EciI
FokI
HgaI
MlyI
MmeI
n unele cazuri, diferite legturi fosfodiesterice din interiorul
aceluia situs de recunoatere sunt tiate de endonucleaze de
restricie provenite de la diferite specii bacteriene. De exemplu,
enzimele de restricie XmaI i SmaI recunosc amndou secvena dar XmaI
taie dup prima citozin 5 la nivelul fiecrei catene complementare
formnd capete coezive la captul 5 pe cnd SmaI genereaz capete oarbe
prin tierea ntre n mijlocul situsului de recunoatere. Prima n
ordinea descoperirii dintre endonucleazele de restricie care se
leag la un anumit situs poart numele de prototip. Orice alt enzim
de restricie care atac acelai situs de restricie ca i prototipul se
numete izoschizomer. De exemplu, endonucleazele de restricie XhoI i
PaeRI izolate din surse diferite au aceelai situs de recunoatere i
de tiere. Enzimele de restricie care recunosc acelai situs dar taie
n poziii diferite se numesc neoschizomere (Figura 6.4).
Figura 6.4 Enzime neoschizomere-endonucleazele KasI, NarI, SfoI
i BbeI se leag la acelai situs de recunoatere dar taie molecula de
ADN n poziii diferite
Endonucleazele de restricie care produc aceleai tipuri de capete
coezive (aceeai extensie de nucleotide) dar care au situsuri de
recunoatere diferite sunt denumite izocaudomere, cum ar fi BamHI i
Sau3AI (Figura 6.1B i Tabelul 6.1).
n unele cazuri, unele endonucleaze de restricie taie o secven
din molecula de ADN numai dac citozina situsului de recunoatere
este nemetilat pe cnd altele pot cliva aceeai secven de nucleotide
doar dac citozina este metilat. Astfel, HpaII taie numai situsul
nemetilat iar MspI izoschizomera enzimei HpaII cliveaz acelai situs
indiferent de starea de metilare a citozinei. Aceste perechi de
endonucleaze de restricie sunt adesea utilizate pentru a determina
statusul metilrii ADN genomic. Dac o molecul de ADN nu este tiat de
enzima HpaII, dar este tiat de MspI, atunci situsul de recunoatere
este metilat. Dac ambele enzime taie molecula de ADN, atunci
situsurile de recunoatere sunt nemetilate.
Realizarea hartilor situsurilor de restricie ale endonucleazelor
pentru o molecul/fragment ADN. Harille ce redau situsurile de
restricie la nivelul unui fragment ADN se realizeaz prin tratarea
respectivului fragment cu cte o enzim de restricie iar apoi cu
combinaii ale acelorai enzime de restricie. Poziia situsurilor unde
enzimele de restricie taie se pot deduce prin analiza marimii
fragmentelor ADN rezultate n urma digestiilor prin electroforez n
gel de agaroz. n figura 6.5 sunt redate mrimile fragmentelor ADN
rezultate n urma digestiei unui fragment ADN liniar de 16500 pb cu
enzima EcoRI, BamHI i cu un amestec al ambelor enzime (EcoRI i
BamHI). Fiindc digestia separat cu fiecare enzim n parte produce
trei fragmente ADN, nseamn c la nivelul fragmentului ADN supus
analizei exist dou situsuri de restricie pentru enzima EcoRI i dou
pentru enzima BamHI. n urma digestiei duble (EcoRI i BamHI),
fragmentul de 3000 pb rezultat n urma digestei doar cu EcoRI rmne
intact, pe cnd fragmentele de 8500 pb i 5000 pb sunt fragmentate.
Astfel, cele dou situsuri de restricie ale EcoRI sunt la o distan
de 3000 pb fr s conin un situs al BamHI, n schimb fragmentele EcoRI
de 8500 pb i 5000 pb conin fiecare cte un situs de restricie BamHI.
Fragmentul BamHI de 9500 pb este tiat de EcoRI n digestia dubl n
trei fragmente (2500+3000+4000=9500pb). Astfel, cele dou situsuri
de restricie ale BamHI se gsesc de o parte i de alta a fragmentului
EcoRI de 3000 pb, delimitnd fragmentele de 4000 pb i 2500 pb
rezultate din digestia dubl. Fragmentul EcoRI de 8500 pb este
fragmentat de BamHI n dou fragmente de 2500 i 6000 pb iar unul din
situsurile EcoRI se afl la 2500 pb de BamHI, astfel fragmentul de
6000 pb conine unul din capetele fragmentului original de 16500 pb.
Fragmentul EcoRI de 5000 pb este tiat de BamHI ntr-un fragment de
4000 pb i unul de 1000 pb, iar un situs al BamHI se afl la o distan
de 4000 pb fa de un situs EcoRI, deci fragmentul de 1000 pb conine
cellalt capt al fragmentului original de 16500. n figura 6.5 B este
redat harta situsurilor de restricie ale fragmentului de 16500 pb
rezultat n urma analizei redat mai sus.
n cazul moleculelor de ADN circular modul de construire al
hrilor situsurilor de restricie este similar cu excepia c dac o
enzim de restricie prezint trei situsuri de clivare n cadrul
moleculei de ADN circulare se formeaz trei fragmente. Astfel, un
plasmid de 12 kpb dac este analizat prin digestie cu enzimele
EcoRI, BamHI, HindIII i HaeII i cu combinaii luate cte dou ale
acestor enzime se obin fragmentele din tabelul 6.3 i harta
situsuilor de restricie din figura 6.6.
Tabelul 6.3 Mrimea fragmentelor ADN (kpb) rezultate n urma
digestiei simple i duble a ADN plasmidial de 12 kpb cu enzimele de
restricie EcoRI, BamHI, HindIII i HaeII
EcoRIBamHIHindIIIHaeIIEcoRI+
HaeIIBamHI+
HaeIIHindIII+
HaeIIEcoRI+
HindIIIEcoRI+
BamHIBamHI+
HindIII
12,012,012,06,05,06,06,06,510,58,0
4,04,04,02,55,51,54,0
2,02,01,52,0
1,00,51,5
n urma experimentelor de digestie cu enzime de restricie a unui
fragment ADN exist posibilitatea s rezulte fragmente de aceeai
mrime (pb) iar suma mrimii fragmentelor rezultate s fie mai mic
dect a fragmentului iniial. n urma electroforezei fragmentele de
aceeai mrime migreaz ntr-o singur band, care este ns mai intens
colorat sau mai groas fa de celelalte fragmente, fiind un indiciu c
n urma digestiei s-au obinut fragmente identice ca mrime.
La ora actual exist programe de calculator care sunt utilizate n
configurarea hrilor situsurilor de restricie pentru fragmente mai
mari de ADN care sunt cuplate la un sistem de electroforez capilar
ce poate separa fragmente ADN care difer printr-o singur pb.
Figura 6.6 Harta situsurilor de restricie ale enzimelor EcoRI,
BamHI, HindIII i HaeII la nivelul unui ADN plasmidial de 12.0
kpb
PAGE 10
_1417809589.unknown
_1417810051.unknown
_1417810242.unknown
_1417810918.unknown
_1417811136.unknown
_1418117386.unknown
_1417810382.unknown
_1417810126.unknown
_1417809837.unknown
_1417809926.unknown
_1417809716.unknown
_1417806553.unknown
_1417808521.unknown
_1417809223.unknown
_1417808242.unknown
_1417806489.unknown
_1417806500.unknown
_1417806478.unknown
_1417806431.unknown