Enzimas vo v

Cinética Enzimática

DRA. VALESKA ORMAZABAL V.

DEPTO. CIENCIAS BÁSICAS

FACULTAD DE MEDICINA

CURSO MEDICINA MED.207

2012

COOPERATIVIDAD

P PP PPL

L L

L

LL

L

L

LL

LK1 K2 K3 K4

K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva

K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa

K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad

Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando

Cooperatividad Positiva

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una

molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así

hasta ocuparse toda la molécula

s s s ss s

s

s

s s

+ + +

1 2 3

En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3

Por lo que cooperatividad negativa, es cuando la fijación de

una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.

El comportamiento cooperativo implica:

1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato

por molécula de enzima (estr.cuaternaria)

2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación

Cooperatividad Negativa

S

vo

Vmax Snh

vo = -----------------

Snh0,5 + Snh

1/S1/S1/S

1/vo

Tratamiento de Hill

Snh

Y = -------------

Snh0,5 + Snh

Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal

v

Y = ------------

Vmax

Saturación de la

enzima [Po2]nh

Y = ---------------

K` + [Po2]nh

S0,5 Concentración substrato la saturación

es igual ½ Vmax

nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana

S0,5 = Km

S

Y = ----------- =

S0,5 + S

v

------------

Vmax

S

= -----------

Km + S

nh>1 Cooperatividad positiva

nh<1 Cooperatividad negativa

2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

loglogmax

log

max1

loglog1

log

11

SnhSnhvoV

vo

voV

vo

Y

Y

SnhSnhY

Y

S

S

SS

S

SS

S

Y

Ynh

nh

nhnh

nh

nhnh

nh

maxV

vY

Reacción enzimática la

fracción de saturación

Representando la ecuación lineal

log [S]

0

Log[S0,5]

pendiente = nHill

La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill

S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad

máxima

voV

vo

maxlog

Obtención valor experimental del índice de Hill nos

permite deducir la existencia de cooperatividad.

nH indica cuántas de las zonas de unión de sustrato

de una enzima afectan a la afinidad de la unión del

sustrato en el resto de las zonas de unión.

nh>1

nh<1

nh=1

S

vo

Vmax Snh

vo = -----------------

Snh0,5 + Snh

1/S1/S1/S

1/vo

nh=1 nh<1nh>1

Significado Biológico de la

Cooperatividad

Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de

sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al

90%.

Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81

veces la concentración de sustrato para alcanzar el 90% de saturación

Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una

saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces la

concentración de sustrato.

Regulación Alostérica de la función enzimática

•La velocidad de una reacción enzimática depende de la

formación del complejo [ES].

¿ Es posible regular la actividad enzimática,

modificando la interacción enzima-sustrato?

Enzimas Alostéricas

•Evidencia Experimental:

Threonine

dehydratase

L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile-

- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de

inhibición.

- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora oefector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacciónque cataliza la enzima retroinhibida.

b) La mayor parte de las enzimas

cuya actividad se controla/regula

por este tipo de regulación, no

muestran cinéticas hiperbólicas

clásicas cuando se representa v

[S], sino que muestran una

cinética de tipo sigmoidal.

c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato.

Varios tratamientos químicos y físicos nos permiten “desensibizar” la enzima, es decir, hacerle

perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida

de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una

enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensibizada” muestra una cinética hiperbólica

semejante a la que presentan las enzimas michaelianas.

d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir,

proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas débiles.

* La unión de la molécula reguladora al “sitio de regulación” induce un cambio conformacional

reversible en la enzima que causa una alteración de la estructura del centro activo y los consiguientes

cambios en sus propiedades cinéticas.

- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

1. la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima

diferente del centro activo, de manera que la interacción entre la

molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o

“alostérica”, (del griego otra estructura).

Aspartato transcarbanilsa

Regulación Alostérica de la función enzimática

Inhibidores y activadoresalostéricos

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(+ Inhibidor)

(+ Activador)

(sin efectores)

V+

V0

V-

Los efectores alostéricos operan sobre el grado de

cooperatividad del sistema:

- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado de

cooperatividad

- Los activadores alostéricos disminuyen el grado de

cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,

la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.

Modelos que permiten explicar el fenómeno de Cooperatibidad

•Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux

•Modelo Secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer

T= estado Inactivo

R= Estado activo

Modelo Concertado

Estado Inactivo= T

Estado Activo=R

Modelo Secuencial

Permite explicar tanto la cooperatividadpositiva como negativa

Enzimas alostericas de

clase KEnzimas alostericas de

clase V

Aspartato transcarbamilasa