-
129
5c a p t u l o
c i n c o
Arriba: La enzima acetilcolinesterasa, con el inhibidor
reversible clorhidrato de donepecilo (Aricept, se muestra en rojo)
ocu-pando el sitio activo. Se usa Aricept para mejorar las
funciones mentales en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Se
creeque acta inhibiendo la descomposicin del neurotransmisor
acetilcolina en el cerebro, prolongando as los efectos del
neuro-transmisor. (Sin embargo, no afecta el curso de la
enfermedad). [PDB 1EVE]. (Vase esta figura a todo color al final
del libro).
Propiedadesde las enzimas
Se ha tenido la ocasin de comprobar de qu manera las formas
tridimensionales delas protenas les permiten desempear papeles
estructurales y de transporte. Ahorase describirn sus funciones
como enzimas. Las enzimas son catalizadores biolgi-cos selectivos
de una eficiencia extraordinaria. Toda clula viva dispone de
cientos de en-zimas distintas que catalizan las reacciones
esenciales para la vida. Aun los organismosvivos ms simples
contienen mltiples copias de cientos de enzimas diferentes. En los
or-ganismos multicelulares, el complemento de las enzimas vara de
un tipo celular a otro.La mayor parte de las enzimas que se
describen en este libro pertenecen a las ms comu-nes que son
virtualmente encontradas en todas las clulas. Estas enzimas
catalizan lasreacciones de las rutas metablicas centrales,
necesarias para mantener la vida.
La mayor parte de las reacciones catalizadas por enzimas no
procederan a veloci-dades apreciables bajo condiciones fisiolgicas
en ausencia de las enzimas. El papelprincipal de las enzimas es
aumentar las velocidades de tales reacciones. En forma tpi-ca, las
reacciones catalizadas por las enzimas son de 103 a 1020 veces ms
rpidas quelas mismas sin catalizar.
Un catalizador es una sustancia que acelera la llegada a un
equilibrio. Un cataliza-dor puede cambiar en forma temporal durante
la reaccin, pero no cambia en el proce-so general, porque se
recicla para participar en varias reacciones. Los reactivos se
unena un catalizador y los productos se disocian de l. Un
catalizador no cambia la posicindel equilibrio de la reaccin (es
decir, no hace que una reaccin no favorable sea favo-rable). Ms
bien reduce la cantidad de energa necesaria para que se efecte la
reaccin.Los catalizadores aceleran las reacciones tanto hacia
adelante como hacia atrs al con-vertir un proceso de uno o dos
pasos en varios pasos menores, cada uno con menornecesidad de
energa que la reaccin no catalizada. El captulo siguiente describe
losdetalles de la forma en que las enzimas actan como
catalizadores.
Las enzimas son muy especficas para los reactivos o sustratos
sobre los que actan,y vara el grado de especificidad hacia el
sustrato. Algunas enzimas actan sobre un gru-
-
130 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Las molculas de ARN cataltico se descri-ben en los captulos 21 y
22.
po de sustratos relacionados y otras slo sobre un simple
compuesto. Muchas enzimas po-seen estereoespecificidad ya que slo
actan sobre un estereoismero del sustrato. Quizel aspecto ms
importante de la especificidad de una enzima es la especificidad de
reac-cin, esto es, la falta de formacin de subproductos como
desperdicios. La especificidadde reaccin se refleja en la pureza
excepcional del producto (100% en esencia) muchomayor que la pureza
de productos de reacciones tpicas catalizadas en qumica orgnica.La
especificidad de las enzimas no slo ahorra energa a las clulas sino
que tambin evi-ta la formacin de productos metablicos
potencialmente txicos.
Las enzimas pueden hacer ms que slo aumentar la velocidad de una
sola reac-cin muy especfica. Algunas tambin pueden combinar, o
acoplar, dos reacciones quenormalmente seran separadas. Esta
propiedad permite que la energa ganada en unareaccin se use en una
segunda reaccin. Las reacciones acopladas son una propiedadcomn de
muchas enzimas; por ejemplo, la hidrlisis del ATP se acopla con
frecuenciaa reacciones metablicas menos favorables.
Algunas reacciones enzimticas funcionan como puntos de control
en el metabo-lismo. Como se podr apreciar, el metabolismo se regula
en una variedad de formas,que incluyen alteraciones en las
concentraciones de enzimas, sustratos e inhibidores deenzima, as
como la modulacin de los niveles de actividad de ciertas enzimas.
Las en-zimas cuya actividad es regulada, tienen en general, una
estructura ms compleja quelas enzimas no reguladas. Con pocas
excepciones, las enzimas reguladas son molculasoligomricas que
tienen sitios de enlace separados para sustratos y moduladores,
com-puestos que actan como seales de regulacin. El hecho de que la
actividad enzimti-ca pueda ser regulada es una propiedad importante
que distingue a los catalizadoresbiolgicos de los que se encuentran
en un laboratorio de qumica.
El nombre enzima deriva de una palabra griega que significa en
la levadura. In-dica que dichos catalizadores estn presentes en el
interior de las clulas. A finales delsiglo XIX se estudi la
fermentacin de los azcares por accin de clulas de levadura.Los
vitalistas (que sostenan que los compuestos orgnicos slo podan ser
formadospor clulas vivas) afirmaban que se necesitaban clulas
intactas para la fermentacin.Los mecanicistas decan que las enzimas
en las clulas de levadura eran las que catali-zaban las reacciones
de fermentacin. Esta ltima conclusin fue respaldada por la
ob-servacin de que los extractos de levadura, sin contenido de
clulas, pueden catalizar lafermentacin. A este hallazgo pronto
sigui la identificacin de las reacciones indivi-duales y de las
enzimas que las catalizan.
Una generacin despus, James B. Summer cristaliz, en 1926, la
primera enzima(ureasa) y demostr que era una protena. En la
siguiente dcada se purificaron cincoenzimas ms y se encontr que
tambin eran protenas: pepsina, tripsina,
quimotripsina,carboxipeptidasa y la enzima Old Yellow (una
flavoprotena NADPH oxidasa). Desdeentonces se ha demostrado que
casi todas las enzimas son protenas, o protenas mscofactores.
Algunas molculas de ARN tambin presentan actividad cataltica,
perousualmente no se les llama enzimas.
En este captulo se describe a las enzimas y sus propiedades,
comenzando con su cla-sificacin y nomenclatura. Despus se tratar el
anlisis cintico (mediciones de veloci-dades de reaccin) destacando
la forma en que los experimentos cinticos pueden revelarlas
propiedades de una enzima y la naturaleza de los complejos que
forma con los sustratosy los inhibidores. Por ltimo, se describen
los principios de inhibicin y activacin de enzi-mas reguladoras. En
el captulo 6 se explica la forma en que trabajan las enzimas a
nivelqumico y para ilustrar la relacin entre la estructura de la
protena y la funcin enzimticael uso de serina proteasas. El captulo
7 se dedica a la bioqumica de las coenzimas, mo-lculas orgnicas que
ayudan a algunas enzimas en su papel cataltico al proporcionar
gru-pos reactivos que no se encuentran en las cadenas laterales de
aminocidos. En los captulosrestantes se presentan muchos otros
ejemplos de las cuatro propiedades principales de lasenzimas: 1)
pueden desempearse como catalizadores, 2) catalizan reacciones muy
espec-ficas, 3) pueden acoplar reacciones y 4) su actividad puede
ser regulada.
5.1 Las seis clases de enzimas
Los nombres en la mayor parte de las enzimas metablicas se
forman agregando el su-fijo asa al nombre de sus sustratos, o a un
trmino descriptivo de la reaccin que ca-talizan. Por ejemplo, la
ureasa tiene a la urea como sustrato. La alcohol deshidrogenasa
-
5.1 Las seis clases de enzimas 131
1
23
4
56
Distribucin de todas las enzimas conoci-das por nmero de
clasificacin EC. 1: oxi-dorreductasas, 2: transferasas, 3:
hidrolasas,4: liasas, 5: isomerasas, 6: ligasas.
COO
C O
CH3Piruvato
NAD
COO
C HHO
CH3L-Lactato
+ + +NADH H
Lactatodeshidrogenasa
(5.1)
COO
C O
CH3Piruvato
+
COO
(CH2)2
COO
C HH3N
L-Glutamato
+
-Cetoglutarato
COO
C O
(CH2)2
COOL-Alanina
COO
C H
CH3
H3NAlanina transaminasa
(5.2)
O
P O
O
O PirofosfatasaH2O+PO
O
O
2
O
P O
O
HO
Pirofosfato Fosfato
(5.3)
cataliza la remocin de hidrgeno de los alcoholes (es decir, la
oxidacin de alcoholes).Unas pocas enzimas, como la tripsina y la
amilasa, se conocen por sus nombres histri-cos. Muchas enzimas
recin descubiertas reciben su nombre de acuerdo con sus geneso de
alguna caracterstica no descriptiva. Por ejemplo, el nombre de Rec
A se debe algen recA y el de HSP70 es de una protena de choque
producida por calor; ambas enzi-mas catalizan la hidrlisis del
ATP.
Un comit de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa
Molecular (IUBMB,de International Union of Biochemistry and
Molecular Biology) mantiene un esquema declasificacin que asigna
categoras a las enzimas de acuerdo con la clase general de reac-cin
qumica orgnica que es catalizada. Las seis categoras son:
oxidorreductasas, trans-ferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y
ligasas; se definirn ms adelante con un ejemplopara cada una. El
esquema de clasificacin de la IUBMB asigna un nmero nico, lla-mado
nmero de clasificacin de la enzima, o nmero EC (de enzyme
classification)para cada enzima. La IUBMB tambin asigna un nombre
sistemtico a cada enzima. Elnombre sistemtico puede ser distinto
del nombre comn de la enzima. En este libro,usualmente se referir a
las enzimas por sus nombres comunes. La base de datos de
laclasificacin completa, se puede ver en
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.
1. Las oxidorreductasas catalizan las reacciones de
oxidacin-reduccin. La ma-yor parte de esas enzimas se llaman, en
general, deshidrogenasas. Tambin hayotras enzimas en esta clase que
se llaman oxidasas, peroxidasas, oxigenasas o re-ductasas. En
bioqumica hay cada vez ms la tendencia a citar esas enzimas porsu
nombre formal, oxidorreductasas, y no por los nombres ms comunes en
laspublicaciones no muy recientes de bioqumica. Un ejemplo de una
oxidorreduc-tasa es la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27),
llamada tambin lactato:NADoxidorreductasa. Esta enzima cataliza la
conversin reversible de L-lactato en pi-ruvato. La oxidacin de
L-lactato se acopla a la reduccin de la coenzima nicoti-namida
adenina dinucletido (NAD).
2. Las transferasas catalizan las reacciones de transferencia de
un grupo y puedennecesitar la presencia de coenzimas. En las
reacciones de transferencia de grupo,una parte de la molcula del
sustrato se suele enlazar en forma covalente con laenzima o con su
coenzima. Este grupo incluye las cinasas, enzimas que catalizanla
transferencia de un grupo fosforilo del ATP. La alanina
transaminasa, cuyonombre sistemtico es L-alanina:2-oxiglutarato
aminotransferasa (EC 2.6.1.2), esun ejemplo tpico de esta
clase.
3. Las hidrolasas catalizan hidrlisis. Son una clase especial de
transferasas dondeel agua sirve como aceptor del grupo transferido.
La pirofosfatasa es un ejemplosencillo de una hidrolasa. El nombre
sistemtico de esta enzima es difosfato fos-fohidrolasa (EC
3.6.1.1).
-
132 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
C O
CH3Piruvato
+ H ODixido de
carbono
+CO
CH3Acetaldehdo
HPiruvatodescarboxilasa
COO
C O (5.4)
Alaninaracemasa
HC
L-Alanina
COO
CH3D-Alanina
COO
NH3CH
CH3
H3N (5.5)
NH4
L-Glutamato
COO
(CH2)2C
C HH3N
OO
ATP ++
L-Glutamina
COO
(CH2)2
C
C HH3N
O NH2
PiADP ++Glutaminasintetasa
(5.6)
4. Las liasas catalizan la lisis de un sustrato, al generar un
enlace doble; son reac-ciones de eliminacin, no hidrolticas y no
oxidantes. En direccin inversa, lasliasas catalizan la adicin de un
sustrato a un doble enlace de un segundo sustra-to. Una liasa que
cataliza una reaccin de adicin en las clulas es frecuentemen-te
llamada sintasa. La piruvato descarboxilasa pertenece a esta clase
de enzimasya que descompone al piruvato en acetaldehdo y dixido de
carbono. El nombresistemtico de la piruvato descarboxilasa,
2-oxo-cido carboxi-liasa (EC 4.1.1.1.)casi nunca se emplea.
5. Las Isomerasas catalizan cambios estructurales dentro de una
misma molcula(reacciones de isomerizacin). Como estas reacciones
slo tienen un sustrato yun producto son de las reacciones
enzimticas ms simples. La alanina racemasa(EC 5.1.1.1) es una
isomerasa que cataliza la interconversin de L-alanina y D-alanina.
El nombre comn es igual al nombre sistemtico.
6. Las ligasas catalizan la ligadura o unin de dos sustratos.
Estas reacciones nece-sitan un suministro de energa potencial
qumica de un nuclesido trifosfato, co-mo el ATP. Las ligasas son
usualmente llamadas sintetasas. La glutaminasintetasa, o
L-glutamato:amoniaco ligasa (formadora de ADP) (EC 6.3.12) usa
laenerga de la hidrlisis del ATP para unir glutamato y amoniaco
para producirglutamina.
De los ejemplos anteriores, es posible ver que la mayor parte de
las enzimas tienenms de un sustrato, aunque el segundo sustrato
pueda ser slo una molcula de agua.Ntese tambin que, aunque las
enzimas catalizan las reacciones tanto directas comoinversas, se
usan flechas de una direccin cuando el equilibrio favorece un gran
excesode producto frente al sustrato. En el equilibrio, una enzima
cataliza las reacciones direc-ta e inversa con la misma
velocidad.
5.2 Experimentos cinticos revelan propiedadesde las enzimas
El estudio de las propiedades de las enzimas se iniciar
examinando las velocidades dereacciones catalizadas por las mismas.
Tales estudios pertenecen a la categora de cinti-ca enzimtica (del
griego kinhtikoj en movimiento). ste es el lugar adecuado para
co-
-
5.2 Experimentos cinticos revelan propiedades de las enzimas
133
Recuerde que las concentraciones se re-presentan con corchetes:
[P] representa laconcentracin de producto, [E] la concen-tracin de
enzima y [S] la concentracindel sustrato.
[S]
[P]
0.05 M 0.1 M 0.2 M
Tiempo
0.2 M
0.1 M
0.05 M
Figura 5.1
Velocidad de una reaccin qumica simple. a) Se grafica la
cantidad de producto elabo-rado durante cierto tiempo para
diversasconcentraciones iniciales de sustrato. La velo-cidad
inicial, v0, es la pendiente del progresode la curva al iniciar la
reaccin. b) La veloci-dad inicial en funcin de la concentracin
ini-cial del sustrato. La pendiente de la curva esla constante de
velocidad.
menzar con la propiedad ms importante de las enzimas que es la
de actuar como catali-zadores, que aceleran las velocidades de las
reacciones. La cintica enzimtica proporcio-na una informacin
indirecta acerca de especificidades y mecanismos catalticos de
lasenzimas. Los experimentos cinticos tambin revelan si una enzima
est regulada.
Durante la primera mitad del siglo XX, la mayor parte de la
investigacin en enzimasse limitaba a experimentos cinticos. Dichas
investigaciones revelaron la forma en que lasvariaciones en las
condiciones experimentales o los cambios en la concentracin de
enzi-ma o sustrato afectan las velocidades de las reacciones. Antes
de describir en detalle la ci-ntica enzimtica, se repasarn los
principios de la cintica de sistemas qumicos noenzimticos. Estos
principios se aplicarn entonces a las reacciones enzimticas.
A. Cintica qumica
En los experimentos cinticos se examina la relacin entre la
cantidad de producto (P)que se forma en una unidad de tiempo
([P]/t) y las condiciones experimentales bajolas que se efecta la
reaccin. La base de la mayor parte de las mediciones cinticas es
laobservacin de la rapidez, o velocidad (v), de una reaccin, la
cual vara en forma direc-ta con la concentracin de cada reactante
(seccin 1.4). Esta observacin se expresa enuna ecuacin de
velocidad. Por ejemplo, la ecuacin de velocidad para la conversin
noenzimtica del sustrato (S) en el producto (P) en una reaccin de
isomerizacin, es
(5.7)
La ecuacin de velocidad refleja que la velocidad de una reaccin
depende de la con-centracin del sustrato ([S]). El smbolo k es la
constante de velocidad e indica la veloci-dad o la eficiencia de
una reaccin. Cada reaccin tiene una constante de
velocidaddiferente. Las unidades de la constante de velocidad para
una reaccin simple son s1.
Al avanzar una reaccin, la cantidad de producto ([P]) aumenta y
la cantidad desustrato ([S]) disminuye. En la figura 5.1a se ve un
ejemplo del avance de varias reac-ciones. La velocidad es la
pendiente de la curva durante determinado intervalo de tiem-po. La
forma de las curvas indica que la velocidad decrece respecto al
tiempo, lo cualera de esperarse.
En este ejemplo hipottico, la velocidad de la reaccin llega a
ser cero al final,cuando se consume el sustrato. Eso explicara por
qu la curva se aplana cuando lostiempos son grandes. (Vase ms
adelante otra explicacin). Es interesante conocer larelacin entre
la concentracin del sustrato y la velocidad de una reaccin ya que
si seconocen estos dos valores ser posible aplicar la ecuacin 5.7
para calcular la constan-te de velocidad. La nica concentracin
exacta de sustrato es la que se prepara al comen-zar el
experimento. Esta concentracin cambia durante el experimento. La
velocidad dela reaccin en el inicio preciso de la reaccin es el
valor que se desea conocer. Este va-lor representa la velocidad de
la reaccin a una concentracin conocida del sustrato an-tes de que
cambie.
La velocidad inicial (v0) se puede determinar a partir de la
pendiente del progresode las curvas (figura 5.1a) o de las
derivadas de esas curvas. En la figura 5.1b se ve unagrfica de
velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato que es
una lnearecta. La pendiente de la curva en la figura 5.1b es la
constante de velocidad.
Una mejor descripcin de esta reaccin sencilla sera
(5.8)
El experimento que muestra la figura 5.1 slo determina la
constante de velocidad di-recta (en direccin de avance) ya que se
reunieron los datos bajo condiciones en las queno haba reaccin
inversa. sta es otra razn importante para calcular la velocidad
ini-cial (v0) y no la velocidad en algn momento posterior. En una
reaccin reversible, elaplanamiento del progreso de las curvas no
representa la velocidad cero. Slo indicaque no hay aumento neto del
producto al paso del tiempo porque la reaccin ha llegadoal
equilibrio.
S k1
k-1P
[P]t
= v = k[S]
-
134 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
[E]
v
Figura 5.2Efecto de la concentracin de enzima ([E])sobre la
velocidad inicial (v0) de una reaccincatalizada por enzima a una
[S] fija de satura-cin. La velocidad de reaccin est influidapor la
concentracin de la enzima, pero no por la concentracin de otro
reactante, S.
En una reaccin ms complicada que de un slo paso, como la reaccin
S1 S2 P1 P2, la velocidad es determinada por las concentraciones de
ambos sustratos. Si es-tn presentes ambos sustratos a
concentraciones similares, la ecuacin de velocidad es
(5.9)
La constante de velocidad para reacciones donde intervienen dos
sustratos tiene las uni-dades M1s1. Estas constantes de velocidad
se pueden determinar estableciendo con-diciones en las que la
concentracin de un sustrato es muy alta y la otra se hace variar.La
velocidad de la reaccin slo depende, en este caso, de la
concentracin del sustratolimitante de la velocidad.
B. Cintica enzimtica
Uno de los primeros y grandes avances en bioqumica, fue el
descubrimiento de que lasenzimas se unen en forma transitoria a los
sustratos, resultado de la investigacin de lacintica enzimtica.
Emil Fischer, en 1894, propuso que una enzima presenta una
plan-tilla rgida, o cerradura, y que el sustrato es la llave que le
corresponde. Slo los sustra-tos especficos se pueden ajustar a
determinada enzima. Los primeros estudios decintica enzimtica
confirmaron que una enzima (E) se une a un sustrato para formar
uncomplejo enzima-sustrato (ES). Los complejos ES se forman cuando
los ligandos seunen de manera no covalente a sus lugares adecuados
en el sitio activo. El sustrato reac-ciona en forma transitoria con
la protena catalizadora (y con otros sustratos, en unareaccin
multisustratos) para formar el producto de la reaccin.
Imagnese ahora una reaccin enzimtica simple, la conversin de un
sustrato enun producto catalizada por una enzima. Aunque la mayor
parte de las reacciones enzi-mticas tiene dos o ms sustratos, se
pueden describir los principios generales de la ci-ntica enzimtica
suponiendo el caso sencillo en que hay un sustrato y un
producto.
(5.10)
Esta reaccin se efecta en dos pasos distintos: la formacin del
complejo enzima-sustrato y la reaccin qumica actual, acompaada por
la disociacin del producto. Ca-da paso transcurre con una velocidad
caracterstica. La velocidad total de una reaccinenzimtica depende
de las concentraciones tanto del sustrato como del catalizador (la
en-zima). Cuando la cantidad de enzima es mucho menor que la
cantidad de sustrato, lareaccin depende de la cantidad de
enzima.
La lnea recta de la figura 5.2 ilustra el efecto de la
concentracin de la enzima sobrela velocidad de reaccin, en una
reaccin de seudoprimer orden. Estas condiciones seusan en
cuantificaciones de enzima donde se determinan concentraciones de
stas. Laconcentracin de una enzima en una muestra se puede
determinar con facilidad compa-rando su actividad con una curva de
referencia parecida a la curva modelo de la figura5.2. Bajo estas
condiciones experimentales hay cantidades suficientes de molculas
desustrato para que cada molcula de enzima se una a una molcula de
sustrato y forme uncomplejo ES; a esta condicin se le llama
saturacin de la E con el S. Los anlisis de en-zima miden la
cantidad de producto formado en determinado tiempo. En algunos
mtodosde anlisis se puede usar un espectrofotmetro para registrar y
obtener continuamente losdatos; en otros mtodos las muestras se
extraen y analizan a intervalos. La cuantificacinse hace a pH y
temperatura constantes, que se suelen escoger para obtener una
actividadenzimtica ptima, o para aproximarse a las condiciones
fisiolgicas.
Si se comienza una reaccin catalizada por una enzima mezclando
sustrato y enzi-ma, no hay producto presente durante las primeras
etapas de la reaccin. Bajo estascondiciones se puede ignorar la
reaccin inversa, donde P se combina con E y se con-vierte en S.
Entonces, la reaccin se puede describir con
(5.11)
Las constantes de velocidad k1 y k1 en la reaccin 5.11 gobiernan
las velocidades deasociacin de S con E y de disociacin de S a
partir de ES, respectivamente. Este primer
E + S k1
k-1ES
k2
" E + P
E + S ES E + P
v = k[S1][S2]
-
5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten 135
[P]
0
2 E
E
[P]
t
Tiempo (t)
v0 ==Pendiente inicial t[P]
t
[P]
Figura 5.3Curva de avance de una reaccin catalizadapor enzima.
[P] es la concentracin de pro-ducto y aumenta a medida que avanza
lareaccin. La velocidad inicial de la reaccin,v0, es la pendiente
de la parte lineal inicial dela curva. Ntese que la velocidad de
reaccinse incrementa al doble cuando se agrega eldoble de enzima (2
E, curva superior) a unamezcla de reaccin que, por lo dems,
esidntica.
paso es un equilibrio de interaccin de enlace parecido a la unin
del oxgeno con la he-moglobina. La constante de velocidad para el
segundo paso es k2, la velocidad de for-macin del producto a partir
de ES. Ntese que la conversin del complejo ES enenzima libre y
producto se indica con una flecha de una direccin porque la
velocidadde la reaccin inversa (E P EP) es insignificante. La
velocidad, medida durante es-te corto periodo es la velocidad
inicial (y 0), que fue descrita en la seccin anterior. Laformacin y
disociacin de los complejos ES son reacciones que suelen ser muy
rpi-das ya que slo se forman y se rompen enlaces no covalentes. En
contraste, la conver-sin de sustrato en producto suele ser la
velocidad limitante. Es durante este pasocuando se produce la
alteracin qumica del sustrato.
La cintica enzimtica se diferencia de la cintica qumica simple
porque las veloci-dades de reacciones catalizadas por enzimas
dependen de la concentracin de la enzima ysta nunca es un producto
ni un sustrato de la reaccin. Las velocidades tambin difierenporque
el sustrato debe unirse a la enzima para poder convertirse en el
producto.
En una reaccin catalizada por enzima, las velocidades iniciales
se obtienen delprogreso de las curvas, igual que en las reacciones
qumicas. La figura 5.3 muestra el pro-greso de las curvas a dos
concentraciones distintas de la enzima en presencia de una
altaconcentracin inicial de sustrato ([S] >> [E]). En este
caso, la velocidad de formacindel producto depende de la
concentracin de la enzima y no de la concentracin del sus-trato.
Los datos de experimentos como los de la figura 5.3 se pueden usar
para graficarla curva de la figura 5.2.
5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten
Las reacciones catalizadas por enzimas, como cualquier reaccin
qumica, se puedendescribir en forma matemtica como ecuaciones de
velocidad. En ellas, varias constan-tes indican la eficiencia y
especificidad de una enzima y en consecuencia son tiles
paracomparar las actividades de varias enzimas o para evaluar la
importancia fisiolgica de unadeterminada enzima. Las primeras
ecuaciones de velocidad fueron deducidas a princi-pios de 1900
examinando los efectos de variaciones en la concentracin de
sustrato. Lafigura 5.4a en la pgina siguiente muestra un resultado
tpico, donde la velocidad inicial(y 0) de una reaccin es graficada
en funcin de la concentracin de sustrato ([S]).
Los datos se pueden explicar con la reaccin presentada en la
ecuacin 5.11. Elprimer paso es una interaccin bimolecular entre la
enzima y el sustrato para formar uncomplejo ES. A altas
concentraciones de sustrato (parte derecha de la curva de la
figu-ra 5.4) la velocidad inicial no cambia mucho cuando se agrega
ms S. Ello indica que lacantidad de enzima ha llegado a ser
limitante de la velocidad de esta reaccin. La con-centracin de la
enzima es una parte importante de la reaccin general, como es de
es-perarse para la formacin de un complejo ES. A bajas
concentraciones de sustrato(parte izquierda de la curva de la
figura 5.4), la velocidad inicial es muy sensible a cam-bios de
concentracin de sustrato. Bajo esas condiciones, la mayor parte de
las molculasde enzima todava no se han unido al sustrato y la
formacin del complejo ES depende dela concentracin de sustrato.
La pendiente de la curva de y 0 en funcin de [S] es la de una
hiprbola rectangular.Las curvas hiperblicas son indicativas de
procesos donde hay una disociacin simple,como se pudo apreciar en
la disociacin del oxgeno desde la oximioglobina (seccin4.13B). Esta
es una evidencia ms de que la reaccin sencilla que se estudi es
bimo-lecular, implicando la asociacin de E y S para formar un
complejo ES.
La ecuacin de una hiprbola rectangular es
(5.12)
donde a es la asntota de la curva (el valor de y a un valor de x
infinito) y b es el puntodel eje x que corresponde a un valor igual
a a/2. En los experimentos de cintica enzi-mtica, y y0 y x [S]. El
valor asinttico (a) se llama Vmx. Es la velocidad mximade la
reaccin a concentraciones de sustrato infinitamente grandes. Con
frecuencia se in-dica el valor de Vmx en las grficas de y0 contra
[S], pero no es obvio por qu se escogi
y =ax
b + x
-
136 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
a) Maud Menten (1879-1960) y b) Leonor Michaelis (1875-1949),
precursores en la ci-ntica enzimtica.
esta asntota en particular. Una de las caractersticas de las
curvas hiperblicas es queparecen aplanarse a concentraciones
moderadas de sustrato, a un valor que parece sermucho menor que la
Vmx. La Vmx real no se determina tratando de estimar la posicinde
la asntota a partir de la forma de la curva. Ms bien se determina
en forma precisa ycorrecta ajustando los datos a la ecuacin general
de una hiprbola rectangular.
El trmino b en la ecuacin general de una hiprbola rectangular se
llama constan-te de Michaelis (Km), y se define como la
concentracin de sustrato cuando y0 es iguala la mitad de la Vmx
(figura 5.4b). La ecuacin completa de velocidad es
(5.13)
Esta es llamada la ecuacin de Michaelis-Menten, por Leonor
Michaelis y MaudMenten. Ntese cmo la forma general de la ecuacin se
compara con la ecuacin 5.12.La ecuacin de Michaelis-Menten describe
la relacin entre la velocidad inicial de unareaccin y la
concentracin del sustrato. En la seccin que sigue se deducir la
ecuacinde Michaelis-Menten por un mtodo cintico para despus
examinar el significado delas diversas constantes.
A. Deduccin de la ecuacin de Michaelis-Menten
Una deduccin comn de la ecuacin de Michaelis-Menten, debida a
George E. Briggsy J. B. S. Haldane, es llamada la derivacin del
estado estable. Esta deduccin postulaque hay un intervalo de tiempo
(llamado estado estable, o estado estacionario) duranteel cual se
forma el complejo ES a la misma velocidad con la que se descompone,
demodo que la concentracin de ES es constante. La velocidad inicial
se usa en la deriva-cin del estado estable porque se asume que la
concentracin de producto ([P]) es insig-nificante. Tal estado
estable es una condicin comn para las reacciones metablicas enlas
clulas.
Al suponer que la concentracin de ES en estado estable es
constante, entonces lavelocidad de formacin de producto depende de
la velocidad de la reaccin qumica yde la velocidad de disociacin de
P para abandonar la enzima. El paso limitante de lavelocidad es
hacia el lado derecho de la reaccin 5.11 y la velocidad depende de
la cons-tante de velocidad k2 y de la concentracin de ES.
(5.14)
La derivacin del estado estable resuelve la ecuacin 5.14 para
[ES], usando trminosque se pueden medir, como la constante de
velocidad, la concentracin total de la enzima([E]total) y la
concentracin de sustrato ([S]). Se supone que [S] es mayor que
[E]total,
ES k2
" E + P v0 = k2[ES]
v0 =Vmx[S]Km + [S]
Orden cero con respecto a S
Primer orden con respecto a S
Vmx
v0
[S]0
Vmx
[S]0
Vmx2
Km
v0
Figura 5.4Grficas de velocidad inicial v0 en funcin de la
concentracin de sustrato ([S]) para unareaccin catalizada por
enzima. a) Cada puntodel experimento se obtiene de una curva
sepa-rada usando la misma concentracin de enzima. La forma de la
curva es hiperblica. A bajas concentraciones de sustrato, la
curvatiende a una recta que asciende con muchapendiente. En esta
regin de la curva, la reac-cin depende mucho de la concentracin
desustrato. A altas concentraciones de sustrato, laenzima est casi
saturada y la velocidad inicialde la reaccin no cambia mucho cuando
se aumenta ms la concentracin del sustrato. b) La concentracin del
sustrato que corres-ponde a la mitad de la velocidad mxima sellama
constante de Michaelis (Km). La enzimaest a la mitad de la
saturacin cuando S Km.
-
5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten 137
pero no necesariamente es saturada. Por ejemplo, rpidamente
despus de que se mez-cla una cantidad pequea de enzima con
sustrato, [ES] se vuelve constante ya que la ve-locidad total de
descomposicin de ES (la suma de las velocidades de conversin de
ESen E S y en E P) es igual a la velocidad de formacin del complejo
ES a partir deE S. La velocidad de formacin de ES a partir de E S
depende de la concentra-cin de la enzima libre (molculas de enzima
que no estn en la forma de ES), que es[E]total [ES]. La
concentracin del complejo ES permanece constante hasta el consu-mo
del S, causado por el acercamiento de [S] a [E]total. Se puede
expresar lo anterior enuna ecuacin matemtica:
Velocidad de formacin de ES Velocidad de descomposicin de ES
(5.15)
Se reordena la ecuacin 5.15 para reunir las constantes de
velocidad.
(5.16)
La relacin de las constantes de velocidad en el lado izquierdo
de la ecuacin 5.16 es laconstante de Michaelis, Km. A continuacin,
de esta ecuacin se despeja [ES] en variospasos.
(5.17)
Esto se desarrolla:
(5.18)
Se renen los trminos [ES],(5.19)
y
(5.20)
La ecuacin 5.20 describe la concentracin de ES en el estado
estable mediante trmi-nos que se pueden medir en un experimento. Si
se sustituye el valor de [ES] en la ecua-cin de velocidad (ecuacin
5.14), el resultado es
(5.21)
Como se indica en la figura 5.4a, cuando la concentracin de S es
muy alta, la en-zima est saturada y esencialmente, todas las
molculas de E estn presentes como ES.Si se agrega ms S casi no hay
efectos sobre la velocidad de reaccin. La nica formade aumentar esa
velocidad es s se agrega ms enzima. Bajo esas condiciones, la
velo-cidad es la mxima velocidad (Vmx), y esta velocidad se calcula
con la concentracintotal de la enzima y la constante de velocidad
k2. As,
(5.22)
por definicin. Esto se sustituye en la ecuacin 5.21 y se llega a
la forma ms familiarde la ecuacin de Michaelis-Menten:
(5.23)
Ya se explic que esta forma de la ecuacin de Michaelis-Menten
describe adecuada-mente los datos de experimentos cinticos. En esta
seccin se demostr que se puede
v0 =Vmx[S]Km + [S]
Vmx = k2[E]total
v0 = k2[ES] =k2[E]total[S]Km + [S]
[ES] = [E]total[S]Km + [S]
[ES]1Km + [S]2 = [E]total[S]
[ES]Km = 1[E]total[S]2 - 1[ES][S]2
[ES]Km = 1[E]total - [ES]2[S]
k-1 + k2k1
= Km =1[E]total - [ES]2[S]
[ES]
k11[E]total - [ES]2[S] = 1k-1 + k22[ES]
-
138 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Enzima kcat(s1)*
Papana 10
Ribonucleasa 102
Carboxipeptidasa 102
Tripsina 102 (to 103)Acetilcolinesterasa 103
Cinasas 103
Deshidrogenasas 103
Transaminasas 103
Anhidrasa carbnica 106
Superxido dismutasa 106
Catalasa 107
* Las constantes catalticas slo se presentan como rdenes de
magnitud.
TABLA 5.1 Ejemplos de constantescatalticas
deducir la misma ecuacin a partir de una consideracin terica de
las implicaciones dela reaccin 5.11, la ecuacin para una reaccin
catalizada por enzima. La concordanciaentre la teora y los datos
brinda la confianza de que las bases tericas de la cintica
en-zimtica estn bien fundamentadas.
B. Constante cataltica kcat
Cuando la concentracin de sustrato es alta, la velocidad total
de la reaccin es Vmx yest determinada por la concentracin de la
enzima. La constante de velocidad observa-da bajo estas condiciones
se llama constante cataltica, Kcat, y se define como sigue:
(5.24)
donde kcat representa la cantidad de moles de sustrato
convertidos en producto, por se-gundo y por mol de enzima (o por
mol de sitio activo, para una enzima con multisubu-nidades) bajo
condiciones de saturacin. En otras palabras, kcat indica la
cantidadmxima de molculas de sustrato convertidas en producto cada
segundo por cada sitioactivo. A eso se le llama con frecuencia
nmero de recambio. La constante catalticamide la rapidez con que
determinada enzima puede catalizar una reaccin especfica; esuna
forma muy til para describir la eficacia de una enzima. La unidad
de kcat es s1. Elrecproco de kcat es el tiempo necesario para que
haya un evento cataltico. Ntese quepara obtener kcat se debe
conocer la concentracin de la enzima.
Para una reaccin sencilla, como la 5.11, el paso limitante es ES
E P y kcat k2.Muchas reacciones enzimticas son ms complejas. Si hay
un paso que claramente sea li-mitante de la velocidad, su constante
de velocidad es la kcat de esa reaccin. Si el mecanis-mo es ms
complejo, entonces kcat puede ser una combinacin de varias y
distintasconstantes de velocidad. Es la causa por la que se
necesita una constante de velocidad di-ferente, kcat, para
describir la velocidad total de la reaccin catalizada por enzimas.
En lamayor parte de los casos se puede suponer que kcat es una
buena aproximacin a k2.
En la tabla 5.1 se muestran valores representativos de kcat. La
mayor parte de lasenzimas son catalizadores potentes con valores de
kcat de 102 a 103 s1. Algunas enzi-mas son catalizadores
extremadamente rpidos con valores de kcat de 106 s1 o mayo-res. Por
ejemplo, la anhidrasa carbnica de mamferos debe actuar con mucha
rapidezpara mantener el equilibrio entre CO2 acuoso y el
bicarbonato (seccin 2.10). Como sever en la seccin 6.4B, la
superxido dismutasa y la catalasa son responsables de la r-pida
descomposicin de los metabolitos txicos de oxgeno, el anin
superxido y elperxido de hidrgeno, respectivamente. Las enzimas que
catalizan un milln de reac-ciones por segundo suelen actuar sobre
molculas pequeas de sustrato que se difundencon rapidez dentro de
la clula.
C. Significados de Km
La constante de Michaelis tiene varios significados. La ecuacin
5.16 define a Km comola relacin de las constantes de velocidad
combinadas para la descomposicin de ES di-vidida entre la constante
para su formacin. Si la constante de velocidad para la forma-cin de
producto (k2) es mucho menor que k1 o que k1, como es el caso
frecuente, sepuede despreciar k2 y Km equivale a k1/k1. En este
caso, Km es igual a la constante deequilibrio de disociacin de ES
para dar E S. As, Km es una medida de la afinidadde E hacia S.
Mientras menor sea el valor de Km, el sustrato est ms
fuertementeunido. Km tambin es uno de los parmetros que determina
la forma de la curva de y0en funcin de [S] de la figura 5.4b. Es la
concentracin del sustrato cuando la velocidadinicial es la mitad
del valor de Vmx. Este significado es consecuencia directa de la
ecua-cin general de una hiprbola rectangular.
A veces se usan los valores de Km para distinguir entre
diferentes enzimas que ca-talizan la misma reaccin. Por ejemplo,
los mamferos tienen distintas formas de lacta-to deshidrogenasa,
cada una con valores distintos de Km. Aunque es til imaginar queKm
representa la constante de disociacin en equilibrio de ES, para
muchas enzimas Km
Vmx = kcat[E]total kcat =Vmx
[E]total
-
5.4 Las constantes cinticas indican la actividad enzimtica y la
eficiencia cataltica 139
es una funcin ms compleja de las constantes de velocidad. Esto
es especialmente im-portante cuando la reaccin se efecta en ms de
dos pasos.
5.4 Las constantes cinticas indican la actividad enzimtica y la
eficiencia cataltica
Est demostrado que las constantes cinticas km y kcat se pueden
usar para medir las ac-tividades relativas de las enzimas y los
sustratos. En la mayor parte de los casos, Km esuna medida de la
estabilidad del complejo ES, y kcat es similar a la constante de
veloci-dad para la conversin de ES en E P, y cuando el sustrato no
es limitante (regin A,figura 5.5). Recurdese que kcat es una medida
de la actividad cataltica de una enzimae indica cuntas reacciones
por segundo puede catalizar una molcula de enzima.
Al revisar la regin B de la hiprbola en la figura 5.5. La
concentracin de S esmuy baja y la curva se aproxima a una recta.
Bajo estas condiciones, la velocidad dereaccin depende de las
concentraciones del sustrato y de la enzima. En trminos qu-micos,
es una reaccin de segundo orden, y la velocidad depende de una
constante develocidad de segundo orden, que se define por
(5.25)
Es interesante conocer cmo se determina esta constante de
velocidad de segundo ordenya que indica la velocidad de la reaccin
catalizada por la enzima bajo condiciones fisio-lgicas. Cuando
Michaelis y Menten escribieron toda la ecuacin de velocidad por
prime-ra vez, usaron la forma que inclua a kcat[E]total en vez de
Vmx (ecuacin 5.24). Ahora queya se comprende el significado de kcat
es posible sustituir kcat[E]total en lugar de Vmx en laecuacin de
Michaelis-Menten (ecuacin 5.23). Si se considera slo la regin de la
curvade Michaelis-Menten donde la [S] es muy baja, esta ecuacin se
puede simplificar des-preciando la [S] en el denominador ya que [S]
es mucho menor que Km.
(5.26)
Al comparar las ecuaciones 5.25 y 5.26 se comprueba que la
constante de velocidad desegundo orden se aproxima mucho a kcat/Km.
As, la relacin kcat/Km es una constantede velocidad aparente de
segundo orden para la formacin de E P a partir de E S
v0 =kcat[E][S]Km + [S]
=kcat
Km [E][S]
v0 = k[E][S]
Regin B:
Regin A: ESkcat
+E PkcatKm +E P+E S
ES +E P)+ S(E
Vmx
[S]
Regin Akcat=v0 [E]1[S]0
Regin B
=v0 [E]1[S]1kcatKm
v0
Figura 5.5
Significados de kcat y de kcat/Km. La constantecataltica (kcat)
es la constante de velocidadpara la conversin del complejo ES a E
P, yse mide con ms facilidad cuando la enzimaest saturada con
sustrato (regin A de estacurva de Michaelis-Menten). La
relacinkcat/km es la constante de velocidad para laconversin de E S
en E P, a concentracio-nes muy bajas del sustrato (regin B).
Lasreacciones medidas para estas constantes develocidad se resumen
bajo la grfica.
-
140 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Constante de Constantevelocidad no de velocidadenzimtica
enzimtica Eficiencia (kn, en s_1) (kcat/Km en M1s1) cataltica
Anhidrasa carbnica
QuimotripsinaCorismato mutasa
Triosa fosfato isomerasa
Citidina desaminasa
Adenosina desaminasa
Mandelato racemasa
b-Amilasa
Fumarasa
Arginina descarboxilasa
Fosfatasa alcalina
Orotidina 5-fosfato descarboxilasa 2 * 10236 * 1073 * 10-16
3 * 10223 * 10710-1510211069 * 10-16102110910-1310201077 *
10-143 * 10181063 * 10-135 * 10161072 * 10-103 * 10163 *
10610-1010144 * 1084 * 10-62 * 10112 * 10610-52 * 10169 * 1074 *
10-97 * 1077 * 10610-1
TABLA 5.2 Eficiencias catalticas de algunas enzimas
cuando la reaccin total est limitada por encuentros de S con E.
Esta relacin tiende aubicarse entre 108 y 109 M1s1, la mxima
velocidad a la que dos solutos sin carga pue-den aproximarse entre
s por difusin a la temperatura fisiolgica. Las enzimas quepueden
catalizar reacciones a esta velocidad tan grande se describirn en
la seccin 6.4.
La relacin kcat/Km es til para comparar las actividades de
enzimas diferentes.Tambin es posible evaluar la eficiencia de una
enzima midiendo su capacidad catal-tica. Este valor es igual a la
constante de velocidad de una reaccin en presencia de la en-zima
(kcat/Km) dividida entre la constante de velocidad de la misma
reaccin en ausenciade la enzima (kn). Es de sorprender que slo se
conozcan pocos valores de eficiencia cata-ltica porque la mayor
parte de las reacciones qumicas se efecta con lentitud extrema
enausencia de las enzimas con tanta lentitud que sus velocidades
sin enzima son muydifciles de medir. Con frecuencia, las
velocidades de reaccin se miden en recipientes es-peciales de
vidrio encerrados en acero a temperaturas mayores de 300C.
La tabla 5.2 contiene una lista de varios ejemplos de
eficiencias o capacidades ca-talticas conocidas. Los valores tpicos
van de 1014 a 1020, pero algunos son bastantemayores (hasta 1023).
La dificultad de obtener constantes de velocidad para reaccionesno
enzimticas es confirmada por el tiempo medio de la reaccin
catalizada por la oro-tidina-5N-fosfato descarboxilasa que es de
unos 78 millones de aos! Los valores deeficiencia cataltica de la
tabla 5.2 remarcan una de las propiedades principales de
lasenzimas, su capacidad de aumentar las velocidades de reacciones
que en el caso normalseran demasiado lentas para tener
utilidad.
5.5 Medicin de Km y Vmx
Los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica pueden producir
informacin va-liosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la
reaccin. Los parmetros claveson Km y Vmx ya que kcat se puede
calcular si se conoce Vmx.
Los datos de Km y Vmx para una reaccin catalizada por enzima se
pueden de-terminar de diversas maneras. Es posible obtener ambos
valores por anlisis de lasvelocidades iniciales en una serie de
concentraciones de sustrato y una concentracinfija de enzima. Para
obtener valores fiables de las constantes cinticas, los puntos de
[S]se deben extender por abajo y por arriba de Km para producir una
hiprbola. Es difcildeterminar Km o Vmx en forma directa con una
grfica de velocidad inicial en funcin
-
5.6 Cintica de las reacciones con sustratos mltiples 141
v0
1
1Vmx
1[S]
1Km
Ecuacin de Lineweaver-Burk :
+1
Vmx=
v0
1 1[S]
Km Vmx
Figura 5.6Grfica de doble-recproca (de Lineweaver-Burk). Esta
grfica se obtiene con una transformacin lineal de la ecuacin de
Michaelis-Menten. Se grafican los valores de 1/v0 en funcin de los
valores de 1/[S].
de la concentracin porque la curva tiende a la Vmx en forma
asinttica. Sin embargo,se pueden determinar valores exactos usando
un programa de cmputo adecuado paraajustar los resultados
experimentales a la ecuacin de la hiprbola.
La ecuacin de Michaelis-Menten se puede reacomodar para obtener
valores deVmx y Km a partir de lneas rectas en grficas. La
transformacin de uso ms frecuentees la grfica de doble recproco, o
de Lineweaver-Burk, en la que se grafican los valoresde 1/y0 contra
los de 1/[S] (figura 5.6). El valor absoluto de 1/Km se obtiene con
la in-terseccin de la recta con el eje x (es decir, la abscisa al
origen), y el valor de 1/Vmx seobtiene con la ordenada al origen.
Aunque las grficas de doble recproco no son losmtodos ms exactos
para determinar las constantes cinticas, se comprenden con
faci-lidad y permiten contar con pautas reconocibles para estudiar
la inhibicin enzimtica,un aspecto de extrema importancia en la
enzimologa que en breve se examinar.
Se pueden obtener valores de kcat con mediciones de Vmx slo
cuando se conoce laconcentracin absoluta de la enzima. Se pueden
determinar los valores de Km aun conenzimas que no hayan sido
purificadas siempre y cuando sea una sola la enzima en lapreparacin
impura la que pueda catalizar la reaccin observada.
5.6 Cintica de las reacciones con sustratos mltiples
Las mediciones cinticas de reacciones con sustratos mltiples (o
reacciones de multi-sustrato) son algo ms complicadas que para
cinticas enzimticas sencillas con un so-lo sustrato. Sin embargo,
para muchos fines, como por ejemplo el diseo de unacuantificacin
enzimtica, basta slo con determinar la Km para cada sustrato en
pre-sencia de cantidades saturantes de cada uno de los dems
sustratos, como fue descritopara las reacciones qumicas (seccin
5.2A). La cintica enzimtica simple que se des-cribe en este captulo
se puede ampliar para diferenciar entre varias posibilidades
meca-nsticas para reacciones multisustrato, como las reacciones de
transferencia de grupo.Eso se hace midiendo el efecto de
variaciones en la concentracin de un sustrato en losresultados
cinticos obtenidos para el otro.
RECUADRO 5.1 Hiprbolas y rectas
Hemos visto que una grfica de velocidad inicial de una
reaccin(v0) en funcin de la concentracin de sustrato ([S]) produce
unacurva hiperblica, como las de las figuras 5.4 y 5.5. La
ecuacingeneral de una hiprbola rectangular (ecuacin 5.12) y la
ecua-cin de Michaelis-Menten tienen la misma forma (ecuacin
5.13).
Es muy difcil determinar Vmx a partir de una grfica dedatos
cinticos para la enzima porque la curva hiperblica quedescribe la
relacin entre la concentracin del sustrato y la ve-locidad inicial
es asinttica hacia Vmx y en forma experimentales difcil alcanzar la
concentracin de sustrato requerida paraestimar Vmx. Por estas
razones es ms fcil con frecuencia con-vertir la curva hiperblica en
una forma lineal que se apegue ala frmula general y mx b, donde m
es la pendiente de larecta y b es la ordenada al origen. El primer
paso para trans-formar la ecuacin original de Michaelis-Menten en
esta formageneral de ecuacin lineal es invertir los trminos, para
que lostrminos Km [S] queden arriba (en el numerador) del
ladoderecho. Eso se hace obteniendo el recproco de ambos
ladostransformacin que podr ser familiar a muchos que conoz-can las
curvas hiperblicas.
Los dos pasos siguientes consisten en separar trminos y
cance-lar [S] en el segundo trmino del lado derecho de la
ecuacin.Esta forma de la ecuacin de Michaelis-Menten se llama
ecua-cin de Lineweaver-Burk y se parece a la forma general de
unaecuacin lineal, y mx b, donde y es el recproco de v0 ylos
valores de x son los recprocos de [S]. A una grfica delos datos en
esta forma se le llama grfica de doble recproco.La pendiente de la
lnea ser Km/Vmx, y la ordenada al origenser 1/Vmx.
La razn original de esta clase de transformacin fue cal-cular
Vmx y Km a partir de datos experimentales. Era ms fcilgraficar los
valores recprocos de v0 y [S] y dibujar una rectaque pase por los
puntos para calcular las constantes cinticas.Hoy hay programas de
cmputo que pueden ajustar con exacti-tud los datos a una curva
hiperblica y calcular las constantes,por lo que ya no es necesaria
la grfica de Lineweaver-Burk paraesta clase de anlisis. En este
libro seguiremos usando grficasde Lineweaver-Burk para ilustrar
algunas propiedades genera-les de cinticas de enzimas, pero se usan
rara vez para su prop-sito original de anlisis de datos.
1v0
= a KmVmx
b 1[S] +1Vmx
1v0
=Km
Vmx[S]+
[S]Vmx[S]
1v0
=Km + [S]Vmx[S]
-
142 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Reacciones consecutivas
Reaccin ping-pong
A B P Q
E EA (EAB) (EPQ) EQ EOrdenada
A B P Q
E
EA EQE
EB
AB
EP
PQAleatoria
(EAB)(EPQ)
E
A Q
E
P B
F(EA)(FP) (FB)(EQ)
Figura 5.7Notacin para reacciones con bisustrato. a) Enlas
reacciones consecutivas, todos los sustratosse enlazan antes de
liberar un producto. Launin de los sustratos puede ser ordenada
oaleatoria. b) En las reacciones ping-pong, unsustrato es enlazado
y un producto es liberadodejando una enzima sustituida. Entonces se
enlaza un segundo sustrato y se libera un segundo producto, con lo
cual la enzima regresa a su forma original.
Las reacciones de multisustrato pueden efectuarse de acuerdo con
varios y distin-tos esquemas cinticos llamados mecanismos cinticos
porque se deducen en su totali-dad mediante experimentos cinticos.
Los mecanismos cinticos son comnmenterepresentados con la notacin
introducida por W. W. Cleland. Como se muestra en la fi-gura 5.7,
la secuencia de pasos va de izquierda a derecha. La adicin de
molculas desustrato (A, B, C, ) a la enzima y la liberacin de
productos (P, Q, R, ) desde la en-zima se indican con flechas que
apuntan hacia (unin de sustrato) o desde (liberacin deproducto) de
la recta. Las diversas formas de la enzima (E libre, complejos ES o
com-plejos EP) se escriben abajo de una lnea horizontal. Los
complejos ES que sufrentransformacin qumica cuando el sitio activo
est lleno se muestran entre parntesis.Las reacciones consecutivas
(o secuenciales) (figura 5.7a) requieren que todos lossustratos
estn presentes para que se libere algn producto. Estas reacciones
secuencia-les pueden ser ordenadas, con un orden obligatorio de
enlazamiento de sustratos y deliberacin de productos. Tambin pueden
ser aleatorias, sin orden obligatorio de enlaza-miento o liberacin.
En las reacciones ping-pong (figura 5.7b), se libera un
productoantes de que se enlacen todos los sustratos. En una reaccin
ping-pong de bisustrato, seenlaza el primer sustrato, se altera la
enzima por sustitucin y se libera el primer pro-ducto, despus de lo
cual se une el segundo sustrato, la enzima alterada regresa a su
for-ma original y se libera el segundo producto. Debido al
enlazamiento covalente de unaporcin de un sustrato a la enzima, a
veces al mecanismo de ping-pong se le llama me-canismo de enzima
sustituida. La unin y liberacin de ligandos en un mecanismo
deping-pong se suelen indicar con lneas inclinadas. Las dos formas
de la enzima se repre-sentan por E (no sustituida) y F
(sustituida).
5.7 Inhibicin reversible de enzimas
Un inhibidor de enzima (I) es un compuesto que se enlaza con una
enzima e interfierecon su actividad. Los inhibidores pueden actuar
evitando la formacin del complejo ES
-
5.7 Inhibicin reversible de enzimas 143
Los inhibidores irreversibles se describenen la seccin 5.8.
o bloqueando la reaccin qumica que lleva a la formacin del
producto. Por regla ge-neral, los inhibidores son molculas pequeas
que se unen en forma reversible con laenzima que inhiben. Las
clulas contienen muchos inhibidores enzimticos naturalesque juegan
papeles importantes en la regulacin del metabolismo. Los
inhibidores arti-ficiales se usan en experimentos para investigar
los mecanismos enzimticos y paradescifrar las rutas metablicas.
Algunas medicinas y muchos venenos son inhibidoresde enzimas.
Algunos inhibidores se unen en forma covalente con las enzimas y
causando que lainhibicin sea irreversible. La mayor parte de la
inhibicin de relevancia biolgica esreversible. Los inhibidores
reversibles se unen a las enzimas con las mismas fuerzas
nocovalentes que enlazan a sustratos y productos. Los inhibidores
reversibles se diferen-cian de los irreversibles por su fcil
eliminacin de soluciones de enzima por mtodoscomo dilisis o
filtracin en gel (seccin 3.6). El equilibrio entre la enzima libre
(E)ms el inhibidor (I) y el complejo EI se caracteriza por una
constante de disociacin. Eneste caso, a la constante se le llama
constante de inhibicin, Ki.
(5.27)
Los tipos bsicos de inhibicin reversible son competitiva,
acompetitiva y no compe-titiva. Se pueden diferenciar de manera
experimental por sus efectos sobre el comporta-miento cintico de
las enzimas (tabla 5.3). La figura 5.8, en la pgina siguiente,
muestradiagramas que representan los modos de inhibicin enzimtica
reversible.
A. Inhibicin competitiva
Los inhibidores competitivos son los que se encuentran con ms
frecuencia en bioqu-mica. En la inhibicin competitiva, el inhibidor
slo se puede unir a molculas de enzi-ma libre que no estn unidas a
sustrato alguno. La inhibicin competitiva se ilustra conlas figuras
5.8a y 5.8b, y por el esquema cintico de la figura 5.9a en la pgina
145.En este esquema slo ES puede llevar a la formacin de producto.
La formacin de uncomplejo EI quita a la enzima de su ruta
normal.
Cuando un inhibidor competitivo se une con una molcula de
enzima, una molcu-la de sustrato no puede unirse a esa molcula de
enzima. Al revs, la unin de sustratoy una molcula de enzima evita
el enlazamiento de un inhibidor. En otras palabras, S eI compiten
por unirse a la molcula de enzima. Ms comnmente, S e I se unen al
mis-mo sitio de la enzima, el sitio activo. Este tipo de inhibicin
(figura 5.8a) se llama inhi-bicin competitiva clsica. No es la nica
clase de inhibicin competitiva. En algunoscasos, como en las
enzimas alostricas (seccin 5.10), el inhibidor se une a un sitio
di-ferente, lo que altera el sitio de unin del sustrato y evita
esta unin (figura 5.8b). A estetipo de inhibicin se le llama
inhibicin competitiva no clsica. Cuando estn presentestanto I como
S en una solucin, la proporcin de la enzima que puede formar
complejosIS depende de las concentraciones de sustrato e inhibidor
y de sus afinidades relativashacia la enzima.
La cantidad de EI se puede reducir aumentando la concentracin de
S. A con-centraciones suficientemente altas, la enzima puede estar
saturada con sustrato.
E + I EI Kd = Ki =[E][I][EI]
Tipo de inhibidor Efecto
Competitivo (I slo se une a E) Aumenta KmVmx permanece sin
cambio
Acompetitivo (I slo se une a ES) Vmx y Km desciendenNo cambia la
relacin Vmx/Km
No competitivo (I se une a E o a ES) Vmx desciendeKm permanece
sin cambio
TABLA 5.3 Efectos de inhibidores reversibles sobre constantes
cinticas
-
144 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Inhibicin competitiva clsica
I
S
Inhibicin acompetitiva
S
SI
Inhibicin no competitiva
I
S
I S
Inhibicin competitiva no clsica
S
I
Figura 5.8Diagramas de inhibicin enzimtica reversible.En este
esquema, las enzimas catalticamentecompetentes estn en gris claro y
las enzimasinactivas estn en gris oscuro. a) Inhibicincompetitiva
clsica. S e I se unen al sitio acti-vo en una forma mutuamente
excluyente. b) Inhibicin competitiva no clsica. La unin de S con el
sitio activo evita la uninde I a un sitio separado y viceversa. c)
Inhi-bicin acompetitiva. I se une slo al complejoES. La enzima se
inactiva cuando se enlazacon I. d) Inhibicin no competitiva. I se
puede unir a E o a ES. La enzima se inactivacuando se enlaza I.
Aunque al complejo EIpueda unirse todava S, no se forma
producto.
-
5.7 Inhibicin reversible de enzimas 145
Benzamidina
CNH2H2 N
NH
CH2
CH2
CH2
CH
Arginina
CNH2H2 N
NH3 COO
Figura 5.10Benzamidina y arginina. La benzamidinacompite con los
residuos de arginina en launin con la tripsina.
En consecuencia, la velocidad mxima es la misma en presencia o
en ausencia de un in-hibidor. Mientras ms inhibidor competitivo est
presente, se necesitar ms sustratopara llegar a la mitad de la
saturacin. Ha sido demostrado que la concentracin de sus-trato
correspondiente a la mitad de saturacin es la Km. As, en presencia
de concentra-ciones crecientes de un inhibidor competitivo, aumenta
la Km. El nuevo valor se suelellamar Km aparente (Kmapp). En una
grfica de doble recproco, la adicin de un inhibi-dor competitivo
produce una disminucin del valor absoluto de la abscisa al
origen(1/Km), mientras que la ordenada al origen (1/Vmx) permanece
igual (figura 5.9b).
Muchos inhibidores competitivos clsicos son anlogos al sustrato,
compuestosque se parecen en su estructura a los sustratos. Los
anlogos se unen a la enzima, perono reaccionan. Por ejemplo, la
benzamidina es un inhibidor competitivo de la tripsina(figura
5.10). La tripsina cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos
cuyos gruposcarbonilo contienen residuos de arginina y lisina, y la
benzamidina es un anlogo de lacadena lateral de alquilguanidilo en
la arginina. La benzamidina acta como inhibidorque compite con los
residuos de arginina en pptidos por la unin de la tripsina.
B. Inhibicin acompetitiva
Los inhibidores acompetitivos slo se unen al ES y no a la enzima
libre (figuras 5.8c y5.11a). En la inhibicin acompetitiva disminuye
la Vmx (aumenta 1/Vmx) por conver-sin de algunas molculas de E en
la forma inactiva ESI. Ya que es el complejo ES elque se enlaza con
I y la disminucin de Vmx no se revierte por la adicin de ms
sustrato.Tambin, los inhibidores acompetitivos hacen descender la
Km (vista como un aumentodel valor absoluto de 1/Km en una grfica
de doble recproco) ya que los equilibrios deformacin de ES y de ESI
son desplazados hacia los complejos, por la unin de I.
Ex-perimentalmente, las lneas de una grfica de doble recproco
representando concentra-ciones variables de un inhibidor
acompetitivo, tienen todas la misma pendiente, lo queindica que los
valores de Km y de Vmx decrecieron proporcionalmente (figura
5.11b).Este tipo de inhibicin suele presentarse en las reacciones
de multisustrato.
+E P+E S ES+I
EI
Ki
kcatk1k
1
Control
[I]
1[S]
v0
1
1Km
1Vmx
1Km
app
Figura 5.9Inhibicin competitiva. a) Esquema cinticopara ilustrar
el enlace de I con E. Ntese quees una ampliacin de la ecuacin 5.11,
que incluye la formacin del complejo EI. b) Grfica de doble
recproco. En la inhibi-cin competitiva, Vmx permanece sin cam-biar
y Km aumenta. La lnea negra llamadaControl es el resultado en
ausencia de inhibidor. Las lneas grises son los resultadosen
presencia de inhibidor, y la flecha indica la direccin del aumento
de la [I].
ES+I
ESI
Ki
+E P+E S
Control
1[S]
v0
1 [I]
Figura 5.11Inhibicin acompetitiva. a) Esquema cinticoque ilustra
el enlace de I con ES. b) Grficade doble recproco. En la inhibicin
acompe-titiva decrecen tanto Vmx como Km (es decir,aumentan los
valores absolutos de 1/Vmx yde 1/Km obtenidos de las coordenadas x
y y al origen, respectivamente). La relacinKm/Vmx es la pendiente
de las rectas y per-manece sin cambio.
-
146 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
+E S ES+I
EI + S
+I
ESI
+E P
Ki KiControl
1[S]
v0
1 [I]
Figura 5.12Inhibicin no competitiva clsica. a) Esquemacintico
que ilustra el enlace de I con E o conES. b) Grfica de doble
recproco. Vmx dismi-nuye, pero Km permanece igual.
C. Inhibicin no competitiva
Los inhibidores no competitivos se pueden unir a la E o al ES y
formar complejos inac-tivos EI o ESI, respectivamente (figuras 5.8d
y 5.12a). Esos inhibidores no son anlo-gos del sustrato y no se
enlazan en el mismo sitio que el S. El caso clsico de inhibicinno
competitiva se caracteriza por una disminucin aparente de Vmx
(1/Vmx pareceaumentar) sin cambiar de la Km. En una grfica de doble
recproco, las lneas de la in-hibicin no competitiva clsica se
cruzan en el punto del eje x que corresponde a 1/Km(figura 5.12b).
Esta ordenada al origen comn indica que Km no se afecta. El efecto
dela inhibicin no competitiva est dada por la interaccin del I con
la E y el ES en for-ma reversible, eliminando las molculas de
enzima activa en la solucin. Esta inhibi-cin no se puede compensar
agregando S. Es rara la inhibicin no competitiva clsica,pero se
conocen ejemplos entre las enzimas alostricas. En esos casos, es
probable queel inhibidor no competitivo altere la conformacin de la
enzima, cuya forma todava lepermita seguir unindose al S pero sin
poder catalizar reaccin alguna.
La mayor parte de las enzimas no se apega a la forma clsica de
inhibicin no com-petitiva, donde no cambia Km. En la mayora de los
casos se afectan tanto la Vmx comola Km, ya que la afinidad del
inhibidor hacia la E es distinta que hacia ES. En esos casosse
suelen llamar de inhibicin mixta.
D. Usos de la inhibicin enzimtica
La inhibicin enzimtica reversible permite contar con un mtodo
poderoso para deter-minar la actividad enzimtica y para alterarla
en el tratamiento de enfermedades. Sepuede obtener informacin
acerca de la forma y de la reactividad qumica del sitio acti-vo de
una enzima a partir de experimentos que impliquen una serie de
inhibidores com-petitivos con estructuras alteradas en forma
sistemtica.
La industria farmacutica recurre a estudios de inhibicin
enzimtica para disearmedicamentos de uso clnico. En muchos casos se
usa un inhibidor natural de una enzi-ma como punto de partida para
disear un medicamento. En lugar de usar sntesis alea-torias y
determinar inhibidores potenciales, algunos investigadores estn
recurriendo aun mtodo ms eficiente llamado diseo racional de un
frmaco. En teora, con el bancode conocimientos tan amplio acerca de
la estructura de las enzimas, hoy pueden dise-arse inhibidores en
forma racional que se ajusten al sitio activo de determinada
enzi-ma. Los efectos de un compuesto sinttico se determinan primero
en enzimas aisladas,y despus en sistemas biolgicos. Aun cuando un
compuesto desarrolle una actividadinhibidora adecuada, se pueden
encontrar otros problemas. Por ejemplo, puede ser queel frmaco no
entre a las clulas diana, o que se metabolice muy rpido y se
conviertaen un compuesto inactivo, o que sea txico al organismo
husped, o que la clula dianapueda desarrollar resistencia al agente
en estudio.
Los progresos en la sntesis de frmacos o medicamentos se
ejemplifican por el di-seo de una serie de inhibidores de la enzima
purina nuclesido fosforilasa. Esta enzi-ma cataliza una reaccin de
degradacin entre fosfato y el nuclesido de guanosinacuya estructura
se observa en la figura 5.13a. Con modelado por computadora, se
disea-ron las estructuras de inhibidores potenciales y se ajustaron
al sitio activo de la enzima.Uno de tales compuestos (figura 5.13b)
fue sintetizado y se encontr que es 100 veces
-
5.8 Inhibicin enzimtica irreversible 147
NH2N
OH
HH
H
HOCH2
H
OH
O
O
N
HN N9
HN
N
N
ClH2C
OOC
HO
H2N
Figura 5.13Comparacin de un sustrato y un inhibidordiseado, de
la purina nuclesido fosforilasa.Los dos sustratos de esta enzima
son guanosi-na y un fosfato inorgnico. a) Guanosina. b) Un
inhibidor potente de la enzima. El N-9de la guanosina se ha
sustituido por un tomode carbono. El anillo de benceno clorado
seune al sitio de unin de azcares con la enzi-ma, y la cadena
lateral de acetato se enlazacon el sitio de unin del fosfato.
ms inhibidor que cualquier compuesto obtenido con el mtodo
tradicional de aproxi-macin por ensayo y error. Se espera que el
mtodo de diseo racional produzca medi-camentos adecuados para
tratar afecciones de autoinmunidad como artritis reumatoidey
esclerosis mltiple.
5.8 Inhibicin enzimtica irreversible
En contraste con un inhibidor enzimtico reversible, un inhibidor
enzimtico irreversibleforma un enlace covalente estable con una
molcula de enzima y elimina as las mol-culas del sitio activo en la
poblacin enzimtica. Tpicamente, la inhibicin irreversibleocurre por
alquilacin o acilacin de la cadena lateral de un residuo de
aminocido enel sitio activo. Hay muchos inhibidores irreversibles
naturales, al igual que hay ejem-plos sintticos que se describirn
aqu.
Una aplicacin importante de los inhibidores irreversibles es la
identificacin de re-siduos de aminocidos en el sitio activo, por
sustitucin especfica de sus cadenas latera-les reactivas. En este
proceso, un inhibidor irreversible que slo reacciona con un tipo
deaminocido se incuba con una solucin de la enzima, la que a
continuacin es analizadapara determinar su prdida de actividad. Las
cadenas laterales ionizables se modifican conreacciones de acilacin
o alquilacin. Por ejemplo, los grupos amino libres, como el
grupoe-amino de la lisina, reaccionan con un aldehdo para formar
una base de Schiff, la cual sepuede estabilizar por reduccin con
borohidruro de sodio (NaBH4) (figura 5.14).
El gas nervioso fluorofosfato de diisopropilo (DFP, de
diisopropyl fluorophosphate)es un qumico del grupo de compuestos
orgnicos de fsforo que inactivan a las hidro-lasas con una serina
reactiva como parte del sitio activo. A estas enzimas se les
llamaserina proteasas o serina esterasas, dependiendo de la
especificidad de su reaccin. Laquimotripsina una serina proteasa,
es una importante enzima digestiva, que es inhibidaen forma
irreversible por el DFP (figura 5.15, pgina 148). El DFP reacciona
con el re-siduo de serina en el sitio activo de la quimotripsina
(Ser-195) y produce diisopropilfos-foril-quimotripsina. En
agricultura se usan algunos inhibidores organofsforados
comoinsecticidas; otros, como el DFP, son buenos reactivos en la
investigacin de enzimas.Los gases nerviosos originales de
organofsforo son venenos de toxicidad extrema, de-sarrollados para
usos militares. La accin biolgica principal de dichos venenos es
lainhibicin irreversible de la acetilcolinesterasa, una serina
esterasa que cataliza la hi-drlisis de la acetilcolina, un
neurotransmisor. Cuando la acetilcolina liberada de unaclula
nerviosa activada se une a su receptor en una segunda clula
nerviosa, activandoel impulso nervioso. La accin de la
acetilcolinesterasa restaura a la clula a su estadode reposo. La
inhibicin de esta enzima puede causar parlisis.
Los inhibidores reversibles con estructuras que les permitan
unirse en forma espe-cfica a un sitio activo son ms tiles que los
reactivos generales de sustitucin. Estosinhibidores se llaman
reactivos dirigidos al sitio activo, o marcadores de afinidad.
Elfosfato de bromohidroxiacetona es un marcador de afinidad para la
triosa fosfato iso-merasa, que cataliza la interconversin de
fosfato de dihidroxiacetona y el 3-fosfato degliceraldehdo. Este
inhibidor reacciona con la cadena lateral de un residuo de
glutama-to de la enzima (figura 5.16, pgina 148). Con experimentos
como ste se identific queel Glu-165 es un componente del sitio
activo de la triosa fosfatoisomerasa.
C
NaBH4
H2O
H2O
(CH2)4
CH
O
R
+
NH2
Lys
N
HR
Base de Schiff
(CH2)4
Lys
CH2
NH
R
(CH2)4
Lys Figura 5.14Reaccin del grupo e-amino del residuo de li-sina
con un aldehdo. La reduccin de la basede Schiff con borohidruro de
sodio (NaBH4)forma una enzima sustituida estable.
En la seccin 6.4A se presentan los deta-lles de esta reaccin de
isomerasa.
-
148 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
F
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Ser-195
C O P O C
F
O
..
CH2
OH
H
H3C
CH3
H
CH3
H3C
C O P O C
F
OH3C CH3
O
H
H3C CH3
H
Ser-195
CH2
C O P O C
OH3C CH3
O
Diisopropilfosforil-quimotripsina
H
H3C CH3
H
Ser-195
CH2
H
Figura 5.15Reaccin de fluorofosfato de diisopropilo (DFP)con un
solo residuo de serina, muy nucleoflico(Ser-195) en el sitio activo
de la quimotripsina;produciendo
diisopropilfosforil-quimotripsina,inactiva. El DFP inactiva las
serina proteasas yserina esterasas.
ONaBH4
Br(CH2)2
C
CH2 Br
C
Glu
C
(CH2)2
Glu
O
C
CH2
(CH2)2
Glu
OO
CH2OPO3
O
O
CH2
C O
CH2OPO3
O
CHOH
CH2OPO322
2
Fosfato de bromohidroxiacetonaFigura 5.16Inhibicin irreversible
de la triosa fosfato isomerasa. El anlogo 1-bromo del fosfato de
dihidro-xiacetona reacciona con la cadena lateral del residuo de
glutamato del sitio activo. La reduc-cin del grupo carbonilo del
sustituyente mediante NaBH4 evita la migracin del indicador
deafinidad hacia otro grupo.
5.9 Enzimas alostricas
Las enzimas alostricas son enzimas cuyas propiedades son
afectadas por cambios en laestructura. Los cambios estructurales
son ocasionados por interaccin con molculaspequeas. Se plante un
ejemplo de alosterismo en el captulo anterior al examinar launin
del oxgeno a la hemoglobina. Con frecuencia, las enzimas alostricas
no presen-tan cintica clsica de Michaelis-Menten debido a su unin
cooperativa del sustrato,como el caso de la hemoglobina, que no es
enzima.
La figura 5.17 muestra una curva de y0 en funcin de [S] para una
enzima alostricacon enlazamiento cooperativo del sustrato. Las
curvas sigmoides se deben a la transicinentre dos estados de la
enzima. En ausencia del sustrato, la enzima est en el estado T.La
conformacin de cada subunidad presenta una forma en la que se une
ineficiente-mente al sustrato y la velocidad de la reaccin es baja.
A medida que la concentracinde sustrato aumenta, las molculas de
enzima comienzan a unirse al sustrato, aunque laafinidad de la
enzima en el estado T sea baja. Cuando una subunidad se une al
sustratosufre un cambio de conformacin que la convierte al estado R
y se efecta la reaccin.Las propiedades cinticas de la subunidad
enzimtica en el estado T y en el estado Rson bastante distintas;
cada conformacin podra, por s misma, exhibir una cinticanormal de
Michaelis-Menten.
El cambio de conformacin en la subunidad que al principio se
enlaza a una mol-cula de sustrato afecta las dems subunidades en la
enzima multisubunidades. Las con-formaciones de esas otras
subunidades se desplazan hacia el estado R, donde es muchomayor su
afinidad hacia el sustrato. Ahora se pueden unir al sustrato a una
concentra-cin mucho menor que cuando se hallaban en el estado
T.
5.10 Regulacin de la actividad enzimtica
Al principio de este captulo se present una lista de las
diversas ventajas que supone eluso de enzimas como catalizadores en
reacciones bioqumicas. Es claro que la ventajams importante es
acelerar reacciones que de otro modo seran muy lentas para
mante-ner la vida. Otra de las ventajas de las enzimas es que su
actividad cataltica se puederegular de varias maneras. La cantidad
de una enzima se puede controlar regulando lavelocidad de su
sntesis o de su degradacin. Este modo de control se presenta en
todaslas especies, pero con frecuencia se tarda de muchos minutos a
horas sintetizar nuevasenzimas o degradar las enzimas
existentes.
En todos los organismos, el control rpido, a escala de segundos
o menos, se pue-de lograr mediante modulacin reversible de la
actividad de enzimas reguladoras. En
-
5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 149
[S]
v0
Figura 5.17Grfica de la velocidad inicial en funcin de
laconcentracin del sustrato para una enzimaalostrica que tiene
enlazamiento cooperativodel sustrato.
este contexto las enzimas reguladoras se definen como aquellas
cuya actividad sepuede modificar en una forma que afecte la
velocidad de una reaccin catalizada por laenzima. (En muchos casos,
tales enzimas reguladoras controlan un paso clave en unaruta
metablica. Cuando se describa la regulacin de una ruta, a veces se
designarncomo enzimas reguladoras a las enzimas que regulan el
flujo de metabolitos en unaruta). La actividad de una enzima
regulada cambia como respuesta a seales del am-biente y permite que
la clula responda a las condiciones variables, con ajuste de
lasvelocidades de sus procesos metablicos.
En general, las enzimas reguladoras se vuelven catalizadores ms
activos cuandoaumenta la concentracin de sus sustratos o cuando
disminuyen las concentraciones delos productos de sus rutas
metablicas. Se vuelven menos activas cuando disminuyenlas
concentraciones de sus sustratos o cuando se acumulan los productos
de sus rutasmetablicas. La inhibicin de la nica enzima inicial en
una ruta conserva tanto materia-les como energa, evitando la
acumulacin de compuestos intermedios y del productofinal. Las
enzimas reguladoras se pueden clasificar por el mtodo de su
modulacin:modulacin alostrica no covalente o modificacin
covalente.
Los fenmenos alostricos son los responsables del control
reversible de numero-sas enzimas reguladoras. En la seccin 4.13C se
explic cmo cambia la conformacinde la hemoglobina y su afinidad
hacia el oxgeno cuando se le une 2,3-bisfosfoglicera-to. Muchas
enzimas reguladoras tambin sufren transiciones alostricas entre los
esta-dos activo (R) e inactivo (T), como se describi en la seccin
anterior. Estas enzimasdisponen de un segundo sitio de unin para el
ligando, alejado de sus centros catalti-cos. Este segundo sitio se
llama sitio regulador o sitio alostrico. Un inhibidor o acti-vador
alostrico, que tambin se llama modulador alostrico o efector
alostrico, se uneal sitio regulador y causa un cambio de
conformacin en la enzima reguladora. Estecambio de conformacin es
transmitido al sitio activo de la enzima, el cual cambia deforma lo
suficiente para alterar su actividad. Los sitios regulador y
cataltico son regionesfsicamente diferentes de la protena en
general se encuentran en dominios separa-dos, y a veces en
subunidades separadas. Las enzimas con regulacin alostrica
suelenser ms grandes que otras enzimas. (Ntese que tambin la
actividad de una enzima re-guladora se puede controlar por
modificacin covalente).
Primero se ha de examinar una enzima que presenta regulacin
alostrica (nocovalente) y despus se mencionarn algunas propiedades
generales de tales enzimas.A continuacin se describen dos teoras
que se proponen para explicar la regulacinalostrica en funcin de
cambios en la conformacin de las enzimas reguladoras. Porltimo, se
describir un grupo de enzimas reguladoras estrechamente
relacionadas lascuales estn sujetas a modificacin covalente.
A. Fosfofructocinasa, una enzima alostrica
La fosfofructocinasa-1 de la bacteria Escherichia coli es un
buen ejemplo de inhibiciny activacin alostrica. La
fosfofructocinasa-1 cataliza la fosforilacin dependiente deATP del
6-fosfato de fructosa para producir 1,6-bis-fosfato de fructosa y
ADP (figura5.18). Esta reaccin es uno de los primeros pasos de la
gluclisis, una ruta de degrada-cin de la glucosa generadora de ATP
(que se describir en detalle en el captulo 11). Elfosfoenolpiruvato
(figura 5.19) es un compuesto intermedio, cercano al final de la
ruta
En el captulo 18 se describir la aspartatotranscarbamoilasa
(ATCasa), otra enzimaalostrica bien caracterizada.
Fructosa 6-fosfato
CH2OH
HO
OC
C
OHCH
OHCH
H
CH2OPO32
Fructosa 1,6-bifosfato
HO C
OHCH
OHCH
H
CH2OPO32
OC
CH2OPO32
Fosfofructocinasa-1
ATP ADP
Figura 5.18Reaccin catalizada por fosfofructocinasa-1.
-
150 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
C
CH2
COO
OPO32
Figura 5.19Fosfoenolpiruvato, intermediario de la gliclisisy un
inhibidor alostrico de la fosfofructocina-sa-1 de Escherichia
coli.
Figura 5.20Conformacin R de la fosfofructocinasa-1 deE. coli. La
enzima es un tetrmero de cadenasidnticas. a) Una subunidad,
representadapor una cinta. Los productos, fructosa 1,6-bi-fosfato
(amarillo) y ADP (verde) estn unidosen el sitio activo. El
activador alostrico ADP(rojo) est enlazado en el sitio regulador.
b) Tetrmero. Dos estn en azul y dos enprpura. Los productos,
fructosa 1,6-bifosfato(amarillo) y ADP (verde) estn enlazados enlos
cuatro sitios activos. El ADP, activadoralostrico (en rojo), est
unido en los cuatrositios reguladores en la interfase de las
sub-unidades. [PDB 1PFK]. (Vase esta figura atodo color al final
del libro).
glucoltica, es un inhibidor alostrico de la fosfofructocinasa-1
de E. coli. Cuando laconcentracin de fosfoenolpiruvato aumenta,
significa que la ruta metablica estbloqueada ms adelante de ese
punto. La produccin continua de fosfoenolpiruvato esevitada al
inhibir la fosfofructocinasa-1.
El ADP es un activador alostrico de la fosfofructocinasa-1. Eso
puede parecer ex-trao, al contemplar la figura 5.18, pero tngase en
mente que la ruta general de la glu-clisis da como resultado la
sntesis neta de ATP a partir de ADP. Si las concentracionesde ADP
aumentan, esto implica que hay deficiencia de ATP y debe
estimularse la glu-clisis. As, el ADP activa la
fosfofructocinasa-1, a pesar del hecho (o debido al he-cho?) de que
el ATP es hidrolizado en esta reaccin en particular.
El fosfoenolpiruvato y el ADP afectan la unin del sustrato
6-fosfato de fructosacon la fosfofructocinasa-1. Con experimentos
cinticos se ha demostrado que hay cuatrositios de enlace en la
fosfofructocinasa-1 para el 6-fosfato de fructosa, y con
experi-mentos para determinacin de estructura se ha confirmado que
la fosfofructocinasa-1de E. coli (Mr 140 000) es un tetrmero
formado por cuatro subunidades idnticas. Lafigura 5.20 muestra la
estructura de la enzima acomplejada con sus productos,
fructosa1,6-bifosfato y ADP, y una segunda molcula de ADP, un
activador alostrico. Las cua-tro cadenas alargadas se asocian
simtricamente para formar dos dmeros en el olig-mero nativo. Los
dos productos estn enlazados en el sitio activo, el cual est entre
dosdominios de cada cadena el ADP se une al dominio grande y el
1,6-bifosfato de fruc-tosa se enlaza principalmente al dominio
pequeo.
Una propiedad notable de la estructura de la fosfofructocinasa-1
(y una propiedadgeneral de las enzimas reguladoras) es la separacin
fsica del sitio activo y el sitio re-gulador en cada subunidad. (En
algunas enzimas reguladoras, los sitios activo y regula-dor se
hallan en distintas subunidades). El activador ADP se une a cierta
distancia delsitio activo, en un orificio profundo entre las
subunidades. Cuando el ADP se une al si-tio regulador, la
fosfofructocinasa-1 asume la conformacin R, que tiene gran
afinidadhacia el 6-fosfato de fructosa. Cuando el
fosfoenolpiruvato, un compuesto ms peque-o, se enlaza con el mismo
sitio regulador, la enzima asume una conformacin diferen-te, la
conformacin T, con menor afinidad hacia el 6-fosfato de fructosa.
La transicinentre las conformaciones se logra mediante una pequea
rotacin de un dmero rgidorespecto del otro. La cooperatividad de
unin con el sustrato depende del movimientoconcertado de un residuo
de arginina en cada uno de los cuatro sitios de unin con 6-fosfato
de fructosa, cerca de la interfase entre los dmeros. El movimiento
de la cadenalateral de esta arginina alejndose del sitio activo
hace descender la afinidad hacia el6-fosfato de fructosa. En muchos
organismos, la fosfofructocinasa-1 es ms grande yest sujeta a una
regulacin alostrica ms compleja que la de E. coli, como se ver enel
captulo 11.
Los activadores pueden afectar ya sea la Vmx, o la Km o ambas.
Es importantereconocer que la unin de un activador altera la
estructura de una enzima y que estaalteracin la convierte en una
forma diferente que puede tener propiedades cinticasdistintas. En
la mayor parte de los casos, las diferencias entre las propiedades
cinti-cas de las formas R y T son ms complejas que las que se
estudiaron con los inhibidoresde enzima en la seccin 5.7.
B. Propiedades generales de las enzimas alostricas
La examinacin de las propiedades cinticas y fsicas de las
enzimas alostricas hademostrado que poseen las siguientes
caractersticas generales:
1. Las actividades de las enzimas alostricas cambian debido a
inhibidores y activa-dores metablicos. Con frecuencia, dichos
moduladores alostricos no se parecen alos sustratos o a los
productos de la enzima. Por ejemplo, el fosfoenolpiruvato(figura
5.19) no se parece al sustrato ni al producto (figura 5.18) de la
fosfo-fructocinasa. Una consideracin de las diferencias
estructurales entre sustra-tos e inhibidores metablicos llev
originalmente, a la conclusin de que losmoduladores alostricos estn
unidos a sitios reguladores, separados de los sitioscatalticos.
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5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 151
2. Los moduladores alostricos se enlazan en forma no covalente a
las enzimas queregulan. (Hay un grupo especial de enzimas
reguladoras cuyas actividades soncontroladas por modificacin
covalente y se describen en la seccin 5.10D). Mu-chos moduladores
alteran la Km de la enzima para un sustrato; otros, la Vmx de
laenzima. Los moduladores mismos no son alterados qumicamente por
la enzima.
3. Con pocas excepciones, las enzimas reguladoras son protenas
de subunidadesmltiples. (Sin embargo, no todas las enzimas de
subunidades mltiples son re-guladoras). Las cadenas polipeptdicas
individuales de una enzima reguladorapueden ser idnticas o
diferentes. Para aquellas enzimas que tienen subunidadesidnticas
(como la fosfofructocinasa-1 de E. coli), cada cadena polipeptdica
puedecontener los sitios cataltico y regulador a la vez y el
oligmero es un complejosimtrico que con frecuencia posee dos o
cuatro cadenas de protena. Las enzi-mas reguladoras formadas por
subunidades diferentes tienen ordenamientos mscomplejos, pero en
general simtricos.
4. Toda enzima sujeta a regulacin alostrica posee cuando menos
un sustrato parael cual la curva de v0 en funcin del [S] es
sigmoidea en lugar de hiperblica(seccin 5.9). La
fosfofructocinasa-1 exhibe una cintica de
Michaelis-Menten(hiperblica) con respecto a un sustrato, ATP, pero
cintica sigmoidea en relacincon su otro sustrato, el 6-fosfato de
fructosa. La curva sigmoidea es causada porla cooperacin positiva
del enlace del sustrato, lo cual es posible por la presenciade
mltiples sitios de enlace del sustrato en la enzima.
La figura 5.21 ilustra el papel regulador que puede desempear el
enlazamientocooperativo. La adicin de un activador puede desplazar
la curva sigmoidea hacia unaforma hiperblica, con descenso de la Km
aparente (la concentracin de sustrato nece-saria para la mitad de
la saturacin) y aumento de la actividad a determinada [S]. Laadicin
de un inhibidor puede aumentar la Km de la enzima y reducir su
actividad a unaconcentracin particular del sustrato.
La transicin alostrica entre las conformaciones activa e
inactiva deuna enzima reguladora es rpida. La relacin de R a T se
controla por las concentracio-nes de los diversos ligandos y por
las afinidades relativas de cada conformacin haciatales ligandos.
En los casos ms simples, las molculas de sustrato y activador slo
seunen a la enzima en el estado R (ER) y las molculas de inhibidor
slo se unen a laenzima en el estado T (ET).
R T
Vmx
[S]
v0Vmx
2
E + Activador
E + Inhibidor
Km
E
KmappKm
app
Figura 5.21Papel de la cooperatividad de enlace en laregulacin.
La actividad de una enzima alos-trica con curva sigmoidea de
enlazamientose puede alterar marcadamente cuando unactivador o un
inhibidor se unen a la enzima.La adicin de un activador puede hacer
des-cender la Km aparente, elevando la actividada determinada [S].
Al revs, la adicin de uninhibidor puede elevar la Km aparente y
pro-ducir menos actividad a una [S] dada.
Transicinalostrica
ER SER
S
S
ETET I
I
I
(5.28)
La adicin de S causa un aumento en la concentracin de la enzima
en su conformacinR. Al revs, la adicin de I aumenta la proporcin de
la especie T.
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152 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas
Estado RTransicinalostrica
S
S
S
S
S
S
S
S
Estado R
Estado T Estado T
S
SS
SSS
S SS S
S
SS
S SS
S SSS
Figura 5.22Dos modelos de cooperatividad de enlaza-miento de
sustrato (S) con una protena tetramrica. a) En el modelo concertado
simplificado, todas las subunidades estn enel estado R o en el
estado T y S slo se enlazaal estado R. b) En el modelo secuencial,
elenlazamiento de S a una subunidad slo convierte esa subunidad a
la conformacin R.Las subunidades vecinas pueden quedar en elestado
T o pueden asumir las conformacionesentre T y R.
Las molculas de activador se enlazan de preferencia a la
conformacin R y causanun aumento en la relacin R/T. Ntese que este
esquema simplificado no muestra quehaya muchos sitios de enlace que
interactan, tanto para S como para I.
Algunos inhibidores alostricos son competitivos no clsicos
(figura 5.8b). Porejemplo, la figura 5.21 describe una enzima que
tiene una Km aparente mayor para susustrato en presencia de un
inhibidor alostrico, pero una Vmx que no cambia. En con-secuencia,
el modulador alostrico es un inhibidor competitivo.
Algunas enzimas reguladoras presentan patrones de inhibicin no
competitiva(figura 5.8d). El enlazamiento de un modulador al sitio
regulador no evita que el sus-trato se enlace, pero parece que
distorsiona la conformacin del sitio activo lo suficien-te para
disminuir la actividad de la enzimtica.
C. Dos teoras de la regulacin alostrica
Hay dos modelos que explican la cooperatividad de enlazamiento
de ligandos a prote-nas oligomricas que se han ganado el
reconocimiento general. Tanto la teora concer-tada como la teora
secuencial describen las transiciones cooperativas en
trminoscuantitativos simples. La ltima es una teora ms general; la
primera es adecuada paraexplicar muchas enzimas alostricas.
La teora concertada, o teora inducida por simetra, fue inventada
para explicarla unin cooperativa de ligandos idnticos como los
sustratos. Se supone que hay un si-tio de unin por cada subunidad y
para cada ligando; tambin que la conformacin decada subunidad est
restringida por su asociacin con otras subunidades, y que cuandola
protena cambia de conformacin conserva su simetra molecular (figura
5.22a). As,hay dos conformaciones en equilibrio, la R (con gran
afinidad hacia el sustrato) y la T(con baja afinidad hacia el
sustrato). La unin con el sustrato desplaza al equilibrio.Cuando la
conformacin de la protena cambia, tambin lo hace la afinidad de sus
sitiosde unin a ligandos. La teora concertada se ampli para incluir
la unin de moduladores
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5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 153
alostricos y se puede simplificar suponiendo que el sustrato slo
se enlaza al estado Ry que el inhibidor alostrico slo se une al
estado T. La teora concertada se basa en lasimetra estructural
observada en las enzimas reguladoras. Parece indicar que todas
lassubunidades de una determinada molcula de protena tienen la
misma conformacin,sean todas R o todas T; esto es, conservan su
simetra cuando pasan del estado T al es-tado R. Los datos
experimentales obtenidos con varias enzimas pueden explicarse
conesta sencilla teora. Por ejemplo, muchas de las propiedades de
la fosfofructocinasa-1de E. coli se ajustan a la teora concertada.
En la mayor parte de los casos la teora con-certada no explica en
forma adecuada todas las observaciones respecto a
determinadaenzima. Su comportamiento es ms complejo que el que
sugiere este sencillo modelode dos estados.
La teora secuencial, o teora inducida por ligando, es una
proposicin ms general.Se basa en la idea de que un ligando puede
inducir un cambio en la estructura terciariade la subunidad a la
que se une. Este complej