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Aus der II. Medizinischen Klinik für Innere Medizin
(Direktor: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. M. Kneba)
im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel,
an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
ENTWICKLUNG UND EVALUATION STANDARDISIERTER
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER METHODEN ZUR BESTIMMUNG
DER MINIMALEN RESTERKRANKUNG BEI
MANTELZELLLYMPHOMEN UND BEI DER CHRONISCHEN
LYMPHATISCHEN LEUKÄMIE DER B-ZELLREIHE
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Sebastian Buske
aus
Rendsburg
Kiel 2014
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Referent: Frau Prof. Dr. Monika Brüggemann, Klinik für Innere Medizin II mit den Schwerpunkten
Hämatologie und Onkologie
Ko-Referent: Herr Prof. Dr. R. Siebert, Institut für Humangenetik
Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2014
Zum Druck genehmigt: Kiel, den 01.12.2014
gez.: Herr Prof. Dr. Johann Roider
(Vorsitzender der Prüfungskommission)
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Abkürzungsverzeichnis:
APC Allophycocyanin
ASO Allele Specific Oligonukleotide; Allel-spezifisches Oligonukleotid
BD Becton Dickinson
BMND Bone Marrow Normal Donor; Knochenmark gesunder Spender
BSA Bovine Serum Albumine, Rinderserumalbumin
CD Cluster of differentiation
CDR Complementarity Determining Region; Region des Immunglobulin-
Schwerkettengens, das die Komplementarität zum Antigen bestimmt
CLL Chronische Lymphatische Leukämie
CR Complete Remission; komplette Remission
CT Treshold Cycle
DCLLSG Deutsche CLL Studiengruppe
DNA Deoxyribonucleic Acid; Desoxyribonukleinsäure (DNS)
dNTP Desoxy-Nucleosid-Triphosphate
ddNTP Didesoxy-Nucleosid-Triphosphate
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting; Durchflusszytometrie
Fc-Rezeptor Membranrezeptor mit Bindungsspezifität zu einem Teil eines Antikörpers welches
Fragment Fc (engl. crystallisable fragment) genannt wird
FC Fludarabin/Cyclophosphamid
FISH Fluoreszenz in-situ Hybridisierung
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSC Forward Scatter, Vorwärtsstreulicht
FR1 Framework Region 1, Rahmenregion 1; Region innerhalb des Schwerkettengens mit
geringer Variabilität
HSZT Hämatopoetische Stammzelltransplantation
IGH Immuneglobulin Gene Heavy Chain; Immunglobulinschwerkettengen
KM Knochenmark
LDH Laktatdehydrogenase
LKR Leichtkettenrestriktion
MCL Mantle Cell Lymphoma; Mantelzelllymphom
MDD Minimal disseminated disease
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MFIR Mean Fluorescence Intensity Ratio; Signal-Rausch-Verhältnisse des
geometrischen Mittelwerts
MRD Minimal Residual Disease; minimale Resterkrankung
NCI National Cancer Institute
ND Normal Donor; gesunder Spender
NK Natürliche Killerzellen
ORR Overall Response Rate; Gesamtansprechrate
OS Overall Survival; Gesamtüberleben
PB Peripheral Blood; peripheres Blut
PBND Peripheral Blood Normal Donor; peripheres Blut gesunder Spender
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction; Polymerase Kettenreaktion
PE Phycoerythrin
PerCP -Cy5.5 Peridinin Chlorophyll Protein Cyanine 5.5
PFÜ Progressionsfreies Überleben
R-CHOP Rituximab-Cyclophosphamid/Doxorubicin/Vincristin/Prednison
R-DHAP Rituximab-Dexamethason/Cytarabin/Cisplatin
R-FC Rituximab-Fludarabin/Cyclophosphamid
RQ Real Time Quantitative-PCR; quantitative Echtzeit-PCR
SRV Signal-Rausch-Verhältnis
SSC Side Scatter; Seitwärtsstreulicht
VH Variable Gene for Heavy Chain; Teil des Schwerkettengens
DH Diversity Gene for Heavy Chain; Teil des Schwerkettengens
JH Joining Gene for Heavy Chain; Teil des Schwerkettengens
WHO World Health Organization; Weltgesundheitsorganisation
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ......................................................................................................................................... 1
2. Patienten, Material und Methodik .................................................................................................... 6
2.1 Patientenproben und Proben gesunder Spender ......................................................................... 6
2.1.1 MCL-Patientenkollektive .................................................................................................... 6
2.1.2 CLL-Patientenkollektive ..................................................................................................... 8
2.1.3 Proben gesunder Spender .................................................................................................... 8
2.2 Durchflusszytometrische Analysen ............................................................................................ 9
2.2.1 Färbeprotokoll ..................................................................................................................... 9
2.2.2 Titration der Antikörper und Auswahl geeigneter Antikörper-Fluorochrom-
Kombinationen ............................................................................................................................. 9
2.2.3 Finale Färbeansätze MCL und CLL.................................................................................. 11
2.2.4 Durchflusszytometrische Messung ................................................................................... 12
2.2.5 Auswertungsstrategie ........................................................................................................ 13
2.2.5.1 Identifikation CD5+CD19
+doppelt positiver Lymphozyten....................................... 13
2.2.5.2 Standardisierte Untersuchung der Expressionsstärken von Antigenen auf MCL- und
CLL-Zellen und auf benignen CD5+CD19
+-B-Lymphozyten ............................................... 15
2.2.5.3 Auswertevorlagen für die objektive Auswertung von Expressionsstärke-
Unterschieden zwischen malignen und benignen B-Zellen. .................................................. 16
2.2.5.4 Analyse der Leichtkettenrestriktion ........................................................................... 18
2.3 Molekulare Analysen ............................................................................................................... 19
2.3.1 Qualitativer Klonalitätsnachweis mittels Konsensus-IGH-FR1-PCR und GeneScan-
Analyse....................................................................................................................................... 19
2.3.2 Sequenzierung klonaler IGH-FR1-PCR-Produkte ............................................................ 21
2.3.3 ASO-IGH-RQ-PCR .......................................................................................................... 22
2.4 Statistische Analysen ............................................................................................................... 25
3. Ergebnisse ...................................................................................................................................... 26
3.1 Titrationsergebnisse und Optimierung der Antikörper-Fluorochrom-Auswahl ...................... 26
3.2 Etablierung der FACS-Panels .................................................................................................. 27
3.2.1 Expressionsstärkenanalyse aberrant exprimierter Antigene auf MCL-Zellen im Vergleich
zu benignen B-Lymphozyten ..................................................................................................... 27
3.2.2 Durchflusszytometrische Analysen zur CLL .................................................................... 32
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3.2.2.1 Expressionsstärkenanalyse aberrant exprimierter Antigene auf CLL-Zellen im
Vergleich zu benignen B-Lymphozyten ................................................................................ 32
3.2.2.2 Anwendung der kreierten Auswertevorlagen anhand 30 zusätzlicher Blutproben
unbehandelter CLL8-Patienten .............................................................................................. 36
3.3 Vergleich der durchflusszytometrischen, histomorphologischen und molekularen
MRD/MDD-Analysen .................................................................................................................... 36
3.3.1 Initialdiagnostischer Vergleich der durchflusszytometrischen mit denen der Konsensus-
IGH-FR1-PCR-Analyse und der Knochenmarkhistologie beim MCL ...................................... 36
3.3.2 Vergleich der durchflusszytometrischen MRD-Ergebnisse der MCL-Verlaufsproben mit
denen der Konsensus-IGH-FR1-PCR ........................................................................................ 38
3.3.3 Vergleich der FACS-MRD-Ergebnisse zwischen Knochenmarkproben und
entsprechender Proben aus dem peripheren Blut bei MCL-Patienten ....................................... 38
3.3.4 Vergleichende Verlaufsanalysen zwischen MRD-FACS und der IGH-RQ-PCR bei
Patienten der CLL8-Studie ......................................................................................................... 40
4. Diskussion ...................................................................................................................................... 41
5. Zusammenfassung .......................................................................................................................... 47
6. Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 49
7. Danksagung .................................................................................................................................... 54
8. Lebenslauf ...................................................................................................................................... 55
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- 1 - Einleitung
1. Einleitung
Das Mantelzelllymphom (MCL) ist eine seltene Neoplasie reifzelliger B-Lymphozyten mit
einer Inzidenz von 2 pro 100.000 Einwohner pro Jahr. Die Erkrankung wurde lange
zusammen mit der Chronischen Lymphatischen Leukämie klassifiziert und erst 1975 durch
Professor Lennert et al. als eigenständige Entität erkannt [1]. Die Ätiologie der Erkrankung ist
bisher unbekannt. Charakterisiert wird das MCL durch eine chromosomale Translokation
t(11;14)(q13;q32). Diese führt zu einer Überexpression von Cyclin D1, einem Protein,
welches eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellzyklus hat. Die Patienten befinden sich
zum Diagnosezeitpunkt zu 95% in einem fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung (Ann
Arbor Stadium III-IV). Das mediane Erkrankungsalter der Patienten liegt bei 63 Jahren, bei
einem Verhältnis von 3:1 zwischen Männern und Frauen. Durchflusszytometrische Marker
sind die oberflächliche Expression von CD19, CD20, CD22 bei gleichzeitiger CD5-Positivität
und CD23-Negativität [2, 3].
Durch schnelle Resistenzentwicklungen gegen zytostatische Chemotherapeutika, hat das
MCL eine deutliche schlechtere Prognose als andere periphere B-Zell-Lymphome. Die
mediane Gesamtüberlebenszeit beträgt 2 - 5 Jahre, mit nur 10-15% Langzeitüberlebenden.
Erst durch die Einführung des monoklonalen therapeutischen Antikörpers Rituximab (anti-
CD20) und der myeloablativen Radiochemotherapie mit anschließender autologer
Knochenmark-Stammzelltransplantation konnten die medianen Überlebenszeiten zuletzt auf
5-6 Jahre erhöht werden [4-6].
Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) ist mit einer Inzidenz von 3 pro 100.000
Einwohner die häufigste Leukämieform in den westlichen Industrienationen. Die Erkrankung
gehört nach der aktuellen WHO-Klassifikation von 2008 zu den peripheren Non-Hodgkin-
Lymphomen der B-Zell-Reihe [2]. Die Ätiologie der CLL ist bis heute ebenfalls ungeklärt.
Eine familiäre Häufung und eine niedrigere Inzidenz in Asien lassen auf einen genetischen
Hintergrund schließen [7, 8]. Das mediane Alter zum Zeitpunkt der Erstdiagnose liegt bei 65
Jahren. Dabei erkranken Männer doppelt so häufig wie Frauen an dieser Leukämieform.
Patienten überleben im Median 10 Jahre mit der Erkrankung. Die Diagnose wird anhand einer
anhaltenden Lymphozytose im peripheren Blut (> 5000 B-Lymphozyten/µl), dem Nachweis
zytomorphologisch reifzelliger Lymphozyten und einer Oberflächenexpression von CD19,
CD20, CD23 bei gleichzeitiger CD5-Positivität sowie der Expression von kappa oder lambda
Immunglobulin-Leichtketten auf den Lymphozyten gesichert [9].
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- 2 - Einleitung
In den vergangenen 15 Jahren wurden entscheidende neue Erkenntnisse zur Biologie und zu
klinischen Verläufen der CLL gewonnen. So gelten eine kurze Verdopplungszeit der
Lymphozyten (< 12 Monate), eine erhöhte Serum-Thymidinkinase-Aktivität, die Expression
des Oberflächenmoleküls CD38 auf den CLL-Zellen, die Expression des Moleküls ZAP-70,
bestimmte genetische Aberrationen (11q- und 17p-Deletion) sowie das Fehlen von
somatischen Hypermutationen der Immunglobulinschwerkettengene als Risikofaktoren für
einen ungünstigen Verlauf der CLL [9-13].
Die Möglichkeiten zur Behandlung der CLL haben sich in den letzten Jahren deutlich
verbessert. Der Einsatz von Purinanaloga (z.B. Fludarabin) und ihre Kombination mit
Cyclophosphamid (FC) führten zu höheren Ansprechraten (Gesamtansprechrate (ORR) von
83% auf 94%, Komplette Remission (CR) von 7% auf 24%) [14]. Das Progressionsfreie
Überleben (PFÜ) konnte durch den Einsatz monoklonaler therapeutischer Antikörper wie
Rituximab (anti-CD20) oder Alemtuzumab (anti-CD52) weiter gesteigert werden (R-FC vs.
FC, PFÜ 65% vs. 45% [9, 15-19]. Somit werden heute deutlich verbesserte
Remissionsqualitäten erzielt. Die intensivere Therapie führt bei jüngeren Patienten auch zur
Verbesserung des progressionsfreien und des Gesamtüberlebens [16]. Trotzdem ist nur mit
der Transplantation allogener hämatopoetischer Stammzellen (HSZT) eine kurative
Behandlungsmöglichkeit für diese Krankheit gegeben [20-22]. Bis heute kann weder mit einer
(Immun)-Chemotherapie noch mit der autologen HSZT der CLL-Klon komplett eliminiert
werden.
Ausgangspunkt eines klinischen Rezidivs sind persistierende Tumorzellen unterhalb der
Nachweisgrenze der Morphologie, die sogenannte minimale Resterkrankung (minimal
residual disease, MRD).
Bei peripheren Non-Hodgkin-Lymphomen der B-Zell-Reihe kommen derzeit drei
unterschiedliche Methoden zur MRD-Bestimmung zur Anwendung:
1. Konsensus- PCR zum Nachweis klonal rearrangierter
Immunglobulinschwerkettengene (Konsensus-IGH-FR1-PCR),
2. Quantitative Real-Time-PCR (RQ-PCR) unter Verwendung von klonspezifischen
Primern gegen die individuelle hypervariable Region des Schwerkettengens (ASO-
IGH-RQ-PCR),
3. Mehrfarbendurchflusszytometrie.
Page 9
- 3 - Einleitung
Die erwähnten molekularen Methoden nutzen das Prinzip des genomischen Rearrangements
des IGH-Lokus, das während der B-Zell-Entwicklung stattfindet und zur Bildung spezifischer
DNA-Abschnitte im Bereich der hypervariablen IGH CDR3-Region führt. Die so
entstandenen hypervariablen Bereiche stellen bei B-Zell-Lymphomen klonspezifische
Sequenzen dar, die als molekulare Lymphommarker eingesetzt werden können.
Eine relativ einfache und kostengünstige Methode stellt in diesem Zusammenhang die
Konsensus-IGH-FR1-PCR dar, bei der Konsensus-Primer gegen konservierte Bereiche der V-
und J-Segmente zu PCR-Produkten führen, die den hypervariablen CDR3-Bereich der
Immungenumlagerung überspannen. Eine Fragmentanalyse der amplifizierten PCR-Produkte
erlaubt die Unterscheidung polyklonaler und monoklonaler PCR-Produkte. Zur
Fragmentanalyse wird in der Regel das GeneScan-Verfahren eingesetzt, bei der
fluoreszenzmarkierte Primer die lasergestützte Detektion der so markierten PCR-Produkte
ermöglichen. Diese Methode liefert allerdings lediglich qualitative Ergebnisse mit einer
Nachweisgrenze von 1-5% [23-25].
Im Gegensatz dazu stellt die ASO-IGH-RQ-PCR eine deutlich sensitivere und quantitative
Methode zum MRD-Nachweis dar, erfordert allerdings die vorherige Sequenzierung der IGH-
CDR3-Region sowie die Entwicklung klonspezifischer CDR3-Primer, die zusammen mit
einer Fluoreszenzsonde und reversen Primern in die RQ-PCR eingesetzt werden [23]. Mit
diesem labortechnisch aufwendigen Verfahren kann eine maligne Zelle unter 10-4
bis 10-5
gesunden Leukozyten erkannt werden [26-29].
Durchflusszytometrische Methoden zur MRD-Quantifizierung beruhen auf dem Nachweis
von Zellen mit definierten Antigenexpressionsmustern [30-33]. Hierbei werden zunächst
möglichst kleine Leukozytensubpopulationen identifiziert, die sowohl maligne als auch
benigne Zellen einschließen. In diesen Leukozytensubpopulationen werden dann über
unterschiedliche Expression weiterer Moleküle maligne von benignen Zellen unterschieden.
Eines der ältesten Verfahren zur Unterscheidung maligner und benigner B-Lymphozyten ist
die Analyse der Leichtkettenrestriktion (LKR). Hierbei werden B-Zell-Populationen auf die
Expression von Immunglobulin-Leichtketten-Gruppen kappa ( ) und lambda ( ) untersucht.
Im Falle von klonal expandierten B-Zellen tragen diese nur eine der beiden Leichtketten,
sodass eine pathologische / -Ratio in definierten Subpopulationen nachgewiesen werden
kann. Neben solchen qualitativen Expressionsunterschieden gewinnt auch die Analyse von
unterschiedlichen Expressionsstärken definierter Antigene auf benignen und malignen Zellen
zunehmende Bedeutung [23, 30, 34, 35]. Allerdings gibt es bis heute keine reproduzierbaren
und allgemein akzeptierten Definitionen, die standardisiert die Über- oder Unterexpression
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- 4 - Einleitung
von Antigenen bei Erkrankten im Vergleich zu Gesunden beschreiben. Dieses Problem wird
umso wichtiger, je geringer die Expressionsstärkenunterschiede sind, die zur Definition des
malignen Immunphänotyps im Vergleich zu einer benignen Population herangezogen werden.
Moderne durchflusszytometrische Methoden zur Bestimmung der MRD bei dem MCL und
bei der CLL beruhen, wie auch bei allen anderen hämatologischen Neoplasien, auf der
Identifikation von Zellen mit einem Immunphänotyp, der bei Gesunden nicht vorkommt [30-
33].
Sowohl das MCL als auch die CLL exprimieren in der Regel CD5 auf ihrer Zelloberfläche.
Methoden zum durchflusszytometrischen MRD-Nachweis bei beiden Entitäten verwenden
Expressionsunterschiede weiterer Oberflächenantigene, um zwischen malignen und benignen
CD5-positiven B-Lymphozyten unterscheiden zu können. CD5+ Zellen machen bei gesunden
Probanden bis zu 43% aller B-Lymphozyten aus [36]. Sensitive Untersuchungen von MRD
erfordern daher eine sichere Abgrenzung von diesen Zellen, insbesondere da ihr Anteil nach
intensiver (Immun)-Chemotherapie auf bis zu 90% aller B-Lymphozyten ansteigen kann [37].
Die Unterexpression von CD20 trug bisher entscheidend zur Unterscheidung von CLL-Zellen
von benignen CD5+-B-Lymphozyten bei [23, 35]. Problematisch in diesem Zusammenhang
ist allerdings, dass der zunehmende Einsatz des therapeutischen monoklonalen anti-CD20
Antikörpers Rituximab zu einer langfristigen kompletten Blockade von CD20 auf der
Zelloberfläche führt, so dass dieser Marker nicht mehr zum MRD-Nachweis verwendet
werden kann. Die umfangreichen vergleichenden Protein-Expressionsanalysen von Rawstron
et al. und de Tute zeigten, dass die Kombination CD81/CD22/CD19/CD5 eine spezifische
Alternative zu den CD20-Kombinationen in der MRD-Diagnostik sein könnte [38, 39].
Deshalb wurde diese CD20 unabhängige Antikörper-Kombination (CD81/CD22/CD19/CD5)
im Vierfarben-Ansatz für die CLL weiter untersucht.
Insgesamt bietet die Vielfarben-Durchflusszytometrie gegenüber sensitiven
molekulargenetischen Verfahren wie der ASO-Primer-IGH-RQ-PCR einige praktische
Vorteile. So können durchflusszytometrische Ergebnisse aus peripheren Blutproben wie auch
aus Knochenmarkproben binnen eines Tages geliefert werden. Außerdem ist die Methode
technisch einfacher anzuwenden.
Vergleichende Untersuchungen molekularer und durchflusszytometrischer MRD-
Quantifizierungen insbesondere bei der CLL zeigen vergleichbare Ergebnisse zwischen ASO-
IGH-RQ-PCR und 4-Farben-Durchflusszytometrie bis zu einer Sensitivität von 1x10-4
[23,
35].
Die MRD-Diagnostik ist heute ein wichtiger Bestandteil zur Effizienzbeurteilung von
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- 5 - Einleitung
verschiedenen Therapien in klinischen Studien [40-42].
Für die CLL zeigte Rawstron et al. erstmals die Bedeutung der 4-Farben-
Durchflusszytometrie als sensitive Methode zur MRD-Quantifizierung [35]. Für diese Entität
wird das Niveau der MRD bereits zur Anpassung der immunsuppressiven Therapie nach
allogener HSZT der CLL verwendet [42]. Jüngst wurde für die CLL das Erreichen eines sehr
niedrigen MRD-Niveaus mit einer Verbesserung des progressionsfreien Überlebens (PFÜ)
und des Gesamtüberleben (OS) aufgezeigt [43-46].
Auch beim MCL erwiesen verschiedene Untersuchungen die Bedeutung der MRD als guten
Indikator für das PFÜ nach verschiedenen Therapiestrategien [40, 41, 47]. Methode der ersten
Wahl bei der Bestimmung der MRD ist derzeit die ASO-IGH-RQ-PCR.
Durchflusszytometrische Quantifizierungen von Mantelzell-Lymphomzellen zum
Diagnosezeitpunkt und im therapeutischen Verlauf wurden bis heute wenig durchgeführt [48,
49].
Eine weitere potentielle Anwendung von sensitiven Nachweismethoden einer minimalen
Tumorinfiltration ist die initiale Ausbreitungsdiagnostik zum Nachweis einer minimalen
disseminierten Erkrankung (minimal disseminated disease, MDD) bei Diagnose eines
Lymphoms. So erlaubt die molekulargenetische bzw. durchflusszytometrische Analyse
diagnostischer Knochenmark- oder Blutproben möglicherweise eine genauere
Ausbreitungsdiagnostik, die gegebenenfalls zu einer therapierelevanten Änderung des
Stadiums der Erkrankung führt. Auch hier fehlen bisher standardisierte Analysen an größeren
Patientenkollektiven [48].
Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es, standardisierte und reproduzierbare Methoden zum
sensitiven und spezifischen durchflusszytometrischen Nachweis von Tumorzellen beim MCL
und der CLL zu entwickeln. Diese Methoden sollten auch für Patienten unter Rituximab-
Therapie anwendbar sein. Grundlage der Entwicklung waren die bei Projektbeginn im Jahre
2004 bekannten immunphänotypischen Aberrationen der beiden Entitäten. Diese wurden
systematisch im Vergleich zu gesunden Probanden analysiert. Zur Verbesserung der
Auswertung der Messungen wurde eine Methode zur reproduzierbaren Detektion von
Expressionstärkeunterschieden entwickelt und sowohl für MCL als auch für CLL-Proben
angewandt. Diese Methode sollte außerdem durch Bezug auf einen internen Referenzstandard
eine Unabhängigkeit vom eingesetzten Gerät sowie von dessen Einstellungen gewährleisten.
Die Spezifität der Analysen sollte durch vergleichende Analysen von Proben gesunder
Probanden überprüft werden, die Sensitivität durch einen Vergleich mit
molekularbiologischen MRD-Techniken.
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- 6 - Patienten, Material und Methodik
2. Patienten, Material und Methodik
2.1 Patientenproben und Proben gesunder Spender
2.1.1 MCL-Patientenkollektive
Zunächst wurden zur standardisierten Definition des aberranten MCL-Immunphänotyps 24
prätherapeutische Blutproben untersucht (Tab. 1.1, Kollektiv 1) und detaillierte Kennzahlen
der Expressionsniveaus verschiedener Antigene bestimmt. Das Antigen CD81 wurde dabei
nur bei 11 dieser 24 Proben untersucht, weil eine Zwischenanalyse die mangelnde Eignung
dieses Antigens zur spezifischen Detektion von MCL-Zellen zeigte (siehe 3.2.1).
Die aus der Untersuchung von Kollektiv 1 hervorgegangenen Kennzahlen wurden an 75
Proben von 50 MCL-Patienten validiert (Tab. 1.1, Kollektiv 2).
Alle Proben stammen von Patienten, die im Rahmen der Studienprotokolle des europäischen
Mantelzell-Lymphom-Netzwerks in unserem Labor untersucht wurden. Zudem wurden
folgende Voraussetzungen festgelegt.
1. Die MCL-Infiltration des untersuchten Materials musste durchflusszytometrisch durch
monoklonale LKR-Nachweis gesichert sein.
2. Die maligne Population musste CD5 positiv sein.
3. Eine (11;14) Translokation musste mittels FISH oder PCR bewiesen sein.
Tab. 1.1: Charakteristika der MCL-Kohorte zur Definition des aberranten Immunphänotyps
Kollektiv 1 Kollektiv 2
Patientenzahl 24 50
Probenzahl 24 75
Geschlecht (m:w) 21:3 40:10
Medianes Alter (Spanne) 60 (39-75) 60 (39-80)
Blutproben: Knochenmarkaspirat 24:0 50:25
Prätherapeutisch : Induktionstherapie : Rezidiv : unklar 24:0:0:0 65:7:2:1
Nach Etablierung eines standardisierten FACS-Protokolls wurde damit im Weiteren
Materialien von insgesamt 98 Patienten mit fortgeschrittenen Mantelzell-Lymphomen im
Stadium II-IV, die im Rahmen der Studienprotokolle des europäischen Mantelzell-Lymphom-
Netzwerks (European MCL Network, [6, 50]) behandelt wurden, untersucht (siehe Tabelle
1.2). Die Therapieprotokolle sahen für therapienaive Patienten unter 65 Jahren („MCL-Studie
für Jüngere“) randomisiert entweder eine Behandlung mit sechs Zyklen R-CHOP oder mit
jeweils drei alternierenden Zyklen R-CHOP und R-DHAP vor, jeweils gefolgt von
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- 7 - Patienten, Material und Methodik
myeloablativer radiochemotherapeutischer Konditionierung und anschließender autologer
HSZT. Patienten ab 65 Jahren („MCL-Studie für Ältere“) erhielten entweder 8 Zyklen R-
CHOP oder 6 Zyklen R-FC, gefolgt von einer Erhaltungstherapie mit Interferon alpha oder
Rituximab. Die Untersuchungszeitpunkte und Details zu den verschiedenen
Studienprotokollen sind der Internetseite http://www.lymphome.de/ zu entnehmen.
Insgesamt wurden innerhalb dieser Studie 281 Proben (198 Blutproben, 83
Knochenmarkaspirate) von 98 Patienten evaluiert. Von denen wurden bei Erstdiagnose (110
Proben von 84 Patienten) und im Therapieverlauf (171 Proben von 67 Patienten) untersucht.
Von 53 Patienten lagen Proben von der Erstdiagnose und Verlaufsmaterialien vor, von 31
Patienten lagen nur Erstdiagnoseproben vor und von 14 Patienten nur Verlaufsmaterialien
ohne Erstdiagnosematerial.
Tab. 1.2: Charakteristika des gesamten MCL-Patientenkollektivs
Anzahl
Patientenzahl 98
Geschlecht (m:w) 22:76
Medianes Alter (Spanne) 62 (38-83)
Klinisches Stadium
Stadium II
Stadium III
Stadium IV
4 (4,1%)
15 (15,3%)
79 (80,6%)
Histologisch gesicherte KM-Infiltration 73 (74,5%)
Magen-Darm-Befall 27 (27,6%)
Erhöhte LDH 30 (30,6%)
t(11;14) Nachweis durch FISH und/oder PCR 71 (72,4%)
Therapieprotokoll
MCL-Studie für Jüngere
MCL-Studie für Ältere
55 (56,1%)
43 (43,9%)
Analysierte Pat. und Untersuchungszeitpunkte
Nur Erstdiagnose (KM/PB-Proben)
MRD-Verlaufsmaterialien (KM/PB-Proben)
84 (30/80)
67 (53/118)
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- 8 - Patienten, Material und Methodik
2.1.2 CLL-Patientenkollektive
Zur standardisierten Definition des aberranten Immunphänotyps der CLL wurden Blutproben
von insgesamt 30 Patienten der CLL8-Studie untersucht (Tab. 2, Kollektiv 1). Bei der CLL8-
Studie handelte es sich um eine Phase-III-Studie der Deutschen CLL Studiengruppe
(DCLLSG), in der bei bisher unbehandelten Patienten eine kombinierte Immunchemotherapie
(R-FC) gegen eine alleinige Chemotherapie (FC) verglichen wurde. Die Diagnose der CLL
musste nach den Kriterien des National Cancer Institute (NCI)-Arbeitsgruppe gesichert sein
[9]. Die Einschlusskriterien für die Studie und die klinischen Ergebnisse sind zwischenzeitlich
publiziert worden [16].
Weiterhin wurden von 11 Patienten der CLL8-Sudie, bei denen der Immunphänotyp aus der
Analyse des primärdiagnostischen Materials bekannt war, insgesamt 67 Verlaufsmaterialien
(Tab. 2, Kollektiv 2) unter FC-Therapie durchflusszytometrisch und mittels ASO-IGH-RQ-
PCR auf minimale Resterkrankung untersucht (durchschnittlich 6 Probeneingänge pro
Patient).
Tab. 2: Charakteristika der untersuchten CLL-Patientenkollektive
Kollektiv 1 Kollektiv 2
Patientenzahl 30 11
Probenzahl 30 67
Geschlecht (m:w:unbekannt) 17:8:5 9:2:0
Medianes Alter (Spanne) 64 (35-77) 62 (52-84)
Blutproben: Knochenmarkaspirat 30:0 61:6
Primärdiagnostische Probe : Verlaufsmaterial 30:0 0:67
2.1.3 Proben gesunder Spender
Zusätzlich wurden 25 Blutproben gesunder Spender als Referenzkollektiv (m/w, 13/12, mit
einem medianen Alter von 30 Jahren und einer Altersspanne von 21- 56 Jahren) und weitere 8
Knochenmarkproben, die im Rahmen der Routinediagnostik des Labors für Hämatologische
Spezialdiagnostik der II. Medizinischen Klinik untersucht wurden, und bei denen kein Befall
durch ein peripheres Non-Hodgkin-Lymphom der B-Zell-Reihe festgestellt werden konnte (5
weibliche und 3 männliche Patienten, medianes Alter 62, Alter zwischen 30- 70 Jahren),
analysiert.
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- 9 - Patienten, Material und Methodik
Der Antikörper CD20 FITC wurde vergleichend an 20 Proben gesunder Spender reevaluiert,
die im Rahmen eines Vorläuferprojektes zur MRD bei der CLL untersucht worden waren
[23].
2.2 Durchflusszytometrische Analysen
2.2.1 Färbeprotokoll
Das Blut oder Knochenmarkaspirat wurde in ein 50 ml Röhrchen (Sarstedt) überführt, auf
50ml mit einer PBS-Lösung (Sigma Aldrich, Schnelldorf, Deutschland), der 0,1%
Natriumazid und 2%-iges fetales Kalbsserum zugesetzt waren, aufgefüllt und mindestens fünf
Minuten vorsichtig geschwenkt. Diese Röhrchen wurden anschließend mit 500g (1600
Umdrehungen pro Minute) zehn Minuten lang zentrifugiert. Dadurch setzten sich die
Leukozyten oberhalb der Erythrozyten ab, sodass der nichtkorpuskuläre Überstand der Probe
abgesaugt werden konnte. Diese Prozedur wurde ein zweites Mal wiederholt. Am Ende des
Waschvorganges wurde die Leukozytenzahl mittels eines Sysmex® Hamätologie-
Messgerätes (Sysmex GmbH, Norderstedt, Deutschland) ermittelt. Die
Leukozytenkonzentration in der Färbesuspension wurde auf 10000/µl eingestellt. Dies
entspricht bei einem eingesetzten Volumen von 100 µl einer Million Leukozyten in der zu
untersuchenden Probe. Waren die Proben zu zellreich an Leukozyten, musste die
Zielkonzentration per Verdünnung mit der oben beschriebenen PBS-Lösung erreicht werden.
Von dieser Zellsuspension wurden 100µl mit 25µl hitzeinaktiviertem Kaninchenserum
(Sigma) 30 Minuten inkubiert, um die unspezifischen Fc-Membranrezeptoren zu blockieren.
Zu diesen Zellproben wurden anschließend die verschiedenen Antikörper gegeben, vermischt
und für weitere 15 Minuten in Dunkelheit inkubiert.
Nach der Inkubation mit den Antikörpern wurden die Erythrozyten mit 2 ml FACS Lysing
Solution (BD) für 10 Minuten in Dunkelheit lysiert. Die Röhrchen wurden anschließend mit
500g 5 Minuten lang zentrifugiert, dekantiert und mit 4 ml PBS-Lösung (mit BSA)
gewaschen. Nach weiteren 5 Minuten zentrifugieren wurden die Proben-Röhrchen erneut
dekantiert und die Zellen mit 400µl PBS-Lösung im einfachen Ansatz resuspendiert.
2.2.2 Titration der Antikörper und Auswahl geeigneter Antikörper-Fluorochrom-
Kombinationen
Die gewählten Antikörper wurden zunächst auf ihre Eignung, das entsprechende Antigen
spezifisch zu detektieren, hin untersucht. Dazu wurden die Signal-Rausch-Verhältnisse (SRV)
Page 16
- 10 - Patienten, Material und Methodik
der Antikörper mit unterschiedlichen Konjugaten auf benignen Lymphozyten und mit
unterschiedlichen Antikörpermengen untersucht.
Blut gesunder Spender wurde nach der unter 2.2.1 beschriebenen Methode mit dem gewählten
Antikörper gefärbt (jeweils in der vom Hersteller für 1 Millionen Zellen angegebenen Menge
sowie zwei Verdünnungsstufen unterhalb der empfohlenen Menge und einer Stufe darüber).
Von diesen vier Proben wurden jeweils 10.000 Leukozyten gemessen. Zur Errechnung der
SRV wurden die gemessenen geometrischen Mittelwerte der für den Antikörper positiven
Lymphozyten durch die geometrischen Mittelwerte der für den Antikörper negativen
Lymphozyten geteilt.
Standen verschiedene Antigen-Fluorochrom-Kombinationen zur Verfügung, so wurde
diejenige Kombination benutzt, die insgesamt das höchste SRV ergab.
Die untersuchten Antikörper sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.
Tab. 3: Titrierte Antikörper, Flurochrome, klonale Abstammung und deren Hersteller
Antigen Fluorochrom Klon Hersteller
Isotypkontrolle FITC X40 BD
Isotypkontrolle PE MOPC-21 PharMingen(BD)
Isotypkontrolle PerCP-Cy5.5 X40 BD
Isotypkontrolle APC X40 BD
kappa/lambda FITC/PE TB 28-2/1-155-2 Simultest® BD
CD3 APC SK7 BD
CD4 PerCP-Cy5.5 SK3 BD
CD5
PE UCHT2 PharMingen(BD)
PerCP-Cy5.5 L17F12 BD
APC UCHT2 PharMingen(BD)
CD8 FITC SK1 BD
CD19 PerCP-Cy5.5 SJ25C1 BD
APC SJ25C1 BD
CD20 FITC L27 BD
PE L27 BD
CD22 PE RFB4 Caltag CD23 FITC MHM6 Dako
CD43 PE L10 Caltag
APC L10 Caltag
CD45 FITC 2D1 BD
CD56 PE B159 PharMingen(BD)
CD79b FITC SN8 Caltag
CD81 FITC JS-81 PharMingen(BD)
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland (BD), Dako, Hamburg, Deutschland (Dako), Caltag, Hamburg,
Deutschland (Caltag), Firma PharMingen von der Firma BD übernommen.
Page 17
- 11 - Patienten, Material und Methodik
2.2.3 Finale Färbeansätze MCL und CLL
Die abschließend gewählten Färbeansätze sind in den folgenden Tabellen 4 (MCL), 5 (CLL)
und 6 für gesunde Probanden aufgelistet. Details zu den verwendeten Antikörpern finden sich
in Tabelle 3. Alle Antikörper wurden in titrierten Konzentrationen eingesetzt.
Tab. 4: Färbeansatz für Proben von MCL-Patienten
Röhrchen FITC (µl) PE (µl) PerCP-Cy5.5 (µl) APC (µl)
1 IgG1(10) IgG1(5) IgG1(2) IgG1(5)
2 CD8(20) - - -
3 - CD5(5) - -
4 - - CD19(10) -
5 - - - CD3(1)
6 CD8(20) CD56(5) CD4(10) CD3(1)
7 Simultest kappa/lambda(10) CD5(15) CD19(2)
8 CD79b(2) CD22(5) CD5(15) CD19(2)
9 CD23(5) CD22(5) CD5(15) CD19(2)
Tab. 5: Färbeansatz für CLL-Proben
Röhrchen FITC (µl) PE (µl) PerCP-Cy5.5 (µl) APC (µl)
1 IgG1(10) IgG1(5) IgG1(2) IgG1(5)
2 CD8(20) - - -
3 - CD5(5) - -
4 - - CD4(10) -
5 - - - CD3(1)
6 CD8(20) CD56(5) CD4(10) CD3(1)
7 Simultest kappa/lambda(10) CD19(10) CD5(10)
8 CD20(20) CD5(10) CD19(20) CD43(10)
9 CD81(10) CD22(10) CD19(20) CD5(20)
10 CD79b(4) CD20(10) CD19(20) CD5(20)
Bei Verlaufsmaterialien wurden in den Probenröhrchen 8-10 die doppelte Zellzahl, d. h. 2 Mio. Leukozyten,
gemessen und mit entsprechend verdoppelter Antikörpermenge gefärbt (grau = Röhrchen zur MRD-Messung).
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- 12 - Patienten, Material und Methodik
Tab. 6: Färbeansatz für gesunde Probanden
Röhrchen FITC (µl) PE (µl) PerCP-Cy5.5 (µl) APC (µl)
1 IgG1(10) IgG1(5) IgG1(2) IgG1(5)
2 CD45(5) - - -
3 - CD5(5) - -
4 - - CD4(10) -
5 - - - CD3(1)
6 CD23(5) CD22(5) CD5(15) CD19(2)
7 CD79b(2) CD22(5) CD5(15) CD19(2)
8 CD79b(4) CD43(10) CD19(20) CD5(20)
9 CD81(10) CD22(10) CD19(20) CD5(20)
10 CD79b(4) CD20(10) CD19(20) CD5(20)
In den Probenröhrchen 8-10 wurde ebenfalls die doppelte Zellzahl gemessen, d. h. 2 Mio. Leukozyten, mit
entsprechend verdoppelter Antikörpermenge gefärbt (grau = Röhrchen zur MRD-Messung).
Um die Sensitivität der MRD-Untersuchung bei CLL-Verlaufsproben zu erhöhen, wurde hier
die Zellzahl im Ansatz verdoppelt (MRD-Ansatz), so dass 200µl der gewaschenen
Zellsuspension mit 50 µl Kaninchenserum und der doppelten Menge Antikörper vermischt
wurden. Dementsprechend waren 4 ml FACS Lysing Solution zur Lyse der Erythrozyten
notwendig. Der MRD-Ansatz wurde mit 500µl PBS-Lösung resuspendiert.
2.2.4 Durchflusszytometrische Messung
Die gefärbten Proben wurden mit einem FACSCalibur (BD) und der CellQuest Pro v4.0.1
Software gemessen. Neben der täglichen Kalibrierung mit Calibrite Beads (BD) und der
FACSComp v4.2 Software wurden anhand von Isotypkontrollen (Zellprobe inkubiert mit vier
isotypidenten irrelevanten monoklonalen Antikörper FITC, PE, PerCP-Cy5.5, APC
konjugiert, alle BD) bei jeder Probe die Vorwärtsstreulicht- (FSC) und
Seitwärtsstreulichtparameter (SSC) angepasst und eingestellt, die Messgrenze (Threshold) auf
den 52. Kanal gesetzt und die Spannung der Sekundärelektronenvervielfacher anhand der
Lymphozyten optimiert. Diese Spannung wurde so gewählt, dass die Lymphozyten der
individuellen Probe innerhalb der ersten Dekade für alle 4 Fluoreszenzkanäle dargestellt
wurden. Die Kompensation wurde mit Hilfe der Kompensationskontrollen (jede war nur für
einen einzelnen FITC, PE, PerCP-Cy5.5 oder APC positiven Antikörper gefärbt) vor jeder
Messung und für jede Probe einzeln eingestellt. Zielkriterium war hier, dass der Median der
Fluoreszenz der positiv gefärbten Lymphozyten in allen Kanälen, die nicht seinem
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- 13 - Patienten, Material und Methodik
Hauptmesskanal entsprechen, dem Median der nichtgefärbten Lymphozytensubpopulation
(d.h. der Isotypkontrolle) entspricht. Von der Isotypkontrolle, den Kompensationsröhrchen,
der T-Lymphozyten-Differenzierung im Röhrchen 6 und der Leichtkettenbestimmung auf B-
Lymphozyten im Röhrchen 7 wurden jeweils 10.000 Ereignisse gemessen. Für die MRD-
Röhrchen (Röhrchen 8-10 des CLL-Panels) wurde eine verlängerte Messzeit eingestellt, um
mehr residuelle maligne Zellen zu erfassen. Es wurden entweder zwei Millionen Ereignisse
oder es wurde maximal 540 Sekunden gemessen. Die Röhrchen wurden mit der mittleren
Durchflussgeschwindigkeit des FACSCalibur-Gerätes gemessen.
Da die durchflusszytometrische MRD-Messung nur für die CLL etabliert war, wurde der
doppelte Ansatz nur bei den Messungen der CLL-Verlaufsmaterialien angewandt.
2.2.5 Auswertungsstrategie
2.2.5.1 Identifikation CD5+CD19
+doppelt positiver Lymphozyten
Ein wichtiges Ziel der vorgelegten Arbeit war es, eine standardisierte Methode zu entwickeln,
deren Ergebnisse möglichst unabhängig von der individuellen Erfahrung des Auswertenden
sind. Dafür wurden folgende Auswertevorlagen mit der CellQuestPro v.4.0.1 Software kreiert
(Abb.1). Grundlage waren Gatingstrategien, die bereits in Arbeiten von Rawstron et al. und
Böttcher et al. verwendet wurden [23, 30, 35].
Zunächst wurden drei Punktwolken-Diagramme (Dot-Plots) erstellt, die sich alle
nacheinander bedingen. Mittels Streulicht wird bei Leukozyten im Engwinkel zum Laserstrahl
(FSC) die Zellgröße und im rechten Winkel dazu (SSC) die Zellgranularität bestimmt. Im
ersten Streulichtdiagramm (FSC/SSC-Dot-Plot) umrahmt man die Leukozyten, um den Debris
auszuschließen (Leukozytengate), der sich unten links darstellt (a) in Abb. 1).
In einem CD19/SSC-Dot-Plot wurden die B-Lymphozyten anhand ihrer Granularität und dem
B-Zell-spezifischen Marker CD19 weiter eingegrenzt (Lymphozyten-Hilfsgate, b) in Abb.1).
Diese CD19-positiven Lymphozyten werden nochmals in einem FSC/SSC-Plot dargestellt,
um die Lymphozyten von den Zelldubletten zu trennen (Lymphozytengate), die sich rechts
unten darstellen (c) in Abb. 1).
In einem Histogramm wurden anschließend alle Zellen im definitiven Lymphozytengate für
den Marker CD19 angezeigt, um den CD19 positiven Messbereich festzulegen. Dazu wurde
eine Region an den aufsteigenden Schenkel der CD19-positiven Population gesetzt. Als B-
Lymphozyten wurden im Folgenden alle Zellen bezeichnet, die Streulichteigenschaften von
Lymphozyten aufweisen (definitives Lymphozytengate) und CD19 positiv sind (CD19+Ly)
(d) in Abb. 1).
Page 20
- 14 - Patienten, Material und Methodik
Die CD5-Positivität wurde anhand der CD19 negativen Lymphozyten definiert. Dazu werden
in einem weiteren Histogramm die CD5 Expressionsstärken aller Zellen angezeigt, die nicht
CD19+Ly sind (T-Lymphozyten, Natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen), im Knochenmark ggf.
Erythroblasten). Dabei wurde die CD5+-Region an den absteigenden Schenkel der negativen
Fraktion gesetzt (NK-Zellen und Erythroblasten) und durfte außerdem maximal 0,3% der
Isotypkontrolle einschließen (CD5+Ly, e) in Abb. 1).
In Cellquest können Regionen über Boolesche Operatoren zu einem Gate verknüpft werden,
so dass CD5CD19-positive Lymphozyten definiert werden konnten (CD5+CD19
+-Ly).
Mit dieser Gatingstrategie wurden die T-Lymphozyten, Monozyten, NK-Zellen und die
benignen, nicht reaktiven B-Lymphozyten weitestgehend ausgeschlossen. Sowohl MCL- als
auch CLL-Zellen wurden im Folgenden als Subpopulationen der so definierten CD5+CD19
+-
Lymphozyten untersucht (siehe Abb. 2-4).
Abb. 1: Definition und Gatingstrategie von CD5+CD19
+-Lymphozyten für CLL- und MCL-Zellen wie
unter Punkt 2.2.5.1 beschrieben
a)
b)
c)
d)
e)
Page 21
- 15 - Patienten, Material und Methodik
2.2.5.2 Standardisierte Untersuchung der Expressionsstärken von Antigenen auf MCL- und
CLL-Zellen und auf benignen CD5+CD19
+-B-Lymphozyten
Verschiedene Antigene wurden daraufhin untersucht, ob sie innerhalb der CD5+ CD19
+-
Lymphozyten MCL- bzw. CLL-Zellen von benignen CD5+ B-Lymphozyten differenzieren
konnten.
Die CD5/CD19-Positivität diente somit als fester Anker bei der Beschreibung des typischen
Immunphänotyps von MCL und CLL. Weitere Oberflächenantigene (CD22, CD23, CD79b,
CD81) wurden bezüglich ihrer Eignung zur Diskriminierung von malignen und benignen
Zellen untersucht [38, 49, 51]. Zudem wurde die bei B-Zell-Neoplasien wichtige und
pathognomonische Leichtkettenrestriktion untersucht.
Ein wesentliches Ziel der vorgelegten Arbeit sollte die objektive und quantitative
Bestimmung von Antigenüber- und Unterexpression sein. Daher wurden alle
Kandidatenantigene auf malignen und benignen CD5+-B-Lymphozyten analysiert. Es wurden
geometrische Mittelwerte und unterschiedliche Perzentile der Fluoreszenzverteilungen auf
benignen und malignen B-Lymphozyten ermittelt und diese Werte über das geometrische
Mittel der Isotypkontroll-Messungen von Lymphozyten der gleichen Probe und des gleichen
Fluorochroms normiert.
Die Fluoreszenzintensitätsverhältnisse (Mean Fluorescens Intensity Ratio, MFIR) wurden wie
folgt festgelegt:
MFIR von Antigen X = Geometrisches Mittel von Antigen X / Geometrisches Mittel der Isotypkontrolle des
Fluorochroms von Antigen-X
Exemplarisch dargestellt für die 95. Perzentile von CD22PE:
MFIR95% CD22PE = 95.Perzentile CD22PE / Geometrisches Mittel der PE-Isotypkontrolle
Page 22
- 16 - Patienten, Material und Methodik
Abb. 2: Unterschiedliche Expressionsstärken von CD22 (gemessen mit CD22PE) und CD23 (gemessen mit
CD23FITC) auf MCL-Zellen und benignen CD5+CD19
+-Lymphozyten
CD22PE CD23FITC
CD5+CD19
+-MCL-Zellen
Benigne CD5+CD19
+-
Lymphozyten
Aus den Untersuchungen der ersten Test-Kohorten wurden für MCL- bzw. CLL-Zellen für
die o.g. Kennzahlen die arithmetischen Mittelwerte berechnet und in einem weiteren Schritt
auf die CD5+CD19
+-B-Lymphozyten gesunder Probanden angewandt, um den Anteil an
falsch positiver Zellen bestimmen zu können.
2.2.5.3 Auswertevorlagen für die objektive Auswertung von Expressionsstärke-Unterschieden
zwischen malignen und benignen B-Zellen.
Anhand der Expressionsanalysen wurden folgende standardisierte MRD-Auswertevorlagen
für MCL-Patienten (Abb. 3) und CLL-Patienten (Abb. 4) kreiert.
Die Definition der CD5+CD19
+-Zellen erfolgte wie oben beschrieben. Dann wurden die
Regionen der jeweiligen Diskriminierungsmarker (z.B CD22PE und CD79bFITC beim MCL)
standardisiert nach dem Ergebnis der folgenden Berechnung eingestellt. Diese multipliziert
die geometrischen Mittelwerte der Isotypkontrolle mit dem Mittelwert der Signal-Rausch-
Verhältnisse der 95. Perzentilen der untersuchten MCL- bzw. CLL-Zellen. Dieser errechnete
Kanal definiert die Grenze für die niedrig exprimierten Oberflächenantigene und somit
zwischen malignen und benignen B-Lymphozyten.
Dagegen wurde beim manuellen Setzen des MCL- bzw. CLL-Gates das Gate entsprechend
der individuellen Erfahrung des Auswertenden auf die maligne Population gesetzt. Die
Sensitivität zur spezifischen Erfassung von MCL- bzw. CLL-Zellen errechnete sich aus dem
Mittelwert der falsch positiven Zellen, addiert mit der doppelten Standardabweichung, in
Relation zur Gesamtzahl analysierter Leukozyten.
Page 23
- 17 - Patienten, Material und Methodik
Abb. 3: Gating-Strategie zur Erfassung der MCL-Population
a) Darstellung aller Leukozyten im SCC, grobe Festlegung der B-Lymphozyten mittels R1
b) B-Lymphozyten werden von dem Zellschrott (links) und den Zelldubletten (rechts) mittels R2 herausgegated
c) Zeigt zwei unterschiedliche B-Zell-Populationen, CD19+CD5niedrig/+ (R4) und CD19niedrig/+CD5+ (R3),
die separiert gegated werden
d) Darstellung und Errechnung der mittleren Fluoreszenzstärken von FITC und PE (MFIIsotyp-FITC = 5,2;
MFIIsotyp-PE = 4,9)
e) Quadrantenmarker der Leichtkettenrestriktion wird an den in Graphik c linken, unteren Quadranten gesetzt
(CD19-CD5- Population in c) um mehr als 99% aller T-Zellen einzubeziehen, dargestellt ist ein monoklonaler,
lambda exprimierender MCL-Klon (kappa/lambda = 32/445 = 0,07)
f) Polyklonale CD19+CD5+ B-Lymphozyten (kappa/lambda = 648/448 = 1,4)
g) CD22 und CD23 Expression auf der MCL-Population
h) CD22 und CD23 Expression auf der CD19+CD5+-Population
i-m) Standardisierte Gatingstrategie zur Erfassung des MCL-Immunphänotyps: M1 und M2 errechnen sich aus
den MFI der Isotypkontrollen von FITC und PE x dem Median der MFIR, der 95. Perzentilen von CD22PE
(154,1) und CD23FITC (4,5) bei MCL;
M1: FIR95CD23-FITC = 4,5 x MFIIsotyp-FITC = 4,5 x 5,2 = 23,4
M2: FIR95CD22-PE = 154,1 x MFIIsotyp-PE = 154,1 x 4,9 = 755,1
Eingeschlossener Anteil der Population in %: i) 99% k) 65% l) 98% m) 22%
M1 und M2 verknüpft entsprachen 21% aller R4/R2 Ereignisse und 98% aller in R3/R2 gegateten Ereignisse
Das MCL-Niveau in dieser Probe lag bei 1,0 x 10-3 (R3 Ereignisse / alle Leukozyten)
Die Konsensus-IGH-FR1-PCR zeigte ein monoklonales Signal vor einem polyklonalen Hintergrund
Page 24
- 18 - Patienten, Material und Methodik
Abb. 4: Exemplarische MRD-Auswertung im Falle einer CLL anhand der CD5+CD19
+-Lymphozyten
nach individueller und starr definierter Auswertestrategie
Dot-Plot der nach 2.5.1 definierten
Lymphozyten
Schwarz markiert und umrandet
CD5+CD19
+-Lymphozyten
CLL-Zellen und benigne B-
Lymphozyten sind nicht zu
unterscheiden!
Dot-Plot der CD5+CD19
+-
Lymphozyten
Zwei unterschiedliche Populationen
erkennbar
CLL-Population CD22niedrig
CD81niedrig
manuell umrandet
Hellgrau im CLL-Klon markiert die
CLL nach starrer CD2295%
CD8195%
-
Festlegung
Dot-Plot der CD5+CD19
+-
Lymphozyten
Zwei unterschiedliche Populationen
erkennbar
CLL-Population
CD20niedrig
CD79bniedrig
manuell
umrandet
Hellgrau im CLL-Klon markiert die
CLL nach starrer CD2095%
CD79b95%
-
Festlegung
2.2.5.4 Analyse der Leichtkettenrestriktion
Die LKR der B-Zellen wurde gegen die Isotypkontrolle als negative Referenz bestimmt.
Dafür wurde der Quadrantenmarker zunächst an den linken unteren Quadranten der
Isotypkontrolle gesetzt (Abb. 5a). Dieser gesetzte Quadrant wurde in identischer Position in
einem CD5+CD19
+-Lymphozyten Dot-Plot dargestellt. Dabei wird das Verhältnis zwischen
kappa und lambda exprimierenden B-Zellen errechnet. Als monoklonal wurde ein Verhältnis
definiert, welches eine 4-fache Abweichung vom normalen Verhältnis (1,5) aufweist (0,37-6).
Abb. 5b zeigt ein normales Verhältnis des Leichtkettenrestriktion auf B-Lymphozyten, Abb.
5c zeigt einen B-Zell-Klon, der die Leichtkette lambda exprimiert.
Page 25
- 19 - Patienten, Material und Methodik
Abb. 5: Leichtkettenrestriktionsanalyse auf B-Zellen
a)
b)
c)
2.3 Molekulare Analysen
2.3.1 Qualitativer Klonalitätsnachweis mittels Konsensus-IGH-FR1-PCR und GeneScan-
Analyse
Für die qualitative molekulare MRD-Analyse wurde genomische DNA der Blut- bzw.
Knochenmarkproben von den MCL- oder CLL-Patienten mittels Konsensus-IGH-FR1-PCR
und anschließender GeneScan-Analyse auf B-Zell-Monoklonalität hin untersucht. Die
Fragmentlängenanalyse der PCR-Produkte erfolgte über ein automatisches Sequenziergerät.
DNA wurde nach der Standardarbeitsanleitung (GITC DNA-Extraktion) durch die Mitarbeiter
des Labors für Hämatologische Spezialdiagnostik der II. Medizinischen Klinik des UK-SH,
Campus Kiel, extrahiert.
Von dieser DNA wurden 500ng mit einem IGH-FR1-Primer-Mix aller sieben VH-Regionen
und einem JH-Konsensus Primer zu 300 bis 400 Basenpaare langen Fragmenten nach
publizierten Methoden amplifiziert [23, 26, 27] (Tab. 7). Dabei ist der JH-Primer mit dem
FAM-Fluoreszenzfarbstoff markiert, der es dem automatischen Kapillarsequenzierer erlaubt,
die Länge eines PCR-Produktes basengenau zu bestimmen [24]. Die PCR-
Reaktionsbestandteile und die Cyclerkonditionen sind in der Tabelle 8 und 9
zusammengefasst.
Monoklonale PCR-Produkte zeichnen sich durch ein deutliches Fluoreszenzsignal identischer
Länge aus (monoklonales Signal, s. Abb. 6A). Polyklonale PCR-Produkte weisen eine
Gauß'sche-Größenverteilung auf (s. Abb. 6A).
Je nach vorhandenem B-Zell-Hintergrund und Lage des klonalen PCR-Produkts in Relation
zu den polyklonalen Amplicons erlaubt diese Methode den Nachweis klonaler
Lymphomzellen mit eine Nachweisgrenze von unter 0,1%-5% (Abb. 6B).
Page 26
- 20 - Patienten, Material und Methodik
Abb. 6: Auswertung der GeneScan-Analyse der Konsensus-IGH-FR1-PCR. (A) zeigt links ein
monoklonales Signal, PCR-Produkte einer Länge und rechts eine polyklonale, Gauß'sche Verteilung. (B)
Verdünnungsreihe klonaler DNA in polyklonaler DNA.
A)
B)
a) b) c)
1:10 1:100 1:1000
Tab. 7: Primersequenzen für die IGH-FR1-PCR
Primer Sequenz
FR1-VH1-2 5´- GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G -3'
FR1-VH2nw 5´- GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C -3'
FR1-VH3-7 5´- CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G -3'
FR1-VH4-4 5´- CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G -3'
FR1-VH5-51 5´- CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T -3'
FR1-VH6 5´- TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G -3'
JH Konsensus 5´- (FAM)-CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C -3
Page 27
- 21 - Patienten, Material und Methodik
Tab. 8: Konsensus-IGH-FR1-PCR
Reaktionsbestandteile Ausgangskonzentration µl / Ansatz
DNA 100 ng/µl 5
dNTP`S 25 mM 0,4
Puffer 10x 5
MgCl 25 mM 3
IGH-FR1-Mix Je 10 pmol/µl 1
IGH-JH Konsensus-Primer 10 pmol/µl 1
Rinder-Albumin BSA 20 mg/ml 1
AmpliTaq Gold 5U/µl 0,2
Aqua auf 50
Tab. 9: Cyclerkonditionen einer Konsensus-IGH-FR1-PCR
Temperatur Zeit in Minuten PCR-Phasen
94°C 10 Denaturierung zu Beginn
94°C 1 Denaturierung
60°C 1 Annealing
72°C 0,5 Elongation
72°C 30 Abschluss-Elongation
2.3.2 Sequenzierung klonaler IGH-FR1-PCR-Produkte
Bei Nachweis klonaler Konsensus-IGH-FR1-Amplifikate erfolgte eine direkte
Sequenzanalyse der PCR-Produkte. Die Sequenzierung basiert auf der Kettenabbruchreaktion
nach Sanger et al. [52]. Dabei wurden zu der PCR-Reaktion vier fluoreszenzmarkierte
Didesoxynukleotide (ddNTPs) hinzugegeben. Im Vergleich zu den üblichen
Desoxynukleotiden (dNTPs) unterscheiden sich die ddNTPs durch das Fehlen der 3’-OH-
Gruppe. Dadurch ist keine Verbindung zum nächsten Nukleotid möglich und es kommt zu
einem Kettenabbruch.
Nach einer Aufreinigung der Sequenzierreaktion konnten die nun fluoreszenzmarkierten
DNA-Fragmente mit Hilfe eines automatischen Sequenzierers in einer Kapillare
elektrophoretisch aufgetrennt und durch Laserdetektion qualitativ analysiert werden. Die
Analyse erfolgte auf einem ABI 3100-Avant nach Anweisung des Herstellers.
35x
Page 28
- 22 - Patienten, Material und Methodik
Generell wurden für die Sequenzieransätze die gleichen Primer benutzt wie für die Konsensus
IGH-FR1-PCR-Ansätze.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit den veröffentlichten VH, DH und JH- Genomsequenzen
(DNAPLOT-Software und IMGT Datenbank; www.imgt.cines.fr initiator and coordinator;
Marie-Paul Lefranc, Montpellier, France) verglichen, um die Lage der patientenspezifischen
Sequenzen der junktionalen Region in Bezug auf die bekannten VH-DH- und JH-Genregionen
der hinterlegten Keimbahnsequenzen sowie die Mutationsfrequenz gegenüber der
Keimbahnsequenz festlegen zu können.
2.3.3 ASO-IGH-RQ-PCR
Zur sensitiven MRD-Verlaufsanalyse der untersuchten CLL-Fälle wurden klonspezifische
real-time quantitative (RQ) – PCR Assays nach publizierten Methoden [23, 26, 29] etabliert.
Hierzu wurden zunächst allelspezifische Oligonukleotide (ASO) entworfen, die
komplementär zur klonspezifischen Sequenz der hypervariablen CDR3-Region der klonalen
IGH-Genumlagerungen waren. Diese wurden zusammen mit Konsensus-TaqMan-Sonden und
Konsensus-Primern in eine RQ-PCR eingesetzt.
Während der Amplifkation kommt es durch die Taq-Polymerase zu einem Abbau der
TaqMan®-Sonde, die über die räumliche Trennung des Reporterfarbstoffs vom
Quencherfarbstoff zu einer Zunahme der Intensität der Reporterfluoreszenz führt, die
wiederum proportional zur Menge der generierten PCR-Produkte ist. Die
Reporterfluoreszenzintensität wird gegen die Anzahl der Zyklen gemessen. Ein
Schwellenwert (CT, threshold cycle) gibt denjenigen PCR-Zyklus an, zu dem die
Fluoreszenzintensität vom Hintergrundsignal unterschieden werden kann. Eine
Quantifizierung der Kopienzahl einer Zielgensequenz in einer Verlaufsprobe erfolgt durch
den Vergleich des CT der Probe mit den CT –Werten einer Standardkurve, die durch eine
Verdünnungsreihe der DNA des primärdiagnostischen Materials mit bekannter Zielgen-
Kopienzahl hergestellt wird. Diese Verdünnungsreihe wird durch serielle Verdünnungen des
primärdiagnostischen Materials in polyklonaler DNA (gepoolte Buffy Coats von 10 gesunden
Spendern) in den Stufen 10-1
, 10-2
, 10-3
, 5x10-4
, 10-4
, 5x10-5
, 10-5
, 10-6
hergestellt.
Durch die gleichzeitige Amplifizierung der Verdünnungsreihe und der Verlaufsproben kann
somit die Kopienzahl der Ziel-Sequenz gemessen werden. Die Verdünnungsreihe ermöglicht
zudem die Bestimmung der Sensitivität des Assays, die durch die höchste Verdünnungsstufe
definiert wird, bei welcher noch ein spezifisches Fluoreszenzsignal generiert wird.
Um die Unterschiede der Amplifizierbarkeit der verschieden Proben eines Patienten
Page 29
- 23 - Patienten, Material und Methodik
auszugleichen, wird die Kopienzahl des Housekeeping-Gens Albumin als interne Referenz
ermittelt. Hierfür wird in einer Albumin-RQ-PCR seriell verdünnte polyklonale DNA gegen
die zu untersuchenden Patienten-DNA's amplifiziert. Der Quotient aus Albuminkopienzahl
der Verlaufsprobe zur Albuminkopienzahl des Ausgangsmaterials definiert somit die
Amplifizierbarkeit der Patientenprobe.
Tab. 10: Reaktionsansatz einer RQ-PCR
Reaktionsbestandteile Ausgangskonzentration Menge / Ansatz
DNA 100 ng/µl 6 µl
Universal Master mix (2x)
ASO-Primer 20 pmol/µl 300 nM
IGH-JH Konsensus-Primer 20 pmol/µl 300 nM
TaqMan-Sonde 20 pmol/µl 100 nM
Rinder-Albumin (BSA 5%) 20mg/ml 2 µl
Aqua Auf 25 µl
Tab. 11: Cyclerkonditionen einer RQ-PCR
Temperatur Zeit in Minuten PCR-Phasen
95°C 10 Denaturierung zu Beginn
95°C 0,25
35x
Denaturierung
60°C 1 Annealing
72°C 0,5 Elongation
72°C 30 Abschluss-Elongation
Tab. 12: Übersicht der verwendeten Geräte
Bezeichnung Hersteller Modell
Thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
Gelelektrophoresekammer Peqlab Biotechnology 40-2314
Spannungsgeber BioRad PoerPac 300
UV-Transilluminator Spectroline TC-312-A
Kamera,
Film
Polaroid Polaroid MP Land Camera,
Polaroid 677
PCR-Aufreinigungsplatte Millipore MANU03010
Unterdruck-Rahmen Millipore Multi-Screen 384
Tisch-Kleinzentrifuge Eppendorf 54150
Doppel-Plattenzentrifuge Heraeus Labofuge 400
Page 30
- 24 - Patienten, Material und Methodik
Sepharose-System Millipore Multiscreen MAHVN4510
Automatischer Sequenzierer Applied Biosystems ABI-377 oder ABI-3100 Avant
Laborwaage Sartorius PT-1200
Rotations-Mischer Scientific Industries Vortex Gene 2 G560E
real-time-PCR Applied Biosystems ABI PRISM 7700
Tab. 13: Übersicht der eingesetzten Chemikalien
Bezeichnung Hersteller Anwendung
DNTP Mix Carl Roth PCR
GeneAmp 10xPCR Puffer Applied Biosystems PCR
MgCl PCR
AmpliTaq Gold DANN
Polymerase
AppliedBiosystems PCR
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich PCR
Oligonukleotide (Primer, Sonden) TIB Molbiol PCR, Sequenzierung, RQ-PCR
5xPuffer Sequenzierung
BigDye1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems Sequenzierung
Sephadex G-50 Fine Sepharose GE Healthcare Sequenzierung
HiDi Formamid Applied Biosystems Sequenzierung
POP-6 Polymer for Genetic
Analyzer
Applied Biosystems Sequenzierung
Universal Master mix Applied Biosystems RQ-PCR
ASO-Primer unterschiedliche
Hersteller
RQ-PCR
TaqMan-Sonde® RQ-PCR
BSA 5% RQ-PCR
Buffy coat RQ-PCR
Page 31
- 25 - Patienten, Material und Methodik
2.4 Statistische Analysen
Die statistischen Untersuchungen wurden mit Hilfe des Graphpad Prism-Programms®
durchgeführt. Zur Überprüfung der Signifikanz der Übereinstimmung zweier Verteilungen
wurde der Mann-Withney-Test angewandt.
Spearman’s Rangkorrelationskoeffizient, als parameterfreies Maß für Korrelationen, wurde
berechnet, um den Zusammenhang zweier unterschiedlicher Untersuchungsmethoden
darzustellen (z.B. zwischen FACS und PCR). Die Standardabweichungen bezogen sich auf
die Gauß’sche Normalverteilung. Werte kleiner 0,05 wurden als signifikant bewertet.
Die Sensitivität gibt den Anteil der korrekt als positiv klassifizierten Proben an der
Gesamtheit der tatsächlich positiven Objekte an.
Die Spezifität gibt den Anteil der korrekt als negativ klassifizierten Proben an der Gesamtheit
der tatsächlich negativen Objekte an.
Der positive prädiktive Wert gibt den Anteil der korrekt als positiv erkannten Ereignisse an
der Gesamtheit der als positiv erkannten Ereignisse an.
Page 32
- 26 - Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Titrationsergebnisse und Optimierung der Antikörper-Fluorochrom-Auswahl
Alle Antikörper wurden titriert, um eine optimierte Auftrennung zwischen
Lymphozytensubpopulationen sowie zwischen den benignen und den malignen Populationen
zu erreichen. Die Titrationsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 14 aufgeführt.
Tab. 14: Signal-Rausch-Verhältnisse der untersuchten Antikörper auf benignen Lymphozyten, jeweils
optimales Signal-Rausch-Verhältnis ist fett hervorgehoben.
Antikörpervolumen [µl] / 100 µl Zellsuspension
1 2 5 10 20 30
Signal-Rausch-Verhältnisse
Antikörper
CD5 FITC 92 93,5 78 94
CD5 PerCP-Cy5.5 141,5 167 186 182
CD5 APC 80 88 92 82,5
CD19 PerCP-Cy5.5 88 105 113 111
CD19 APC 209 216 187 157
CD20 FITC 101 127 134 132,5
CD22 FITC 12 13 13 13
CD22 PE 184 195 208 203
CD43 PE 12 20 33 42
CD79b FITC 28,5 29 29 29
CD79b PE 18 19 25 27
CD81 FITC 42 41 27,5 42
CD81 PE 27 57,5 101,5 134
Für MRD-Bestimmungen bei CD5+ B-Zell-Lymphomen ist die sichere Identifizierung der
CD5+CD19
+ Lymphozyten essentiell. Hierfür ist ein möglichst gutes SRV nötig. Wir
überprüften daher, ob der Austausch der Fluorochrom-Antikörperkombination von der
bisherigen CD5-APC/CD19-PerCp-Cy5.5 Konstellation zu einem insgesamt besseren
Ergebnis führen würde. Ursächlich war hierfür eine Beobachtung, dass MCL häufig eine
deutlich reduzierte CD19-Expression im Vergleich zu benignen B-Zellen aufweisen (siehe
Abb. 3).
Erwartungsgemäß ließ sich für CD19 (Klon SJ25C1) mit APC ein deutlich höheres
maximales SRV als mit PerCP-Cy5.5 erzielen (216 vs. 113). Unerwarterweise konnte
andererseits das SRV auch durch den Wechsel von CD5 APC (Klon UCHT2) auf CD5
PerCP-Cy5.5 (Klon L17F12) verbessert werden, wobei es sich wahrscheinlich um einen
Effekt des Klons handelt. Insgesamt entschieden wir uns daher bei unserem MRD-Ansatz für
MCL zum Austausch des Konjugates, um die gerade hier wesentliche Diskriminierung der
malignen B-Zellen von Nicht-B-Lymphozyten zu erleichtern.
Page 33
- 27 - Ergebnisse
3.2 Etablierung der FACS-Panels
3.2.1 Expressionsstärkenanalyse aberrant exprimierter Antigene auf MCL-Zellen im
Vergleich zu benignen B-Lymphozyten
Es wurden zunächst die medianen Signal-Rausch-Verhältnisse der analysierten Antigene auf
MCL- und benignen CD5+ Blut- und Knochenmarkzellen untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass CD22 PE auf den benignen B-Lymphozyten des peripheren
Blutes stark exprimiert wird. Auf den CD5+CD19
+-Lymphozyten der Knochenmarkproben
von Gesunden findet sich CD22 PE auf der Zelloberfläche im Mittel niedriger ausgeprägt als
auf reifen, peripheren B-Zellen gesunder Spender.
Die MCL-Zellen exprimierten CD22 PE schwach (CD22niedrig
). Dieser Marker wurde im
Vergleich zu benignen B-Lymphozyten im peripheren Blut, wie auch zu denen im
Knochenmark, signifikant (p<0,0001) unterexprimiert.
Die Expressionsstärke von CD22PE wurde jeweils in den Kombinationen
CD23FITC/CD22PE/CD5PerCP-Cy5.5/CD19APC und CD79bFITC/CD22PE/CD5 PerCP-
Cy5.5/CD19APC untersucht, um eine mögliche Interaktion mit den verschiedenen FITC-
konjugierten Antikörpern (CD79bFITC und CD23FITC) beurteilen zu können. Dabei zeigten
sich nahezu identische Mediane der Signal-Rausch-Verhältnisse des geometrischen
Mittelwertes und damit ein konstantes Verhalten des Antikörpers in beiden Röhrchen (53,84
zu 54,68, p=0,91).
Die Abbildung 7 zeigt die unterschiedlichen Expressionsstärken und die Auftrennung von
MCL- gegenüber benignen CD5+ Zellen.
CD23FITC wurde auf MCL-Zellen gar nicht oder schwach exprimiert (CD23-/niedrig
). Im
peripheren Blut stellte sich ein signifikanter Unterschied zu den ebenfalls CD23 schwach
exprimierenden gesunden B-Lymphozyten dar (p<0,0001), der im Knochenmark weniger
deutlich ausfiel (p=0,0125). Dennoch überschnitten sich die Bandbreiten der MFIR's der
gewählten Antigene teilweise, was konsekutiv zu einer Abnahme der Sensitivität führte (Abb.
7)
Page 34
- 28 - Ergebnisse
Abb. 7: Signal-Rausch-Verhältnisse für (a) CD22, (b) CD23, (c) CD79b und (d) CD81 analysiert als MFIR
auf MCL im Vergleich zu Signal-Rausch-Verhältnissen von CD5+ B-Zellen im peripheren Blut (PBND)
und im Knochenmark gesunder Spender (BMND).
a) CD22PE
b) CD23FITC
c) CD79bFITC
d) CD81FITC
Die Kastengraphik zeigt jeweils den Median, das obere und untere Quartil und die beiden Extremwerte an.
CD79bFITC wurde auf MCL-Zellen sehr inhomogen exprimiert. Zu beobachten war eine
bimodale Verteilung. In 65 Prozent der Fälle wurde dieses Antigen unterexprimiert
(CD79bniedrig
), in 5 Prozent überexprimiert (CD79bhoch
) und in 30 Prozent zeigte sich kein
Expressionsunterschied zu den benignen B-Lymphozyten (CD79b+). MCL-Zellen zeigten im
Vergleich zu den gesunden B-Lymphozyten zwar im Median im Blut (p<0,0001) und im
Knochenmark (p=0,0056) eine signifikante Unterexpression von CD79b, dennoch ist CD79b
wegen seiner Variabilität ein schwierig anzuwendender MRD-Marker. Die Abbildung 7 zeigt
die Streuungsbreite von CD79bFITC und somit die Problematik dieses Markers zur Detektion
residueller MCL-Zellen.
Die Expressionsuntersuchung von CD81FITC in 11 MCL-Proben ergab keinen deutlichen
Unterschied zu benignen B-Lymphozyten (p<0,0214, Abb. 7).
Die Mediane der Signal-Rausch-Verhältnisse sind in der Tabelle 15 zusammengefasst.
Page 35
- 29 - Ergebnisse
Aus der Analyse der Signal-Rausch-Verhältnisse der aberranten Moleküle CD22, CD23,
CD79b und CD81 auf CD5+-MCL-Zellen und deren benignen Entsprechnungen in Blut und
Knochenmark ließ sich deren Eignung als MRD-Marker abschätzen.
CD22 erwies sich aufgrund des größten und homogensten Unterschiedes zu benignen B-
Zellen als am besten geeignet. CD23 war der nächstbeste Marker. CD79b war aufgrund der
interindividuellen Unterschiede (Über- oder Unterexpression im Vergleich zum Gesunden bei
unterschiedlichen Patienten) als MRD-Marker ungeeignet. CD81 zeigte keine signifikanten
Expressionsstärke-Unterschiede und war damit als MRD-Marker ungeeignet.
Trotz deutlicher Unterschiede in der medianen Expressionstärke von CD22 und CD23
zwischen Gesunden und MCL-Patienten, zeigten sich die Zellpopulationen teils überlappend.
Zur standardisierten Auswertung von MRD muss jedoch für jede einzelne Zelle eine
eindeutige Zuordnung der Dignität möglich sein.
Hierzu wurde zunächst die durchschnittliche 1. Perzentile bei Gesunden untersucht. Für die
drei signifikant unterexprimierten Marker CD22, CD23 und CD79b beschreibt die erste
Perzentile den Bereich, in dem sich dasjenige Prozent der gesunden Zellen befindet, das am
weitesten in den Bereich der MCL hineinragt.
Zur weiteren Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurde versucht, den Begriff der
„Unterexpression“ zu definieren. Da die beiden gewählten Marker keine eindeutige Trennung
zu den benignen CD5+CD19
+-B-Lymphozyten herstellten, wurden zunächst die Kanäle der
90., 95. und 99. Perzentile von 24 MCL-Patienten untersucht und mit der 1. Perzentile der
CD5+-B-Lymphozyten gesunder Spender verglichen.
Es diente der Median der Signal-Rausch-Verhältnisse der 95. Perzentile von CD22PE (154,1)
und der von CD23FITC (4,5) auf MCL als Grenzwert (s. Tab. 15). Anhand der
Normalprobanden konnte der Anteil an falsch positiven CD5+CD19
+-Lymphozyten mit dem
festgesetzten MCL-Immunphänotyp ermittelt werden. Durchschnittlich fielen 0,1% aller
benignen Leukozyten in das MCL-Gate. Addiert wurden zwei Standardabweichungen, was
eine maximale Sensitivität von 2,4x10-3
für diesen Antikörperansatz ergab. Durchschnittlich
104 benigne B-Lymphozyten wurden von 100.000 gemessenen Leukozyten als maligne
markiert. Ohne CD22PE erreichte der Ansatz eine Sensitivität von 8,4x10-3
. Nur mit dem
CD22PE-Antikörper ist der Ansatz deutlich sensitiver (3,0x10-3
) und zeigt, dass CD22PE
deutlich besser zu benignen B-Lymphozyten diskriminierte als CD23FITC. Die Anzahl an
falsch positiven Zellen im peripheren Blut zu den Knochenmarkproben war nicht signifikant
unterschiedlich (p=0,0889). Ein typischer MCL-Immunphänotyp ist
CD23niedrig
CD22niedrig
CD5+CD19
niedrig.
Page 36
- 30 - Ergebnisse
Tab. 15: Mediane der Signal-Rausch-Verhältnisse ausgewählter Perzentilen und der Geometrischen
Mittelwerte auf MCL-Zellen und benignen CD5+CD19
+-Lymphozyten
MCL Peripheres Blut
gesunder Spender
Knochenmark
gesunder Spender
CD22PE n 75 25 8
1. Perzentile - 39,6 12,5
10. Perzentile - 105,9 -
20. Perzentile - 164,6 -
30. Perzentile - 225,2 -
Geometrisches
Mittel
(Spanne)
53,8
(12,7-
216,3)
251,9*
(182,5-313,1)
164*
(66,4-277,1)
40. Perzentile - 260,7 -
50. Perzentile - 303,9 -
95. Perzentile 154,1 - -
99. Perzentile - 747,6 603,4
CD23FITC n 75 25 8
1. Perzentile - 0,2 0,2
10. Perzentile - 0,8 -
20. Perzentile - 1,4 -
30. Perzentile - 2,1 -
Geometrisches
Mittel
(Spanne)
1,3
(0,5-2,8)
2,5*
(0,9-4,9)
2,0**
(1,2-3,3)
40. Perzentile - 2,8 -
50. Perzentile - 4,6 -
95. Perzentile 4,5 - -
99. Perzentile - 39,7 16,7
CD79bFITC n 75 25 8
1. Perzentile - 0,6 0,5
10. Perzentile - 4,3 -
20. Perzentile - 7,7 -
30. Perzentile - 10,6 -
40. Perzentile - 13,5 -
Geometrisches
Mittel
(Spanne)
6,1
(1,2-
90,2)
16,3*
(8,2-28,6)
16,7**
(8,3-57,5)
50. Perzentile - 16,7 -
95. Perzentile 16,9 - -
99. Perzentile - 172,7 247,5
CD81FITC n 11 25 0
Geometrisches
Mittel
(Spanne)
15,2
(6,4-
36,9)
20,2§
(14,4-37,1) -
*p < 0,0001; ** p < 0,05; § nicht signifikant, jeweils MCL vs. gesunde Referenzpopulation
Page 37
- 31 - Ergebnisse
Tab. 16: Immunphänotypische Abweichungen, Anwendbarkeit und Spezifität zum
durchflusszytometrischen MRD-Nachweis bei MCL.
Angewandte Gates auf CD5+CD19
+-Lymphozyten
CD22niedrig
CD23niedrig
CD79bniedrig
CD22niedrig
+
CD79bniedrig
CD22niedrig
+
CD23niedrig
Erfasste MCL-Zellen in %
Median
Spanne
93
31-100
97
71-100
97
1-100
86
0,5-100
88
29-100
% der MCL-Proben in denen
95%
90%
85%
80%
75%
70%
65%
60%
der MCL-Zellen erfasst
wurden
41
66
70
79
88
91
93
93
69
83
89
98
98
100
100
100
64
73
75
76
77
79
80
85
25
40
51
60
65
69
74
80
28
45
58
70
85
93
93
93
% falsch positiver Ereignisse
von allen gemessenen
Leukozyten
Peripheres Blut:
Mittelwert
Mittelwert + 2 x
Standardabweichung
Knochenmark:
Mittelwert
Mittelwert + 2 x
Standardabweichung
0,12
0,30
0,05
0,13
0,31
0,84
0,12
0,32
0,39
1,04
0,09
0,27
0,06
0,16
0,02
0,04
0,10
0,24
0,05
0,11
% falsch positiver Ereignisse
von CD5+CD19
+-
Lymphozyten
Peripheres Blut:
Mittelwert
Mittelwert + 2 x
Standardabweichung
Knochenmark:
Mittelwert
Mittelwert + 2 x
Standardabweichung
24,0
39,4
37,6
82,6
54,7
89,0
71,7
124,9
66,4
87,3
58,8
100,3
12,2
22,4
20,4
50,8
18,2
33,2
32,8
73,5
Page 38
- 32 - Ergebnisse
3.2.2 Durchflusszytometrische Analysen zur CLL
3.2.2.1 Expressionsstärkenanalyse aberrant exprimierter Antigene auf CLL-Zellen im
Vergleich zu benignen B-Lymphozyten
Es wurden Blutproben prätherapeutischer CLL-Patienten mit Blutproben gesunder Spender
verglichen, um die Expressionsstärkedifferenzen ausgewählter Antigene objektiv zu
analysieren.
Es konnte gezeigt werden, dass alle drei untersuchten Antigenkombinationen
CD81FITC/CD22PE, CD79bFITC/CD20PE und CD20FITC/CD43APC auf CD5+CD19
+-
Lymphozyten im Vergleich zwischen den CLL-Zellen und den benignen B-Lymphozyten alle
hoch signifikant unterschiedlich exprimiert wurden (p<0,0001). Dabei fiel lediglich bei dem
CD81FITC-Marker eine Überlappung der Streuungsbreiten auf, was sich bei den
Sensitivitätsberechnungen als ungünstig bestätigte (s. Abb. 8 und Tab. 17).
Abb. 8: Signal-Rausch-Verhältnisse der geometrischen
Mittelwerte (MFIR) von CD81 FITC auf CLL-Zellen
und benignen CD19+CD5
+Lymphozyten (ND).
Die Kastengraphik zeigt jeweils den Median, das obere
und untere Quartil und die beiden Extremwerte an.
Alle verwendeten Antigenmarker, bis auf CD43 APC, wurden auf CLL-Zellen im Vergleich
zu benignen B-Lymphozyten unterexprimiert (s. Abb. 8 und 9). CD43 gilt im Vergleich als
positiv exprimiert (CD43+) und wurde somit weiter manuell gegated.
In der Tabelle 17 sind die Mediane der MFIR’s für die verschiedenen unterexprimierten
Marker auf CLL-Zellen und benignen CD5+CD19
+-Lymphozyten aufgelistet.
Betrachtet man die Sensitivitäten der einzelnen Marker und deren Kombinationen auf
CD5+CD19
+-Lymphozyten, stellte sich CD20
niedrig mit CD43
+ als sensitivste Kombination
heraus. Zur Definition der „niedrig“-Grenze diente wie bei den MCL-Zellen der Median der
95. Perzentilen. Dabei war der Dreifarben-Ansatz mit CD20niedrig
FITC/CD5+PE/CD19
+PerCP-
Cy5.5 (2,3x10-4
) fast genau so sensitiv wie mit CD43+ APC (1,3x10
-4).
Deutlich wurde ebenfalls die Überlegenheit des FITC-konjugierten CD20-Antikörpers
gegenüber dem PE-konjugierten. Fast eine logarithmische Stufe unterschied beide Antikörper
in ihrer Sensitivität (2,3x10-4
mit CD20 FITC vs. 1,3x10-3
mit CD20 PE).
Page 39
- 33 - Ergebnisse
Tab.17: Mediane der Signal-Rausch-Verhältnisse der geometrischen Mittelwerte und ausgewählter
Perzentilen auf CLL-Zellen und benignen CD5+-B-Lymphozyten
CLL gesunde Spender
CD20FITC n 30 19
Geometrisches Mittel 11,5 152,5*
90.Perzentile 36,7 -
95.Perzentile 47 -
99.Perzentile 77,3 -
CD20PE n 30 25
1.Perzentile 1,8 101,8
5.Perzentile - 192,1
10.Perzentile - 228,2
20.Perzentile - 286,8
Geometrisches Mittel
(Spanne)
33,7
(6,8-84,5)
391,7*
(257,4-590,0)
90.Perzentile 106,7 -
95.Perzentile 139 -
99.Perzentile 239,6 1333,5
CD22PE n 30 25
1.Perzentile - 13,9
5.Perzentile - 75,3
10.Perzentile - 116,2
20.Perzentile - 187,8
Geometrisches Mittel
(Spanne)
26,4
(6,6-129,9)
248,4*
(159,8-336,8)
90.Perzentile 58,2 -
95.Perzentile 69,8 -
99.Perzentile 97,6 729,8
CD79bFITC n 30 25
1.Perzentile - 0,7
5.Perzentile - 2
10.Perzentile - 3,3
20.Perzentile - 5,8
Geometrisches Mittel
(Spanne)
1,6
(1,1-2,7)
13,1*
(8,0-24,5)
90.Perzentile 3,6 -
95.Perzentile 4,7 -
99.Perzentile 6,8 127,2
CD81FITC n 30 25
1.Perzentile - 3,1
5.Perzentile - 5,9
10.Perzentile - 8,1
20.Perzentile - 11,2
Geometrisches Mittel 6,9 20,2*
90.Perzentile 14,2 -
95.Perzentile 17 -
99.Perzentile 24 115,7
* p < 0,0001, jeweils CLL vs. gesunde Referenzpopulation
Page 40
- 34 - Ergebnisse
CD79bFITC/CD20PE/CD19PerCP-Cy5.5/CD5APC war die zweit-sensitivste Kombination
(3,1x10-4
). Dabei diskriminierte CD20PE besser zu den falsch positiven Zellen als
CD79bFITC. Wenn beide Marker wie oben als niedrig definiert wurden, fielen pro 100.000
gemessener Leukozyten durchschnittlich 13,3 Zellen falsch in das CLL-Gate. Grenzte man
näher an die benigne B-Lymphozyten-Population heran, indem als Grenze von CD20PE die
99. Perzentile zugrunde gelegt wurde, so verfünffachten sich die falsch positiven Ereignisse
von durchschnittlich 42 auf 207,6 pro 100.000 gemessene Leukozyten. Mit CD79b kam es
dabei zu einer Reduktion der Sensitivität um fast eine halbe logarithmische Stufe (8,5x10-4
vs.
3,1x10-4
).
Die Kombination von CD81FITC/CD22PE/CD19PerCP-Cy5.5/CD5APC erreichte eine
Sensitivität von 7,8x10-4
. Dabei zeigte sich, dass CD81FITC in einigen CLL-Fällen aberrant
hoch exprimiert wurde (s. Abb. 8) und somit in den Expressionsbereich der benignen Zellen
fiel, so dass durchschnittlich 434,2 falsch positive Zellen, immer auf 100.000 gemessene
Leukozyten bezogen, gemessen wurden. Kombiniert mit dem wesentlich stabileren Marker
CD22PE, fielen im Durchschnitt nur noch 28,5 Zellen fälschlicher Weise in das CLL-Gate.
Die Sensitivitäten für die CLL-Kombinationen CD22/CD81 und für CD20/CD79b sind in der
folgenden Tabelle 18 aufgelistet.
In der Abbildung 9 sind die gut diskriminierenden Oberflächenmarker CD20FITC/PE,
CD22PE und CD79bFITC auf CLL gegen die Referenzpopulation aufgeführt.
Der typische CLL-Immunphänotyp entsprach CD20niedrig
/CD22niedrig
/CD43+/CD79b
niedrig/
CD81niedrig
/CD5+/CD19
+.
Page 41
- 35 - Ergebnisse
Tab. 18: Immunphänotypische Abweichungen, Anwendbarkeit und Spezifität zum
durchflusszytometrischen MRD-Nachweis bei CLL.
Angewandte Gates auf CD5+CD19
+-Lymphozyten
CD20niedrig
CD22niedrig
CD79bniedrig
CD81niedrig
CD22niedrig
+
CD81niedrig
CD20niedrig
+
CD79bniedrig
Erfasste CLL-Zellen in %
Median
Spanne
97
7-100
98
70-100
97
28-100
99
22-100
93
19-100
86
6-100
% der CLL-Proben in
denen
95%
90%
85%
80%
75%
70%
65%
60%
der CLL-Zellen erfasst
wurden
57
73
83
83
87
87
90
90
63
77
87
90
97
100
100
100
57
67
70
70
77
80
80
87
73
80
83
83
83
87
90
90
47
60
67
73
80
87
90
90
30
40
53
53
67
70
70
80
% falsch positiver
Ereignisse
von allen gemessenen
Leukozyten
Peripheres Blut:
Mittelwert
Mittelwert + 2 x
Standardabweichung
0,04
0,13
0,08
0,18
0,19
0,41
0,43
0,93
0,03
0,08
0,01
0,03
Abb. 9: Signal-Rausch-Verhältnisse der geometrischen Mittelwerte (MFIR) von CD20FITC/PE,CD22PE
und CD79bFITC auf CLL-Zellen und auf gesunden CD5+CD19
+-Lymphozyten (ND)
Die Kastengraphik zeigt jeweils den Median, das obere und untere Quartil und die beiden Extremwerte an.
Page 42
- 36 - Ergebnisse
3.2.2.2 Anwendung der kreierten Auswertevorlagen anhand 30 zusätzlicher Blutproben
unbehandelter CLL8-Patienten
Um herauszufinden, in wie vielen Fällen die starre Festlegung der „niedrig“-Marker auf die
95. Perzentile ausreichend die CLL erfassten, wurden nochmals 30 prätherapeutische CLL8-
Blutproben untersucht. Dabei wurde der CLL95%
-Immunphänotyp in der standardisierten
Methode mit den Regionen der 95. Perzentile beschrieben. CD79b95%
FITC/
CD2095%
PE/CD19+PerCP-Cy5.5/CD5
+APC und CD81
95%FITC/CD22
95%PE/CD19
+PerCP-
Cy5.5/CD5+APC.
Demgegenüber wurde der sichtbare CLL-Klon manuell markiert und als CLLmanuell
bezeichnet. Als ausreichend erfasst galten die Proben, in denen mindestens 75 Prozent der
wahren CLL-Population (CLLmanuell
) als maligne markiert wurden.
Der CD79bFITC/CD20PE-95%-Ansatz erkannte die CLL in einem Drittel der Fälle nur
ungenügend. In diesen Fällen wurden durchschnittlich nur 49 Prozent des sichtbaren Klons
erfasst (6,24%-70,43% von CLLmanuell
).
Dabei wurde CD20PE in 4 Fällen und CD79bFITC in 7 Fällen überexprimiert und nur in
einem Fall wurden beide Antigene gemeinsam aberrant überexprimiert.
Der CD81FITC/CD22PE-95%-Ansatz erkannte in 6 Fällen nur durchschnittlich 50 Prozent
der CLL und somit nicht ausreichend (18,51%-70,86%). Dabei stellte sich CD81FITC in 5
Fällen unkonstant überexprimierend dar, CD22PE nur in einem Fall.
Durch die interindividuelle Heterogenität der CLL führte eine vordefinierte MRD-
Gatingstrategie zum Einschluss einer geringeren Zahl von CLL-Fällen als die traditionelle
Methode, die die Krankheit als Immunphänotyp detektiert, der in der zweidimensionalen
Auswertung Gesunder nicht vorkommt.
3.3 Vergleich der durchflusszytometrischen, histomorphologischen und molekularen
MRD/MDD-Analysen
3.3.1 Initialdiagnostischer Vergleich der durchflusszytometrischen mit denen der Konsensus-
IGH-FR1-PCR-Analyse und der Knochenmarkhistologie beim MCL
Es galt nun, die klinische Bedeutung der Vierfarben-FACS-Analyse in der Primärdiagnostik
eines MCL zu ermitteln. Hierzu wurden 80 PB- und 30 KM-Proben von 84 zuvor
unbehandelten Patienten durchflusszytometrisch, histologisch und molekulargenetisch
untersucht. 88 der 110 Proben stammten von Patienten mit histologisch nachgewiesener
Knochenmarkinfiltration.
Page 43
- 37 - Ergebnisse
Das FACS wies in 96 der 110 Proben (87,3%) MCL nach (86,7% in den KM-, 87,5% in den
PB-Proben).
In der FACS-Analyse wurden MCL-Zellen in 67 Proben anhand einer LKR und dem
aberranten Immunphänotyp erkannt, in 24 Proben nur anhand der monoklonalen LKR und in
5 Fällen ausschließlich anhand des aberranten Immunphänotyps.
Mittels der Konsensus-IGH-FR1-PCR wurde in 104 der 110 Fälle Monoklonalität
nachgewiesen.
In zwölf Proben von Patienten, in deren Knochenmark histologisch kein MCL nachgewiesen
wurde, waren mittels FACS-Analyse MCL-Zellen nachweisbar (10,9%; 11 PB, 1 KM). Dabei
lag die mediane Infiltration bei 1,7x10-2
Zellen (Spanne: 1,0x10-1
bis 1,0x10-3
). Jeweils vier
Patienten wurden in der Ann-Arbor-Klassifikation als Stadium II, III, IV eingestuft. Diese
sensitiveren Ergebnisse der Durchflusszytometrie hätten somit bei acht der 84 Patienten
(9,5%) zur Einstufung in ein höheres Befallsstadium geführt.
In drei Proben von zwei Patienten mit histomorphologischer Knochenmarkinfiltration zeigte
die FACS-Untersuchung ein negatives Ergebnis. Von einem der zwei Patienten lag vom
Diagnosezeitpunkt lediglich eine Blutprobe vor. In beiden Fällen wurde zwar der typische
MCL-Immunphänotyp CD22niedrig
CD23niedrig
CD5+CD19
niedrig nachgewiesen, jedoch bei
unklarer LKR. Durch den geringgradigem Befall (1,2x10-4
, 3,9x10-4
, 6,9x10-4
), der jeweils
unter der ermittelten Nachweisgrenze dieses FACS-Ansatzes lag, wurden diese drei Proben
als negativ bewertet. In der Konsensus-IGH-FR1-PCR waren diese Proben positiv.
Die Blutprobe eines Patienten mit histologisch nachgewiesener Knochenmarkinfiltration
wurde im FACS negativ befundet, obwohl das zugehörige Knochenmarkaspirat einen
durchflusszytometrisch nachweisbaren Befall aufwies.
Diese Vergleichsuntersuchungen belegten, dass standardisierte durchflusszytometrische
MRD-Analysen in einem klinisch bedeutsamen Anteil ein höheres Ausbreitungsstadium des
MCL als die Histologie nachweisen können. Konsensus IGH-PCR detektierte MCL häufiger
als die Durchflusszytometrie.
Tab. 19: Ergebnisse der FACS Analyse in Abhängigkeit vom histologisch nachgewiesenem
Knochenmarkbefall und dem Ergebnis der Konsensus IGH-FR1-PCR.
Initialdiagnose (n = 110) FACS+ FACS-
Knochenmarkhistologie + 84 (76,4%) 4 (3,6 %)
Knochenmarkhistologie - 12 (10,9 %) 10 (9,1 %)
PCR + 95 (86,4 %) 9 (8,2 %)
PCR - 1* (0,9%) 5 (4,5%)
* diese Probe war positiv in der t(11;14) PCR
Page 44
- 38 - Ergebnisse
3.3.2 Vergleich der durchflusszytometrischen MRD-Ergebnisse der MCL-Verlaufsproben mit
denen der Konsensus-IGH-FR1-PCR
Untersucht wurden 171 Verlaufsproben (53 aus dem Knochenmark, 118 aus dem peripheren
Blut) von 67 Patienten. Dabei wurden 134 Proben während oder direkt nach der
Induktionstherapie (Interim- bzw. Final Staging) entnommen. 23 Proben aus der
Nachbeobachtungszeit (follow-up), mit einer maximalen Nachbeobachtungszeit von 8
Monaten und 14 Proben von Patienten, die eine Erhaltungstherapie erhielten.
Die Mehrzahl aller Proben während oder unmittelbar nach der Induktionstherapie waren im
FACS sowie in der Konsensus-IGH-FR1-PCR MRD-negativ (76,0%). In zehn Proben von
zehn Patienten wurden im FACS und in der PCR MCL nachgewiesen. Dabei konnten acht
Proben mittels des MCL-Immunphänotyps und der LKR identifiziert werden, eine Probe nur
mittels der LKR und eine Probe nur anhand des Immunphänotyps. Das mediane MRD-Niveau
lag bei 1 x 10-2
Zellen, was im Median 41 Zellen pro µl entsprach (14- 8200 Zellen/µl).
In 31 der 171 untersuchten Proben (18,1%) konnte in der PCR ein monoklonales Signal
nachgewiesen werden, in denen die FACS-Kriterien einer minimalen Resterkrankung nicht
gegeben waren. Aufgeschlüsselt waren es 9 Knochenmarkproben und 22 Blutproben von 22
Patienten, die alle bis auf eine Probe während oder direkt nach der Induktionstherapie
entnommen wurden. In diesen 31 PCR+/FACS- Proben wurden im Median 88.563
Leukozyten pro Röhrchen gemessen. In 16 dieser Proben (51,6%) konnte eine suspekte B-
Zell-Population erkannt werden, während in den 15 anderen Proben keine B-Lymphozyten
nachweisbar waren. Der mediane B-Lymphozyten-Gehalt lag somit lediglich bei 6,5x10-4
(von 1,3x10-4
bis 1,4x10-1
) selbst in den Proben mit erkennbarer B-Lymphozyten-Population.
Die Daten zeigten bei den meisten MCL-Patienten, dass die Immunchemotherapie mit
Rituximab neben der erwünschten Reduzierung des MCL zu einer starken B-
Lymphozytopenie führte. In dieser Phase der Therapie zeigte die PCR eine deutlich höhere
Sensitivität als die Vierfarben-Durchflusszytometrie.
3.3.3 Vergleich der FACS-MRD-Ergebnisse zwischen Knochenmarkproben und
entsprechender Proben aus dem peripheren Blut bei MCL-Patienten
Von 45 Patienten lagen 74 Knochenmarkproben zu den entsprechenden Blutproben zur
parallelen Untersuchung vor (26 zum Diagnosezeitpunkt, 48 Verlaufsproben). 22 gepaarte
Proben waren im Blut sowie im Knochenmark MCL positiv, 5 Paare waren nur in der
Knochenmarkprobe positiv und negativ im Blut, während in 47 gepaarten Proben weder im
Page 45
- 39 - Ergebnisse
KM noch im Blut MCL nachgewiesen werden konnten.
Betrachtet man nur die gepaarten Proben aus dem prätherapeutischen Staging erhielt man
vergleichbare Ergebnisse für Blut und Knochenmark. 3/26 (11,5%) sind gleichzeitig negativ
für MCL, 21/26 (80,8%) sind in den beiden korrespondierenden Proben positiv und 2/26
(7,7%) waren nicht leukämisch, jedoch knochenmarkinfiltriert.
Leukämische MCL ohne Knochenmarkbeteiligung wurden nie beobachtet. In den
Knochenmarkproben, in denen ein positiver MCL-Nachweis in der entsprechenden Blutprobe
gelang, zeigte sich eine positive quantitative Korrelation des Infiltrationsgrades in beiden
Materialien (r=0,77; p<0,0001). Zeigte sich durchflusszytometrisch ein Anhalt für MCL-
Infiltration im Knochenmark und war die zugehörige Blutprobe negativ, lag ein quantitativ
sehr geringer Infiltrationsgrad im Knochenmark vor (7,9x10-4
und 9,8x10-2
Zellen).
Im prätherapeutischen Material zeigte die Arbeit eine hohe Übereinstimmung des Befalls
zwischen Knochenmark und Blut.
Page 46
- 40 - Ergebnisse
3.3.4 Vergleichende Verlaufsanalysen zwischen MRD-FACS und der IGH-RQ-PCR bei
Patienten der CLL8-Studie
Um das MRD-FACS als valides Instrument im therapeutischen Verlauf eines Patienten zu
etablieren, wurden 67 Verlaufsproben von 11 FC-behandelten CLL8-Patienten (im Mittel 6
Proben/Patient), mittels MRD-FACS sowie mit der molekularen Referenzmethode IGH-RQ-
PCR untersucht.
Dabei korrelierten die Ergebnisse beider Methoden im MRD-Verlaufsmonitoring
hochsignifikant (p<0,0001, s. Tab. 20).
Auch zwischen der von uns oben beschriebenen standardisierten Auswertestrategie und der
nach der individuellen Erfahrung geleiteten FACS-Auswertung zeigte sich eine signifikante
Korrelation zu den molekulargenetischen MRD-Ergebnissen (p<0,0001, siehe Abbildung 10).
Tab. 20: Vergleichende RQ-PCR und FACS Untersuchungsergebnisse der Verlaufsanalysen bei der CLL
Verlaufsproben (n = 67) FACS+ FACS-
RQ-PCR + 34 (50,7 %) 5 (7,5 %)
RQ-PCR - 0 (0,0 %) 28 (41,8 %)
Abb. 10: Graphische Darstellung der Korrelationsanalysen zwischen den CLL-MRD-Ergebnissen der
standardisierten Auswertestrategie (Mean CLL) und der individuellen Auswertung (Mean of CLL best
gate) jeweils in Prozent.
Page 47
41 Diskussion
4. Diskussion
Ziel dieser Arbeit war, neue durchflusszytometrische Methoden zur Quantifizierung einer
minimalen Tumorzellinfiltration bei Diagnosestellung und im Therapieverlauf (MRD-FACS)
bei dem MCL und bei der B-CLL zu etablieren.
Zusätzlich sollte die Sensitivität und Spezifität der FACS-Panels durch den Vergleich mit
molekularen MRD-Messungen ermittelt werden.
Für das MCL wurden bislang nur wenige Zwei- oder Dreifarben-Durchflusszytometrie-
Studien mit kleinen Fallzahlen durchgeführt [34, 49]. Bisher wurde der MCL-
Immunphänotyp dabei folgendermaßen beschrieben: CD5+, CD19
niedrig, CD23
niedrig,
CD22niedrig
, CD79bhoch
und LKR+ [34, 49, 53]. Anhand einer klar definierten MCL-
Referenzgruppe von Patienten des Europäischen Mantelzelllymphom-Netzwerks (EU-MCL-
Network) mit sicher nachgewiesener LKR und t(11;14) Translokation wurde die
durchschnittliche Expressionstärke von CD22, CD23 und CD79b auf den CD5+CD19
niedrig-
MCL-Zellen ermittelt.
Diese Arbeit quantifizierte die Expressionsniveaus von CD22/CD23 beziehungsweise von
CD22/CD79b auf den CD5+CD19
+-Subpopulationen. Es konnte bestätigt werden, dass
CD22niedrig
CD23niedrig
CD5+CD19
niedrig ein stabiler und typischer Immunphänotyp bei MCL ist.
Allerdings fanden sich auch einige Fälle CD5-negativer MCL, wie von Liu et al bereits
beschrieben [54].
Im Gegensatz zu den Beobachtungen von D’Arena et al [49] wurde in der vorgelegten Arbeit
eine CD79b-Überexpression nur in 5% der MCL-Proben nachgewiesen (D’Arena et al.: 100%
bei 10 MCL-Proben). In den meisten MCL-Proben (65%) wurde CD79b deutlich
unterexprimiert, in 30% eine gegenüber benignen B-Zellen unveränderte CD79b-Expression
gemessen. Vor dem Hintergrund einer klar definierten pathognomonischen Translokation
t(11;14) erscheint eine derartige Variabilität der CD79b-Expression ungewöhnlich.
Neben der inhomogenen CD79b-Expression finden sich auch Überlappungen in der mittleren
Expressionsstärke von CD22PE und CD23FITC zwischen MCL- und nicht malignen B-
Lymphozyten.
Zusätzlich erscheint auch eine therapiebedingte Modulation der Expression einzelner
Oberflächenantigene möglich, wie es Gaipa et al für die kindliche Akute Lymphatische
Leukämie beschrieben haben [55]. Auch bei zwei der von uns untersuchten MCL-Patienten
war eine bei Diagnosestellung eindeutig nachweisbare LKR der MCL-Zellen unter
Induktionstherapie nicht mehr detektierbar (Daten nicht gezeigt).
Page 48
42 Diskussion
Aufgrund dieser Phänomene sowie der teils unzureichenden Trennbarkeit maligner und
benigner Zellen durch die Analyse einzelner Antigene wurde die Kombination mehrerer
Marker und eine klare Definition von „Unterexpression“ unumgänglich.
In diesem Definitionsversuch wurden nicht nur die unterschiedlichen mittleren
Expressionsstärken (MFI) zwischen den verschiedenen Proben untersucht, sondern auch die
Verteilung der Fluoreszenzintensitäten der MCL-Zellen innerhalb einer Probe. Dafür wurde
der empirisch festgelegte MFIR95%
-Wert für CD22, CD23 und CD79b mit dem MFI der
jeweiligen Isotypkontrolle jeder einzelnen Probe multipliziert, um das Expressionsniveau
dieser Antigene festzulegen. Wendet man diese standardisierte Gatingstrategie auf
Kontrollproben gesunder Probanden an, errechnete sich eine Sensitivität von 2,4x10-3
für den
CD23niedrig
CD22niedrig
CD5+CD19
niedrig-Ansatz, MCL-Zellen zu detektieren. Unter der
Maßgabe, dass mindestens 75% der MCL-Zellen erkannt werden müssen, ließ sich dieser
Ansatz nur in 79% aller untersuchten MCL-Proben anwenden.
Eine striktere Begrenzung auf die 90. Perzentile der mittleren Expression auf MCL-Zellen
(MFIR90%
) hätte die Spezifität des Ansatzes zwar erhöht, jedoch die Sensitivität weiter
negativ beeinflusst. Umgekehrt hätte eine Annäherung der „Unterexpressionsgrenze“ an die
benigen B-Zellen durch die teils deutliche Überlappung beider Populationen den positiven
prädiktiven Wert deutlich erniedrigt. Somit stellte die Festlegung auf die 95. Perzentile den
besten Kompromiss dar.
Da diese Gatingstrategie nicht auf alle MCL-Patienten anwendbar ist, sollte bei der MRD-
Untersuchung der initiale Immunphänotyp zusammen mit der sensitiveren LKR bekannt sein,
um atypische MCL-Fälle individuell auszuwerten zu können.
Ein Beispiel ist die bimodale Verteilung von CD79b auf MCL-Zellen. In dem
CD79bniedrig/+/hoch
CD22niedrig
CD5+CD19
niedrig-Ansatz muss CD79b nach dem initialen
Immunphänotyp entweder als „niedrig“- oder „hoch“-Marker eingesetzt werden.
In der Veröffentlichung von Böttcher et al [56], wurde gezeigt, dass die LKR-Untersuchung
der CD5+CD19
niedrig-Lymphozyten-Subpopulation eine sensitive Methode zur MCL-
Detektion darstellt. Die monoklonale LKR als eine typische Eigenschaft von Lymphomzellen
und die gerade bei MCL-Zellen niedrige CD19-Expression lässt eine gute Unterscheidung zu
benignen B-Lymphozyten zu. Die Sensitivität der LKR-Untersuchung wird insofern im
Wesentlichen durch die Anzahl der gemessenen Leukozyten begrenzt. Es muss eine minimale
Zellzahl im definierten Gate gemessen werden, um eine positive Population von verstreuten
Zellen, T-Lymphozyten oder Zelldebris unterscheiden zu können. Die minimale Zellzahl zur
Bildung eines Clusters liegt bei 20-50 Zellen.
Page 49
43 Diskussion
Die maximale Sensitivität der LKR-Untersuchung in dieser Studie liegt bei 7,9x10-4
[56] und
liegt damit bei den MCL wesentlich höher, als für die CLL beschrieben [35]. Diese
Beobachtungen hängen mit dem typischen Immunphänotyp CD5+CD19
niedrig der MCL-Zellen
und deren hochgradiger Leichtkettenexpression zusammen. Durch die höhere Sensitivität und
die breitere Anwendbarkeit gegenüber der Analyse aberranter Immunphänotypen ist die LKR-
Untersuchung als überlegen anzusehen. Bei zweifelhafter oder fehlender LKR sollte der
alleinige Nachweis des aberranten Immunphänotyp nur ergänzende Auskünfte über eine
mögliche MRD liefern.
Die Spezifität der durchflusszytometrischen MRD-Untersuchungen beim MCL wurde in
dieser Arbeit anhand der parallelen Konsensus-IGH-FR1-PCR-Untersuchungen überprüft. Bis
auf eine MCL-Probe, die in den Verlaufsproben-Untersuchungen im FACS positiv und in der
PCR negativ gemessen wurde (FACS+/PCR-), waren alle FACS positiven Proben auch in der
PCR positiv. Die einzige FACS+/PCR- Probe zeigte in der PCR der t(11;14) ein spezifisches
Signal, so dass insgesamt von einer hohen Spezifität der FACS-Analyse auszugehen ist (s.
Tab. 19).
Die Sensitivität der Konsensus-IGH-FR1-PCR hängt im Wesentlichen von der Größe des
klonalen Amplifikats in Relation zur Größe der polyklonalen PCR-Produkte sowie der Anzahl
der polyklonalen B-Lymphozyten in der Probe ab. Zudem kann die PCR beispielsweise durch
Mutationen an der Bindungsstelle des Primers zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Allerdings werden Mutationen innerhalb von IGH-Rearrangements im Wesentlichen bei
Keimzentrums- und Post-Keimzentrumslymphomen beobachtet.
Auffällig ist der hohe Anteil an FACS-/PCR+ Ergebnissen (18,1%) der follow-up-Proben. Ein
entscheidender Punkt scheint die Anwendung von Rituximab in den Induktionsprotokollen zu
sein. Dieses führt nicht nur zu einer starken Reduktion der MCL-Zellen, sondern auch der
benignen B-Lymphozyten. In diesen Proben lag die absolute Zahl der gemessenen B-
Lymphozyten oftmals unter der absoluten Nachweisgrenze zur Definition einer Population im
FACS-Ansatz. Dagegen ist die hohe Erkennungsrate der Konsensus-IGH-FR1-PCR vor dem
Hintergrund der effizienten Eliminierung polyklonaler B-Lymphozyten erklärbar. Hinzu
kommt, dass die PCR auch die DNA apoptotischer Zellen amplifizieren kann, während die
Durchflusszytometrie nur intakte Zellen erfasst.
Des Weiteren wurde in der vorgelegten Arbeit gezeigt, dass die Vierfarben-
Durchflusszytometrie und die Konsensus-IGH-FR1-PCR den initialen MCL-Befall sensitiver
als die Knochenmarkhistologie, erfasst. Bei Patienten mit histologisch unauffälligem
Knochenmark wurden im MRD-FACS deutlich niedrigere Infiltrationsraten erfasst, als in
Page 50
44 Diskussion
Proben mit histologischem Lymphomnachweis. Diese Beobachtungen legen eine höhere
Sensitivität des FACS gegenüber der Knochenmarkhistologie nahe. Allerdings wurden
histomorphologische Befunde im Rahmen der Routinediagnostik durch verschiedene
pathologische Institute erhoben. Somit ist nicht auszuschließen, dass eine standardisierte
Referenzhistologie sowie zusätzliche einheitliche immunhistochemische Färbungen die
histomorphologischen Erfassungsraten erhöht hätten.
Die Einbeziehung der durchflusszytometrischen Ergebnisse hätte bei ca. 10% aller
untersuchten MCL-Patienten zu einer Hochstufung in das Stadium IV nach Ann Arbor
geführt. Weitere 6% der Patienten wären durch Anwendung der Konsensus-IGH-FR1-PCR in
ein generalisiertes Stadium gestuft worden. Aufgrund der prognostischen Relevanz des
Ausbreitungsstadiums sollte in prospektiven Studien die Bedeutung einer nur
durchflusszytometrisch beziehungsweise molekulargenetisch nachweisbaren KM-Beteiligung
bzw. Ausschwemmung evaluiert werden.
Zudem könnten diese sensitiven Methoden eine klinische Bedeutung erlangen für Patienten
mit lokalisiertem Befall indolenter Lymphome. Vor der Entscheidung bezüglich einer lokalen,
potentiell kurativen Strahlentherapie wäre möglicherweise ein Ausschluss beziehungsweise
der Nachweis einer Systemerkrankung bedeutsam.
Weiterhin konnte in der vorgelegten Arbeit gezeigt werden, dass Patienten mit einer
durchflusszytometrisch nachgewiesenen Knochenmarkinfiltration durch ein MCL auch
leukämisch ausschwemmen. Somit könnte bei Patienten mit nachweisbarer Ausschwemmung
des MCL auf die invasive diagnostische KM-Untersuchung verzichtet werden. Bei sehr
niedrigem MRD-Niveau im Knochenmark (<0,09%) ließ sich allerdings in der
korrespondierenden Blutprobe keine Ausschwemmung nachweisen.
Für die CLL wurden bereits verschiedene durchflusszytometrische MRD-Panels etabliert. [23,
30, 35, 57]. Dabei wurde der CLL-Immunphänotyp bisher folgendermaßen beschrieben.
CD19+, CD5
+, CD20
niedrig, CD22
niedrig, CD23
+, CD43
+, CD79b
-/niedrig, CD81
niedrig und LKR-
Nachweis [9, 23, 30, 35, 57].
Um die Trennschärfe der einzelnen Marker beurteilen zu können, wurden in der vorgelegten
Arbeit die durchschnittlichen Expressionsstärken von CD20, CD22, CD79b und CD81 auf
CLL-Zellen und reifen B-Lymphozyten untersucht. Gemessen wurden die
immunphänotypischen Expressionsunterschiede von CD20/CD79b und CD81/CD22 auf den
CD5+CD19
+-Subpopulationen. Die Sensitivität dieser beiden Antikörper-Ansätze sowie der
von Böttcher et al. beschriebenen Antikörperkombination CD20/CD5/CD19/CD43 [23]
Page 51
45 Diskussion
wurde anhand der gesunden Referenzgruppe errechnet. Erneut fand die oben beschriebene
Auswertestrategie Anwendung. Das Panel von Böttcher et al. erwies sich als sensitivster
Ansatz mit einer maximalen Sensitivität von 1,3x10-4
. Interessant in diesem Zusammenhang
war die offensichtliche Bedeutung der Wahl der verwendeten CD20-Fluorochroms.
CD20FITC führte zu einer gegenüber CD20PE fast um eine log-Stufe erhöhten Sensitivität
der Analyse (CD20FITC: 2,3x10-4
versus CD20PE:1,3x10-3
). Bekannt ist das wesentlich
höhere Signal-Rausch-Verhältnis von PE gegenüber FITC. Das führt möglicherweise zu einer
Reduktion des messbaren Unterschieds zwischen den CD20 niedrig exprimierenden CLL-
Zellen und den CD20 hoch exprimierenden benignen B-Lymphozyten. Insgesamt bestätigte
sich die hohe Bedeutung von CD20 für die Sensitivität beider Ansätze. Allerdings ergeben
sich hieraus diagnostische Probleme für die MRD-Untersuchungen nach Gabe von
Rituximab-haltigen Therapieprotokollen. Auch die Anfärbung intrazytoplasmatischer Anteile
von CD20 scheint dieses Problem nicht zu umgehen, da bereits wenige Stunden nach
Rituximabgabe auch hier eine dramatische Reduktion des spezifischen Signals auf CLL-
Zellen zu beobachten ist (S. Böttcher, unveröffentlichte Analysen). Aktuelle Protein-
Expressionsanalysen von Rawstron et al [38] zeigen, dass die Kombination mit
CD81/CD22/CD19/CD5 eine spezifische Alternative zu den CD20-Kombinationen in der
MRD-Diagnostik ist. Dieses wurde in der vorgelegten Arbeit bestätigt. Mit diesem Panel
wurde eine Sensitivität von 7,8x10-4
erreicht und somit eine halbe log-Stufe niedriger als in
den CD20-haltigen Panels.
Neben der Blockierung von CD20 durch den therapeutischen Antikörper können auch eine
aberrant hohe Expression von CD20 auf CLL-Zellen oder andere untypische
Proteinexpressionsprofile problematisch sein. Als sogenannte „atypische“ CLL wird eine
CLL beschrieben, deren Immunphänotyp teilweise vom typischen Immunphänotyp abweicht.
Dieses stellt ein weiteres Problem für die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten rigiden
Auswertestrategie dar.
Für die untersuchten Antikörper-Kombinationen können aberrant hohe Expressionen von
CD20, CD22 und CD79b relevant werden. Es zeigten sich für diese Antigene in den
Expressionsanalysen zwar keine Überlappungen zu den B-Lymphozyten der gesunden
Referenzgruppe, allerdings führten relative Überexpressionen von CD20 und CD79b in einem
Drittel der 30 untersuchten CLL-Fälle zu einem Versagen der Auswertestrategie. Allerdings
waren nur in 1/10 Fällen beide Marker gleichzeitig hoch exprimiert, in 9/10 Fällen hingegen
nur CD20 oder CD79b überexprimiert waren.
Page 52
46 Diskussion
Weiterhin wurde durch die vorgelegte Arbeit die geringe Bedeutung von CD43+ bestätigt.
Eine Dreifarbenanalyse unter Exklusion von CD43 führte zu einer Sensitivität von 2,3x10-4
.
Jedoch erreichte auch ein von Rawstron et al. 2001 publiziertes Panel, welches CD79b statt
CD43 einsetzte, keine höhere Sensitivität. Eine mögliche Erklärung ist, dass Rawstron einen
PE-markierten CD20-Antikörperklon verwendete.
CD81 war der einzige Marker, der eine Überlappung in der Expression zwischen der CLL und
den gesunden B-Lymphozyten aufwies. Teilweise erschien auch CD81 „atypisch“ hoch
exprimiert. In 5 von 30 Fällen wurde der CLL-Klon durch eine solche atypische CD81-
Überexpression nur unzureichend erfasst.
CD22 erschien dagegen als stabil exprimierter CLL-Marker (nur in einem von 30 Fällen
überexprimiert), mit einer guten Diskrimination zu benignen B-Lymphozyten. In einer
Dreifarben-Kombination erreichte CD22 eine Sensitivität von 1,8x10-3
, mit durchschnittlich
76,8 falsch positiven Ereignissen pro 100.000 gemessene Leukozyten, im Vergleich zu 193,6
Ereignissen bei Verwendung von CD79b und 434,2 Ereignissen mit CD81.
Dennoch zeigte sich in den vergleichenden MRD-Analysen sowohl für den standardisierten
MRD-FACS-Ansatz als auch für die freie Gating-Strategie eine gute Korrelation der
quantitativen MRD-Ergebnisse zur molekularen Referenzmethode. Zudem erwies sich die
FACS-MRD-Analyse als hochspezifisch.
Ein Vorteil der Durchflusszytometrie gegenüber der Molekulargenetik ist die rasche
Verfügbarkeit der Ergebnisse sowie die simultane Erfassung weiterer Charakteristika
maligner und benigner Zellen. Eine standardisierte Auswertestrategie erscheint hierbei, auch
wenn sie mit einigen Limitierungen verbunden ist, eine Möglichkeit, Ergebnisse der FACS-
MRD-Diagnostik vergleichbarer zu machen und die Analysen expertenunabhängiger zu
gestalten.
Page 53
47 Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Die Möglichkeiten zur Behandlung des MCL’s und der CLL haben sich in den letzten Jahren
deutlich verbessert. Der Anteil der Komplettremissionen konnte insbesondere durch Einsatz
moderner Immunchemotherapieprotokolle gesteigert werden. Allerdings stellen auch diese
Therapien keine kurative Behandlungsoption dar, da sie zu keiner kompletten Elimination der
Tumorzellen führen. Somit muss auch bei Patienten, die nach klassischen Kriterien eine
Vollremission erreichen, von einer submikroskopischen Persistenz von Tumorzellen
ausgegangen werden, die Ausgangspunkt für spätere Rezidive darstellen. Diese sogenannte
"minimal residual disease" (MRD) hat neben konventionellen Risikofaktoren eine
entscheidende Bedeutung für die Prognose und möglicherweise für das diagnostische und
therapeutische Management von Patienten mit MCL oder CLL.
In der vorgelegten Arbeit wurde die Mehr-Farben-Durchflusszytometrie zum MRD-Nachweis
bei MCL und CLL im Vergleich zu sensitiven molekulargenetischen Verfahren getestet. Die
Durchflusszytometrie nutzt aberrante Antigenexpressionen der Lymphomzellen, um maligne
von benignen Zellen zu unterscheiden und ermöglicht so eine schnelle und quantitative MRD-
Analyse. Im Rahmen der Dissertation wurden Expressionsunterschiede definierter Antigene
zwischen Lymphomzellen und benignen B-Lymphozyten gesunder Spender analysiert.
Zudem wurden standardisierte Kriterien zum Nachweis von MCL- und CLL-Zellen mittels 4-
Farben-Durchflusszytometrie entwickelt und Markerkombinationen auf ihre Sensitivität,
Spezifität und Anwendbarkeit zum MRD-Nachweis untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass 4-Farben-FACS und Konsensus-IGH-FR1-PCR MCL-Zellen
bei Diagnosestellung sensitiver detektieren als die Knochenmarkhistologie. Es wurde
bestätigt, dass CD5+CD19
niedrigCD22
niedrigCD23
niedrig ein typischer Immunphänotyp bei MCL
ist. Allerdings wurde die Sensitivität der FACS-Analyse durch überlappende
Expressionsniveaus zwischen MCL-Zellen und gesunden B-Lymphozyten reduziert. Wendet
man die in dieser Arbeit beschriebene standardisierte Auswertungsstrategie für MCL-Zellen
an, erreicht dieser Ansatz eine maximale Sensitivität von 2,6x10-3
.
Bei der CLL wurde CD5+CD19
+CD22
niedrigCD81
niedrig als “CD20”-freier Immunphänotyp
bestätigt und nach der standardisierten Auswertungsstrategie CLL-Zellen bis zu einer
Sensitivität von 7,8x10-4
detektiert. Die Anwendbarkeit und die Korrelation zur molekularen
Referenzmethode waren zur Diagnostik sowie in der MRD-Verlaufsanalyse gut.
Zusammenfassend ist die Durchflusszytometrie eine sensitive Methode für das initiale MCL-
Staging. Ein Nachweis von leukämischen MCL könnte für eine große Anzahl von Patienten
Page 54
48 Zusammenfassung
eine diagnostische Knochenmarkpunktion überflüssig machen. Zudem können niedrige
Knochenmarkinfiltrationen, die unter der Nachweisgrenze der Knochenmarkzytologie liegen,
mittels FACS gesichert werden. Dieses führt zur häufigeren Diagnose eines generalisierten
Ausbreitungsstadiums mit möglichen Konsequenzen für Therapie und Prognose.
Die 4-Farben-FACS-Analyse ist zur MRD-Detektion von MCL-Zellen nach Rituximab
Therapie der Molekulargenetik unterlegen. Auch bei der CLL weist die molekulare
Referenzmethode eine gegenüber der FACS-Analyse höhere Sensitivität auf.
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54 Danksagung
7. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Dr. rer. nat. M. Kneba, Direktor der 2.
Medizinischen Klinik für Innere Medizin im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein,
Campus Kiel, der mir den Arbeitsplatz im Labor für hämatologische Spezialdiagnostik zur
Verfügung stellte und mir somit die Arbeit an diesem interessanten Thema ermöglichte.
Ganz besonders danken möchte ich außerdem Frau PD Dr. med. M. Brüggemann, Oberärztin
des Labors für hämatologische Spezialdiagnostik der 2. Medizin und Herrn Dr. med. S.
Böttcher, Oberarzt an der oben genannten Klinik, die mich als Betreuerin und Betreuer
umfassend in das Thema einführten und mich während meiner gesamten Arbeit sorgfältig
anleiteten und mich allzeit beratend unterstützten.
Ein weiterer besonderer Dank gilt auch Frau E. Harbst und Frau J. Hanani für die kompetente
Anleitung in die Abläufe und Durchführung der Durchflusszytometrie sowie Frau PD Dr.
med. C. Pott, Herrn Dr. rer. nat. H. Trautmann und Frau M. Bucher für die tatkräftige
Unterstützung bei den Durchführungen der molekulargenetischen Analysen.
Danken möchte ich ebenso den Patienten, die an den Studien des Europäischen Mantelzell-
Lymphom-Netzwerks und der Deutschen CLL-Studiengruppe teilgenommen haben.
Schließlich gilt mein herzlicher Dank meiner Familie, die mir den Raum für diese Arbeit
geschaffen haben.
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55 Lebenslauf
8. Lebenslauf
Name: Buske
Vorname: Sebastian
Geburtstag: 10.03.1980
Geburtsort: Rendsburg
Wohnort: Steinstr. 10, 24118 Kiel
Eltern: Dr. Dietrich Buske, Facharzt für Nervenheilkunde
Sylvie Buske, geb. Chalier, Sozialpädagogin
Geschwister: Christopher Buske, Arzt
Ausbildung: 1986-1990 Wilhelminen-Grundschule in Schleswig
1990-1999 Domschulgymnasium in Schleswig, Abschluss
Abitur
1999-2000 Zivildienst beim Deutschen-Roten-Kreuz in
Schleswig im Rettungsdienst
2000-2007 Studium der Humanmedizin an der Christian-
Albrechts-Universität zu Kiel, Abschluss: 3. Staatsexamen
Beruflicher Werdegang: Seit Juni 2007 Assistenzarzt in der II. Medizinischen Klinik
und Poliklinik des UK-SH, Campus Kiel
Veröffentlichungen zum Dissertationsthema als Co-Autor:
Minimal residual disease detection in mantle cell lymphoma: methods and significance of
four-color flow cytometry compared to consensus IGH-polymerase chain reaction at initial
staging and for follow- up examinations. Haematologica 2008 Apr; 93(4):551-559.