Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden von Staatl. gepr. Lebensmittelchemiker Klaus Beckmann Geboren am 4.10.1973 in Bielefeld Gutachter: Prof. Dr. Karl Speer Prof. Dr. Hans Büning-Pfaue Dr. Cord Lüllmann eingereicht am: 14.08.2008 Tag der Verteidigung: 04.12.2008
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Entwicklung neuer analytischer Methoden zur Erweiterung ... · ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer
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Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt
der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der
Technischen Universität Dresden
von
Staatl. gepr. Lebensmittelchemiker Klaus Beckmann
Geboren am 4.10.1973 in Bielefeld
Gutachter: Prof. Dr. Karl Speer
Prof. Dr. Hans Büning-Pfaue
Dr. Cord Lüllmann
eingereicht am: 14.08.2008
Tag der Verteidigung: 04.12.2008
1 1. Einführung
1
Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. K. Speer, danke ich für die Überlassung des
Dissertationsthemas und die Betreuung, die trotz der räumlichen Distanz
hervorragend funktionierte.
Bei Frau G. Beckh und Herrn Dr. C. Lüllmann von der Firma Quality Services
International bedanke ich mich für die Betreuung vor Ort und den Freiraum, der mir
bei der Durchführung dieser Arbeit eingeräumt wurde.
Dem gesamten Team von Quality Services International danke ich für das
ausgezeichnete Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft.
Mein ganz besonderer Dank geht an Frau Sarah Englisch, Frau Karin Tausendfreund
und Herrn Shendi Xiao für ihre wertvolle Hilfe und Unterstützung bei der praktischen
Durchführung dieser Arbeit.
1. Einführung 2
2
Für meine Familie
3 1. Einführung
3
Zusammenfassung Die Qualität von Honig ist in zahlreichen Normen geregelt, welche allerdings ständig
den aktuellen Rahmenbedingungen angepasst werden müssen. Ziel dieser Arbeit
war es, Lösungen für zwei Fragestellungen zu erarbeiten, die derzeit im Fokus der
Qualitätssicherung von Honig stehen.
Der erste Teil behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche ausgehend von
der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach
Einsatz als Bienenvertreibungsmittel im Honig vorliegen kann. Letzteres war der
Grund dafür, dass Stiftung Warentest im April 2004 verschiedene Honige abgewertet
hatte. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, von welchen Faktoren der natürliche
Gehalt an Phenylacetaldehyd abhängt, um beurteilen zu können, ob die Substanz
natürlicherweise oder als Rückstand im Honig vorhanden sein kann.
Untersuchungen der Phenylalaningehalte verschiedener Honige ergaben, dass die
ermittelten Konzentrationen sortenabhängig sehr unterschiedlich waren. Zur
analytischen Bestimmung der Phenylacetaldehydgehalte wurde zunächst eine in der
Literatur beschriebene Headspace-GC/MS-Methode eingesetzt, die sich jedoch als
ungeeignet erwies, da durch die Probenvorbereitung Phenylalanin bereits in
Phenylacetaldehyd umgewandelt wurde. Mit der daraufhin entwickelten
Extraktionsmethode ließen sich die Gehalte hingegen sicher bestimmen.
Im nächsten Schritt wurden verschiedene Honige sowie Zuckersirupe, mit und ohne
Phenylalanin dotiert, bei unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Dabei zeigte sich,
dass durch erhöhte Temperatur und UV-Licht die Gehalte an Phenylacetaldehyd
deutlich zunahmen. Auch hierbei war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen
den Phenylalanin- und Phenylacetaldehydgehalten zu beobachten.
Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Abwertungen von Stiftung Warentest nicht
zulässig waren, da weder die Phenylalaningehalte der beanstandeten Proben
bekannt waren noch die äußeren Bedingungen, denen diese Honige beim Transport
und der Lagerung ausgesetzt waren.
1. Einführung 4
4
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Filtration von Honig. Diese ist seit
Inkrafttreten der neuen Honigverordnung von 2004 zulässig. Beimischungen
gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen sind allerdings illegal, und es galt, eine
Methode zu entwickeln, um einen derartigen Zusatz nachzuweisen.
Vergleichende Untersuchungen von Honigen vor und nach Filtration ergaben
zunächst, dass die Enzymaktivitäten, vor allem die der Saccharase, durch einen
solchen Prozess gemindert werden. Daraufhin wurde eine Methode zur
gelchromatographischen Trennung der Honigenzyme bzw. -proteine entwickelt. In
den Chromatogrammen war zu beobachten, dass insbesondere der Peak der
Saccharase abnahm.
Es war indes noch keine eindeutige Differenzierung von gefilterten und ungefilterten
Honigen möglich. Daher wurde im folgenden Schritt eine Methode erarbeitet, mit der
die Proteine der Saccharase elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Dabei zeigte
sich, dass von den beiden dominierenden Banden, die die Saccharase ungefilterter
Honige aufwies, nach Filtration eine Bande nahezu verschwunden war.
Mit Hilfe einer quantitativen densitometrischen Auswertung wurden dann die
Verhältnisse der Farbdichtewerte der beiden Banden berechnet. Bei ungefilterten
Honigen lag dieses Verhältnis bei ungefähr 3, während dieses nach einer Filtration
bei mindestens 30 lag. Zumischversuche gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen
ergaben, dass mit dieser Methode ein Nachweis gefilterter Honige ab 15 % möglich
ist.
5 1. Einführung
5
Inhaltsverzeichnis
1. Einführung ....................................................................................................... 8 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig ................... 10
2.1. Honigerzeugung ......................................................................................... 10 2.2. Inhaltsstoffe des Honigs.............................................................................. 11
2.3. Qualitätsuntersuchungen von Honig ........................................................... 18 2.3.1. Bestimmung der botanischen und regionalen Herkunft .................. 19 2.3.2. Parameter zum Nachweis von Verfälschungen .............................. 21 2.3.3. Untersuchung auf Wärmeschädigung ............................................ 23 2.3.4. weitere Parameter zur Prüfung der Honigqualität ........................... 25 2.3.5. Rückstandsanalytik......................................................................... 26
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil ................... 28
3.1. Charakterisierung von Phenylacetaldehyd .................................................. 28 3.2. Phenylacetaldehyd in Honig ....................................................................... 28 3.3. Problemstellung .......................................................................................... 30 3.4. Bienenvertreibungsmittel ............................................................................ 31
3.4.1. Phenylacetaldehyd als Bienenvertreibungsmittel ........................... 32 3.5. Einflüsse auf den Phenylacetaldehydgehalt ............................................... 33
3.5.1. Analytik der freien Aminosäuren ..................................................... 33 3.5.2. Phenylacetaldehyd-Analytik mittels Headspace-GC/MS ................ 35 3.5.3. Ergebnisse und Schlussfolgerungen .............................................. 36
3.6. Bestimmung von Phenylacetaldehyd nach Extraktion ................................ 37 3.6.1. Methodenentwicklung ..................................................................... 37 3.6.2. Methodenvalidierung ...................................................................... 38
4.6.6. Zuckerprofile ..................................................................................... 56 4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide ............................................................ 56
4.6.7. HMF-Gehalt .................................................................................... 60 4.6.8. Mikroskopische Untersuchung ....................................................... 62 4.6.9. Enzymaktivität der Diastase ........................................................... 63 4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase ...................................................... 64 4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche ................................... 65
4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration ...................................................... 65 4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen ........................................ 66 4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme .................... 69
4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme .............................................................. 71 4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige............................................ 75 4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC ........................................... 76
4.7.3. Elektrophorese ............................................................................... 77 4.7.3.1. Elektrophorese von Saccharasefraktionen ............................................... 79 4.7.3.2. Ergebnisse der Elektrophorese ................................................................ 81 4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen ........................... 84 4.7.3.4. Densitometrische Auswertung ................................................................. 85 4.7.3.5. Methodenvalidierung ............................................................................... 90 4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen ........................................................ 94
5. Material und Methoden ................................................................................... 98
Abkürzungsverzeichnis Å Ångström Abb. Abbildung Abschn. Abschnitt AID absolute integrated density Anl. Anlage BSA Bovine Serum Albumin c Konzentration CCD Charge-coupled Device DAD Diodenarray-Detektor DID differential integrated density DIN Deutsche Industrie-Norm EC Enzyme Commission EG Europäische Gemeinschaft EN Europäische Norm Fa. Firma F/G Fructose-Glucose-Verhältnis GC Gaschromatographie GPC Gelpermeationschromatographie h Stunde HMF Hydroxymethylfurfural HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ICP induktiv gekoppeltes Plasma IR infrarot ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer MS Massenspektrometrie m/z Masse pro Ladung n Probenzahl NaAc Natriumacetat nm Nanometer PAA Phenylacetaldehyd PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese ppm parts per million (entspricht mg/kg) RHmV Rückstandshöchstmengen-Verordnung RI Refraktionsindex SDS Natriumdodecylsulfat sek. Sekunde Tab. Tabelle
1. Einführung 8
8
Abb. 1.a: Honigjäger (6000 Jahre alte Höhlenmalerei bei Valencia, Spanien)
1. Einführung
Honig ist ein Lebensmittel, welches von Honigbienen (Apis mellifera) aus
Blütennektar oder Honigtau erzeugt wird.
Seit Jahrtausenden wird Honig als naturbelassenes und
hochwertiges Erzeugnis zum unmittelbaren Verzehr oder
zum Süßen von Speisen genutzt (Abb. 1.a). Der Name
stammt aus dem indogermanischen ab, wo er seiner Farbe
wegen als „der Goldfarbende“ bezeichnet wurde.
Vor allem in Deutschland besitzt dieses Lebensmittel einen
hohen Stellenwert. Die deutsche Bevölkerung verzehrt pro
Jahr ca. 100.000 t Honig, was einem Pro-Kopf-Verbrauch
von etwa 1,4 kg entspricht und damit den höchsten
Durchschnittskonsum der Welt darstellt. Die einheimischen
Imker produzieren dabei ungefähr ein Viertel der benötigten
Menge, der restliche Honig wird importiert.
Die Verbraucher stellen hohe Ansprüche an die Qualität von Honig. Diese wird im
deutschen und im europäischen Lebensmittelrecht in zahlreichen Normen geregelt,
wobei die honigspezifischen Qualitätsparameter in der deutschen Honigverordnung
festgelegt sind. Darüber hinaus legen die Abfüller und Importeure häufig zusätzliche
Spezifikationen fest, um ihre Produkte von denen der Mitbewerber abzuheben.
Die Qualitätsmerkmale unterliegen jedoch einem stetigen Wandel und müssen stetig
aktuellen Gegebenheiten, aber auch rechtlichen Anforderungen angepasst werden.
So gilt es Verfahren zum Nachweis von neu zugelassenen Substanzen, die im
Pflanzenschutz oder in der Bienenhaltung zum Einsatz kommen, zu entwickeln oder
Verfälschungen des Honigs analytisch nachzuweisen. Dahingehend müssen sowohl
Analysemethoden erarbeitet als auch Grenzwerte festgelegt werden.
Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Qualitätssicherung von Honig aktuellen
Fragestellungen anzupassen.
Im ersten Teil wurde die Problematik des Stoffes Phenylacetaldehyd aufgegriffen.
Dieser kann als Bienenvertreibungsmittel zur Vereinfachung der Honigernte
9 1. Einführung
9
eingesetzt werden und somit als Rückstand im Honig vorliegen. Das führte dazu,
dass Stiftung Warentest im Jahr 2004 Honige aufgrund analytischer Befunde
beanstandete. Die Substanz kann jedoch auch natürlicherweise im Honig vorliegen,
so dass die Aufgabe darin bestand, den Bildungsmechanismus von
Phenylacetaldehyd genauer zu untersuchen. Anhand der zu ermittelten Daten sollte
dem Handel die Möglichkeit gegeben werden, eindeutig zu erkennen, ob
Phenylacetaldehyd als Rückstand oder als natürlicher Bestandteil im Honig
vorhanden ist.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Auswirkungen der Filtration von Honig gemäß
der Honigverordnung aus 2004 (LFGB) untersucht. Durch die Filtration werden dem
Honig Pollen entzogen, so dass sich die botanische und geographische Herkunft
mittels mikroskopischer Pollenanalyse nicht mehr feststellen lassen. Die Folge sind
mögliche illegale Beimischungen von billigen filtrierten Honigen zu teuren Sorten und
ein Preisverfall dieser hochwertigen Produkte. Es gab bislang noch keine
Möglichkeit, derartige Zusätze zu detektieren.
Forschungsziel war es somit, eine analytische Methode zu entwickeln, um in
Honigmischungen einen unzulässigen Zusatz von filtrierten Honigen nachweisen zu
können. Dabei wurde eine Forderung des Agrarausschusses des Bundesrates
aufgegriffen, welcher im Rahmen der Zustimmung zur neuen Honigverordnung im
Jahr 2003 darum gebeten hatte, die Forschung zu verstärken, um
Nachweismethoden für eine Verschneidung zu erarbeiten.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 10
10
Abb. 2.1.a: Biene beim Sammeln von Nektar
Abb. 2.1.b: Bienen beim Verdeckeln der Waben
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
2.1. Honigerzeugung
Honig entsteht aus Nektar bzw. Honigtau, welcher von Bienen gesammelt und
weiterverarbeitet wird. Bei Honigtau, dem Rohstoff für den Waldhonig, handelt es
sich um die zuckerhaltigen Abscheidungsprodukte von Blattläusen.
Die Säfte werden zunächst von der Biene
aufgenommen (Abb. 2.1.a) und gelangen in die
Honigblase. Ein Teil davon wird in den Darm
abgegeben und dient den Bienen als Nahrung.
Die heimkommenden Sammlerinnen geben den
unverbrauchten Honigblaseninhalt an die
Stockbienen ab. Gleiches passiert auch
zwischen den Stockbienen, so dass die
Pflanzensäfte ständig von Honigblase zu
Honigblase wechseln. Bei diesen Vorgängen wird die Flüssigkeit mit bieneneigenen
Absonderungen angereichert, die vor allem lange Zuckerketten zerkleinern und
aufspalten. Je mehr Bienen der Rohhonig auf diese Weise auf seinem Weg zur
Einlagerung passiert, desto höher ist am Ende der Enzymgehalt des ausgereiften
Honigs.
Danach wird der Honig von den Stockbienen in Waben eingelagert. Während des
Reifungsprozesses wird der Honig eingedickt. Der Wassergehalt der Honigrohstoffe
liegt bei ca. 75 % und wird während der
Honigreifung im Bienenstock bis auf 20 %
erniedrigt. Dies geschieht üblicherweise
innerhalb weniger Tage. Erst wenn der
Wassergehalt unter 20 % gesunken ist,
werden die Waben verdeckelt (Abb. 2.1.b),
und der Honig gilt als reif. Da dies aber von
verschiedenen Faktoren abhängig ist, zum
Beispiel Klima oder Volksstärke, kann es in
11 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
11
Abb. 2.1.c: Honig-schleuder
seltenen Fällen vorkommen, dass Bienen auch Honig mit höherem Wassergehalt
verdeckeln.
Bei der Honigernte durch die Imker werden die
verdeckelten Waben dem Stock entnommen. Die
Gewinnung des Honigs erfolgt üblicherweise mittels
Schleudern, bei denen der Honig durch Zentrifugalkräfte
aus den Waben herausgedrückt wird (Abb. 2.1.c)
[LÜLLMANN & HORN (2006)].
Anschließend wird der Honig gesiebt, um
Verunreinigungen wie Wachspartikel, Bienenteile oder
Bestandteile der Waben zu entfernen. Die Siebe bestehen
aus einem grobmaschigen Obersieb und einem
feinmaschigen Untersieb, wobei die maximale
Maschenweite der Siebe 200 µm beträgt [LÜLLMANN &
HORN (2006)].
Je nach Zustand des Honigs können weitere Aufarbeitungsschritte folgen, wie zum
Beispiel das Klären zum Entfernen kleinster Wachsteilchen oder das Verflüssigen
kristallisierter Honige (siehe dazu Kap. 4.2.).
2.2. Inhaltsstoffe des Honigs
2.2.1. Hauptbestandteile
Wasser und Kohlenhydrate (Zucker) ergeben zusammen etwa 90 % der Masse von
Honig.
Kohlenhydrate
Kohlenhydrate stellen mit ca. 70 % den Hauptbestandteil des Honigs dar, wobei die
Monosaccharide D-Fructose (im Folgenden nur „Fructose“) (33 - 42 %) und D-
Glucose (im Folgenden nur „Glucose“) (27 - 36 %) (Abb. 2.2.1.a) den
überwiegenden Anteil ausmachen. Als weitere Einzelzucker wurde lediglich das
Vorhandensein von Galactose in Spuren beobachtet [VAL et al. (1998)].
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 12
12
Abb. 2.2.1.a: D-Glucose (links) und D-Fructose (rechts)
Fructose und Glucose entstammen direkt dem Nektar, werden aber auch durch
Hydrolyse des Disaccharids Saccharose mit Hilfe des Enzyms Saccharase gebildet.
Da letzteres im Honig unter entsprechenden Voraussetzungen aktiv bleibt, können
während der Lagerung weitere Anteile an Saccharose umgesetzt werden (siehe Kap. 2.2.3.2.).
Das Verhältnis von Fructose und Glucose (F/G) ist unter anderem von der
Blütentracht abhängig und liegt zumeist auf der Seite der Fructose. Eine Ausnahme
bilden Rapshonige, bei denen der Anteil an Glucose überwiegen kann.
Weiterhin sind im Honig unterschiedliche Disaccharide zu finden. Am häufigsten
kommen Saccharose (Rohrzucker), Maltose, Isomaltose, Turanose und Trehalose
vor. Die Konzentrationen dieser Zucker unterliegen dabei großen Schwankungen.
Beispielsweise ist der Gehalt an Saccharose bedingt durch die Tracht und den
Einspeichelungsgrad an Saccharase durch die Biene. Manche Disaccharide sind
aber auch auf enzymatische Aktivitäten von Mikroorganismen zurückzuführen [LIPP
(1994)].
Trisaccharide, wie zum Beispiel Erlose, Melezitose und Maltotriose, sowie Tetra- und
Pentasaccharide sind ebenfalls im Honig zu finden. Honigtauhonige enthalten im
Schnitt mehr höhermolekulare Zucker als Blütenhonige, was damit zu erklären ist,
dass diese Kohlenhydrate durch Enzymsysteme der Blattlaus synthetisiert werden
[LIPP (1994)].
Di-, Tri- und höhere Saccharide können im Honig bis zu 10 % vorhanden sein.
Generell kann die Verteilung bzw. Menge der Kohlenhydrate charakteristisch für
bestimmte Honigsorten sein [FÖLDHÁZI (1994), MATEO & BOSCH-REIG (1997)]
(vergleiche Kap. 2.3.1.).
13 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
13
Wasser
Der Wassergehalt in reifen Honigen liegt zwischen 16 und 20 % (vergleiche Kap. 2.1.). Eine Ausnahme bilden Heidehonige, die durchschnittlich etwas höhere Gehalte
aufweisen.
2.2.2. weitere Bestandteile
Organische Säuren
Honig enthält eine Reihe niedermolekularer organischer Säuren, die unterschiedliche
Ursprünge haben können. Dominierend ist die Gluconsäure als Produkt der Glucose-
Oxidase (siehe Kap. 2.2.3.3.). Aber auch Citronensäure, Brenztraubensäure und DL-
Milchsäure wurden in vielen Honigsorten nachgewiesen [NOZAL et al. (2003), PILZ-
GÜTHER & SPEER (2004)].
L-Äpfelsäure kann hingegen in höheren Konzentrationen ein Indikator für eine
Gärung des Honigs sein [PATSCHKY & SCHÖNE (1970)].
Das Vorhandensein hoher Gehalte von Ameisensäure oder Oxalsäure deutet auf
eine Behandlung der Bienen gegen Varoose hin [BOGDANOV et al. (2003)].
Flavonoide und Phenolcarbonsäuren
Phenolcarbonsäuren und Flavonoide sind vielfach untersuchte Stoffgruppen, die in
unterschiedlichen Mengen im Honig in Abhängigkeit von der Tracht vorhanden sind.
In verschiedenen Sortenhonigen wurden beispielsweise p-Hydroxybenzoesäure, p-
Cumarsäure, Kämpferol oder Chrysin in Konzentrationen von 0,1 bis 15 mg/kg
beobachtet [GHELDOF et al. (2002)]. Es handelt sich dabei um so genannte
sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, die nicht nur farb- und aromagebende
Eigenschaften besitzen, ihnen werden auch antioxidative Wirkungen zugesprochen.
Aromakomponenten
Das Spektrum der Substanzen im Honig, die für die Organoleptik verantwortlich sind,
ist sehr vielfältig. Die Sensorik ist neben dem Pollenspektrum auch das wichtigste
Beurteilungskriterium zur Unterscheidung von Honigsorten (vergleiche Kap. 2.3.1.).
Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Carbonylverbindungen und Ester stellen die
hauptsächlichen Stoffgruppen dar, die Beiträge zum Aroma liefern. Bestimmte
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 14
14
Verbindungen können sogar als Marker für einzelne Sorten herangezogen werden.
Beispiele sind 2,3-Pentandion für Eukalyptushonige oder 3-Methyl-2-butanol für
Sonnenblumenhonige [RADOVIC et al. (2001)].
Mineralstoffe und Spurenelemente
Die Zusammensetzung der mineralischen Bestandteile unterliegt starken
Schwankungen je nach Honigart und Herkunft. Kalium bildet das Hauptelement der
Asche [SOUCI et al. (1994)], wobei die Zusammensetzung von vielen Faktoren
abhängig ist. Verschiedene Arbeiten haben bereits gezeigt, dass die Profile
bestimmter Spurenelemente auf den botanischen Ursprung von Honigen hindeuten
können [DEVILLERS et al. (2002), NANDA et al. (2003)].
Aminosäuren
Unter den freien Aminosäuren, die der Honig enthält, dominiert das Prolin mit einem
Mindestgehalt von 66 % und einem durchschnittlichen Gehalt von 80 - 90 %, wobei
der größte Anteil auf Sekretzugabe durch die Bienen zurückzuführen ist. Viele
andere Aminosäuren entstammen dagegen der Tracht. Kap. 3.5.1. behandelt diese
Stoffgruppe ausführlicher, zur Bestimmung von Prolin siehe Kap. 2.3.4.
Proteine
Der Proteingehalt im Honig stammt zum überwiegenden Teil von der Biene, wird
aber auch durch die Tracht mitbestimmt. Er ist dabei von vielen Faktoren abhängig,
zum Beispiel Art der Tracht, Zustand des Bienenvolkes oder der Jahreszeit. Beim
Großteil der Proteine handelt es sich um Enzyme (siehe Kap. 2.2.3.), aber auch
kolloidale Eiweißsubstanzen kommen im Honig vor.
Der Gehalt der Proteine schwankt stark und liegt zwischen 0,01 bis 0,17 % (siehe
dazu auch Kap. 4.7.1.).
IGLESIAS et al. nahmen 2006 chromatographische Proteinuntersuchungen ohne
Berücksichtigung der Enzymaktivitäten vor, um zu zeigen, dass es möglich ist,
anhand der Eiweißprofile eine Unterscheidung zwischen Blüten- und
Honigtauhonigen zu treffen.
15 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
15
2.2.3. Enzyme
Der überwiegende Teil biochemischer Reaktionen in lebenden Organismen wird von
Enzymen gesteuert. Enzyme sind katalytisch wirkende, meist komplex aufgebaute
Proteine. Sie besitzen eine chemisch uneinheitliche Oberfläche, aus der an
verschiedenen Stellen funktionelle Gruppen herausragen. Katalytische Reaktionen
laufen dabei an dem sogenannten aktiven Zentrum, in dem das Enzym mit einem
definierten Substrat reagiert. Dies wird als „Substratspezifität“ bezeichnet. Das
Enzym, welches mit einem Substrat reagiert, bestimmt auch die Art der Reaktion,
was „Wirkungsspezifität“ genannt wird.
Nach dem Vorschlag der Enzyme Commission (EC) der IUPAC (International Union
of Pure and Applied Chemistry) werden die Enzyme nach ihrer Wirkspezifität in
sechs Gruppen eingeteilt: Oxidoreduktasen (Gruppe 1), Transferasen (2),
Hydrolasen (3), Lyasen (4), Isomerasen (5) und Ligasen (6).
Entscheidend für die Enzymaktivität sind der pH-Wert und die Temperatur. Der pH-
Wert beeinflusst die Ionisation funktioneller Gruppen der Aminosäuren und ist häufig
auch Voraussetzung dafür, dass das Substrat als Ion vorliegt, um eine Interaktion mit
dem aktiven Zentrum zu ermöglichen. Extreme pH-Werte können allerdings zu einer
Denaturierung, also einer irreversiblen Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur
der Enzyme führen, womit das Enzym seine katalytischen Fähigkeiten verliert.
Die Temperatur bestimmt die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen. Diese
steigt mit zunehmender Temperatur, so dass die pro Zeiteinheit gebildete Menge des
Produktes erhöht wird. Ab einer bestimmten Temperatur beginnt jedoch auch hier
eine Denaturierung, so dass diese beiden Effekte (Erhöhung der
Reaktionsgeschwindigkeit und Denaturierung) den Bereich des Temperaturoptimums
bestimmen [LEISTNER & BRECKLE (1997)].
Honig enthält eine Reihe von Enzymen, die entweder von der Biene oder von der
Pflanze eingetragen werden können.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 16
16
2.2.3.1. Diastase
Die α-Amylase des Honigs, die sogenannte Diastase, gehört zu der Enzymgruppe
der Hydrolasen und stammt aus dem Kopfdrüsensekret der Bienen. Die Diastase
wird dem Honig während der Reifung zugesetzt. Vermutlich wird dieses Enzym zum
Aufschluss der Pollennahrung herangezogen.
Das Molekulargewicht beträgt 57 kDa [BABACAN & RAND (2005)], das pH-Optimum
liegt im Bereich von 4,6 bis 5,3 und das Temperaturoptimum bei 55 °C [BABACAN &
RAND (2007)].
Diastase erweist sich als relativ wärmeunempfindlich. Die Inaktivierungstemperatur
liegt zwischen 60 und 100 °C. Ist keine Enzymaktivität nachweisbar, so ist dies ein
Indiz für einen unreifen Honig bzw. für eine Verfälschung. Zur Ermittlung der
Diastaseaktivität siehe Kap. 2.3.3.
Es wurde eine Abhängigkeit der Diastaseaktivität von der Honigsorte festgestellt
(siehe dazu Kap. 2.2.3.2.).
2.2.3.2. Saccharase
Das Vorhandensein der Saccharase im Honig wurde erstmals von NELSON &
COHN (1924) erwähnt.
Die Saccharase, auch Invertase genannt, ist eine α-Glucosidase und das Enzym,
welches für die Hydrolyse der Saccharose des Nektars während der Honigreifung
verantwortlich ist. Des Weiteren bewirkt dieses Enzym Transglucosidierungen im
Honig, die unter anderem zum Entstehen des Trisaccharids Erlose führen [WHITE &
MAHER (1953)]. Allerdings weisen auch Zuckerfütterungshonige bei Fütterung mit
Trockenzucker hohe Invertaseaktivitäten auf. Der Grund ist, dass das Angebot des
Hauptnahrungsmittels sehr groß ist und damit die Enzymproduktion der Biene
angeregt wird. Nach etwa 10 Tagen sind die Bausteine der Enzymbildung im
Bienenkörper allerdings erschöpft, so dass die Saccharaseaktivität in dem aus
diesen Zuckern hergestellten Honig wieder sinkt. Somit ist dieses Enzym weniger ein
Parameter für Verfälschung als ein Parameter für den Reifegrad eines Honigs
[BERGNER & HAHN (1972a)].
Das Temperaturoptimum der Saccharase liegt zwischen 40 und 50 °C, der optimale
pH-Bereich bei 6,0 (CHO (1994)].
17 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
17
Gegen Erhitzung ist die Invertase wesentlich empfindlicher als die Diastase. So
beträgt die Halbwertszeit der Saccharase bei 40 °C ca. 10 Tage, während die der
Diastase bei 31 Tagen liegt. Eine Erhitzung auf 60 °C führt schon nach wenigen
Stunden zum vollständigen Aktivitätsverlust. Ein besonders schonend behandelter
Honig wird daher auch eine relativ hohe Saccharasezahl aufweisen [BONHEVI et al.
(2000)]. Allerdings wird die Ausgangsaktivität ebenfalls von der Honigsorte
mitbestimmt. So besitzen beispielsweise Akazienhonige im Allgemeinen niedrige,
Honigtauhonige dagegen hohe Aktivitäten. Es wurde weiterhin eine ungefähre
Korrelation zwischen Diastase- und Saccharaseaktivitäten beobachtet [PERSANO-
ODDO et al. (1999), SERRANO et al. (2007)]. Zur Ermittlung der Saccharaseaktivität
siehe Kap. 2.3.3.
Zum Molekulargewicht (MG) der Saccharase sind in der Literatur unterschiedliche
Angaben zu finden. HUBER & MATHISON gaben 1976 einen Bereich von 51 – 82
kDa an, EDELHÄUSER & BERGNER (1987) ermittelten ein MG von 57 kDa und
CHO (1994) eines von 76 kDa.
2.2.3.3. Glucose-Oxidase
Die Glucose-Oxidase (EC-Nr. 1.1.3.4) gehört zu den Oxidoreduktasen und setzt
Glucose über das Gluconolacton zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um (Abb. 2.2.3.3.a) [DUSTMANN (1971)]. Letzteres besitzt eine keimtötende Wirkung und ist
damit für antibakterielle Effekte des Honigs verantwortlich.
Das pH-Optimum dieses Enzyms liegt bei 6,1, das Temperaturoptimum bei 40 °C
[SCHEPARTZ & SUBERS (1964)]. Das Enzym ist sehr wärme- und lichtempfindlich
[DUISBERG & WARNECKE (1959)], so dass eine unsachgemäße Lagerung zu einer
Abnahme der Aktivität und somit zum Verlust der inhibinen Wirkung führen kann.
Abb. 2.2.3.3.a: Umsetzung von Glucose zur Gluconsäure durch die Glucose-Oxidase
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 18
18
2.2.3.4. weitere Enzyme
Die Katalase ist ein Enzym, welches Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff
zersetzt. Es kann somit die antibakterielle Wirkung der Glucose-Oxidase
abschwächen. Das Vorliegen im Honig ist trachtabhängig, da die Katalase dem
Pollen und Nektar entstammt [DUSTMANN (1971)].
Darüber hinaus wird über das Vorkommen einer sauren Phosphatase vom
Diastase- und Saccharaseaktivität (siehe Kap. 2.3.1. bis 2.3.4.).
Alle gelieferten ungefilterten Honigproben erwiesen sich als unverfälscht und
entsprachen den Vorgaben der Honigverordnung.
Bei den gefilterten Honigen konnten hinsichtlich Zuckerspektrum, 13C-Stabilisotopen-
Analytik, Prolingehalt, pH-Wert, Säuregrad, Wassergehalt und Diastaseaktivität keine
Auffälligkeiten festgestellt werden. Siehe aber hierzu Kap. 4.6.
4.6. Auswirkung einer Filtration auf unterschiedliche Parameter
4.6.1. Sensorik
Zur Beurteilung der sensorischen Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten
Honigproben wurden paarweise Vergleichsprüfungen („Duo-Tests“) nach BUSCH-
STOCKFISCH (2002) durchgeführt. Dabei handelt es sich um attributbezogene
Unterschiedsprüfungen, bei denen der Prüfer jeweils Probenpaare erhält. Die Paare
bestanden aus den ungefilterten Honigen und ihren gefilterten Pendants. Es war
darüber zu befinden, ob sich die Proben anhand der olfaktorischen und
gustatorischen Merkmale differenzieren lassen. Alle gelieferten Honigproben wurden
zu den Untersuchungen herangezogen und von jeweils drei geschulten Prüfern
bewertet.
Die Auswertungen der Prüfungen zeigten, dass gefilterte Honige nur marginale
Unterschiede zu ungefilterten Honigen aufwiesen. Diese fielen auch lediglich im
direkten Vergleich auf.
4.6.2. Elementaranalysen
Analysen der Elemente wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob Reste von
Kieselgur in den gefilterten Honigen wiederzufinden sind. Dazu gehören Silizium,
aber auch charakteristische Metalle wie zum Beispiel Natrium (siehe Kap. 4.3.). Die
Untersuchungen wurden mittels ICP-MS durchgeführt. Es wurden allerdings keine
Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten Honigen festgestellt.
4. Filtration von Honig 54
54
4.6.3. Leitfähigkeit, pH-Wert und Säuregrad
Die analytische Bestimmung der Leitfähigkeit erfolgte nach DIN 10753 (siehe Kap. 2.3.1.), die des pH-Wertes und des Säuregrades potentiometrisch nach DIN 10756
(siehe Kap. 2.3.4.).
In den vergleichenden Untersuchungen stellte sich heraus, dass alle drei Parameter
durch den Filtrationsprozess nicht verändert wurden, so dass eine Differenzierung
gefilterter und ungefilterter Honige über diese Kenngrößen nicht möglich war.
4.6.4. Flavonoide und Phenolcarbonsäuren
Die Überlegung zur Untersuchung dieses Parameters war, dass das bei der Filtration
eingesetzte Kieselgur selektiv Komponenten dieser Substanzgruppen aus dem
Honig entfernen kann.
TRAUTVETTER et al. untersuchten 2006 gefilterte und ungefilterte Honige auf das
Spektrum der Flavonoide und Phenolcarbonsäuren mittels HPLC-DAD nach
Extraktion mit Ethylacetat. Die Ergebnisse zeigten, dass die Gehalte dieser Stoffe
durch eine Filtration keinen Veränderungen unterworfen waren. Die Messungen
erbrachten somit keine Erkenntnisse hinsichtlich einer Unterscheidung gefilterter und
(Disaccharide) sowie Erlose, Melezitose und Maltotriose (Trisaccharide).
Die Zuckerprofile gefilterter und ungefilterter Honige waren nahezu identisch (siehe
Abb. 4.6.6.a).
Abb. 4.6.6.a: Zuckerspektren eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)
4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide
Bei Oligosacchariden handelt es sich um Kohlenhydrate, die aus 3 bis 10
Einzelzuckern bestehen. Darüber hinaus werden sie als Polysaccharide bezeichnet
[FREDE (2006)]. Honige enthalten Anteile an diesen höheren Zuckern zwischen
1 und 3 %.
Ziel war es, zu überprüfen, ob durch Filtration die höheren Saccharide selektiv in
ihren Gehalten gemindert werden. Sie sind größer und haben eine geringere
Zeit Zeit
Signalhöhe Signalhöhe
4. Filtration von Honig 58
58
Polarität als die Monosaccharide. Sie könnten durch das eingesetzte Kieselgur eher
beeinflusst werden.
Diese Zucker sind aufgrund ihrer geringen Gehalte mit der Methode nach DIN 10758
nicht zu erfassen, denn die Honige liegen dabei in einer zu großen Verdünnung vor.
Bei konzentrierteren Honiglösungen, mit denen man die geforderten Gehalte hätte
messen können, bestand jedoch das Problem, dass durch die großen Anteile von
Fructose und Glucose im Honig die HPLC-Säule überladen würde. Somit war die
Aufgabe, diese beiden Monosaccharide abzutrennen und die größeren Zucker
anzureichern, so dass deren Bestimmung gelingen kann.
Als Ansatz für die Methodenentwicklung diente eine Applikation von LIPP et al.
(1988), die ein Verfahren zum Nachweis von Glucose- und Hochfructosesirupen in
Honig vorstellten. Sie fraktionierten die Saccharide im Honig mittels einer
Kieselgur/Aktivkohle-Mischung, wobei zunächst die kleinen Zucker mit 7%- und
10%igem Ethanol von der Säule gewaschen wurden. Die Oligosacharide wurden mit
50%igem Ethanol eluiert, wobei man sich die unterschiedliche Löslichkeit der
Zuckerbausteine in Alkohol zunutze machte. Diese Fraktion wurde anschließend zur
Ionenaustausch-HPLC verwendet.
Die Methode wurde derart modifiziert, dass zunächst eine gelchromatographische
(GPC-) Trennung der Honigzucker an Fractogel TSK HW-40 (S) ® der Firma Merck
erfolgte. Als Eluent diente bidestilliertes Wasser, die Peakerfassung wurde mittels RI-
Detektion vorgenommen. Zunächst eluierten dabei die größeren Zucker vor den
kleineren (Chromatogramm siehe Abb. 4.6.6.1.a). Der Vorteil dieser Methode ist,
dass die Oligosaccharide mit der GPC nahezu quantitativ separiert werden und mit
kleinen Einzelfraktionen eine genauere Trennung von den Monosacchariden
vorgenommen werden kann. Glucose und Fructose können bei den Honigen zwar
nicht vollständig abgetrennt werden, die Konzentrationen dieser beiden
Kohlenhydrate in den Fraktionen waren jedoch so gering, dass die analytische
Bestimmung der größeren Zucker gelingen konnte.
Die Eluate, in denen sich die höheren Zucker befanden, wurden isoliert und
zusammengeführt. Nach Aufkonzentrierung wurde die Probe zur analytischen HPLC
eingesetzt.
59 4. Filtration von Honig
59
Abb. 4.6.6.1.a: GPC-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs. In den Fraktionen 5 und 6 befinden sich die Oligosaccharide.
Die analytische Trennung dieser Fraktionen erfolgte an einer Ionenaustauschersäule
mit einer wässrigen NaOH/NaAc-Lösung als Eluenten in einem isokratischen
System. Das Prinzip beruht darauf, dass Kohlenhydrate als schwache Säure (pK-
Werte zwischen 12 und 14) bei hohem pH-Wert mindestens zum Teil ionisiert sind
und sich somit mit Natronlauge/Acetatpuffer an einem Latex-Anionentauscher
trennen lassen. Dabei kam die gepulste amperometrische Detektion zum Einsatz, bei
der die Zucker an einer Goldelektrode oxidiert werden [DIONEX CORPORATION
(2005)].
Als Vergleichsstandards dienten Maltooligosaccharide, also Kohlenhydrate mit
definierten Mengen an unterschiedlichen Glucosebausteinen (Abb. 4.6.6.1.b).
Es ist mit dieser Methode möglich, in einem HPLC-Lauf Honigzucker zu trennen, die
zwischen 3 und 9 Monosaccharid-Einheiten enthalten. Die genaue Durchführung der
Methode ist in Kap. 5.2.3.1. beschrieben.
Ziel dieser Untersuchungen war es, eine Differenzierung gefilterter und ungefilterter
Honige mit Hilfe der Oligosaccharid-Chromatogramme zu erarbeiten. Nach der
Aufnahme von Oligosaccharid-Profilen verschiedener Honige vor und nach Filtration
konnte nicht bestätigt werden, dass signifikante Veränderungen durch den
4. Filtration von Honig 60
60
Filtrationsprozess eintreten. Die Gehalte an größeren Zuckern variierten, wie auch
die an den Mono- und Disacchariden, nur in einem geringen Bereich (Abb. 4.6.6.1.c, d). Aus diesem Grund wurde keine genaue Identifizierung einzelner Oligosaccharide
in den Honigproben vorgenommen.
Abb. 4.6.6.1.b: Chromatogramm der analytischen HPLC einer Maltooligosaccharid- Standardmischung Retentionszeiten: 3.67 Maltotriose (3 Glucose-Einheiten, G3)
Abb. 4.6.6.1.c: Oligosaccharid-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs
Zeit
Zeit
Signalhöhe
Signalhöhe
61 4. Filtration von Honig
61
Abb. 4.6.6.1.d: Oligosaccharid-Chromatogramm des gefilterten Kleehonigs
4.6.7. HMF-Gehalt
Die Bestimmung der Gehalte an Hydroxymethylfurfural erfolgte mittels HPLC nach
DIN 10751-3.
Sämtliche Proben wiesen nach einer Filtration deutliche Erhöhungen in den HMF-
Konzentrationen auf (Abb. 4.6.7.a und b). Der in der Honigverordnung festgelegte
Grenzwert von 40 mg/kg wurde jedoch in keinem der Fälle überschritten.
HMF ist ein Produkt der Maillard-Reaktion und gilt als Parameter für eine
Wärmeschädigung von Honig (siehe Kap. 2.3.3.). Da Honig vor der eigentlichen
Filtration kurzzeitig erhitzt wird (vergleiche Kap. 4.3.), lag die Vermutung nahe, dass
damit der Anstieg der HMF-Konzentrationen zu erklären war. Um dies zu belegen,
wurden daraufhin ungefilterte Honigproben mit bekannten HMF-Gehalten im Labor
für 5 Minuten in einen Trockenschrank (80 °C) gestellt und anschließend auf die
HMF-Konzentrationen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass derartige
Bedingungen zu einer Erhöhung von HMF führen (Abb. 4.6.7.c).
Für eine Differenzierung von gefiltertem und ungefiltertem Honig ist HMF nicht
geeignet, denn auch bestimmte Transport- und Lagerungsbedingungen können zu
einem Ansteigen der Konzentrationen führen und sind nicht allein durch einen
vorherigen Filtrationsprozess zu erklären.
Zeit
Signalhöhe
4. Filtration von Honig 62
62
Abb. 4.6.7.a: HMF-Chromatogramme eines ungefilterten (links) und eines gefilterten amerikanischen Kleehonigs
Abb. 4.6.7.b: HMF-Gehalte verschiedener Honigproben vor und nach Filtration
Zeit Zeit
Signalhöhe Signalhöhe
HMF
HMF
Signalhöhe
63 4. Filtration von Honig
63
Abb. 4.6.7.c: HMF-Gehalte verschiedener Honige vor und nach Erhitzung (5 min. auf 80 °C)
4.6.8. Mikroskopische Untersuchung
Die mikroskopische Untersuchung wurde nach LOUVEAUX et al. (1970)
durchgeführt.
Nach einer Filtration waren erwartungsgemäß keine Pollen mehr zu sehen, denn die
verwendete Porengröße können sie nicht passieren (vergleiche Kap. 4.3.).
Der Gehalt an Hefezellen war nach einer Filtration deutlich geringer als vorher.
Offensichtlich wird durch den Prozess ein großer Anteil entfernt. Möglich sind auch
eine komplette Abtrennung der Hefezellen und eine erneute Vermehrung während
des Transports und der Lagerung, wenn wieder Hefezellen in die Honige gelangen.
So wäre dann das Vorhandensein von Hefen auch nach der Filtration zu erklären.
Pilzsporen waren in den meisten Honigen nicht detektierbar. Durch die Filtration wird
ihre Anzahl nur marginal reduziert. Die Größen von Pilzsporen und Hefezellen sind
sehr variabel und liegen im Allgemeinen zwischen 3 und 15 µm [MÜLLER & WEBER
(1996)].
In wenigen Honigen waren vor der Filtration Stärkekörner mikroskopisch
nachweisbar, bei sämtlichen gefilterten Proben jedoch nicht.
4. Filtration von Honig 64
64
Auch größere Partikel, die keinen Honigbestandteilen zugeordnet werden konnten,
waren nach Filtration nicht mehr im Honig vorhanden. Dies gilt gleichermaßen für
Reste des Filterhilfsmittels Kieselgur.
Für eine Differenzierung ist eine mikroskopische Untersuchung zwar geeignet, ein
Nachweis von Mischungen gefilterter und ungefilterter Honige ist allerdings nicht
möglich.
4.6.9. Enzymaktivität der Diastase
Die Untersuchung der Diastaseaktivität erfolgte photometrisch nach Schade (DIN
10750) (siehe Kap. 2.3.3.).
Es wurde bei sämtlichen Proben eine Abnahme der Diastaseaktivität festgestellt. Die
Minderung betrug allerdings lediglich zwischen 5 und 15 % (Abb. 4.6.9.a), was für
eine präzise Abgrenzung gefilterter und ungefilterter Honige nicht ausreichend ist.
Abb. 4.6.9.a: Veränderungen der Diastaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten
65 4. Filtration von Honig
65
4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase
Die Bestimmung der Saccharaseaktivität wurde photometrisch nach Siegenthaler
(DIN 10759-1) durchgeführt und wird als Hadorn-Zahl ausgedrückt (siehe Kap.
2.3.3.).
Die Enzymaktivitäten der Saccharase waren nach Filtration deutlichen
Veränderungen unterworfen. Diese wurden bei allen Proben auf ein Minimum
abgesenkt, die Verluste lagen zumeist bei mehr als 90 % (Abb. 4.6.10.a).
Im Vergleich zu den Diastaseaktivitäten waren die Unterschiede vor und nach
Filtration hier zwar beträchtlich, trotzdem gestaltete sich eine eindeutige
Differenzierung in Mischungen schwierig, da die Saccharase wärmeempfindlich ist
(vergleiche Kap. 2.2.3.2.) und die Aktivitäten somit auch durch andere äußere
Faktoren beeinflusst werden können.
Abb. 4.6.10.a: Veränderungen der Saccharaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten
4. Filtration von Honig 66
66
4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche
Von den analytischen Parametern kamen nur wenige in Frage, mit denen man
gefilterten und ungefilterten Honig hätte unterscheiden können. Veränderungen
waren im mikroskopischen Bild, beim HMF-Gehalt und bei den Enzymaktivitäten von
Diastase und Saccharase zu beobachten.
Mischungen von gefilterten und ungefilterten Honigen ließen sich indes mit Hilfe
dieser Kenngrößen nicht feststellen, denn dazu waren entweder die Abweichungen
zu gering oder die Parameter zu sehr von weiteren Gegebenheiten beeinflussbar.
Theoretisch wäre es möglich, eine Differenzierung über die Enzymaktivitäten
vorzunehmen: Während die Aktivität der Diastase nach Filtration nur schwach
abnahm, erfuhr die der Saccharase große Verluste. Da jedoch die Aktivitäten beider
Enzyme in ungefilterten Honigsorten sehr stark schwankten, gelang dies nicht.
Allerdings erschien eine eingehendere Untersuchung der Proteine hinsichtlich eines
Nachweises sinnvoll, da es sich bei beiden Enzymen um Eiweissstoffe handelt und
beide durch den Filtrationsprozess unterschiedlich beeinflusst werden.
4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration
Die Beobachtungen, dass die Enzymaktivitäten im Honig nach einer Filtration
abnehmen, führten zu der Fragestellung, ob Enzyme durch den Prozess denaturiert
oder aus dem Honig entfernt wurden. Wäre ersteres der Fall, lägen sie nach
Filtration weiterhin mindestens zum Teil vor, und es könnte sich eine eingehendere
Untersuchung anschließen.
Da die Enzyme überwiegend aus Eiweißstoffen bestehen, sollte eine Bestimmung
des Gesamtproteingehaltes im Honig Aufschluss über diese Fragestellung geben.
Nimmt der Proteingehalt nach Filtration deutlich ab, werden Eiweiße aus dem Honig
herausfiltriert. Wären nur schwache oder gar keine Verluste zu beobachten, sollten
die Enzyme weiterhin, mindestens zu einem Teil in denaturierter Form, im Honig
vorhanden sein.
67 4. Filtration von Honig
67
Abb. 4.7.1.a: Struktur von Coomassie Brillant Blue G-250
4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen
In der Literatur werden verschiedene Methoden zur Messung von Eiweißgehalten in
Honig vorgeschlagen. BOGDANOV verglich 1981 quantitative Methoden zur
Proteinbestimmung von KJEDAHL (1883), LUND (1910), LOWRY et al. (1951) und
der Biuret-Methode mit der Methode nach BRADFORD (1976).
Die Bestimmung nach Bradford hat sich danach als sehr geeignet für die Matrix
Honig erwiesen. Die alternativen Methoden sind entweder für die Routine zu
aufwändig oder liefern aufgrund der sehr geringen Proteingehalte des Honigs nur
ungenaue Ergebnisse.
Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf der unspezifischen Bindung des
Farbstoffes Coomassie Brillant Blue G-250 (Abb. 4.7.1.a) an kationische und
unpolare hydrophobe Seitenketten der Aminosäuren (vor allem Arginin). Diese
Substanz besitzt zwar eine höhere Nachweisgrenze für Proteine als R-250 (Abb. 4.7.1.b), färbt diese aber deutlich schneller und wird deshalb bevorzugt für den
Bei der ungebundenen (kationischen), rötlich gefärbten Form des Stoffes liegt das
Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird die
Substanz in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform stabilisiert, und
das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf ein Maximum bei 595 nm. Da der
Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes sehr viel höher ist als der des
freien Farbstoffes, kann die Zunahme der Absorption durch die Bildung des
Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegenüber der Absorption des freien
Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist somit ein Maß für die
Proteinkonzentration der Lösung [REISNER et al. (1975)].
Abb. 4.7.1.b: Struktur von Coomassie Brillant Blue R-250 (besitzt 2 Methylgruppen weniger)
4. Filtration von Honig 68
68
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5 10 15 20 25 30
Standardkonzentration BSA [µg/ml]
Abso
rptio
n
Abb. 4.7.1.c: Eichgerade für die Proteinbestimmung nach Bradford mit BSA
Der Bildungsprozess des Komplexes verläuft sehr schnell (ca. 2 min.) und hält
vergleichsweise lang an (mehr als eine Stunde) [AZEREDO et al. (2003)], wodurch
viele Proben zunächst gleichzeitig aufgearbeitet und danach zusammen gemessen
werden können. Coomassie Brillant Blue G-250 hat neben der Spezifität für Protein-
Peptid-Bindungen den Vorteil, dass es von Pufferchemikalien und reduzierenden
Stoffen kaum gestört wird. Die Methode versagt allerdings, wenn in der
Proteinlösung Substanzen enthalten sind, die in stark phosphorsauren Lösungen
grobflockige Niederschläge bilden (z. B. Detergenzien wie Desoxycholat). Störungen
des Tests werden auch durch andere Tenside wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und
Triton X-100 verursacht. Da Honig derartige Substanzen nicht enthält und diese in
der Applikation auch nicht zu Einsatz kommen, ist die Bradford-Methode zur
Messung der Proteinkonzentrationen in Honig geeignet.
Die verdünnte Honiglösung (1:40 mit Wasser) wurde mit G-250 versetzt, welches in
ethanolischer Phosphorsäure gelöst war, anschließend wurde die Absorption bei
595 nm gemessen. Zur Kalibrierung wurde eine Eichgerade mit BSA (Bovine Serum
Albumine) erstellt (Abb. 4.7.1.c).
Die Ergebnisse ergaben, dass der Proteingehalt der Honige zwischen 0,01 und
0,07 % variierte. Die geringsten Konzentrationen wurden in Akazienhonigen ermittelt;
sie lagen in der Regel unter 0,02 %. Lediglich Wald- (bis 0,1 %) und vor allem
Heidehonige (bis 0,17 %) wiesen deutlich höhere Konzentrationen auf (siehe Abb.
69 4. Filtration von Honig
69
4.7.1.c). Dies entsprach Gehalten, die auch in der Literatur publiziert worden waren
und ebenfalls mit der Bradford-Methode ermittelt worden waren [BOGDANOV
(1981), AZEREDO et al. (2003)]. Die in den genannten Arbeiten beschriebenen
außergewöhnlich hohen Werte für Heidehonige konnten somit ebenfalls bestätigt
werden.
Einfluss der Filtration
Um den Einfluss einer Filtration auf die Proteinkonzentrationen von Honig zu
dokumentieren, wurden Honigproben vergleichend vor und nach Filtration auf ihre
Proteingehalte untersucht. Anhand der Vergleichsmessungen war zu beobachten,
dass nach einer Filtration maximal 10 % der Eiweißstoffe verloren gehen (Abb. 4.7.1.c). Bei gefilterten Honigen war also noch ein großer Anteil der Proteine
vorhanden, daher konnten im nächsten Arbeitsschritt weitergehende Enzym- und
Proteinuntersuchungen durchgeführt werden.
Abb. 4.7.1.c: Proteinkonzentrationen verschiedener Honigsorten vor und nach Filtration
4. Filtration von Honig 70
70
4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme
Gelchromatographie (GPC), die auch als Gelpermeationschromatographie,
Gelfiltration oder Ausschlusschromatographie bezeichnet wird, ist die Bezeichnung
für eine als Säulenchromatographie durchgeführte Flüssigkeitschromatographie. Die
stationäre Phase besteht aus einem heteroporösen gequollenen Netzwerk (zum
Beispiel vernetztes Polyacrylamid oder Polystyrol), dessen Porengrößenverteilung
über mehrere Größenordnungen variiert. Die Fraktionierung erfolgt nach
Molekülgröße (Molekularsieb-Effekt). Eine Lösung des zu untersuchenden Polymers
wird durch das Gel gegeben, wobei kleinere Moleküle in alle Poren eindringen
können und ihnen daher das gesamte Volumen der mobilen Phase in der Trennsäule
zur Verfügung steht. Folglich werden sie länger in der Säule zurückgehalten als die
größeren Moleküle [YAU et al. (1979)].
Mittels GPC lassen sich demnach auch Proteine und Enzyme trennen, so dass es
sinnvoll erschien, für diesen Schritt auf eine solche Applikation zurückzugreifen. Ziel
war es, ein möglichst breites Spektrum von Proteinen und Enzymen des Honigs zu
erhalten, um zu überprüfen, ob bestimmte Substanzen aus dieser Gruppe durch eine
Filtration mehr beeinflusst werden als andere, so wie das schon bei den Aktivitäten
der Diastase und der Saccharase beobachtet worden war. In der GPC würde sich
dies dadurch ausdrücken, dass sich die Korrelationen von Peaks im
Chromatogramm nach Filtration im Vergleich zu denen ungefilterter Honige deutlich
verschieben würden.
Als Grundlage diente eine Methode von BERGNER & DIEMAIR (1975), die schon
auf ähnliche Weise Enzyme des Honigs isolieren konnten. Nach der Anreicherung
mittels Dialyse (48 h) erfolgte dort die Chromatographie an Sephadex G-200-Gel,
womit viele Proteine getrennt werden konnten, jedoch Diastase und Saccharase
zusammen in einem Peak eluierten. Ein Lauf dauerte dabei 24 - 28 h. Die
Abtrennung der Diastase gelang anschließend unter Verwendung von hydrophober
Bei der Methodenentwicklung für diese Arbeit fiel die Wahl des Gels für die
Chromatographie auf Toyopearl HW-55S ® der Firma Tosoh Bioscience. Es handelt
sich dabei um ein modifiziertes Methacrylat-Copolymer mit einer Partikelgröße von
71 4. Filtration von Honig
71
30 µm. Die Porengröße beträgt 500 Å und die Ausschlussgrenze für Moleküle
150 kDa. Dies erschien ausreichend, da das größte im Honig bekannte
vorkommende Enzym, die Glucose-Oxidase, ein Molekulargewicht von 120 kDa
aufweist (vergleiche Kap. 2.2.3.3.). Die Partikel besitzen eine schwach polare
Oberfläche und lassen somit zusätzlich eine geringe Retention aufgrund
hydrophober Wechselwirkungen zu, was die Trennung von Diastase und Saccharase
begünstigen sollte.
Eine Aufkonzentrierung der Honigproben vor der Chromatographie war aufgrund der
geringen Proteinkonzentrationen notwendig (vergleiche Kap. 4.7.1.). Dazu wurden
Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäße der Firma Sartorius eingesetzt (Abb. 4.7.2.a), die als
Zentrifugalkonzentratoren bezeichnet werden. Diese fassen ein Probenvolumen von
20 ml und besitzen eine Membran mit einem MWCO („Molecular Weight Cut-Off“)
von 10 kDa. Das heißt, Substanzen, die ein höheres Molekulargewicht als 10 kDa
haben, werden von der Membran zurückgehalten. Die Abtrennung der Proteine und
anderer größerer Komponenten von der Matrix erfolgte mittels Zentrifugation (20 –
30 min., abhängig von der Honigsorte) bei 4000 U/min. 20 ml der Honiglösung (1:1
mit Wasser) wurden dabei auf 3 ml eingeengt. Anschließend wurde das Gefäß
zweimal mit je 1 ml Wasser nachgespült. Es resultierte somit ein Volumen von 5 ml,
was eine Anreicherung um den Faktor 4 bedeutete. Dieses Retentat mit den
abgetrennten Proteinen wurde für die GPC eingesetzt. Die Probenschleife der GPC
betrug 2 ml, so dass mit jeder Probe zwei Injektionen möglich waren.
Als Eluent für die Gelchromatographie diente ein Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,0),
detektiert wurde bei λ = 280 nm, da Proteine bei dieser Wellenlänge ein
Absorptionsmaximum aufweisen. Die Flussrate betrug 2 ml/min.
Abb. 4.7.2.a: Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäß
(„Zentrifugalkonzentrator“)
4. Filtration von Honig 72
72
4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme Zunächst wurden Enzymstandards von Diastase, Saccharase und Glucose-Oxidase
chromatographiert. Die kommerziell erhältliche Saccharase (EC 3.2.1.26), die
üblicherweise aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae gewonnen wird, entspricht
jedoch nicht dem Typ, der im Honig vorkommt. Bei der Honigsaccharase handelt es
sich um eine α-Glucosidase (vergleiche Kap. 2.2.3.2.), während es sich bei
käuflichen Standards um β -Fructosidasen handelt, die also bei der Spaltung der
Saccharose die Fructose-Seite angreifen. Aus diesem Grund lässt sich deren
Enzymaktivität auch nicht mit der Siegenthaler-Methode (siehe Kap. 2.3.3.)
bestimmen [EDELHÄUSER (1983)].
Der Grund, dieses Enzym trotzdem einzusetzen, war, dass es ein Molekulargewicht
270 kDa besitzt und somit in der Säule nicht zurückgehalten wurde, da Moleküle, die
größer als 150 kDa sind, nicht in die Poren des Gels eindringen können (vergleiche
Kap. 4.7.2.). Dies diente somit als ein Parameter für die Qualität der Trennung, da es
noch vor der Glucose-Oxidase eluieren sollte. Weiterhin ließ sich damit zusätzlich die
Totzeit ermitteln, also die Zeit, die die mobile Phase braucht, um das
chromatographische System von der Injektion bis zur Detektion zu durchlaufen.
Es wurde zusätzlich eine Mischung von Glucose, Fructose und Saccharose in
Wasser vermessen. Diese Substanzen absorbieren sehr schwach bei 280 nm, in
hoher Konzentration können sie aber trotzdem erfasst werden. Um ein ausreichend
großes GPC-Signal zu erhalten, wurden Konzentrationen von je 1,5 g Glucose und
Fructose bzw. 0,3 g Saccharose in 20 ml hergestellt.
Aufgrund der geringen Größe der Saccharide im Vergleich zu den Proteinen war zu
erwarten, dass nach den Zuckern keine Makromoleküle mehr eluieren. Somit konnte
der Elutionsbereich der Eiweißfraktion der Honige im Chromatogramm eingegrenzt
werden.
In Abb. 4.7.2.1.a ist ein Chromatogramm einer Mischung von Saccharase, Glucose-
Oxidase, Diastase, Glucose, Fructose und Saccharose in Wasser abgebildet. Es
zeigte sich, dass die einzelnen Enzyme unter diesen Bedingungen voneinander und
von den Zuckern getrennt werden konnten. Das Peakmaximum der Saccharase lag
bei 10 min., das der Glucose-Oxidase bei 22 min., das der Diastase bei 33 min. Die
Zucker wurden hingegen erst zwischen der 40. und 50. min. eluiert.
73 4. Filtration von Honig
73
Abb. 4.7.2.1.a: GPC-Chromatogramm von Saccharase (S), Glucose-Oxidase (G), Diastase (D) und den Zuckern Glucose, Fructose und Saccharose (Z) und die jeweiligen Konzentrationen in wässriger Lösung
Bei den Honigen wurden zunächst die nach 4.7.2. hergestellten Konzentrate
ungefilterter Proben chromatographiert. Die GPC-Chromatogramme eines Klee- und
eines Akazienhonigs sind in Abb. 4.7.2.1.b und c dargestellt.
Abb. 4.7.2.1.b: GPC-Chromatogramm eines amerikanischen Kleehonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)
S G
D Z
Komponente Konzentration in H2O Saccharase 10 mg/25 ml
Glucose-Oxidase 5 mg/25 ml Diastase 20 mg/25 ml Glucose 1,5 g/25 ml Fructose 1,5 g/25 ml
Saccharose 0,3 g/25 ml
Z
4. Filtration von Honig 74
74
Abb. 4.7.2.1.c: GPC-Chromatogramm eines rumänischen Akazienhonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)
Zunächst wurde entsprechend der Standards auch bei den Honigen die Enzym- bzw.
Proteinfraktion eingegrenzt, indem die Retentionszeit der Zucker bestimmt wurde.
Das mutmaßliche zwischen ca. 40 - 50 min. auftretende Signal wies eine ähnlich
charakteristische Form auf wie der Standard von Glucose, Fructose und Saccharose
(leichtes Tailing) (vergleiche Abb. 4.7.2.1.a). Zur Bestätigung wurden die einzelnen
Peaks isoliert und mittels HPLC auf die Zuckerprofile untersucht (vergleiche Kap. 2.3.1.). Die Signale nach 40 - 50 min. zeigten Zuckerprofile, welche den jeweils
reinen Honigen entsprachen, während in den weiteren Fraktionen keine Zucker
gemessen wurden. Somit entsprach der Elutionsbereich von Zucker-
Standardlösungen dem von realen Honiglösungen.
Die GPC-Chromatogramme aller Honige wiesen vor den Zuckern vier Peaks auf. Es
galt nun, die jeweiligen Enzymaktivitäten zu identifizieren. Dazu wurden die
einzelnen Signale mittels Fraktionssammler aufgefangen und nach Einengen mit
Vivaspin 20 - 10.000 ® jeweils die Aktivitäten von Saccharase, Diastase und Glucose-
Oxidase untersucht. Dabei kamen die Methoden nach Kap. 2.3.3. zum Einsatz. Die
Bestimmung der Aktivität der Glucose-Oxidase wurde mit Hilfe von Peroxid-
Teststäbchen vorgenommen, jedoch gelang damit lediglich eine qualitative Aussage
Tab. 4.7.2.1.e: Aktivitäten von Saccharase und Diastase des Klee- und des Akazienhonigs aus Abb. 4.7.2.1.b bzw. c
Abb. 4.7.2.1.d zeigt beispielhaft die Fraktionierung des Kleehonigs aus
Abb. 4.7.2.1.b und die Enzymaktivitäten der jeweiligen Peaks (Tabelle). Die
Aktivitäten der Diastase sind in Schade-Einheiten, die der Saccharase als Hadorn-
Zahlen angegeben.
Abb. 4.7.2.1.d: Chromatogramm des Kleehonigs (vergl. Abb. 4.7.2.1.b): Fraktionierung der Proteinsignale 1 - 4 (blaue Striche) (Z = Zuckerpeak) und die Ergebnisse der Untersuchungen der Enzymaktivitäten in den einzelnen Fraktionen Die Glucose-Oxidase konnte demnach dem Peak Nr. 2 zugeordnet werden. Die
Retentionszeit stimmte mit der des Standards überein (siehe Abb. 4.7.2.1.a).
Gleiches galt für die Diastase: Peak Nr. 4 zeigte eine hohe Aktivität, und das
Peakmaximum lag bei dem des Standard-Enzyms.
Die Saccharase konnte aufgrund der Aktivität dem Peak Nr. 3 zugeordnet werden.
Peak Nr. 1 zeigte keine Aktivität für eines der drei Enzyme.
Weiterhin war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen den Signalhöhen von
Diastase und Saccharase im GPC-Chromatogramm und den korrespondierenden
Enzymaktivitäten der ursprünglichen Honige zu erkennen. Honige mit hohen
Aktivitäten wiesen entsprechend große Signale auf, bei geringen Aktivitäten fielen
diese kleiner aus. Dies ist beispielhaft in Tab. 4.7.2.1.e dargestellt.
Es war bei den Chromatogrammen bereits optisch zu erkennen, dass mit der
Methode keine Basislinientrennung aller Komponenten erreicht wurde. Die Verteilung
der Enzymaktivitäten von Diastase und Saccharase bei den Peaks Nr. 2 - 4 belegte
dies, denn deren Aktivitäten waren über jeweils drei Signale verteilt.
Es kam folglich zu leichten Überlagerungen von Glucose-Oxidase, Saccharase und
Diastase. Es war ebenso nicht auszuschließen, dass zusätzliche Komponenten zu
weiteren Überlagerungen führten.
Die Trennung wurde aber als ausreichend befunden, um Differenzen zwischen
gefilterten und ungefilterten Honigen anhand von GPC-Chromatogrammen
feststellen zu können.
4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige
Im nächsten Schritt wurden gefilterte Honige gemessen und die Chromatogramme
mit denen der ungefilterten Proben verglichen. In Abb. 4.7.2.2.a sind als Beispiel die
Chromatogramme des ungefilterten Kleehonigs aus Abb. 4.7.2.1.b und des
gefilterten Analogons gegenübergestellt.
Abb. 4.7.2.2.a: GPC-Chromatogramme des ungefilterten (links) und des gefilterten Kleehonigs (rechts) (G = Glucose-Oxidase, S = Saccharase, D = Diastase, Z = Zucker)
Dabei war vor allem die verhältnismäßig starke Abnahme jenes Peaks auffällig,
welcher der Saccharase zugeordnet werden konnte, während sich die Größe des
Diastase-Peaks nur wenig verändert hatte. Dies bestätigte die Beobachtungen der
Analytik der Enzymaktivitäten (siehe Kap. 4.6.8. und 4.6.9.). Auch weitere Signale
waren nach Filtration deutlich reduziert, wohingegen bei den Peaks, die hinter den
Proteinen auftraten, kaum Verschiebungen zu beobachten waren.
Z
D
S
G
D
S
G
Z
77 4. Filtration von Honig
77
Diese Beobachtungen bestätigten sich nach Vergleichsuntersuchungen von
insgesamt 20 gefilterten und ungefilterten Honigproben.
Bei einer Minderung der Saccharaseaktivität von 90 % (vergleiche Kap. 4.6.9.) nach
Filtration sollte jedoch auch die Reduzierung des entsprechenden Signals in der
GPC wesentlich ausgeprägter sein. Die Abnahme fiel dafür jedoch zu gering aus.
Dies kann zwei Ursachen haben. Eine Erklärung wäre, dass die Saccharase nach
Filtration zwar inaktiv ist, wenn zum Beispiel die Quartärstruktur des Proteins
verändert wäre, das Enzym aber als solches noch vollständig vorhanden ist. Somit
würde das Molekulargewicht und damit auch der Peak in der GPC unverändert
bleiben. Ein weiterer Grund kann eine Überlagerung der Saccharase mit anderen
Proteinen bzw. Makromolekülen sein.
4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC Die gelchromatographische Methode zur Trennung von Honigenzymen von
BERGNER & DIEMAIR bzw. BERGNER & SABIR (siehe Kap. 4.7.2.) wurde
hinsichtlich Dauer und Trennschärfe optimiert. Saccharase und Diastase konnten in
einem Lauf getrennt werden. Der Zeitraum einer Messung wurde von mehr als 24 h
auf 90 min. reduziert, der der Probenvorbereitung (Aufkonzentrierung) sogar von
48 h auf maximal 30 min. Somit konnte bei gleichem apparativem Aufwand eine
Vielzahl von Proben vergleichsweise schnell gemessen werden.
Die Gelchromatographie von ungefilterten Honigen zeigte, dass in der Fraktion der
Proteine und Enzyme, also vor den Zuckern, vier Peaks im Chromatogramm
auftraten, von denen drei den Enzymen Glucose-Oxidase, Saccharase und Diastase
zugeordnet werden konnten. Allerdings traten Koelutionen weiterer Makromoleküle
auf.
Untersuchungen filtrierter und nicht filtrierter Honige ergaben, dass mit dieser
Analysentechnik prinzipiell Unterschiede herausgestellt werden konnten. Mittels
direkter Vergleiche der Chromatogramme konnten gefilterte und ungefilterte Proben
differenziert werden. Allein aufgrund der unterschiedlichen Signalhöhen in den
Chromatogrammen ließ sich jedoch eine Filtration noch nicht beweisen, vor allem
4. Filtration von Honig 78
78
nicht in Mischungen, denn ungefilterte Honige mit natürlichen geringen
Enzymaktivitäten hätten kleinere Signale aufweisen können als gefilterte Honige,
deren Aktivitäten vor Filtration sehr hoch waren.
Da das Signal der Saccharase bei gefilterten Honigproben allerdings deutlich
weniger reduziert wurde, als es die Messungen der Enzymaktivitäten erwarten
ließen, war zu vermuten, dass dieses Enzym noch weiterhin im Honig vorhanden
war. Es sollte nun aufbauend auf diesen Erkenntnissen eine Methode etabliert
werden, mit der das Proteinspektrum der Saccharase dargestellt wird. Es konnte
angenommen werden, dass so Unterschiede vor und nach Filtration signifikanter
herausgearbeitet werden könnten. Als geeignete Methode wurde die Elektrophorese
ausgewählt.
4.7.3. Elektrophorese
Die zwei wichtigsten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Proteine, nämlich
Molekülgröße und Ladungszustand, werden überwiegend zu ihrer Trennung und
Charakterisierung verwendet, wobei elektrophoretische Trennmethoden eine
wichtige Stellung einnehmen.
Unter dem Begriff Elektrophorese werden Trennverfahren zusammengefasst, die die
Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Gleichstromfeld ausnutzen.
Man unterscheidet trägerfreie und trägergebundene Elektrophoresesysteme, wobei
die trägergebundenen Systeme weit mehr verbreitet sind. Die wichtigsten
Trägermaterialien für die sogenannte Gelelektrophorese sind unter anderem Stärke,
Agarose sowie Polyacrylamid, wobei letzteres weitaus am meisten für die
Gelelektrophorese von Proteinen verwendet wird. Die Polyacrylamid-
Gelelektrophorese wird als „PAGE“ abgekürzt. Bei der Gelelektrophorese werden die
einzelnen Substanzen nicht durch ihre unterschiedlichen Ladungen getrennt,
sondern durch einen Siebeffekt des Gels aufgrund der unterschiedlichen Größe und
Gestalt des Probenmaterials. Der Siebeffekt eines Polyacrylamidgels hängt von der
Porengröße ab, welche sich exakt und reproduzierbar verändern lässt.
Standardmäßig wird die SDS-PAGE zur Trennung von Proteingemischen eingesetzt.
SDS („Sodium dodecyl sulfate“) ist ein anionisches Detergenz, welches die
79 4. Filtration von Honig
79
Eigenladung von Proteinen so effektiv überdeckt, dass Micellen mit konstanter
negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen (1,4 g SDS pro 1 g Protein). Bei der
Probenvorbereitung werden die Proben mit einem Überschuss von SDS auf 95 °C
erhitzt und so die Sekundär- und Tertiärstrukturen durch Aufspalten der
Wasserstoffbrücken und durch Streckung der Moleküle aufgelöst.
Disulfidbrückenbindungen werden durch Zugabe einer reduzierenden
Thiolverbindung, zum Beispiel β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT),
aufgespalten (Auflösen der Quartärstruktur). Dadurch wird gewährleistet, dass nur
die molare Masse des Proteins als Trennkriterium wirkt. Bei der SDS-Elektrophorese
wandert der SDS-Protein-Komplex im elektrischen Feld zum Plus-Pol [KLEINERT
(1990), SCHWEDT (1992)].
Üblichweise wird zur Bestimmung von Polypeptiden und Proteinen die Methode nach
LAEMMLI (1970) in einem diskontinuierlichen Tris-HCl/Tris-Glycin Puffersystem
genutzt (Tris: Tris(hydroxymethyl-)aminomethan). Ein weitporiges Sammelgel (Tris-
Es war folglich mittels dieser Analysentechnik möglich, filtrierte und unfiltrierte
Honige optisch eindeutig zu differenzieren.
4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen
Im nächsten Schritt sollte durch Zumischversuche geklärt werden, ob die 65 kDa-
Bande schwächer wird, je mehr filtrierter Honig im Erzeugnis vorhanden ist. Dazu
wurden gefilterte und ungefilterte Honige in bestimmten Verhältnissen vermengt und
die resultierenden Proben auf die gleiche Weise untersucht.
Ein Beispiel dieser Zumischversuche ist in Abb. 4.7.3.3.a exemplarisch
dokumentiert. Hier wurde einem naturreinen Kleehonig vor der Untersuchung
filtrierter Blütenhonig beigemischt, und zwar zu 25, 50 bzw. 75 %. Die
vorhergehenden Beobachtungen bestätigten sich bereits visuell: Mit höheren
Zumischungsgraden des filtrierten Honigs nahm die Intensität der 65 kDa-Bande ab.
4. Filtration von Honig 86
86
Abb. 4.7.3.3.a: Elektrophorese von Beimischungen (A: Kleehonig, unfiltriert, B: Blütenhonig, filtriert, sowie Zumischungen des filtrierten Honigs zu 75, 50 und 25 %)
Demnach ist es mittels Kopplung von Gelchromatographie und Elektrophorese
möglich, über die Farbintensitäten der beiden Hauptbanden filtrierten Honig in
unfiltrierten Honigen nachzuweisen.
Zur exakten Ermittlung des Anteils von filtriertem Honig in einer Mischung mussten
die Intensitäten der Proteinbanden nun in Zahlenwerten ausgedrückt werden.
4.7.3.4. Densitometrische Auswertung
Eine Möglichkeit der quantitativen Auswertung von Gelbildern in der Elektrophorese
ist die Densitometrie (Farbdichtemessung).
Für die densitometrische Auswertung wurde die Software Gelscan 5.1 ® der Firma
BioSciTec genutzt. Das Foto des Gels wurde in Gelscan eingelesen und dort in
Graustufen dargestellt. Die Erkennung der Banden erfolgte zunächst automatisch.
Die für die Quantifizierung nicht benötigten Banden wurden daraufhin manuell
eliminiert. Die Molekulargewichte des Proteinmarkers wurden definiert, anschließend
erfolgte die automatische Berechnung der Molekulargewichte der Probenbanden. Die
eigentliche Quantifizierung wurde dann derart vorgenommen, dass den Pixeln in
Die Berechnung der Farbdichtewerte der Proteinbanden aus den
Saccharasefraktionen der Honigproben wird am Beispiel des Kleehonigs, des
filtrierten Blütenhonigs und der Zumischungen aus Abb. 4.7.3.3.a dargelegt. Abb. 4.7.3.4.f zeigt das Gelbild mit den markierten Banden, die zur Quantifizierung
herangezogen wurden. In Abb. 4.7.3.4.g sind die Molekulargewichte der beiden
Hauptbanden mittels Gelscan berechnet. In Tab. 4.7.3.4.h sind die einzelnen
Messwerte für diese Proben aufgelistet.
Lane Band Height AID IBG DID % DID RF Mol.Weight
2 (=A) 1 170 3273 2153 1120 25,5 109 63,4
2 182 10274 6994 3280 74,5 151 43,0
3 (=B) 1 122 747 662 85 2,7 98 73,9
2 178 8571 5559 3012 97,3 139 42,7
4 (=75 %) 1 128 1348 1223 125 3,9 98 65,1
2 172 7965 4893 3072 96,1 136 43,4
5 (=50 %) 1 151 2167 1913 254 6,8 101 63,1
2 181 10007 6542 3465 93,2 138 43,0
6 (=25 %) 1 145 2558 2196 362 9,6 101 63,1
2 177 8862 5454 3408 90,4 141 42,4
Abb. 4.7.3.4.h: Tabellarische Aufstellung der Messwerte der Honigproben aus Abb. 4.7.3.3.a nach Auswertung mit Gelscan (rot markiert: Änderungen des DID bei der 65 kDa-Bande)
Bande
Abb. 4.7.3.4.f: unfiltrierter Kleehonig (A), filtrierter Blütenhonig (B) sowie Beimischungen von B in A zu 25, 50 bzw. 75 % (1: Bande 65 kDa, 2: Bande 40 kDa)
Abb. 4.7.3.4.g: Auswertung mittels Gelscan: Berechnung der Molekulargewichte der Banden
1
2
91 4. Filtration von Honig
91
Die Ergebnisse der Auswertung bestätigten die vorherigen Beobachtungen: Die
Probe nach Filtration wies sowohl beim AID als auch beim DID einen deutlich
geringeren Farbdichtewert bei der 65 kDa-Bande auf als bei der unfiltrierten Probe,
während die Werte für die 40 kDa-Bande relativ konstant blieben. Somit ließ sich an
der Veränderung der Bandenverhältnisse nicht nur erkennen, ob ein filtrierter Honig
vorlag, auch ein Zusatz von filtriertem zu unfiltriertem Honig war in diesem Beispiel
detektierbar.
Es zeigte sich, dass zur Bewertung der Befunde der DID herangezogen werden
sollte, da hierbei der Background nicht in die Berechnungen mit einbezogen wurde
und somit der DID deutlich konstantere Werte für die 40 kDa-Bande lieferte als der
AID. Dies konnte bereits bei der Auswertung der BSA-Standardlösungen festgestellt
werden, denn auch hier war der Korrelationskoeffizient des DID etwas höher als der
des AID.
4.7.3.5. Methodenvalidierung
Es mussten im nächsten Schritt die Parameter untersucht werden, die belegen, dass
diese Methode generell geeignet ist, gefilterte Honige auch in Mischungen zu
erkennen. Die Grundlage zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten bildete die Arbeit
von KROMIDAS (1999).
Reproduzierbarkeit:
Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu prüfen, wurden zwei ungefilterte Honige
jeweils viermal unter Wiederholbedingungen aufgearbeitet und elektrophoretisch auf
zwei Gelen untersucht. Als Honigproben wurden ein Akazienhonig (geringe
Saccharaseaktivität) und ein Waldhonig (hohe Saccharaseaktivität) ausgewählt.
Die absoluten Farbdichtewerte des Waldhonigs waren wie erwartet deutlich höher als
die des Akazienhonigs, wobei sich die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-
Banden relativ konstant verhielten. Die jeweiligen Farbdichtewerte aller Messungen
wiesen mit durchschnittlich 8 % geringe Standardabweichungen auf, demnach besaß
die Methode eine hohe Wiederholpräzision und war somit gut reproduzierbar
(Durchführung und Ergebnisse siehe Kap. 5.2.7.).
4. Filtration von Honig 92
92
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100 120
Verhältnis 40 kDa zu 65 kDa
Zum
isch
ungs
grad
[%]
Abb. 4.7.3.5.a: Linearität der Bandenverhältnisse bei Zumischung eines filtrierten Blütenhonigs zu einem Kleehonig (Korrelationskoeffizient 0,98)
Linearität:
Es wurde geprüft, ob die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande mit
steigenden Zumischungsgraden filtrierten Honigs linear zunehmen. Dazu wurden
fünf verschiedenen ungefilterten Sorten- und polyfloralen Honigen gefilterte Honige in
den Verhältnissen 25 %, 50 % und 75 % beigemischt und deren Saccharase-
fraktionen aus der GPC elektrophoretisch untersucht (Durchführung siehe Kap. 5.2.7.).
Mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,98 wurde die Forderung
nach ausreichender Linearität erfüllt. In Abb. 4.7.3.5.a ist exemplarisch die
Regressionsgerade von Messungen einer Zumischung filtrierten Blütenhonigs zu
einem Kleehonig dargestellt.
Robustheit – Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen:
Es wurde geprüft, inwieweit sich unterschiedliche Verdünnungsstufen einer
Saccharasefraktion auf die Bandenverhältnisse auswirken. Die Ermittlung dieses
Parameters war aus dem Grund wichtig, da die Einengung der Eluate nach der
Gelchromatographie mittels der Zentrifugalkonzentratoren nur recht ungenau
vorgenommen werden konnten.
Dazu wurden bei drei unfiltrierten Honigproben je fünf Verdünnungsstufen der
Saccharasefraktion erstellt und elektrophoretisch untersucht (siehe Kap. 5.2.7.). Abb. 4.7.3.5.b zeigt am Beispiel eines Kleehonigs, dass die Farbdichtewerte wie
93 4. Filtration von Honig
93
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 1 2 3 4 5 6
Verdünnungsstufe
Farb
dich
tew
ert
Abb. 4.7.3.5.b: Area-Werte der Banden (rot: 65 kDa, grün: 40 kDa) bei unterschiedlichen Verdünnungen eines Kleehonigs
erwartet zwar abnahmen, die Verhältnisse in den jeweiligen Verdünnungen jedoch
konstant blieben.
Robustheit - Ausschluss von Hitzeeinfluss
Obwohl die gefilterten Honige von unterschiedlichen Lieferanten stammten (siehe
Kap. 4.5.), bei denen vermutlich auch jeweils unterschiedliche Filtrationsparameter
zum Einsatz kamen, zeigten alle Proben hinsichtlich des Verlustes der
Saccharaseaktivität bzw. des Verschwindens der 65 kDa-Bande das gleiche Bild.
Trotzdem galt die Frage zu klären, ob dieser Effekt mit dem Hitzeeinfluss während
des Filtrationsprozesses zu begründen war, welcher generell gegeben ist. Die
Überprüfung dieses Faktors war aufgrund der Hitzeempfindlichkeit der Saccharase
von großer Wichtigkeit (siehe Kap. 2.2.3.2.). Wäre allein die Wärmezufuhr für das
Verschwinden des 65 kDa-Proteins verantwortlich, so wäre die erarbeitete Methode
kein garantierter Nachweis für eine vorherige Filtration, denn auf den Honig kann
Hitze in vielfältiger Weise einwirken, beispielsweise beim Transport oder den
großtechnischen Abfüllvorgängen.
Zur Absicherung wurden ungefilterte Honige im Labor entsprechend der
Filtrationsbedingungen wenige Minuten im Trockenschrank auf 80 °C erwärmt
(vergleiche Kap. 4.3.) und anschließend vor und nach Wärmezufuhr vergleichend
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass in der kurzen Zeit, die für die
Viskositätsverminderung der Honige notwendig ist, keine Beeinflussung des
4. Filtration von Honig 94
94
Proteinspektrums der Saccharasefraktionen festzustellen war. In Abb. 4.7.3.5.c ist
anhand eines Blütenhonigs ersichtlich, dass es keine signifikanten Unterschiede
zwischen dem Gelbild vor und dem nach der Erwärmung gab; die Intensität der
65 kDa-Bande veränderte sich nicht. Eine Veränderung des Proteinspektrums der
Saccharasefraktion war somit allein durch Hitze nicht zu erklären, sondern musste
auf eine Filtration zurückzuführen sein.
Abb. 4.7.3.5.c: Proteinspektrum der Saccharasefraktionen eines Blütenhonigs vor (links) und nach Erwärmung (rechts) auf 80 °C
Robustheit – Ausschluss von Auswirkungen der Überlagerungen bei den GPC-Peaks
Bei der Auftrennung der Proteine in der GPC kam es zu Überlagerungen, wie in Kap. 4.7.2.1. dargelegt. Bei der Validierung der elektrophoretischen Analytik war zu
prüfen, inwieweit Veränderungen der Gelbilder zu beobachten waren, wenn die
Fraktionierung der Peaks etwas ungenauer erfolgte. Dazu wurden Honigproben
identisch aufgearbeitet, wobei die Peaks zum einen unmittelbar zu Beginn bzw. am
Ende und zum anderen jeweils fünf min. vorher und nachher abgenommen wurden.
Die densitometrischen Auswertungen der Gelbilder ergaben, dass sich die
Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande nur marginal, deren Verhältnisse
sogar überhaupt nicht veränderten. Die Überlagerungen haben demnach keine
Auswirkungen auf das Analyseergebnis.
95 4. Filtration von Honig
95
4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Es wurden insgesamt 40 Honige vor und nach Filtration mit der vorgestellten
Methode gemessen und mit Gelscan ausgewertet.
Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass sich die Intensität und somit der
Farbdichtewert der 40 kDa-Bande nach einer Filtration praktisch nicht veränderte.
Die 65 kDa-Bande war hingegen kaum noch vorhanden. Das führte dazu, dass der
Quotient der Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande bei gefilterten
Honigen im allgemeinen deutlich höher als 30 war, während er bei gefilterten
Honigen grundsätzlich zwischen 2 und 3 lag. In Abb. 4.7.3.6.a sind als Beispiel noch
einmal die Messwerte der Honigproben sowie die entsprechenden
Bandenverhältnisse aus Abb. 4.7.3.4.h aufgeführt (unfiltrierter Kleehonig, filtrierter
Honig und jeweilige Zumischungen des filtrierten Honigs zu 25 %, 50 % und 75 %).
Abb. 4.7.3.6.a: Messwerte der densitometrischen Auswertung und Verhältnisse der Banden bei Kleehonig, gefiltertem Honig sowie Zumischungen
In Abb. 4.7.3.6.b ist ein Streudiagramm der Farbdichtewerte verschiedener
Honigproben vor und nach Filtration dargestellt. Darin ist zu erkennen, dass bei den
ungefilterten Proben die Intensitätswerte der 40 kDa-Bande mit denen der 65 kDa-
Bande korrelierten. Hohen Werten für die 40 kDa-Bande stehen auch hohe Werte für
die 65 kDa-Bande gegenüber. Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass beide
Proteine einer identischen Quelle entstammen, und zwar der Saccharase (siehe
Robustheit - Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen
- GPC von ungefilterter Honige und Aufkonzentrierung der Saccharasefraktion
- Verdünnungen aus Konzentrat (A) herstellen:
B 0,1 ml A + 0,1 ml bidest. Wasser
C 0,1 ml B + 0,1 ml bidest. Wasser
D 0,1 ml C + 0,1 ml bidest. Wasser
E 0,1 ml D + 0,1 ml bidest. Wasser
- elektrophoretische Untersuchung der Proben und Auswertung des DID
Bandenverhältnis 40 kDa zu 65 kDa Honig A B C D E Klee 2,9 3,2 2,5 2,9 2,7
(28748) Wald 2,8 2,8 3,3 3,2 2,8
(3558) polyfloral 3,2 3,5 3,4 2,7 3,4 (98864)
Tab. 5.2.7.c: Ergebnisse der Messungen zur Bestimmung der Robustheit
5. Material und Methoden
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Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die
aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche
kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. K. Speer (TU
Dresden, Professur für Spezielle Lebensmittelchemie/Lebensmittelproduktion) in der
Zeit von April 2004 bis Dezember 2007 bei der Firma Quality Services International