-
4472
Enterotoxigenic Genes in strains of Staphylococcus spp.,
isolated from cheese made in Pamplona-Colombia
Genes enterotoxigénicos en cepas de Staphylococcus spp.,
aisladas a partir de queso elaborado en Pamplona-Colombia
Fanny Herrera A,1* Ph.D, Jesús Santos B,2 Ph.D.
1Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas,
Departamento de Microbiología, Grupo de Investigación en
Microbiología y Biotecnología (GIMBIO). Ciudad Universitaria,
Pamplona, Norte de Santander, Colombia. 2Universidad de León,
Facultad de Veterinaria, Departamento de Higiene y Tecnología de
los Alimentos. Campus de Vegazana, A.A. Nro. 24071, León, España.
*Correspondencia: [email protected]
Received: April 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT
Objective. To determine the incidence of coagulase-positive
strains of enterotoxigenic Staphylococcus in doble crema (double
cream) cheese samples produced in Pamplona. Materials and methods.
Bacterial isolation was performed following the routine method for
coagulase positive Staphylococcus provided by the Colombian
Technical Standard 4779, by using Baird Parker medium with
confirmation of typical colonies by performing the coagulase test.
Detection of genes for principal enterotoxins was done by PCR.
Results. The prevalence of coagulase positive Staphylococcus in
cheese samples was 31%, with 27% of the samples failing to meet the
requirements of the NTC 750. In 24.6% of the studied isolates,
genes for enterotoxin production were detected. The presence, in
the isolated strains, of genes for SEB, SEA and SED was 18.5%, 4.6%
and 3.0%, respectively. Conclusions. The significant presence of
enterotoxigenic genes found in the isolates obtained from samples
of double cream cheese made in Pamplona, suggests an important
hazard to the health of consumers.
Key words: coagulase, cheese, enterotoxins, prevalence,
Staphylococcus (Source: MeSH).
RESUMEN
Objetivo. Determinar la incidencia de cepas de Staphylococcus
coagulasa positivas, potencialmente enterotoxigénicas, en muestras
de queso doble crema elaborado en Pamplona. Materiales y métodos.
Se siguió el método tradicional de aislamiento de Staphylococcus
coagulasa positivos estipulado por la Norma Técnica Colombiana
4779, empleando el medio de Baird Parker con confirmación de las
colonias típicas mediante la realización de la prueba de la
coagulasa. La detección de los genes para las principales
enterotoxinas se realizó utilizando la técnica de PCR. Resultados.
Se encontró una prevalencia de Staphylococcus coagulasa positivos
en el 31% de las muestras; el 27% de las muestras incumplieron la
NTC 750. En el 24.6% de las cepas estudiadas se detectaron genes
para producción de enterotoxinas. La presencia, en las cepas
aisladas, de genes para ESB, ESA y ESD
ORIGINAL
Rev.MVZ Córdoba 20(1):4472-4481, 2015. ISSN: 0122-0268
-
4473
fue de 18.5%, 4.6%, y 3.0%, respectivamente. Conclusiones. La
significativa presencia de genes enterotoxigénicos encontrada en
las cepas obtenidas a partir de las muestras de queso doble crema
elaborado en Pamplona, sugiere un importante peligro para la salud
de los consumidores.
Palabras clave: Coagulasa, enterotoxinas, prevalencia, queso,
Staphylococcus (Fuente: MeSH).
INTRODUCCIÓN
Las Enfermedades de Origen Alimentario (ETAs) son un problema
creciente de salud pública en todo el mundo, resultando de la
ingestión de alimentos contaminados con microorganismos, organismos
pluricelulares (helmintos), sustancias químicas y/o toxinas. Las
manifestaciones clínicas más evidentes de las ETAs son de tipo
gastrointestinal: sin embargo, estas enfermedades pueden tener
efectos crónicos sobre la salud, incluyendo síntomas neurológicos,
ginecológicos o inmunológicos, como también daño a múltiples
órganos, cáncer y la muerte (1).
Dentro de los agentes etiológicos más importantes de ETAs en el
mundo se encuentra Staphylococcus aureus. El término
“estafilococos” define un grupo de bacterias en forma de cocos
Gram-positivos que se dividen en más de un plano para formar
racimos tridimensionales de células. El género Staphylococcus,
pertenece al orden I Bacillales, familia Staphylococcaceae (2); se
han descrito 18 especies de Staphylococcus de importancia en
alimentos, siendo, las especies coagulasa-positivas como S. aureus
las que más se transmiten por alimentos (3).
Los estafilococos son habitantes normales de las superficies
corporales de la mayoría de los animales de sangre caliente,
encontrándose en las mucosas y en la piel, por esta razón la fuente
más importante de estas bacterias en los alimentos son los
portadores nasales y las personas con heridas y/o forúnculos en
manos y brazos que manipulan los alimentos; adicionalmente,
animales domésticos como vacas pueden ser portadores de esta
bacteria ya que S. aureus es importante productor de mastitis en
hembras lecheras contaminando el queso elaborado con la misma
(3).
Staphylococcus aureus produce una gama amplia de sustancias
asociadas con la virulencia, entre ellas enzimas, citotoxinas,
exotoxinas, toxinas exfoliativas y enterotoxinas (4).
El principal factor de virulencia de Staphylococcus involucrado
en la intoxicación alimentaria estafilocócica (IAE) es la
producción de enterotoxinas (SE). S. aureus produce cinco toxinas
típicas: SEA, SEB, SEC, SED y SEE las cuales producen emesis en
primates. Las enterotoxinas mejor caracterizadas son la ESA y ESB;
las más frecuentes en brotes de ETAs son la ESA y la ESB (4). Las
enterotoxinas de S. aureus
INTRODUCTION
Foodborne Illnesses (FBI) are a growing problem to public health
around the world, resulting in the ingestion of food contaminated
with microorganisms, pluricellular organisms (helminthes), chemical
and/or toxic substances. The most obvious clinical manifestations
of FBIs are gastrointestinal: however, these illnesses can have
chronic effects on health, including neurological, gynecological or
immunological symptoms, as well as damage multiple organs, and
cause cancer or death (1).
One of the most important etiologic agents of FBIs in the world
is Staphylococcus aureus. The term “staphylococci” defines a group
of Gram positive coco bacteria that divide on more than one plane
to form three-dimensional cell bunches. Staphylococcus belongs to
order I Bacillales of the Staphylococcaceae family (2); 18 species
of Staphylococcus that affect food have been described, and
coagulase positive ones such as S. aureus is the one that is most
transmitted by food (3).
Staphylococci are normal inhabitants of the body surface of the
majority of warm blooded animals, present in mucous and skin, and
for this reason the most important source of these bacteria in food
are nasal passages and food handlers that have wounds and/or boils
on hands and arms; additionally, domestic animals such as cows can
be bearers of this bacteria, since S. aureus is an important
mastitis producer in milk-producing females, which contaminates
cheese made from it (3).
Staphylococcus aureus produces a wide range of substances
associated with virulence, among them enzymes, cytotoxins,
exotoxins, exfoliative toxins and enterotoxins (4).
The main factor for virulence of Staphylococcus involved in
staphylococcal food poisoning (SFP) is the production of
enterotoxins (SE). S. aureus produces five typical toxins: SEA,
SEB, SEC, SED and SEE, which produce emesis in primates. The
enterotoxins that are best characterized are ESA and ESB; the most
frequent outbreaks of ETAs are ESA and ESP (4). S. aureus
enterotoxins are thermostable, and thus resist thermal treatments
to which food is subjected (3).
Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from
cheese
-
4474 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
son termoestables, de tal manera que resisten los tratamientos
térmicos a los cuales se someten los alimentos (3).
La IAE, se adquiere al consumir un alimento en el cual el
microorganismo ha preformado una o varias de sus enterotoxinas. Los
síntomas se desarrollan, generalmente, 6 horas después de la
ingestión del alimento contaminado, caracterizándose por vómitos,
náuseas, espasmos abdominales y diarrea. En personas
inmunocomprometidas puede ocasionar la muerte. La IAE es
autolimitante y no es una enfermedad de declaración obligatoria,
aspectos que hacen que muchos brotes y casos no se informen. En los
Estados Unidos de Norteamérica (USA) se ha calculado que sólo son
declarados entre el 1 y el 5% de todos los casos por esta
intoxicación, a pesar de esto, se estima que es la causante del 14%
de ETAs en ese país (5). Se considera que S. aureus es uno de los
principales agentes causales de ETAs en el mundo, y es el patógeno
más frecuentemente asociado a quesos elaborados con leche cruda
(6).
En USA, se calcula que ocurren más de 241,000 casos domésticos
de IAE anualmente; teniendo en cuenta una tasa aproximada de
hospitalización del 6.4%, para los casos confirmados en el
laboratorio, en promedio 1,064 de estos casos fueron hospitalizados
resultando en 6 muertes (7). En Francia, en el 2008, fue confirmado
S. aureus como el segundo agente causal de ETAs después de
Salmonella y se le considera el primer agente sospechoso del 42.5%
de los brotes de ETAs (6).
En Latinoamérica existen muchos tipos de quesos frescos
artesanales; dentro de las ETAs se destaca la IAE. En provincias de
países de la región como Cuba y Argentina, S. aureus ha sido de las
principales bacterias implicadas en brotes de ETAs en los períodos
2004-2008 y 1993-2001, respectivamente, resultando el queso
artesanal un importante alimento involucrado en los mismos
(8,9).
En Colombia, S. aureus se encuentra entre los principales
microorganismos que se declaran en la red de vigilancia de ETAs
(10). Dentro de los brotes publicados se destacan el sucedido en el
departamento del Atlántico en el comedor de un colegio del
municipio de Santo Tomás y el ocurrido en el municipio de Honda
(Tolima) el cual afectó a personas que participaban de un evento
comunitario; en estos brotes se implicó como agente causal
principal a S. aureus (11,12).
Los objetivos del presente trabajo fueron detectar la
prevalencia de Staphylococcus coagulasa positivos en muestras de
queso doble crema artesanal elaborado en la ciudad de Pamplona,
estableciendo si las muestras de queso analizadas cumplían o no con
los límites permisibles para esta bacteria establecidos por la
Norma Técnica Colombiana (NTC) 750 y también
FBI is acquired when consuming food where the microorganism has
preformed one or several of its enterotoxins. Symptoms generally
develop 6 hours after ingesting contaminated food, characterized by
vomiting, nausea, abdominal spasms and diarrhea. It can cause death
in persons whose autoimmune system is compromised. FBI is
self-limiting and is not a notifiable illness, which means that
many outbreaks and cases are not reported. In the United States of
America (USA) it has been calculated that only from 1 to 5% of all
food poisoning cases are reported; however, it is estimated that it
causes 14% of the FBIs in the country (5). S. aureus is considered
one of the principal agents causing FBIs in the world, and the
pathogen is more frequently associated with cheese made with raw
milk (6).
In the United States, it is calculated that more than 241,000
domestic cases of staphylococcal food poisoning (SFP) occur
annually; keeping in mind that the hospitalization rate is 6.4% for
confirmed laboratory cases, an average of 1,064 of these cases were
hospitalized, resulting in 6 deaths (7). In France in 2008, S.
aureus was confirmed as the second causative agent of FBIs after
Salmonella and is the first suspected agent in 42.5% of FBI
outbreaks.
In Latin America many types of fresh artisan cheese exist;
within FBIs are SFPs. In provinces of countries in the region, such
as Cuba and Argentina, S. aureus has been one of the principal
bacteria implicated in FBI outbreaks in periods from 2004-2008 and
1993-2001, respectively, with artisan cheese being an important
food involved in those outbreaks (8,9).
In Colombia, S. aureus is found among the principal
microorganisms that are on the FBI surveillance network (10). Among
published outbreaks is one that happened in the Atlantic Department
in a school cafeteria from the Santo Tomás municipality and one
that happened in the Honda municipality (Tolima), which affected
people who participated in a community event; the causative agent
in these outbreaks was S. aureus (11,12).
The objectives of this study were to detect the prevalence of
positive Staphylococcus coagulasa in doble crema (double cream)
cheese made in the city of Pamplona, establishing if the analyzed
cheese samples did or did not comply with the allowable limits for
this bacteria as established by the Colombian Technical Standard
(NTC) 750, and also to determine the presence of genes that codify
ESA, ESB, ESC, ESD and ESE enterotoxins in positive Staphylococcus
coagulasa strains by means of the Polymerase Chain Reaction
(PCR).
-
4475Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from
cheese
determinar la presencia de genes que codifican las enterotoxinas
ESA, ESB, ESC, ESD y ESE, en las cepas de Staphylococcus coagulasa
positivas, mediante la realización de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
MATERIALES Y METODOS
Muestreo. Durante el lapso de un año, se recolectaron 100
muestras de 200 g de queso doble crema elaborado en Pamplona,
expendido en lugares formalmente establecidos. Las muestras fueron
refrigeradas y transportadas en las mismas condiciones y realizando
los análisis microbiológicos inmediatamente.
Aislamiento de Staphylococcus. Se siguió el protocolo
recomendado por la NTC 4779 (13), así: se tomaron 10 g de la
muestra y se homogeneizaron en 90 mL de agua peptonada 0.1% (Oxoid,
Basingstoke, United Kingdom), realizando diluciones decimales hasta
10-3; posteriormente se pipeteó 0.1 mL de las diluciones 10-3 y
10-2 (dependiendo de la muestra en algunos casos se inocularon las
diluciones 10-1 y 10-2 ó 10-3 y 10-4) sobre la superficie del medio
Baird Parker (Oxoid), previamente preparado; se extendió el inóculo
con ayuda de un asa de Drigalsky hasta que la superficie quedó bien
seca, incubando a 35±2ºC durante 48 horas. Transcurrido el período
de incubación se seleccionaron las placas que contenían entre
20-200 colonias negras y brillantes con bordes reducidos blancos,
rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco, zona de
precipitado de sales de calcio y magnesio, las cuáles fueron
contadas; se tomó un mínimo de tres colonias para realizar la
prueba de la coagulasa.
Prueba de la coagulasa. Se transfirió el número de colonias a
confirmar en un mismo número de tubos que contenían 5 mL de caldo
Infusión Cerebro Corazón (BHI, Oxoid), incluyendo un control
positivo, incubando a 35±2ºC durante 18-24 horas. Pasado este
tiempo, se pasaron 0.3 mL de cada caldo BHI a tubos que contenían
0.3 mL de plasma deshidratado de conejo-EDTA (bioMerieux SA, Marcy
l’Etoile, France), igualmente se transfirió a un tubo 0.3 mL del
plasma como control negativo, incubando a 35±2ºC. Se observó cada
hora durante las primeras seis horas, en caso negativo se realizó
la lectura hasta las 24 horas. Una vez finalizado el tiempo de
incubación, se interpretaron los resultados, con base en los tubos
que presentaron coagulación del plasma, comparándolos con los
controles positivos y negativos. Se realizó el cálculo de
Staphylococcus coagulasa positivo teniendo en cuenta el número
total de colonias después de las 48 horas de incubación y la
proporción de colonias confirmadas por la prueba de la coagulasa,
utilizando como factor de corrección la relación: colonias
positivas/colonias examinadas, informando Unidades Formadoras de
Colonia (UFC)/g.
MATERIALS AND METHODS
Sampling. Over the course of a year, 100 samples of 200 g of
doble crema (double cream) cheese made in Pamplona and sold in
formally established places were collected. The samples were
refrigerated and transported in the same conditions for immediate
microbiological analysis.
Isolation of Staphylococcus. The NTC 4779 recommendation (13)
was followed: 10 g of the sample was taken and homogenized in 90 mL
of 0.1% peptonized water (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom),
making decimal dilutions up to 10-3; later 0.1 mL of dilutions 10-3
y 10-2 were piped (depending on the sample, at times 10-1 and 10-2
ó 10-3 and 10-4 dilutions were inoculated) on the previously
prepared surface of the Baird Parker medium (Oxoid); the inoculated
dilution was spread with the help of a Drigalsky loop until the
surface was very dry, incubating at 35±2ºC for 48 hours. After the
incubation time, plates that contained from 20-200 black, shiny
colonies were selected having white shrunken borders and surrounded
by clear areas that contrasted with the opaque medium, areas with
precipitated calcium and magnesium salts, which were then counted;
a minimum of three colonies were used for the coagulase test.
Testing the coagulase. The number of colonies to be confirmed
were transferred in the same number of tubes that contained 5 mL of
Brain Heart Infusion broth (BHI, Oxoid), concluding a positive
control, incubating at 35±2ºC for 18-24 hours. After this time, 0.3
mL of each BHI broth was put into tubes that contained 0.3 mL of
dehydrated plasma of rabbit-EDTA (bioMerieux SA, Marcy l’Etoile,
France), and a tube of 0.3 mL of plasma as a negative control was
also transferred, incubating at 35±2ºC. For the first six hours
they were observed hourly, in negative cases the reading was
extended to 24 hours. Once finalized the incubation time, the
results were interpreted, based on tubes that presented plasma
coagulation, comparing them with positive and negative controls.
The calculation of positive Staphylococcus coagulasa was done
keeping in mind the total number of colonies after 48 hours of
incubation and the proportion of colonies confirmed for the
coagulase test, using as a correction factor the relation: positive
colonies/examined colonies, reporting Colony Forming Units
(CFU)/g.
Detecting enterotoxigenic genes. From the positive coagulase
strains cultivated in Soy Tripticase broth (Oxoid) and incubated at
37ºC for 24 hours, 1 mL was transferred, centrifuged in a Eppendorf
5415D micro centrifuge at 12,000 rpm/3 min. Later 200 µL of Chelex
(Bio-Rad,
-
4476 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
Detección de genes enterotoxigénicos. A partir de las cepas
coagulasa positivas crecidas en caldo Tripticasa de Soja (Oxoid), e
incubadas a 37ºC durante 24 horas, se transfirió 1 mL,
centrifugando en una microcentrífuga Eppendorf 5415D a 12,000 rpm/3
min. Posteriormente se adicionaron 200 µL de Chelex (Bio-Rad,
Hércules, California, EEUU), resuspendiendo el “pellet”
completamente e incubando a 56ºC por 30 min. Se agitó cada tubo
empleando un vortex durante 10 segundos; luego se transfirió cada
tubo a un bloque de calentamiento (JP Selecta S.A, Barcelona) a
100ºC durante 8 minutos. Nuevamente se agitó cada tubo y finalmente
se centrifugó a 12,000 rpm /3 min. Se cuantificó la concentración
de ADN empleando un Espectrofotómetro-UV Q3000 (Quawell, Beijing,
China). Partiendo de 3 µL del ADN (50 ng/µL aproximadamente) se
llevó a cabo la PCR, para esto, se emplearon los pares de cebadores
correspondientes para cada enterotoxina a una concentración de 25
mM y un cóctel comercial 5 PRIME MasterMix (Taq polimerasa, buffer,
dNTPs y Mg+2) (5 PRIME Hamburgo, Alemania). Fueron amplificados los
diferentes genes en un equipo Mastercycler Personal (Eppendorf,
Hamburgo, Alemania); la secuencia de los cebadores empleados y la
longitud de los amplificados se muestran en la tabla 1 (14).
Se sometieron los productos de la amplificación (5 μl) a
electroforesis en gel de agarosa (Bio-Rad) al 1% p/v a 100 V
durante 1 h. Se realizó la visualización mediante tinción con
RedSafeTM (iNtRon Biotechnology, INC., Sungnam, Kyungki-Do, Korea),
empleando un transiluminador de luz ultravioleta,
Mini-Transiluminador (Bio-Rad) y documentando con la aplicación del
Digimage System acoplado a una cámara digital Canon Power Shot G11
(Major Science, Taipei, Taiwan).
RESULTADOS
La prevalencia de Staphylocuccus coagulasa positivos (SCP) en
las muestras analizadas fue del 31%. Adicionalmente, el 27% de las
muestras incumplieron la NTC 750 (15), que establece los requisitos
microbiológicos (entre ellos Staphylococcus coagulasa positivos),
para queso fresco (Tabla 2). En el 23% de las muestras, se encontró
una concentración de SCP mayor o igual a 104 UFC/g.
De 65 cepas estudiadas se detectaron genes que codificaron para
la producción de las enterotoxinas investigadas en el 24.6% de las
cepas, las cuáles fueron aisladas a partir de 12 muestras. La
prevalencia de genes para ESB, ESA y ESD en estas cepas fue de
18.5%, 4.6%, y 3.0%, respectivamente (Tabla 3, Figura 1). En una de
las cepas estudiadas se detectaron los genes para las ESA y ESB
simultáneamente. No se detectó la presencia de genes para
producción de ESC ni ESE.
Hércules, California, USA) was added, the pellet was completely
re-suspended and incubated at 56ºC for 30 min. Each tube was
agitated in a vortex for 10 seconds; later each tube was placed on
a heating block (JP Selecta S.A, Barcelona) at 100ºC for 8 minutes.
Then each tube was again agitated and finally centrifuged at 12,000
rpm /3 min. The concentration of DNA used was quantified using a
Spectrophotometer-UV Q3000 (Quawell, Beijing, China). Using 3 µL of
the DNA (50 ng/µL approximately) the PCR was done, and for this,
corresponding pairs of primers for each enterotoxin were used at a
concentration of 25mM and a commercial cocktail, 5 PRIME MasterMix
(Taq polimerase, buffer, dNTPs y Mg+2) (5 PRIME Hamburg, Germany).
Different genes were amplified in a Mastercycler Personal
(Eppendorf, Hamburg, Germany); the sequence of the primers used and
the length of the amplified ones are shown in table 1 (14).
Table 1. Genes, primers, hybridization temperatures, and sizes
expected in amplicons used to determine the presence of enterotoxin
genes in positive S.aureus coagulase strains.
Gen Primer Sequence (5´ a 3´) TH(ºC) LEA(pb)
sea ACGATCAATTTTTACAGCTGCATGTTTTCAGAGTTAATC 56544
seb GAATGATATTAATTCGCATCTCTTTGTCGTAAGATAAACTTC 55 416
sec GACATAAAAGCTAGGAATTTAAATCGGATTAACATTATCCA 56 257
sed TTACTAGTTTGGTAATATCTCCTTCCACCATAACAATTAATGC 58 334
see ATAGATAAAGTTAAAACAAGCAATAACTTACCGTGGACCC 52 170
TH: Temperature of hybridization; LEA: Expected amplicon
length
The amplification products (5 μl) were subjected to
electrophoresis in agarose gel (Bio-Rad) at 1% p/v at 100 V for 1
h. Visualization was done by means of staining with RedSafeTM
(iNtRon Biotechnology, INC., Sungnam, Kyungki-Do, Korea), using a
transiluminator ultraviolet light, Mini-Transiluminator (Bio-Rad)
and documented with the Digimage System application connected to a
Canon Power Shot G11 digital camera (Major Science, Taipei,
Taiwan).
RESULTS
The prevalence of positive Staphylocuccus coagulase (SCP) in the
analyzed samples was 31%. Additionally, 27% of the samples did not
comply with NTC 750 (15), which establishes the microbiological
requirements (among them positive Staphylococcus coagulase), for
fresh cheese (Table 2). In 23% of the samples a
-
4477Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from
cheese
DISCUSIÓN
Se encontró una alta prevalencia de SCP en las muestras. Estos
resultados concuerdan con los hallados por Mendonça et al (16)
quienes analizaron muestras de queso fresco expendido en Brasil,
determinando una prevalencia del 30.9%; de igual forma se relaciona
con los datos hallados por Maldonado y Llanca (17), en muestras de
queso comercializado en Girardot estado Aragua, Venezuela quienes
encontraron SCP en el 25% de las muestras analizadas. Sin embargo,
estos resultados distan de los hallados por otros autores como
Rodríguez et al (18) quienes no lograron aislar SCP en muestras de
queso artesanal comercializado en Upata, Bolivar, Venezuela. Can y
Celik (19) analizaron muestras de queso de origen turco, detectando
SCP en el 9.5% de las muestras de queso. Jakobsen et al (20),
detectaron SCP en el 47.3% de muestras de queso fresco elaborado
artesanalmente en Noruega. En Colombia, Vanegas et al (10) aislaron
SCP en el 100% de muestras de queso expendido en tiendas, ventas
callejeras y mercados de la ciudad de Bogotá.
concentration of SCP greater or equal to 104 UFC/g was
found.
Of the 65 strains studied, genes that codified for the
production of enterotoxins were found in 24.6% of the strains,
which were isolated from 12 samples. The prevalence of genes for
ESB, ESA and ESD in these strains was 18.5%, 4.6%, and 3.0%,
respectively (Table 3, Figure 1). In one of the strains studied
genes detected for ESA and ESB simultaneously. The presence of
genes to produce ESC or ESE was not detected.
Table 2. Quality of double cream samples studied according to
the positive Staphylococcus coagulase count.
UFC/g % SAMPLES(N=100) QUALITY CRITERIA
≤100 72 Good
>100-1000 1 Marginally acceptable
>1000 27 Inacceptable
1: according to NTC 750
Table 3. Relationship of samples and strains in which the
studied enterotoxinogenic genes were detected.
SAMPLE STRAIN DETECTED ENTEROTOXENIC GEN
9 8 ESD
12 9 ESD
29 15 ESB
29 16 ESB
50 45 ESB
54 54 ESA
67 57 ESA
70 59 ESA/ESB
70 60 ESB
78 61 ESB
78 62 ESB
78 63 ESB
80 64 ESB
82 65 ESB
83 66 ESB
84 67 ESB
Figure 1: Example obtained for each one of the detected
enterotoxins: M: pattern of molecular size 100 pb; 1: Strain ESA
(+) ATCC (American Type Culture Collection) 13565; 2: Isolated
cheese strain; 3: Strain ESB (+) CECT (Colección Española de
Cultivos Tipo) 4459; 4-5: Isolated cheese strains; 6: Strain ESD
(+) ATCC 23235; 7: Isolated cheese strain.
DISCUSSION
A high prevalence of SCP was found in the samples. These results
concur with those found by Mendonça et al (16), who analyzed
samples of fresh cheese sold in Brazil, determining a prevalence of
30.9%; similarly, data found by Maldonado and Llanca (17) in
samples of cheese sold in Girardot, Aragua State, Venezuela, found
SCP in 25% of the analyzed samples. However, these results are
different from those found by other authors such as Rodríguez et al
(18), who were not able to isolate SCP in samples of artisan cheese
sold in Upata, Bolivar, Venezuela. Can and Celik (19) analyzed
samples of cheese from Turkey, detecting SPC in 9.5% of the cheese
samples. Jakobsen et al (20) detected SCP in 47.3% of samples of
fresh artisan cheese made in Norway. In Colombia, Vanegas et al
(10) isolated SCP in 100% of the samples sold in stores, on the
street and in markets in Bogota.
-
4478 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
Por otro lado, un importante porcentaje de muestras incumplieron
la legislación colombiana que reglamenta estos alimentos (15).
Resultados diferentes hallaron Giammanco et al, quienes
determinaron que sólo el 4% de las muestras de queso fresco
tradicional siciliano incumplían la legislación europea (>103
UFC/g) (17). Sin embargo, otros autores como Maldonado y Llanca
determinaron que el 100% de las muestras de queso fresco en forma
de torta expendido en Girardot, estado Aragua, Venezuela incumplían
la norma de la Comisión Venezolana de Normas Industriales Covenin
(>104 UFC/g). Luján et al (22) determinaron que el 80% de
muestras de queso fresco artesanal comercializado en tres distritos
de Lima, Perú, incumplían la Norma Técnica Peruana (>102 UFC/g).
Komatsu et al (23) detectaron que el 88% de las muestras de queso
elaborados en la ciudad de Uberlândia, Brasil, incumplían la norma
establecida por el Ministerio de Salud para S. aureus (5.0 x
102
UFC/g).
El gen que codifica la ESB fue el principal gen enterotóxico
detectado en este estudio, seguido de la ESA; resultado que
concuerda con los hallados por Gücükoğlu et al (24) quienes
analizando muestras de helado de crema, y encontraron que la
principal enterotoxina producida fue la ESB. Valero-Leal (25),
también hallaron que la ESB fue la principal enterotoxina detectada
en muestras de leche y queso freso de vaca originarios del estado
Zulia (Venezuela). Por otro lado Vanegas et al (10), detectaron la
ESA en el 100% de las cepas SCP aisladas a partir de queso
artesanal procedente de Bogotá.
Se ha determinado que la ESB es responsable de cerca del 10% de
los brotes de ETAs en USA (4). Su dosis letal 50 (LD50) es
0.02mcg/kg (26), concentraciones de esta toxina de tan solo 0.4
μg/kg pueden inducir los síntomas en humanos; adicionalmente, se ha
observado, que individuos expuestos a la ESB manifiestan síntomas
más severos que los expuestos a la ESA (5). De otra parte, se ha
demostrado que esta enterotoxina retiene su actividad biológica
luego del calentamiento a 60ºC durante 16 horas, y la temperatura
óptima para su producción en medio de cultivo es de 39.4ºC (3),
condiciones que favorecen su presencia en queso fresco.
En un porcentaje importante de las muestras analizadas, se
encontró una concentración de SCP mayor o igual a 104 UFC/g; el
menor número de células de S. aureus requeridos para la producción
del nivel mínimo de enterotoxinas considerado necesario para
provocar enfermedad depende del tipo de enterotoxina, por ejemplo
la ESA se ha detectado en concentraciones de 104 UFC/g (3); se
reconoce, en general, que este valor se encuentra entre 105-108
UFC/g (5). Sin embargo, existen datos de brotes de IAE en los
cuales se reportaron recuentos de SCP desde 7.6 x 102 (27),
concentración encontrada en el 33% de las muestras analizadas en
este trabajo.
On the other hand, an important percentage of samples did not
comply with Colombian legislation that regulates these products
(15). Different results were found by Giammanco et al, who
determined that only 4% of the samples of traditional, fresh
Sicilian cheese did not comply with European legislation (>103
CFU/g) (17). However, authors such as Maldonado and Llanca
determined that 100% of samples of fresh cheese in the form of
cakes sold in Girardot, Aragua State, Venezuela, did not comply
with Covenin, the Venezuelan Commission of Industrial Regulations
(>104 CFU/g). Luján et al (22) determined that 80% of the
samples of fresh artisan cheese sold in three districts of Lima,
Peru, did not comply with the Peruvian Technical Standards (>102
CFU/g). Komatsu et al (23) detected that 88% of the samples of
cheese made in the city of Uberlândia, Brazil, did not comply with
the standards established by the Ministry of Health for S. aureus
(5.0 x 102
CFU/g).
The gene that codifies ESB was the main enterotoxic gene
detected in this study, followed by ESA; results concur with the
findings of Gücükoğlu et al (24), who analyzed samples of ice cream
and found that the main enterotoxin produced was ESB. Valero-Leal
(25) also found that ESB was the main enterotoxin detected in
samples of milk and fresh cow cheese from Zulia State (Venezuela).
On the other hand, Vanegas et al (10) detected ESA in 100% of the
SCP strains isolated from artisan cheese from Bogota.
It has been determined that ESB is responsible for close to 10%
of FBIs in the USA (4). Its lethal dose 50 (LD50) is 0.02mcg/kg
(26), and concentrations of this toxin of just 0.4 μg/kg can induce
symptoms in humans; additionally, it has been observed that
individuals exposed to ESB manifest more severe symptoms than those
exposed to ESA (5). On the other hand, it has been demonstrated
that this enterotoxin maintains biological activity after heating
to 60 ºC for 16 hours, and the optimum temperature for producing it
in cultures is 39.4ºC (3), conditions that favor its presence in
fresh cheese.
An important percentage of samples analyzed found a
concentration of SCP greater or equal to 104 CFU/g; the lowest
number of S. aureus cells required to produce the minimum level of
enterotoxins considered necessary to provoke illness depends on the
type of enterotoxin. For example, ESA has been detected in
concentrations of 104 CFU/g (3); it is recognized, in general, that
this value is found between 105-108 CFU/g (5). However, there is
data from reported SFP outbreaks in which SCP counts are from 7.6 x
102 (27), a concentration found in 33% of the samples analyzed in
this study.
-
4479Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from
cheese
La elaboración del queso doble crema, en Pamplona, se realiza
empleando leche cruda como materia prima, aplicando procesos
artesanales en los que no existen factores intrínsecos y/o
extrínsecos, que limiten o controlen la presencia de Staphylococcus
aureus: en primer lugar la etapa de hilado, que se realiza entre
40ºC y 42ºC, permite su crecimiento ya que puede crecer hasta los
47.8ºC; el pH del producto terminado (5.3-5.6) no controla el
crecimiento ni la multiplicación de esta bacteria porque puede
crecer a pH incluso de 4.0; el porcentaje de sal del queso (3.47%
NaCl), no se considera limitante para esta bacteria ya que es
halotolerante soportando concentraciones de sal hasta del 20% p/p
(5). Adicionalmente, se puede presentar contaminación en cualquier
etapa del proceso de elaboración ya que la obtención del producto
implica etapas con elevado contacto con manipuladores, utensilios,
ambientes, entre otros, etapas que se realizan a temperaturas
superiores a 25°C que favorecen la multiplicación de la bacteria,
ya que S. aureus presenta un tiempo de generación en la leche de
0.8 h a esta temperatura (28), y por ende la producción de
enterotoxinas.
Por otra parte, la presencia de esta bacteria en este tipo de
queso podría indicar contaminación a partir de la piel, boca o
fosas nasales de los manipuladores que entraron en contacto directo
con el alimento y no contaban con las mínimas normas de higiene,
como el uso de guantes, tapa bocas, gorros y batas, además de la
deficiente higiene de superficies, equipos y utensilios, lo cual
pudo comprobarse en algunas microempresas lácteas de la provincia
de Pamplona (29). Otras fuentes de contaminación pueden ser, leche
con mastitis, equipos y utensilios de trabajo, aire, polvo y agua.
Es evidente que inadecuadas prácticas de limpieza y desinfección
aumentan la persistencia de la bacteria en los equipos y ambientes
de procesamiento del queso; a esto hay que sumar la demostrada
resistencia de S.aureus a desinfectantes cuando forma biopelículas
(30).
En conclusión, se encontró una alta prevalencia de
Staphylococcus en las muestras de queso doble crema elaborado en
Pamplona, reflejando inadecuadas practicas de higiene y
desinfección empleadas a lo largo de toda la cadena de
procesamiento del mismo, de tal manera que se debe capacitar a los
manipuladores en Buenas Prácticas de Manufactura. Además, se deben
controlar la temperatura de almacenamiento de la leche y del
producto terminado para minimizar la multiplicación de la
bacteria.
El hecho de encontrar en el 24.6% de las cepas analizadas, genes
enterotoxigénicos correspondientes a las toxinas más frecuentemente
implicadas en brotes de ETAs, indica que el queso doble crema
elaborado en Pamplona puede representar un peligro para la salud
pública.
Double cream cheese in Pamplona is made using raw milk and
applying artisan processes where intrinsic and/or extrinsic factors
do not exist that limit or control the presence of Staphylococcus
aureus. Stretching, which is done between 40ºC and 42ºC, allows
growth, since it can grow up to 47.8ºC; the pH of the finished
product (5.3-5.6) does not control growth or the spread of this
bacteria, since it can grow in pH of up to 4.0; the percentage of
salt in the cheese (3.47% NaCl), is not considered a limitation for
this bacteria, since it is halotolerant and can survive in salt
concentrations of up to 20% p/p (5). Additionally, contamination
can occur in any stage of production, since making the product
implies intense contact with handlers, utensils, environments,
among others. These stages are done at temperatures above 25°C that
favor the spread of the bacteria, since S. aureus has a generation
time of 0.8 h at this temperature (28) and therefore produces
enterotoxins.
On the other hand, the presence of this bacteria in this type of
cheese could indicate contamination on the skin, mouth or nasal
passages of handlers that came into direct contact with the food
and did not follow minimal hygiene standards, such as the use of
gloves, mouth coverings, caps or protective clothing, as well as
poor cleaning of surfaces, equipment and utensils, which could be
seen in some dairy microbusinesses in the province of Pamplona
(29). Other sources of contamination could be milk with mastitis,
work equipment and tools, air, dust and water. It is evident that
inadequate cleaning and disinfecting practices increase the
persistence of the bacteria in cheese processing equipment and
environments, and the demonstrated resistance of S.aureus to
disinfectants when a biofilm is formed is added to this (30).
In conc lus ion , a h igh p reva lence o f Staphylococcus was
found in samples of double cream cheese made in Pamplona,
reflecting inadequate hygiene practices and disinfection used all
along the processing chain, so that it is necessary to train food
handlers in Good Manufacturing Practices. Additionally, the storage
temperature of milk and the finished product should be controlled
so as to minimize the spread of the bacteria.
Finding enterotoxigenic genes in 24.6% of the analyzed strains
that correspond to the toxins that are most frequently found in FBI
outbreaks indicates that double cream cheese made in Pamplona can
be a public health risk.
-
4480 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
Agradecimientos
A la Universidad de Pamplona. Facultad de Ciencias Básicas,
Departamento de Microbiología, estudiantes del Semillero del Grupo
de Investigación en Microbiología y Biotecnología, Paola Andrea
Naranjo, Yelitza Lizcano y Vanessa Ortega.
Acknowledgements
Universidad de Pamplona. Faculty of Basic Sciences, Department
of Microbiology, students of the Semillero of the Investigation
Group in Microbiology and Biotechnology, Paola Andrea Naranjo,
Yelitza Lizcano and Vanessa Ortega.
REFERENCES
1. Haagsma J, Polinder S, Stein C, Havelaar A. Systematic review
of foodborne burden of disease studies: Quality assessment of data
and methodology. Int J Food Microbiol 2013; 166(1):34–47.
2. Yakoubou S, Xu D, Côté JC. Phylogeny of the Order Bacillales
inferred from 3’ 16S rDNA and 5’ 16S-23S ITS nucleotide sequences.
Nat Sci 2010; 2(9):990-997
3. Jay J, Loessner M, Golden D. Modern Food Microbiology.
Seventh Edition. New York: Springer; 2005.
4. Pinchuk I, Beswick E, Reyes V. Review Staphylococcal
Enterotoxins. Toxins 2010; 2(8):2177-2197.
5. Doyle M, Buchanan R. Food Microbiology: Fundamentals and
Frontiers. 4 th edition. Washington: ASM Press; 2013.
6. Cretenet M, Even S, Le Loir Y. Unveiling Staphylococcus
aureus enterotoxin production in dairy products: a review of recent
advances to face new challenges. Dairy Sci Technol 2011;
91(2):127–150.
7. Scallan E, Hoekstra R, Angulo F, Tauxe R, Widdowson M, Roy S,
Lones J, Griffin M. Foodborne illness acquired in the United
States-Major pathogens. Emerg Infect Dis 2011; 17(1):7-15.
8. López D, Rivero E, Martínez A, Alegret M. Enfermedades
transmitidas por alimentos en Villa Clara. Rev Cubana Hig Epidemiol
2013;51(2):203-213.
9. Di Pietro S, Haritchabalet K, Cantoni G, Iglesias L, Mancini
S, Temperoni A, Labanchi J, Barbarossa N, Garcia M, Cofre M,
Rosales S, Herrero E, Bigatti R, Orellana O, Larrieu E. Vigilancia
epidemiológica de enfermedades transmitidas por alimentos en la
Provincia de Río Negro, Argentina, 1993-2001. Medicina 2004;
64(2):120-124.
10. Vanegas M, González L, Martínez A, Buitrago F. Aislamiento y
caracterización de cepas de Staphylococcus enterotoxigénicos
aislados de quesos en Bogotá. Rev MVZ Córdoba 2008;
13(2):1288-1293.
11. Guerra-Sarmiento M, Palacios-González D, Maestre-Serrano R,
Baena-Del Valle J, Gómez-Camargo D. Identificación de Agentes
Etiológicos Aislados de Muestras Biológicas en Brote por
Intoxicación Alimentaria en el Departamento de Atlántico, Colombia
2008. Rev Cienc Biomed 2013; 4(2):233-241.
12. Santos M, Santos C, González J, López M. Brote de
intoxicación alimentaría en el municipio de Honda, Tolima,
Colombia, Junio de 2009. Inf Quinc Epidemiol Nac 2009;
14(21):321-327.
13. NTC 4779. Norma Técnica Colombiana. Microbiología de
alimentos y alimentos para animales. Método horizontal para el
recuento de Estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus aureus
y otras especies). Bogotá, D.C.: Instituto Colombiano de Normas
Técnicas y Certificación (ICONTEC); 2007. URL Disponible en:
http://tienda.icontec.org/brief/NTC4779.pdf
14. Linage B, Rodríguez-Calleja J, Otero A,
García-López M, Santos J. Characterization of coagulase-positive
staphylococci isolated from tank and silo ewe milk. J Dairy Sci
2012; 95(4):1639–1644.
15. NTC 750. Norma Técnica Colombiana. Productos Lácteos. Queso.
Bogotá, D.C.: Instituto Colombiano de Normas Técnicas y
Certificación (ICONTEC); 2000. URL Disponible en:
http://tienda.icontec.org/brief/NTC750.pdf
16. Mendonça M, Nogueira V, Keizo Y, Tassinari O, Nero L.
Foodborne pathogens and microbiological characteristics of raw milk
soft cheese produced and on retail sale in Brazil. Foodborne Pathog
Dis 2009; 6(2):245-249.
-
4481Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from
cheese
17. Maldonado R, Llanca L. Estudio de la calidad del queso de
mano comercializado en el municipio Girardot, estado Aragua,
Venezuela. Rev Cientif FCV-LUZ 2008; 18(4):431-436.
18. Rodríguez C, Caldas L, Ogeerally P. Calidad sanitaria en
queso artesanal tipo “telita”. Upata, estado Bolívar, Venezuela.
Rev Soc Venezolana Microb 2009; 29(2):98-102.
19. Can H, Çelik T. Detection of enterotoxigenic and
antimicrobial resistant S. aureus in Turkish cheeses. Food Cont
2012; 24(1-2):100-103.
20. Jakobsen R, Heggebø R, Sunde E, Skjervheim M. Staphylococcus
aureus and Listeria monocytogenes in Norwegian raw milk cheese
production. Food Microbiol 2011; 28(3):492-6.
21. Giammanco G, Pepe A, Aleo A, D’Agostino V, Milone S, Mammina
C. Microbiological quality of Pecorino Siciliano “primosale” cheese
on retail sale in the street markets of Palermo, Italy. New
Microbiol 2011; 34(2):179-185.
22. Luján D, Valentín M, Molina M. Evaluación de la presencia de
Staphylococcus aureus en quesos frescos artesanales en tres
distritos de Lima – Perú. Respyn (en línea) 2006. (Fecha de acceso
3 de Abril de 2014); 7(2). URL disponible en:
http://www.respyn.uanl.mx/vii/2/articulos/quesos_frescos-1.htm
23. Komatsu R, Rodrigues M, Loreno W, Santos K. Ocorrência de
Staphylococcus coagulase positiva em queijo minas frescal produzido
em Uberlândia-MG / Occurrence of Staphylococcus coagulase positiva
in fresh minas cheese produced in Uberlândia-MG. Biosci J 2010;
26(2):316-321.
24. Gücükoğlu A, Çadirci Ö, Terzi G, Kevenk TO, Alişarli M.
Determination of enterotoxigenic and methicillin resistant
Staphylococcus aureus in ice cream. J Food Sci 2013;
78(5):738-741.
25. Valero-Leal K, Rivera-Salazar J, Valbuena, E, Boscán L,
Valeris R, Castro G, Briñez W. Caracterización bioquímica y
producción de enterotoxinas de cepas de Staphylococcus aureus
aisladas de leche cruda y queso fresco artesanal en fincas del
estado Zulia. Rev Cientif FCV-LUZ 2012; 22(4):303-314.
26. Ahanotu E, Alvelo-Ceron D, Ravita T, Gaunt E. Staphylococcal
Enterotoxin B as a Biological Weapon: Recognition, Management, and
Surveillance of Staphylococcal Enterotoxin. Appl Biosaf 2006;
11(3):120-126.
27. Kérouanton A, Hennekinne J, Letertre C, Petit L, Chesneau O,
Brisabois A, De Buyser ML. Characterization of Staphylococcus
aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France.
Int J Food Microbiol 2007; 115(3):369-375.
28. Le Marc, Valík l, Medvedová A. Modelling the effect of the
starter culture on the growth of Staphylococcus aureus in milk. Int
J Food Microbiol 2009; 129(3):306–311.
29. Daza A, Herrera F, Naranjo A. Condiciones
higiénico-sanitarias aplicadas en la elaboración de queso doble
crema manufacturado en tres empresas de la provincia de
Pamplona-Colombia. Bistua 2013; 11(2):61-73
30. Cabrera C, Gómez R, Zúñiga A. La resistencia de bacterias a
antibióticos, antisépticos y desinfectantes; una manifestación de
los mecanismos de supervivencia y adaptación. Colomb Med
2007;38(2):149-158.