Engenharia do DNA María Julia Barison BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana Plasmodium falciparum.

Engenharia do DNA

María Julia Barison

BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas

do parasita da malária humana Plasmodium falciparum

USP - 2012

DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de sequencias derivadas de diferentes organismos.

Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante.

Aplicações: Medicina

Produção de hormônios como insulina ou fatores de crescimento Produção de vacinas

Pesquisa Produção de proteínas recombinantes knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais Estudos de expressão e localização subcelular (genes repórteres)

Melhoramento animal e vegetal (OGMs)

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor

2. DNA recombinante

3. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras

4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA

purificado

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor

DNA• PCR• Livrarias de DNA

VETOR

• Plasmídeo Origem de replicação (ORI) Marcador de seleção (resistência a ATB)

Polylinker (sítios de corte únicos para diferentes ER)

• Bacteriófago Lambda/Cosmidos• BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) • YAC

Molecular Cell Biology, 5ta edição

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Tipo Estrutura Cofatores Sítio de reconhecimento

Sítio de corte

Tipo I Multifuncional, várias subunidades

Mg2+, ATP, AdoMet

Asimétrico Aleatóriamente, a distância médias de 1000 pb.

Tipo II Restrição e modificação em enzimas diferentes

Mg2+ Palindrómicos Dentro da sequencia de reconhecimento*.

Tipo III Multifuncional, várias subunidades

Mg2+, ATP, Asimétrico A uma distância de 25-27 pb da seq de reconhecimento.

*Extremos produzidos pelas enzimas tipo II:

Bickle and Krüger (1993); Molecular Cell Biology, 5ta edição

LIGASES

OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM

Vetores tipo T - ligação Clonagem por recombinação

Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras

4. Isolamento, sequenciamento e

manipulação do fragmento de DNA

purificado

Transformação:• Shock térmico• Electroporação

Molecular Cell Biology, 5ta edição

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA

Tipos de mutação:

• Pontual• Deleção• Inserção

Mutação Pontual

Silenciosa Nonsense Missense

Sem Mutação

conservativa Não -conservativa

ESTRATÉGIAS

Sequencia de interes

Introdução da mutação desejada + sítio de restrição

Sítio de restrição que permitirá o screening de clones mutantes

Introdução da mutação desejada

Primer que introduzirá ou eliminará um sítio de restrição

Se um sitio foi eliminado, ele pode ser utilizado para aumentar a proporção de clones mutados.

Sistema pALTER

Mutagênesis sítio dirigida mediante Overlap Extension PCR

PCR

Desnaturação

Re-hibridação

Extensão

Amplificação

Clonagem

Ho, S. N et al (1989)

Screening dos clones mutados:

• Análise por digestão com enzimas de restrição

• Identificação do clone por hibridação com sonda marcada

Hibridação com sonda marcada

Sinal positivo

Colonias de bacterias levando o plasmídeo mutado

Membrana de nitrocelulosa

Incubação da membrana com solução alcalina

DNAss unido à membrana

Adaptado de Molecular Cell Biology, 5ta edição

Obrigada pela atenção!!...