UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE academiejaar 2010 - 2011 PREVALENTIE VAN YERSINIA ENTEROCOLITICA EN YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS BIJ DE BELGISCHE VLEESVARKENS door Gerty VANANTWERPEN Promotor: Prof. Dr. L. De Zutter Medepromotor: Dierenarts I. Van Damme Onderzoek in het kader van de Masterproef
49
Embed
EN YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSISlib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/788/934/RUG01-001788934...Yersinia pestis Yersinia pestis is het primair agens van de zwarte dood en veroorzaakte rond
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
academiejaar 2010 - 2011
PREVALENTIE VAN YERSINIA ENTEROCOLITICA
EN YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS
BIJ DE BELGISCHE VLEESVARKENS
door
Gerty VANANTWERPEN
Promotor: Prof. Dr. L. De Zutter
Medepromotor: Dierenarts I. Van Damme
Onderzoek in het kader van de Masterproef
De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen hiervan te
kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht
betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). De auteur en de promotor(en) zijn niet
verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD
Bij deze gelegenheid wil ik Prof. Dr. Lieven De Zutter bedanken voor de toewijding die hij de
afgelopen drie jaar getoond heeft. Hij stond telkens klaar met verbeteringen, aanpassingen en
vernieuwende inzichten. Hij was altijd bereikbaar als ik hulp nodig had en vond het niet erg als ik na
een lange werkdag 's avonds nog bij hem kwam aankloppen.
Dan wil ik ook mijn welgemeende dank betuigen aan dierenarts Inge Van Damme. Ze heeft me steeds
met raad en daad bijgestaan bij alle mogelijke problemen in het labo en daarbuiten. Inge, je hebt me
meer geleerd dan labotechnieken, kolonies herkennen en PCR's tot een goed einde brengen. Bedankt
ook voor het gezelschap in de wekelijkse, nachtelijke uurtjes op maandag op weg naar het slachthuis.
Het is fijn te weten dat ik op je kan rekenen.
Ook mijn ouders, Marc Vanantwerpen en Gudrun Lagae, mogen niet vergeten worden. Jullie stonden
elke maandagochtend met mij op, of het nu 3u of 4u was. Papa, bedankt om me te helpen met het
bewerken en herwerken van de foto's en met het helpen oplossen van allerhande
computerproblemen.
Tot slot wil ik ook nog mijn vrienden, Nicky Van Der Vekens en Jorien De Loor, bedanken voor hun
begrip toen ik weinig tijd voor hen kon vrijmaken.
enterocolitica en maar 1,8% het gevolg van Y. pseudotuberculosis. Er werd geen informatie verstrekt
over de resterende 6,3%. Gebaseerd op het aantal gerapporteerde gevallen waren er in 2008 in
Europa 1,8 gevallen op 100000 inwoners. In Litouwen en Finland lag de incidentie respectievelijk op
15,9 en 11,5 gevallen op 100000 inwoners. Zes lidstaten van de Europese Unie lieten in 2008 22
voedseluitbraken ten gevolge van yersiniose optekenen. Enkel Finland en Frankrijk lieten deze
uitbraken verifiëren. In deze twee landen waren 53 personen betrokken waarvan er 11
gehospitaliseerd werden. De bron in Finland waren wortelen die gecontamineerd waren met Y.
pseudotuberculosis en 50 mensen besmetten (Anonymous, 2010).
Jonge kinderen tussen 1 en 4 jaar oud worden het vaakst geïnfecteerd, namelijk 25-32% van alle
infecties met Yersinia-species komen in deze leeftijdsgroep voor (Fig. 2). Deze kinderen krijgen 4-7
dagen na blootstelling een vaak bloederige diarree, die 1-3 weken kan aanhouden. Ongeveer een
kwart van de infecties verschijnen bij oudere kinderen van 5-14 jaar. De symptomen zijn gelijk met die
bij de volwassenen: pijn gesitueerd in het rechterabdomen, koorts, eventueel huiduitslag,
gewrichtspijn en septicemie (Anonymous, 2006).
0
200
400
600
800
1000
1200
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
aan
tal g
era
pp
ort
eerd
e g
ev
allen
jaartal
Europa (x10)
België
trendlijn Europa
9
Fig. 2: Yersiniose bij de verschillende leeftijdsgroepen in Europa (naar Anonymous, 2007c)
1.3 Yersinia enterocolitica bij het varken
Y. enterocolitica is dus een voedselgebonden pathogeen en varkensvlees wordt aanvaard als de
belangrijkste infectiebron. Dit gegeven kan aangetoond worden door het aantal gevallen van humane
yersiniose in België en het voorkomen van de consumptie van rauw varkensvlees te vergelijken met
de zeer lage incidentie van yersiniose in de moslimlanden, waar nauwelijks varkensvlees
geconsumeerd wordt. Dankzij de eigenschap om te vermenigvuldigen van -2 tot 42°C kan Y.
enterocolitica eventueel groeien in producten met een bewaartemperatuur van rond het vriespunt
(Nesbakken, 2000; Anonymous, 2007a).
De bacteriën worden bij varkens vooral teruggevonden in de mondholte, hoofdzakelijk op de tong en
in de tonsillen, gevolgd door de ingewanden en de feces (Nesbakken, 2000). De prevalentie van Y.
enterocolitica in Europa is zeer variërend (Fig. 3). Bij onderzoek van de tonsillen fluctueert de
prevalentie van 7,5% in Tsjechië tot 89% in Estland (Simonova et al., 2008; Martinez et al., 2009). Bij
onderzoek van de mest was dit 3,3% in Nederland en 16% in de regio van München (de Boer et al.,
2008; Fredriksson-Ahomaa et al., 2009).
Als de varkensbedrijven van naderbij bekeken worden, varieert het voorkomen van Y. enterocolitica
afhankelijk van het soort bedrijf. Uit een Noorse studie (Skjerve et al., 1998) die het voorkomen van
antistoffen tegen Y. enterocolitica O:3 onderzocht, blijkt dat 53,1% van de gesloten varkensbedrijven
besmet is, terwijl bij de vleesvarkensbedrijven 86,0% positief bevonden is. Op de
vermeerderingsbedrijven wordt Y. enterocolitica teruggevonden op 56,1% van de bedrijven, wat
overeenkomt met het voorkomen op de gesloten varkensbedrijven. Uit een andere studie (Virtanen et
al., 2011) blijkt dat er geen verschil bestaat in prevalentie tussen gesloten bedrijven en
vleesvarkensbedrijven.
0
2
4
6
8
10
12
14
0-4 5-14 15-24 25-44 45-64 ≥65
aan
tal g
eva
llen
pe
r 1
00
00
0 in
wo
ne
rs
leeftijdsgroep
10
Fig. 3: De prevalentie van Y. enterocolitica in Europa op basis van onderzocht
tonsillair weefsel bij vleesvarkens (Bonardi et al., 2003; Nesbakken et
al., 2003; Fredriksson-Ahomaa et al., 2007; Kechagia et al., 2007; de
Boer et al., 2008; Simonova et al., 2008 ; Laukkanen et al., 2009;
Martinez et al., 2009; Fredriksson-Ahomaa et al., 2010; Fondrevez et
al., 2010; Martinez et al., 2010; Van Damme et al., 2010; Martinez et
al., 2011)
Binnen deze bedrijven loopt de prevalentie van Y. enterocolitica bij de varkens ook uiteen. Op de
gesloten bedrijven en de vermeerderingsbedrijven bezitten respectievelijk 35,0% en 37,3% van de
varkens antistoffen, terwijl dit op de vleesvarkensbedrijven 66,0% is. Hieruit blijkt dat gesloten
bedrijven en vermeerderingsbedrijven een beschermende factor vormen ter preventie van de infectie
met Y. enterocolitica (Skjerve et al., 1998). Nowak et al. (2006) toonde aan dat op de organische
vleesvarkensbedrijven (voeder geproduceerd op het bedrijf zelf en geen antimicrobiële additieven in
het voeder) de prevalentie lager ligt dan op de conventionele vleesvarkensbedrijven. Dit werd ook
beweerd door Virtanen et al. (2011), die de organische bedrijven als een beschermende factor
beschouwde, maar dit wijdde aan de oudere slachtleeftijd van de varkens. De
binnenbedrijfsprevalentie van Y. enterocolitica varieert dus afhankelijk van het soort bedrijf (Nowak et
al., 2006).
11
De dynamiek van de infectie binnen een bedrijf is nog niet helemaal duidelijk. Een Amerikaanse studie
(Bowman et al., 2007), bij 2349 levende varkens van diverse leeftijden, toonde een significant verschil
aan in infectiestatus tussen de productiestadia. Enkel de feces en de oropharynx werden via isolatie
onderzocht. Twee van de 500 onderzochte, zogende biggen (0,4%) hadden pathogene Y.
enterocolitica. Amper 0,6% van de biggen uit de biggenbatterij waren positief, terwijl 5,2% van de
mestvarkens de bacterie in zich hadden, waarbij de prevalentie het hoogst was bij de oudere
vleesvarkens. Uit een Duitse studie (Gürtler et al., 2005) die enkel de feces onderzocht van 600
varkens en deze varkens opvolgde gedurende hun productie, bleek dat er geen besmetting
plaatsvond bij de zogende biggen en in de biggenbatterijen. Pas bij de vleesvarkens van 14 weken
oud, werd 2,8% van de varkens positief bevonden. Later, op 20 weken leeftijd, was 19,6% reeds
gecontamineerd. Naarmate de varkens ouder worden, neemt het aandeel van besmette dieren dus
toe.
Bij experimentele infecties vertonen alle varkens een seroconversie op dag 19 post infection (p. i.),
terwijl de feces van alle varkens bij isolatie positief zijn van dag 5 tot dag 21 p. i.. Op dag 49 p. i. is de
fecale uitscheiding gedaald tot 10% van de varkens en wordt er geen Y. enterocolitica meer
uitgescheiden 68 dagen p. i. (Nielsen et al., 1996).
Het onderzoek naar de natuurlijke en experimentele infecties kan ertoe leiden dat de methode en het
soort weefsel dat gebruikt wordt voor onderzoek, varieert naargelang de leeftijd van het varken. Via
bacteriële isolatie uit de tonsillen kunnen varkens van 85 dagen oud tot slachtleeftijd (6 maand)
bemonsterd worden. De isolatie uit de feces is betrouwbaar vanaf een leeftijd van 85 tot 135 dagen.
Dit betekent dat tijdens het slachten beter de tonsillen verzameld worden dan de feces. Serologisch
kunnen de varkens onderzocht worden van zodra ze 100 dagen oud zijn tot slachtleeftijd (Nesbakken
et al., 2006).
Er werd reeds beperkt onderzoek verricht op de varkensbedrijven om de risicofactoren en de
beschermende factoren voor infectie op te sporen. Als risicofactor kunnen strobedding in de hokken
van de slachtvarkens, dagelijkse aanwezigheid van katten in de stallen en het vervoer van varkens
naar het slachthuis met eigen transportmiddelen aangehaald worden (Skjerve et al., 1998). Een
verhoogde fecale uitscheiding van de bacteriën wordt bekomen bij varkens met een hogere
gezondheidsstatus, meer neuscontact en het gebruik van tetracyclines (Virtanen et al., 2011). Het
manueel voederen van slachtvarkens en onderdrukventilatie daarentegen worden opgevat als
beschermende factoren (Skjerve et al., 1998).
12
Tabel 3. Bereiding en interpretatie van de media nodig ter detectie van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis
2. Eigen onderzoek
Het beschreven onderzoek kadert in een project om de prevalentie van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis bij de vleesvarkens in België te bepalen,
aangezien in België hieromtrent geen gegevens beschikbaar zijn. Dit project loopt over een periode van één jaar, waaraan in het kader van deze Masterproef
zes maand meegewerkt is. Naast de bepaling van de prevalentie werden de gegevens ook gebruikt om de detectiemethodes te vergelijken en om de
risicofactoren op contaminatie in het slachthuis nader te bekijken. Voor dit laatste moeten de resultaten van de volledige studie afgewacht worden omdat er nu
te weinig gegevens beschikbaar zijn.
2.1. Materiaal en methoden
2.1.1. Bereiding en interpretatie van de media
medium bestanddelen voor 1 l bereiding a, b,c
interpretatie en opmerkingen
Phosphate-Buffered Saline met
0,5% pepton, 1% mannitol en
0,15% galzout (PMB)
5 g Tryptone (Lab M Limited,
Lancashire, Verenigd
Koninkrijk)
10 g D-mannitol (Sigma)
8,23 g Disodium Hydrogen
Phosphate (Merck, Overijse,
België)
1,2 g Sodium Dihydrogen
Phosphate Monohydrate
(Merck)
1,5 g Bile Salts (Oxoid,
Basingstoke, Verenigd
Koninkrijk)
5 g NaCl
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, pH aanpassen naar 7,6,
gedeelte overbrengen naar proefbuizen (20
ml per buisje), autoklaveren,
1 maand houdbaar bij 4°C
13
a autoklaveren: sterilisatie bij 121°C gedurende 15 min
b ureum autoklaveren: sterilisatie bij 115°C gedurende 20 min
c pH: (± 0,2) bij 25°C
medium bestanddelen voor 1 l bereiding a, b,c
interpretatie en opmerkingen
Irgasan-Ticarcilline-
Kaliumchloraatmedium (ITC)
62 g ITC Broth (Sigma,
Steinheim, Duitsland)
970 ml gedeïoniseerd water
1 g KClO3
Oplossen, autoklaveren, pH aanpassen
naar 6,9, verdeling: 45 ml per buis en
90 ml per fles, net voor gebruik 45 μl
ticarcilline (1 mg/ml) (Sigma) aan de
buizen en 90 μl ticarcilline (1 mg/ml)
aan de flesjes toevoegen
1 maand houdbaar bij 4°C
Yersinia Cin Schiemann Agar
(CIN)
aangekocht bij Bio-Rad (Eke, België)
Plate Count Agar (PCA) 20,5 g Plate Count Agar (Bio-
Rad, Marnes-La-Coquette,
Frankrijk)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, koken, autoklaveren,
verdeling: 60 petriplaten, eindpH 7,0
1 maand houdbaar bij 4°C
fijne, niet-gepigmenteerde culturen zijn
verdacht
Kligler Iron Agar (KIA) 55 g Kligler Iron Agar (Oxoid)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, koken, pH aanpassen naar
7,4, verdeling: 7,5 ml per buisje,
autoklaveren, schuin houden tot ze
afgekoeld zijn
1 maand houdbaar bij 4°C
tongverkleuring wijst op
lactosefermentatie
geel: +
rood: -
stompverkleuring wijst op
glucosefermentatie
geel: +
rood: -
zwartverkleuring wijst op H2S-vorming
gasvorming wijst op de aanwezigheid van
gasvormende bacteriën
Urea Broth volgens Christiansen
(Ur)
9 g Urea Broth Base (Oxoid)
950 ml gedeïoniseerd water
50 ml Supplement Urea (40%)
(Oxoid)
Oplossen, autoklaveren, afkoelen, pH
aanpassen naar 6,8, supplement
toevoegen, verdeling: 2 ml per buisje
1 maand houdbaar bij 4°C
geel: -
roze: +
Trypton Soya Broth (TSB) 30 g T. C. S. (Bio-Rad)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, pH aanpassen naar 7,3,
verdeling: 5 ml per buisje, autoklaveren
1 maand houdbaar bij 4°C
14
2.1.2. Methoden
2.1.2.1. Proefopzet
Er werd een selectie gemaakt uit alle Belgische varkensslachthuizen. De voorwaarde was dat ze meer
dan 100000 varkens per jaar slachten. De selectie bestond uit 22 slachthuizen. De computer koos hier
ad random tien slachthuizen uit. Op deze manier kon de prevalentie van Y. enterocolitica en Y.
pseudotuberculosis in België onderzocht worden. De gekozen slachthuizen werden op voorhand
allemaal eens bezocht en er werd een enquête ingevuld (bijlage I). Hierbij werd de organisatie van de
infrastructuur, het slachtritme, de verschillende stadia van het slacht- en het evisceratieproces, de
reiniging en de desinfectie van de gebruikte messen en apparatuur bekeken. Het is de bedoeling elk
slachthuis vier maal te bezoeken. In het kader van deze masterproef werd elk slachthuis twee keer
bezocht. Door het stoppen van de werkzaamheden van één van de uitgekozen slachthuizen tijdens
deze proef, werden uiteindelijk twee keer negen slachthuizen bezocht. Tijdens elk slachthuisbezoek
werd tijdens de staalnames opnieuw een enquête ingevuld, waarbij het klopnummer van de
bemonsterde varkenskarkassen werd genoteerd en gelet werd op de reiniging en desinfectie van de
messen bij het verwijderen van de buikorganen en de hartslag en op het aansnijden van de darmen
(bijlage II).
2.1.2.2. Staalname
Alle bemonsteringen gebeurden telkens op een maandagochtend. De staalnames werden aangevat
binnen 15 min na de aanvang van de evisceratie van het eerste varken en telkens werd om het
kwartier een varken bemonsterd. Van telkens tien varkens werden de volgende zes stalen genomen:
het rectum (D), de tonsillen (T) en vier karkasswabs (K1 tot K4), namelijk ter hoogte van het
bekkenkanaal (K1), het kapvlak (K2), de borst (K3) en de kauwspieren (K4) (Fig. 4). Er werden 106
loten bemonsterd. Het aantal bemonsterde varkens per lot varieerde van 1 tot 6.
Aan het begin van de evisceratie, net na het opensnijden van de buikholte, worden de buikorganen uit
het karkas verwijderd. Op dit moment werd dit maagdarmpakket opgevangen en bijgehouden in een
grote, genummerde plastiekzak. Wanneer de tijd er zich toe leende, tussen de andere staalnames
door, werd de zak geopend en het rectum opgezocht. Op de plaats waar het colon in het rectum
overgaat, werden twee koordjes vastgemaakt om het rectum af te binden, waarna tussen de touwtjes
een incisie gemaakt werd. Het rectum werd overgebracht in een nieuwe, kleinere plastiekzak.
De tonsillen (tonsilla veli palatini) werden op steriele wijze zo volledig mogelijk uit de hartslag, uit de
kop of uit beiden verwijderd. De plaats waar de tonsillen teruggevonden werden, was afhankelijk van
de manier waarop het slachthuispersoneel de hartslag uitsneed (Fig. 5a en Fig. 5b). Het tonsillair
weefsel werd in een steriel zakje overgebracht.
Aan elke steriele cellulosespons (3MTM
Sponge-Stick SSL100, 3M, Diegem, België) werd net voor de
bemonstering 20 ml PMB toegevoegd. De swab werd doorheen zijn steriele zakje enkele keren
leeggedrukt en losgelaten zodat de PMB in voldoende mate door de swab opgenomen werd en de
swab voldoende bevochtigd werd. Er werd bemonsterd na het klieven van het karkas, zodat per
varken afwisselend de linker- of de rechterkarkashelft bemonsterd kon worden.
15
Fig. 4: Bemonsteringsplaatsen op het karkas
De onderzochte oppervlakte per bemonsteringsplaats was steeds ± 100 cm² groot. De eerste plaats
die afgeswabt werd, was het bekkenkanaal ter hoogte van de passage met de anusboor. Deze plaats
werd gekozen om fecale verontreiniging te detecteren. Het tweede staal werd genomen tussen de
sacraalwervels en de dorsale huid (het kapvlak) om bacteriële overdracht via de kapmachine te
ontdekken. Vervolgens werd met een derde swab de huid net achter de voorpoot (de borst) en de
borstspieren bemonsterd. Ook op deze plaats kan fecale verontreiniging voorkomen. De laatste swab
werd genomen van de kauwspieren waarbij er op gelet werd de tonsillaire regio te vermijden om
kruiscontaminatie tijdens de staalname te voorkomen. Deze plaats werd gekozen om de invloed van
het opensnijden en de manipulatie aan de kop te bekijken. Soms werd er geswabt wanneer het karkas
voor dit onderzoek even van de slachtlijn gehaald werd, in andere slachthuizen werden de stalen
16
Fig. 5a: De tonsilla veli palatini ter hoogte van de
hartslag: (A) er zijn geen tonsillen meer
aanwezig, (B) nog één tonsil aanwezig of
(C) beide tonsillen aanwezig
genomen terwijl het varken de slachtlijn bleef volgen. De steel van de swabs werd afgebroken zodat
de genummerde zakjes gesloten en getransporteerd konden worden.
Na tien varkens bemonsterd te hebben, werden alle stalen gekoeld getransporteerd naar het
laboratorium van de Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid van de Faculteit
Diergeneeskunde van de Universiteit Gent, om daar verder onderzocht te worden.
2.1.2.3. Bereiding van de homogenaten
De stalen werden bij aankomst in het labo onmiddellijk verder verwerkt tot homogenaten, die als basis
dienden voor de verschillende analysen (Fig. 6).
Het zakje van de tonsillen werd steriel opengeknipt, waarna de tonsil op steriele wijze van zijn
omgevende weefsel ontdaan werd en in kleine stukjes werd verdeeld. Daarna werd een hoeveelheid
van 11 g tonsillair weefsel in een steriele stomacherzak afgewogen en aangevuld met 99 ml PMB. De
zak werd overgebracht in een Colworth Stomacher 400 (Seward, West Sussex, Verenigd Koninkrijk)
en gedurende 2 min gehomogeniseerd. Het rectum werd uit de transportzak gehaald en het uiteinde
waar nog een koordje aan bevestigd was, werd 2 s in de ethanol ondergedompeld. Nadat de ethanol
verdampt was, werd net naast het koordje een dwarse incisie gemaakt. Vervolgens werd de mest naar
deze nieuwe opening gemasseerd en werd 11 g darminhoud naar buiten geduwd en in een steriele
filterzak overgebracht. Indien dit niet lukte, werd met een propje watte dat bevochtigd was met
ethanol, de darmwand over zijn volledige lengte gesteriliseerd. Daarna kon hier een longitudinale
incisie gemaakt worden waardoor de darmmucosa zichtbaar werd. De darminhoud kon dan van deze
darmmucosa afgelepeld worden. In de filterzak werd de darminhoud aangelengd met PMB tot een
verhouding 1/10 ontstond. De zak werd overgebracht in de stomacher en gedurende 2 min
gehomogeniseerd. De verdere verwerking van de karkasswabs bestond uit het stomacheren van de
zakjes. Op deze manier werden alle stalen verwerkt tot homogenaten die gebruikt werden voor de
directe uitplating, de aanrijking in ITC en de koude aanrijking.
Fig. 5b: De tonsilla veli palatini zijn nog
aanwezig in de kop
17
Fig. 6: Gevolgde methode ter detectie en bevestiging van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis
2.1.2.4. Directe uitplating
Er werd tweemaal 0,5 ml van alle homogenaten (T, D, K1-K4) drooggespateld op een CIN-plaat en de
T- en D-homogenaten werden ook met de spiraalenter (Eddie Jet, IUL Instruments, Barcelona,
Spanje) op een CIN-plaat uitgeënt. Alle platen werden geïncubeerd bij 30°C gedurende 24 h. Tien ml
van zowel T- als D-homogenaten werden overgebracht in flesjes met 90 ml ITC, waarna dit flesje
geschud werd en geïncubeerd werd bij 25°C gedurende 48 h. Vijf ml PMB die uit de swab gedrukt
werd, werd overgebracht in een proefbuis met 45 ml ITC, die na het schudden met een vortex 48 h bij
25°C geïncubeerd werd. Er werd nog 11 ml steriele PMB aan de swab toegevoegd, waardoor de swab
bijna volledig ondergedompeld was in PMB. Alle homogenaten met PMB werden geïncubeerd bij 4°C
(frigotemperatuur).
T + PMB
D + PMB
K1-K4 + PMB
T, D: 90 ml ITC
K1-K4: 45 ml ITC
2 X (0,5 ml op CIN)
T, D: 10 ml
K1-K4: 5 ml
48 h bij 25°C
0,5 ml in
4,5 ml KOH
(0,5%)
7 d bij 4°C
7 d bij 4°C
0,5 ml in 4,5 ml
KOH (0,25%)
T, K1-K4: 10 μl op CIN
D: 100 μl op CIN
100 μl op CIN 100 μl op CIN 100 μl op CIN
24 h bij 30°C 24 h bij
30°C 24 h bij 30°C 24 h bij
30°C
24 h bij
30°C
verdachte kolonies uitplaten op PCA
enten op Ur, KIA en TSB
DNA-extractie
multiplex PCR
24 h bij 30°C
24 h bij 30°C
urease +
glucose +
lactose –
H2S –
gas –
18
2.1.2.5. Aanrijking in ITC
Na twee dagen incubatie bij 25°C in ITC werden de flesjes en proefbuizen nog eens geschud met een
vortex. Van de ITC (T en K1-K4) werd telkens met een öse 10 μl geënt op een CIN-plaat. Honderd μl
ITC, dat afkomstig was van de darminhoud, werd eveneens uitgestreken op een CIN-agar. Er werd
ook een alkalibehandeling voor het uitplaten uitgevoerd. Daartoe werd 0,5 ml ITC overgebracht in
proefbuizen met 4,5 ml KOH-oplossing (0,5% KOH in 0,5% NaCl) en met een vortex geschud. Na een
contacttijd van 20 s werd 100 μl van het homogenaat op een CIN-plaat geënt. Alle CIN-agars werden
gedurende 24 h bij 30°C geïncubeerd.
2.1.2.6. Koude aanrijking in PMB
Na één week bij 4°C geïncubeerd te zijn, werd van elk zakje (T, D en K1-K4) met PMB 100 μl
uitgeplaat op een CIN-agar. Deze platen werden dan 24 h bij 30°C geïncubeerd. De zakjes met PMB
werden terug in de frigo geplaatst om verder bij 4°C te incuberen.
Veertien dagen na de staalname, werden de PMB-oplossingen (T, D en K1-K4) voor de derde keer
geënt. Hiervoor werd 0,5 ml PMB samengebracht met 4,5 ml KOH-oplossing (0,25% KOH in 0,75%
NaCl) en met een vortex geschud. Na 20 s werd 100 μl overgebracht op een CIN-plaat en
uitgestreken. De CIN-platen werden 24 h bij 30°C geïncubeerd.
2.1.2.7. Aflezen van CIN-platen
Alle CIN-platen werden na één dag incubatie zowel macroscopisch als onder een stereomicroscoop
met Henry-belichting (Olympus, Aartselaar, België) bekeken. Bij aanwezigheid van verdachte kolonies
werd minstens één kolonie afgenomen en overgezet op een PCA-plaat. Dit konden zowel kolonies zijn
met het typisch uitzicht van Y. enterocolitica of Y. pseudotuberculosis, als kolonies die morfologische
gelijkenissen vertoonden met deze bacteriën. De PCA-platen werden 24 h bij 30°C geïncubeerd. De
CIN-platen werden 24 h later nogmaals bekeken, om de trager groeiende Y. pseudotuberculosis niet
te missen.
2.1.2.8. Biochemische bevestiging
Indien de groei op de PCA-plaat de aanwezigheid van Y. enterocolitica of Y. pseudotuberculosis liet
vermoeden, werd van elke detectiemethode één PCA-cultuur geënt op TSB, Ur en KIA. Bij lichte
morfologische afwijkingen werd de cultuur ook geënt. Hiervoor werd met een gesteriliseerde entnaald
een deel van de cultuur op PCA afgenomen en een klein entpuntje werd geplaatst net boven het
vloeistofoppervlak van de schuingehouden TSB- en Ur-buisjes. Met diezelfde entnaald werd daarna
over de tong van de KIA gestreken en daarna tot op de bodem doorgestoken. Zowel de TSB, de Ur
als de KIA werden 24 h bij 30°C geïncubeerd. Enkel indien de Kligler Iron Test en de Ureum Test
lieten blijken dat de stammen positief waren voor urease en glucose, negatief voor lactose en H2S en
er geen gasvorming optrad, werden lysaten van de culturen gemaakt.
19
2.1.2.9. DNA-extractie
Er werd 100 μl aangerijkte TSB overgebracht in een 1,5 ml epje (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en
gecentrifugeerd gedurende 2 min bij 12000 tpm. Hierna werd het supernatans verwijderd en 50 μl
PrepMan® Ultra (Applied Biosystems, Foster City, Verenigde Staten) toegevoegd waarmee de pellet
gesuspendeerd werd. Alle epjes werden gemengd met een vortex waarna ze gedurende 10 min in
een heat-block (Grant, Cambridge, Verenigd Koninkrijk) werden geplaatst bij 100°C. Na 2 min
afkoeling op kamertemperatuur werden de epjes terug 2 min gecentrifugeerd aan 12000 tpm. Er werd
30 μl supernatans overgebracht in een nieuw 1,5 ml Eppendorf-epje en ingevroren bij -20°C.
2.1.2.10. Polymerase Chain Reaction
Elk staal werd gebruikt in twee multiplex PCR reacties om het serotype en de virulentiefactoren op te
sporen. Hiertoe werden de epjes ontdooid en werd er telkens 2,5 μl toegevoegd aan 22,5 μl PCR-mix
in 0,2 ml Eppendorf-epjes. Voor één staal bestaat de PCR-mix uit 1x PCR-buffer (Promega, Leiden,
Nederland), 200 μM dNTP Mix (Invitrogen, Carlsbad, Verenigde Staten), 1,5 mM MgCl2 (Promega),
0,5 mM per primer (Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk), 1 U Taq DNA polymerase (Promega).
Deze mix werd dan aangevuld tot 22,5 μl met water.
Aan de eerste multiplex PCR (PCR 1) werden nog twee controles toegevoegd: een positieve controle
met DNA van een O:3 referentiestam en een negatieve controle zonder DNA. Bij de tweede multiplex
PCR (PCR 2) werden drie controles gebruikt: twee positieve controles met DNA van een O:3 en een
O:9 referentiestam, en een blanco. Het DNA gebruikt voor de positieve controles, is meer
geconcentreerd dan het DNA van de lysaten. Er werd hierdoor 0,5 μl aan 22,5 μl PCR-mix
toegevoegd.
Al deze epjes werden in de iCycler® (Bio-Rad) geplaatst om de PCR amplificatie uit te voeren. De
amplificatie volgde verschillende stappen. Bij de eerste stap werd het DNA gedenatureerd bij 94°C
gedurende 4 min. Daarop volgden 30 cycli van 3 stappen: denaturatie bij 94°C gedurende 30 s,
aanhechting van de primer bij 55°C gedurende 30 s en primerextensie bij 72°C gedurende 1 min. De
derde stap is een finale extensie bij 72°C gedurende 7 min. Bij PCR 1 werden de genen ail, yst en virF
geamplificeerd om aan te tonen dat het om een pathogene Y. enterocolitica gaat en om het
virulentieplasmide op te sporen. Bij de PCR 2 werden per en rfbC vermenigvuldigd om het serotype te
bepalen. Deze twee genen staan in voor de detectie van respectievelijk serotype O:9 en serotype O:3
(Weynants et al., 1996; Jacobsen et al., 2005). Indien het staal verdacht was van Y.
pseudotuberculosis, werd een derde PCR (PCR 3) uitgevoerd om het gen inv te detecteren De
aanhechting van de primer gebeurde dan bij 58°C. Het geamplificeerde product mocht geen gelijkenis
vertonen met het inv van Y. enterocolitica (Tabel 4) (Nakajima et al., 1992).
20
Tabel 4. Sequentie van de gebruikte primers en de grootte van het geamplificeerde product
Tabel 5. Bestanddelen en bereiding van een 1,5% agarosegel voor 20 stalen
a De bestanddelen voor TBE zijn voor de bereiding van 1 l TBE (10x)
primer oligonucleotidesequentie (5’-3’) grootte van het geamplificeerde
product (bp) referentie
ail-a TGG TTA TGC GCA AAG CCA TGT 356 Harnett et al., 1996
ail-b TGG AAG TGG GTT GAA TTG CA
yst-a GTC TTC ATT TGG AGG ATT CGG C 134 Harnett et al., 1996
yst-b AAT CAC TAC TGA CTT CGG CTG G
virF-a GCT TTT GCT TGC CTT TAG CTC G 231 Harnett et al., 1996