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Empleo de proteínas multiepitópicas recombinantes, candidatas a
vacuna, para
el diagnóstico del Adenovirus Aviar tipo I
* Francesca Falconi-Agapito.1
David Requena 1, 2
Manuel Ramirez1, 2
Hugo Valdivia1, 2
Luis E. Saravia1
Mirko Zimic1, 2
Manolo Fernandez1
1. FARVET S.A.C., Farmacológicos Veterinarios S.A.C. Chincha
Alta, Chincha, Ica – Peru.
2. Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular,
Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias y
Filosofía. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio
Delgado 430, San Martin de Porres. Lima - Peru.
RESUMENLa hepatitis con cuerpos de inclusión es una enfermedad
que tiene como agente causal al Adenovirus aviar tipo I (AVA) que
afecta principalmente pollos de engorde y se caracteriza por
presentar una elevada mortalidad. En el presente estudio se evaluó
el valor diagnóstico de tres proteínas multiepitópicas
recombinantes en una prueba de ELISA para inmunoinformático de
genomas completos de NetMHCIIpan, prediciendo in silico epítopes T
lineales conservados e inmunodominantes, potencialmente reactivos
al MHC-I y MHC-II de pollo. Con estos epítopes, se
construyercodificaron a proteínas multiepitópicas, designadas como
ISB, IISB y IWB. Las proteínas fueron expresadas en E. coli,
purificadas por resina de níquel y cuantificadas para su evaluación
en una prueba de ELISA como antígenos de captura. Se emplearon
sueros positivos de aves SPF Hyexperimentalmente con AVA-4; así
como sueros negativos de aves SPF y sueros de aves de Charles River
positivos a patógenos aviares distintos de AVA-4. Los resultados
fueron comparados code ELISA. El valor diagnóstico de cada antígeno
fue estimado en base a la curva ROC (Receiver Operating Curve). Las
áreas bajo la curva fueron 0.8571, 0.9701, 0.9325 y 0.6089, para
ISB, IISB, IWB y el kit comercial, respectivamente. Los valores de
cut-off de 0.58, 0.381, 0.428 y 0.4028; con estimados de
sensibilidad y especificidad para ISB, IISB, IWB y el kit comercial
de 86.36 y 85.71%; 90.91 y 94.29%; 90.9% y 82.86%; y 62.50 y
62.86%, respectivamente. Según estos resultados, la
proteíncandidata como una futura herramienta de diagnóstico;
resultados consistentes con el hecho que IISB está constituida por
los mejores epítopes MHC-II identificados y asociados a una
respuesta de anticuerpos.
PALABRAS CLAVEAdenovirus aviar, epitopes inmunodominantes,
proteína multiepitópica, curva ROC.
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INTRODUCCIONLa hepatitis con cuerpos de inclusión (HCI)/síndrome
de hidropericardio (SHP) tienen como agente causal al Adenovirus
aviar tipo I, serotipo 4 (AVA-4) y han sido reportadas afectando
tanto pollos de engorde y aves de postura, caracterizándose por
presentar una elevada mortalidad. Parece ser que la
inmunosupresión, previa o simultánea a una infección con AVA es
necesaria para desarrollar la enfermedad (Hess, 2000; Hafez,
2011).Los kits de diagnóstico comerciales para AVA están basados en
el uso del virus completo como antígeno y están normalmente
asociados con falsos positivos debido a reactividad serológica
cruzada y altos costos en la producción de antígeno. Esto ha
requerido la necesidad de desarrollar antígenos alternativos para
reemplazar el empleo del virus completo como antígeno en las
pruebas de diagnóstico, que sean costo efectivas, sencillas y que
combinen sensibilidad con especificidad (Kumar et al., 2008).Para
lograr este fin empleamos una nueva aproximación que involucra la
creación de proteínas multiepitópicas, el empleo de estas proteínas
han sido reportadas en otra enfermedades (Houghton et al., 2000;
Duthie et al., 2010; Lin et al., 2008). El objetivo del presente
trabajo fue evaluar el valor diagnóstico de 3 proteínas
recombinantes multiepitópicas: ISB, IISB y IWB candidatas a vacuna
contra Adenovirus aviar tipo I mediante la prueba de ELISA.
MATERIALES Y METODOSAnálisis inmunoinformáticoA partir de 6
genomas de AVA-4 se seleccionaron genes que codificaban para
proteínas expuestas empleando los servidores online SignalP-4 y
TMHMM. Posteriormente se emplearon los servidores NetMHCcons y
NetMHCIIpan, para la predicción in silico de epítopes T lineales
conservados e inmunodominantes potencialmente reactivos al MHC-I y
MHC-II de pollo. Luego aquellos epitopes que mostraban una elevada
promiscuidad y conservación con epítopes presentes en el genoma del
pollo fueron descartados. Finalmente se realizó el ordenamiento de
los epitopes seleccionados y las secuencias de las proteínas
candidatas fueron optimizadas para su expresión en Escherichia
coli. Seis residuos de histidina (his-tag) fueron introducidos en
la porción N-terminal de la proteína. Con estos epítopes, se
construyeron 3genes sintéticos que codificaron a proteínas
multiepitópicas, designadas como ISB, IISB y IWB (Tabla
1).Expresión y purificación de proteínasLas secuencias de las 3
proteínas candidatas fueron insertadas independientemente en el
plásmido pET28. E. coli rosetta fueron transformadas con el
plásmido y las colonias transformantes fueron seleccionadas por su
resistencia a antibiótico. La expresión de las proteínas fue
producida en caldo Luria, cuando la absorbancia alcanzó un valor de
0.6 a una longitud de 600 nm se agregó el IPTG (1mM) y se cultivó
por 4 horas en agitación. Las bacterias fueron peleteadas, lisadas
por shock calor frio seguido por sonicación, el lisado fue
clarificado por centrifugación. El sobrenadante fue usado para
purificar las proteínas por cromatografía de afinidad empleando
columnas de níquel. Las fracciones conteniendo las proteínas fueron
cuantificadas por el método de Bradford.Muestras: Se emplearon 21
sueros positivos de aves SPF Hy-line infectadas experimentalmente
con AVA-4, y una muestra de suero de Charles River positiva a AVA
tipo I. Además 25 sueros negativos de aves SPF y 10 muestras de
sueros de pollo de Charles River negativos a AVA-4, pero positivos
a distintos patógenos aviares: Viruela aviar, Virus de la
enfermedad de Newcastle, Avibacterium paragallinarum, Virus de
Gumboro, Virus de Bronquitis infecciosa, Influenza aviar, Virus de
laringotraqueitis infecciosa. ELISAPlacas de poliestireno de 96
pozos fueron cubiertas con 100 μl de la proteína multiepitópica a
una concentración de 500 ng/ml, diluida en buffer
carbonato-bicarbonato pH 9.6 e incubadas overnight a 4ºC.
Posteriormente las placas fueron lavadas 6 veces con PBS + 0.05%
Tween 20 (PBST). Continuó un paso de bloqueo con 200 μl de PBST +
3% leche descremada por 1 hora a 37ºC, para luego ser lavados 6
veces con PBST. Subsecuentemente se colocaron 100 μl de las
muestras de suero diluidas 1:500 en PBST e incubadas por 1 hora a
37ºC; transcurrido el tiempo se lavaron las placas 6 veces con
PBST. Los
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anticuerpos específicos contra AVA fueron detectados
posteriormente agregando 100 μl de anti-inmunoglobulina Y total
conjugada a peroxidasa de rábano, diluida 1:5000 en PBST y se
incubaron las placas por 30 min a 37ºC, para luego ser lavados 6
veces con PBST. Se adicionó luego la solución de revelado que
consistió en TMB (tetrametilbenzidina), en este paso final las
placas fueron incubadas por 15 min, para luego detener la reacción
con 50 μl de una solución de H2SO4 al 2N. La absorbancia fue
determinada empleando un lector de microplacas (EON, Biotek) a 450
nm. Los resultados fueron comparados con un kit comercial de
ELISA.Análisis estadístico.Los datos fueron procesados con GraphPad
Prism 5.0. El test Mann-Whitney U no paramétrico fue empleado para
la comparación estadística de los resultados de ELISA entre los
grupos infectados y sueros de animales control. La curva de
características operativas del receptor (ROC) fue empleada para
evaluar la habilidad de las tres proteínas y el kit comercial para
distinguir el mejor marcador. El punto de corte fue definido como
la mayor suma de los estimados de sensibilidad y especificidad. El
área bajo la curva fue usada como una medida de la precisión de la
técnica. (Swets, 1988).
RESULTADOS Y DISCUSIÓNLas curvas ROC fueron usadas para comparar
el valor diagnóstico de las 3 proteínas (Figura 1). Las áreas bajo
la curva fueron 0.8571, 0.9701, 0.9325 y 0.6089, para ISB, IISB,
IWB y el kit comercial, respectivamente. Los valores de punto de
corte fueron 0.58, 0.381, 0.428 y 0.4028; con estimados de
sensibilidad y especificidad para ISB, IISB, IWB y el kit comercial
de 86.36 y 85.71%; 90.91 y 94.29%; 90.9% y 82.86%; y 62.50 y
62.86%, respectivamente.
Tabla 1: Características de las proteínas multiepitópicas
evaluadasProteína Epitope Peso molecular
ISB MHC-I 16 kDa
IISB MHC-II 18 kDa
IWB MHC-I 15.7 kDa
Figura 1. Curvas ROC (características operativas del receptor).
A: Curva ROC de ISB. B: Curva ROC de IWB, C: Curva ROC de IISB, D:
Curva ROC de Kit comercial. a: área bajo la curva ROC, b:
sensibilidad; c:
especificidad.
Figura 2. Niveles de IgY específicos contra las proteínas
multiepitópicas (A: ISB; B: IWB; C: IISB; D: Kit comercial)
evaluadas en individuos control negativos (n=35) e individuos
infectados (n=22) con AVA. Cada punto representa un sujeto. Líneas
negras horizontales representan la mediana y las líneas punteadas
rojas el punto de corte. Prueba no parámetrica Mann- Whitney U; se
asignó un p
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CONCLUSIONESLa proteína IISB, dados los altos valores de
sensibilidad y especificidad, al mayor área bajo la curva ROC y a
que el punto de corte establecido fue menor, constituye la mejor
candidata como una futura herramienta de diagnóstico para
SHP/HCI.
BIBLIOGRAFÍA1. Duthie MS, et al. 2010. Rational Design and
Evaluation of a Multiepitope Chimeric Fusion Protein
with the Potential for Leprosy Diagnosis. Clin Vaccine Immunol.
17(2):298-303.2. Hafez, M. H. 2011. Avian Adenoviruses Infections
with Special Attention to Inclusion Body
Hepatitis/Hydropericardium Syndrome and Egg Drop Syndrome. Pak
Vet J. 31(2): 85-92.3. Hess, M. 2000. Detection and differentiation
of avian adenoviruses: a review. Avian Pathology. 29,
195– 206.4. Houghton RL, et al. 2000. Multiepitope synthetic
peptide and recombinant protein for the detection of
antibodies to Trypanosoma cruzi in patients with treated or
untreated Chagas' disease. J Infect Dis.181(1):325-30.
5. Kumar, R., Chandra, R. 2004. Studies on structural and
immunogenic polypeptides of hydropericardium syndrome virus by
SDS-PAGE and western blotting. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis.
27: 155–161.
6. Lin X, et al. 2008. Recombinant multiepitope protein for
diagnosis of leptospirosis. Clin Vaccine Immunol.
15(11):1711-4.
7. Swets, J. A. 1988. Measuring the accuracy of diagnostic
systems. Science. 240: 1285-1293.