Emlős sejtek tenyésztésephysiology.elte.hu/gyakorlat/szakirany/Cell_cultivation... · 2016-03-11 · Ismertebb médiumok: 3. RPMI-1640 medium was developed by Moore et al., at

Emlős sejtek tenyésztése

A sejttenyészetek fenntartása

Tápfolyadék (médium)

• Sók (NaCl, KCl, CaCl2, stb.)• Esszenciális aminosavak• Glükóz• Vitaminok• Puffer (pl.: Na-bikarbonát,

HEPES)• Antibiotikum+gombaölő• Indikátor (fenolvörös)• + tápfolyadék kiegészítők –

supplements (szérum /FCS/, B27 stb.)

A tápfolyadékok (médiumok) összetétele ismert és a szállító cég honlapján elérhető

Ismertebb médiumok:1. Minimum Essential Medium (MEM), developed by Harry Eagle, is one of the

most widely used of all synthetic cell culture media. Early attempts to cultivate normal mammalian fibroblasts and certain subtypes of HeLa cells revealed they had specific nutritional requirements that could not be met by Eagle’s Basal Medium (BME). Subsequent studies using these and other cells in culture indicated additions to BME could be made to aid growth of a wider variety of fastidious cells. MEM, which incorporates these modifications, includes higher concentrations of amino acids so the medium more closely approximates the protein composition of cultured mammalian cells. MEM has been used forcultivation of a wide variety of cells grown in monolayers. Optional supplementation of non-essential amino acids to the formulations that incorporate either Hanks’ or Earle’s salts has broadened the usefulness of this medium. The formulation has been further modified by optional elimination of calcium to permit growth of cells in suspension culture.

2. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) is a modification of Basal Medium Eagle (BME) that contains a 4-fold higher concentration of amino acids and vitamins, as well as additional supplementary components. The original DME formula, first reported for culturing embryonic mouse cells, contained 1,000 mg/L of glucose. An alteration with 4,500 mg/L glucose is optimal in cultivating certain cell types.

Ismertebb médiumok:3. RPMI-1640 medium was developed by Moore et al., at Roswell Park Memorial

Institute, hence the acronym RPMI. The formulation is based on the RPMI-1630 series of media utilizing a bicarbonate buffering system and alterations in the amounts of amino acids and vitamins. RPMI-1640 medium has been used for the culture of human normal and neoplastic leukocytes. RPMI-1640 when properly supplemented, has demonstrated wide applicability for supporting growth of many types of cell cultures, including fresh human lymphocytes in the 72-hour phytohemagglutinin (PHA) stimulation assay.

4. Ham’s Nutrient Mixtures (F12) were originally developed to support clonal growth of several clones of Chinese hamster ovary (CHO) cells, as well as clones of HeLa and mouse L-cells. Both mixtures were formulated for use with or without serum supplementation, depending on the cell type being cultured. Ham’s F-10 has been shown to support the growth of human diploid cells, white blood cells for chromosomal analysis, primary explants of rat, rabbit and chicken tissues. Ham’s F-12 has been used for the growth of primary rat hepatocytes and rat prostate epithelial cells.

5. Neurobasal® Medium is a basal medium that meets the special cell culture requirements of pre-natal and embryonic neuronal cells when used with GIBCO® B-27® Supplement. Neurobasal® Medium can be used to grow neuronal cells from hippocampus, cortex and other regions of the brain. Neurobasal® Medium allows for both long and short term maintenance of homogeneous populations of neuronal cells without the need of an astrocyte feeder layer.

Fundamental Techniques in Cell Culture

www.hpacultures.org.uk

16

6.1 Basic Constituents of Media• Inorganic salts

• Carbohydrates

• Amino Acids

• Vitamins

• Fatty acids and lipids

• Proteins and peptides

• Serum

• Trace Elements

The Cell Environment (including types of culture medium)

Media Type Examples Uses

Balanced salt solutions

PBS, Hanks’ BSS, Earle’s saltsDPBS HBSS EBSS

Form the basis of many complex media

Basal media MEM Primary and diploid culture

DMEM Modification of MEM containing increased level of amino acids and vitamins. Supports a wide range of cell types including hybridomas

GMEM Glasgows modified MEM was defined for BHK-21 cells

Complex media RPMI 1640 Originally derived for human leukaemic cells. It supports a wide range of mammalian cells including hybridomas

Iscoves DMEM Further enriched modification of DMEM which supports high density growth

Leibovitz L-15 Designed for CO2 free environments

TC 100 Graces insect medium Schneider's Insect medium

Designed for culturing insect cells

Serum free media

CHO HEK293

For use in serum free applications

Ham F10 and derivatives Ham F12 DMEM/F12

Note: these media must be supplemented with other factors such as insulin, transferrin and epidermal growth factor. These media are usually HEPES buffered

Insect cells Serum-Free Insect Medium 1 (Cat no. S3777)

Specifically designed for use with Sf9 insect cells

Table 2. Different types of culture medium and their uses

A leggyakoribb médiumtípusok és alkalmazásuk

A sejttenyészetek fenntartása

CO2 inkubátor• 37°C• 5% CO2 atmoszféra• 100% páratartalom

A sejttenyészetek fenntartása

Steril fülke:• HEPA (high efficiency

particulate air) szűrő 99.99%-ban kiszűri a levegőből a 0.3 µm méretűrészecskéket

• A szűrt levegőt a rendszer folyamatosan áramoltatja a munkafelületen

• A munkafelület sterilizálható

Sejttenyészet típusok

• Felülethez kitapadó tenyészetek (pl: HeLa)

• Sejtszuszpenzióban lévő tenyészetek (pl: fehérvérsejtek – Jurkat, tumorsejtek)

• Kitapadva és szuszpenzióban is fenntartható tenyészetek (pl: CHO)

HeLa Jurkat

CHO

A sejtek morfológiája a tenyészetben

Fibroblaszt szerű (fobroblastic/fibroblast-like) sejtek (bi- vagy multipolárisak, elnyújtott alakúak; letapadva növekednek)

Epitélium szerű (epithelial-like) sejtek (multipolárisak, általában szabályozottabb sejtalakkal; letapadva foltszerűen növekednek)

Az egyik legismertebb humán sejtvonal:

HeLa: Henrietta Lacks méhnyak karcinómájából származó biopsziából kitenyésztve (Dr. George Otto Gey, 1951.)

Ez volt az első in vitro körülmények között jól fenntartható emberi sejtvonal

Sejtkultúrák készítése• Szövet izolálás (szerv

explantátum, vér, embrió)• A sejtek szétválasztása

(darabolás szikével, késes homogenizátor, enzimatikus emésztés)

• Primer sejtkultúra: Az eredeti szervből/szövetből frissen eltávolított sejtekből készült kultúra

• Szelekciós hatások (migrációs képesség, osztódási sebesség, médium, stb.)

Szekunder sejtkultúra, sejtvonal• Passzálás: Bizonyos sejtszám elérése után a

sejtosztódás leáll. Ilyenkor új felületet/teret kell adni a sejteknek. A tenyészet egy részét új tenyésztőedénybe visszük át és friss médiumot adunk hozzá.

• Generációs szám: osztódási ciklusok száma. Nem egyenlő a passzázs-számmal.

• Szekunder kultúra: A primer kultúra sejtjeinek egyszeri passzálása (átoltása) révén jön létre.

• Sejtvonal: A primer kultúrából néhány passzálás után kialakult véges élettartamú, korlátolt növekedésű (40-100 passzálás) sejtkultúra. pl. fibroblaszt tenyészet

• Hayflick-limit: Az emlős sejtek szaporodása korlátozott. Humán embrionális sejtek ált. 40-60 osztódáson mehetnek keresztül. Ezt a kromoszómák folyamatos rövidülése okozza.

Korlátlanul osztódó sejtek• Folyamatos sejtvonal: Korlátlan ideig fenntartható

sejtkultúra, mert sejtjei folyamatos osztódó képességgel rendelkeznek. Az ilyen sejtekben gyakran a normálisnál több kromoszóma van, vagy más genetikai elváltozás van.

• Korlátlanul osztódó emlős sejtek: Ø Természetesen előfordulók: őssejtek és csírasejtek Ø Immortalizáció = korlátlan osztódó képesség elnyeréseØ Spontán imortalizáció (pl: hámsejt-, fehérvérsejt-kultúrák)Ø Mutáció vagy vírus okozta immortalizáció (pl: tumorsejtek)Ø Mesterséges immortalizáció (gének bevitele, hibridóma)

• Sejttörzs: Megfelelő tulajdonságok alapján szelektált sejtekből kiinduló sejtkultúra. A sejtek azonos típusúak.

Sejt klónok

• Klón: Egyetlen sejtből származó utódsejtek populációja, amelyek genetikailag teljesen azonosak.

Tenyésztőedények

Petri-csészeFlaska Plate Lombik

Speciális tenyésztőedényekChamber Slide:

Live cell imaging dish:

Sejtkultúrák befertőződése

• Okozhatja: baktérium, élesztő, gomba, mycoplasma• Jellemzők:

– Médium zavarosodása– Hirtelen pH csökkenés (baktérium)– pH növekedés (gomba)– Nagyon lassú sejtnövekedés (mycoplasma)

• Mikroszkóppal 100x-os nagyításban már látható (kivéve: mycoplasma – fluoszcens DNS festés ill. orcein vagy Giemsa festés)

bakteriális fertőzés

14 | Cell Culture Basics

Part 2. Cell Culture Laboratory

For educational purposes only.

Biological Contamination

Introduction Contamination of cell cultures is easily the most common problem encountered in cell culture laboratories, sometimes with very serious consequences. Cell culture contaminants can be divided into two main categories, chemical contaminants such as impurities in media, sera, and water, endotoxins, plasticizers, and detergents, and biological contaminants such as bacteria, molds, yeasts, viruses, mycoplasma, as well as cross contamination by other cell lines. While it is impossible to eliminate contamination entirely, it is possible to reduce its frequency and seriousness by gaining a thorough understanding of their sources and by following good aseptic technique. This section provides an overview of major types of biological contamination.

Bacteria Bacteria are a large and ubiquitious group of unicellular microorganisms. They are typically a few micrometers in diameters, and can have a variety of shapes, ranging from spheres to rods and spirals. Because of their ubiquity, size, and fast growth rates, bacteria, along with yeasts and molds, are the most commonly encountered biological contaminants in cell culture. Bacterial contamination is easily detected by visual inspection of the culture within a few days of it becoming infected; infected cultures usually appear cloudy, sometimes with a thin film on the surface. Sudden drops in the pH of the culture medium is also a frequently encountered. Under a low-power microscope, the bacteria appear as tiny granules between the cells, and observation under a high-power microscope can resolve the shapes of individual bacteria. The simulated images below show an adherent 293 cell culture contaminated with E. coli.

Figure 2.2 Simulated phase contrast images of adherent 293 cells contaminated with E. coli. The spaces between the adherent cells show tiny, shimmering granules under low power microscopy, but the individual bacteria are not easily distinguishable (panel A). Further magnification of the area enclosed by the black square resolves the individual E. coli cells, which are typically rod-shaped and are about 2 µm long and 0.5 µm in diameter. Each side of the black square in panel A is 100 µm.

A B

élesztő fertőzés

15

Part 2. Cell Culture Laboratory

For educational purposes only.

Yeasts Yeasts are unicellular eukaryotic microorganisms in the kingdom of Fungi, ranging in size from a few micrometers (typically) up to 40 micrometers (rarely). Like bacterial contamination, cultures contaminated with yeasts become turbid, especially if the contamination is in an advanced stage. There is very little change in the pH of the culture contaminated by yeasts until the contamination becomes heavy, at which stage the pH usually increases. Under microscopy, yeast appear as individual ovoid or spherical particles, that may bud off smaller particles. The simulated image below shows adherent 293 cell culture 24 hours after plating that is infected with yeast.

Molds Molds are eukaryotic microorganisms in the kingdom of fungi that grow as multicellular filaments called hyphae. A connected network of these multicellular filaments contain genetically identical nuclei, and are referred to as a colony or mycelium. Similar to yeast contamination, the pH of the culture remains stable in the initial stages of contamination, then rapidly increases as the culture become more heavily infected and becomes turbid. Under microscopy, the mycelia usually appear as thin, wisp-like filaments, and sometimes as denser clumps of spores. Spores of many mold species can survive extremely harsh and inhospitable environments in their dormant stage, only to become activated when they encounter suitable growth conditions.

Figure 2.3 Simulated phase contrast images of 293 cells in adherent culture that is contaminated with yeast. The contaminating yeast cells appear as ovoid particles, budding off smaller particles as they replicate.

micoplazma fertőzés

16 | Cell Culture Basics

Part 2. Cell Culture Laboratory

For educational purposes only.

Viruses Viruses are microscopic infectious agents that take over the host cells machinery to reproduce. Their extremely small size makes them very difficult to detect in culture, and to remove them from reagents used in cell culture laboratories. Because most viruses have very stringent requirements for their host, they usually do not adversely effect cell cultures from species other than their host. However, using virally infected cell cultures can present a serious health hazard to the laboratory personnel, especially if human or primate cells are cultured in the laboratory. Viral infection of cell cultures can be detected by electron microscopy, immunostaining with a panel of antibodies, ELISA assays, or PCR with appropriate viral primers.

Mycoplasma Mycoplasma are simple bacteria that lack a cell wall, and they are considered the smallest self-replicating organism. Because of their extremely small size (typically less than one micrometer), mycoplasma are very difficult to detect until they achieve extremely high densities and cause the cell culture to deteriorate; until then, there are often no visible signs of infection. Some slow growing mycoplasma may persists in culture without causing cell death, but they can alter the behavior and metabolism of the host cells in the culture. Chronic mycoplasma infections might manifest themselves with decreased rate of cell proliferation, reduced saturation density, and agglutination in suspension cultures; however, the only assured way of detecting mycoplasma contamination is by testing the cultures periodically using fluorescent staining (e.g., Hoechst 33258), ELISA, PCR, immunostaining, autoradiography, or microbiological assays.

Figure 2.4 Photomicrographs of mycoplasma-free cultured cells (panel A) and cells infected with mycoplasma (panels B and C). The cultures were tested using the MycoFluor™ Mycoplasma Detection Kit, following the kit protocols. In fixed cells, the MycoFLuor™ reagent has access to the cell nuclei, which are intesensely stained with the reagent, but the absence of fluorescent extranuclear objects indicates that the culture is free from mycoplasma contamination (panel A). In fixed cells infected with mycoplasma, the MycoFluor™ reagent stains both the nuclei and the mycoplasma, but the intense relative fluorescence of the nuclei obscure the mycoplasma on or near the nuclei. However, the mycoplasma separated from the bright nuclei are readily visible (panel B). In live cells, the MycoFluor™ reagent does not have access to the nuclei, but readily stains the mycoplasma associated with the outside of cells (panel C). The emission spectra of the MORFS are designed to have a homogeneous intensity that closely matches that of mycoplasma stained according to the MycoFluor™ mycoplasma detection protocol, allowing the researchers to discriminate between stained mycoplasma and other forms of background luminescence, including viruses, bacteria and cellular autofluorescence. The images were obtained using 365 nm excitation and a 100/1.3 Plan Neofluar objective lens coupled with a 450 ± 30 nm bandpass filter.

A B C

Biosafety szintjei (Biosafety Levels = BL, vagy BS)

• 4 szint• NIH Guidelines: „Research Involving Recombinant

DNA”• A gazdaszervezet veszélyességétől függ• Lehetséges patogén hatások figyelembe vételével

1. védelmi szint

Def.: Emberi megbetegedést vélhetően nem okozó, környezetre nem veszélyes ágensekkel való munka.Nulla vagy nagyon alacsony szintű egyéni és társadalmi kockázat.pl. középiskolai, egyetemi oktató laborok.

pl.Bacillus subtilisNaegleria gruberiE. coli

1. védelmi szint

• Személyi feltételek: • Laborvezető általános laboratóriumi gyakorlattal és a

megfelelő szakmai hátérrel rendelkezzen. • Laboránsok: a munkafolyamatoknak megfelelő

specifikus tréningen kell résztvenniük.

1. védelmi szint

Def.: Az emberi egészségre és a környezetre mérsékelten veszélyes ágensekkel való munka.

2. védelmi szint

Olyan patogén, ami emberi vagy állati fertőzést képes okozni, de várhatóan nem jelent komoly kockázatot az egyénre, közösségre, állatokra és a környezet egyéb részeire.

A laboratóriumi fertőzés komoly betegséget okozhat, de rendelkezésre áll hatékony és megfelelő kezelés, valamint a fertőzés továbbterjedésének kockázata igen alacsony.

pl. Salmonellae, Hepatitis B virus

2. védelmi szint

Személyi feltételek:• Laborvezető: A felelőssége tudatában lévő, a

patogénekkel kapcsolatos szakmai tudás birtokában van.

• Laboráns: Megfelelő gyakorlattal kell rendelkeznie a patogénekkel való munkában, melyet a hozzáértő laborvezető irányít.

2. védelmi szint

biológiai veszélyt jelző tábla

•Arc védelme: ha fülkén kívül dolgozunk és fertőző vagy más veszélyes anyag kifröcskölődése várható. (védőszemüveg, maszk)

• Köpeny vagy egyenruha viselése kötelező. Ezt az öltözéket a laborban kell hagyni távozáskor. Tilos hazavinni, helyben kell biztosítani a tisztításukat.• Egyszer használatos kesztyűt kell viselni, ha fertőzött állattal vagy fertőző anyaggal, fertőzött felületen vagy eszközzel dolgozunk. A munka végén helyben kell a kesztyűt levenni, es a fertőzésbiztos tárolóedénybe helyezni.

2. védelmi szint

Biztonsági berendezések

Def.: Belélegzéssel terjedő súlyos vagy halálos betegséget okozó ágensekkel való munka.

3. védelmi szint

Olyan patogén, mely várhatóan súlyos betegséget okoz állatban vagy emberben, de továbbterjedése egyénről egyénre nem valószínű. Hatékony kezelési módszer és megelőzési lehetőség rendelkezésre áll.

3. védelmi szint

Személyi feltételek§ Labor vezető: Felügyeli a dolgozókat, ezen ágensek terén megfelelően jártas legyen mind az elméletben, mind a gyakorlatban.§ Labor személyzet: Speciális oktatáson kell részt venniük, mely a patogén vagy letalitást okozó ágensekkel való munkára készít fel.

3. védelmi szint

Def.: Veszélyes és idegen ágensekkel való munka, melyek életveszélyes betegségekkel járnak. A fertőzés valószínűsége egyénről egyénre igen magas. Általában nem állnak rendelkezésre a megbetegedés kezelésére alkalmas módszerek.

4. védelmi szint

Szükséges laboratóriumi eszközök

biológiai biztonsági szint 1. 2. 3. 4.labor izolálása - - * +hermetikus lezárás lehetősége - - + +szellőztetés be - * + +sz. épület rendszerével - * + -sz. elkülönítve - * + +kimenő HEPA sz. - - * +dupla-ajtós bejárat - - + +légzár zuhannyal - - - +előtér öltöző - - + -előtér zuhannyal - - * -elfolyó anyagok kezelése - - * +

* ajánlott