So Paulo 2012
EMLIA CRISTINA PERES
Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos isquemia e
reperfuso intestinal: mecanismos evolvidos e
papel protetor da sinvastatina
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fisiologia
Humana do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo 2012
EMLIA CRISTINA PERES
Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos isquemia e
reperfuso intestinal: mecanismos evolvidos e
papel protetor da sinvastatina
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fisiologia
Humana do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Fisiologia
Orientadora: Prof. Dra. Luciana Venturini Rossoni
Verso original
Aos meus pais, pelos maiores presentes: amor e base slida,
que
permitiram e permitiro trilhar meus caminhos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar ao meu lado em todos os pequenos passos por
mim dados e em todas
as grandes conquistas por mim alcanadas.
Aos meus pais pelo amor, carinho, dedicao, educao, alm de serem
exemplo de
fora e coragem, que terei para vida.
A Professora Doutora Luciana Venturini Rossoni, pela orientao,
confiana, amizade e
acolhimento em seu laboratrio.
A minha irm pela cumplicidade e estar presente nos momentos
difceis para concluso do
meu mestrado.
As minhas amigas, Gisele e Camilla, por serem iluminadas, e
sempre iluminarem minha vida.
No sei o que seria de mim sem vocs!
Ao Claudiomar pelo companheirismo, fora, e principalmente por me
amar
incondicionalmente.
Aos meus tios Valdemar (in memorian) e Yara pelo apoio e
orientao a mim concedidos em
todos os momentos de minha vida.
Aos meus primos, Marcos, Lo e Raquel, pela amizade e apoio.
Aos meus colegas de laboratrio por sempre me fazerem rir, por
compartilharem comigo dos
momentos duros de trabalho, pelas boas conversas regadas a caf e
por terem tornado meus
momentos no laboratrio muito agradveis.
A Universidade de So Paulo pelas oportunidades ao longo da minha
vida.
Ao Departamento de Fisiologia e Biofsica pela oportunidade de
realizao do curso de
Mestrado.
Ao Departamento de Enfermagem do Hospital Universitrio da USP
pelo apoio para
realizao do curso de Mestrado.
Aos Professores da banca de qualificao pela contribuio com sua
experincia e boas ideias.
Aos Professores da banca de defesa por lerem este trabalho.
A FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro concedido para execuo
deste trabalho.
Muito obrigada!
Que tristes os caminhos, se no fora a
presena distante das estrelas!
Mrio Quintana
RESUMO
Peres EC. Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos
isquemia e reperfuso
intestinal: mecanismos envolvidos e papel protetor da
sinvastatina. [dissertao (Mestrado em
Fisiologia Humana)] - Instituto de Cincias Biomdicas,
Universidade de So Paulo, So
Paulo; 2012.
A isquemia a deficincia no fluxo de sangue para uma determinada
rea durante um perodo
de tempo, incompatvel com as necessidades metablicas. Vrias so
as complicaes
presentes na isquemia e reperfuso intestinal (iIR), dentre elas
destaca-se a leso pulmonar.
Sabe-se, que as estatinas so frmacos que apresentam resultados
favorveis nas leses
intestinais ocasionadas pela iIR. Entretanto, desconhecido se os
prejuzos ocasionados pela
iIR esto relacionados a modificaes na reatividade vascular e se
os efeitos benficos das
estatinas na iIR esto correlacionados esses ajustes vasculares.
Objetivou-se neste estudo
caracterizar a reatividade vascular no leito mesentrico e
pulmonar e verificar se a
sinvastatina capaz de prevenir essas possveis alteraes. Ratos
Wistar, ~2,5 meses, foram
anestesiados e submetidos ocluso da artria mesentrica superior
(AMS) por 45 min e
reperfuso por 2 h (IR). No grupo controle foi realizado o mesmo
protocolo; porm, sem a
ocluso da AMS (SHAM). Anis de AMS e artria pulmonar (AP) foram
dissecados e
montados em um sistema de rgos isolados para medida da tenso
isomtrica. Curvas
concentrao-resposta (CCR) acetilcolina (10-10
3x10-5
M), ao nitroprussiato de sdio (NPS,
10-10
-3x10-5
M) e a fenilefrina (10-10
-3x10-5
M) foram realizadas em anis com (E+) e sem (E-)
endotlio. Alguns anis E+ de AP foram pr-incubados com o inibidor
da sintase de xido
ntrico (NOS), L-NAME (100 M) ou com inibidor da NOS induzvel
(iNOS), 1400W
(1M), antes das CCR acetilcolina e a fenilefrina. Em um
sub-grupo: IR e SHAM foi
realizado o pr-tratamento com sinvastatina (20mg/kg, p.o.) ou
com veculo 1 h antes da iIR.
Em seguida foram avaliadas as respostas: dependente e
independente do endotlio e a
contrtil em anis de AP. A iIR no alterou a vasodilatao ao NPS em
ambas as artrias. Nos
anis de AMS a iIR no alterou nem a vasodilatao acetilcolina e
nem a contrao
fenilefrina. Entretanto, tanto as respostas acetilcolina como
fenilefrina foram reduzidas em
AP dos IR quando comparado ao SHAM. A pr-incubao com L-NAME como
a E-, em
ambos os grupos, reduziu a vasodilatao acetilcolina e aumentou a
contrio fenilefrina.
Por sua vez, o 1400W melhorou a vasodilatao acetilcolina e a
hiporreatividade
fenilefrina observada nos anis de AP dos IR, sem alterar a
reatividade dos SHAM. Tanto a
retirada do endotlio como a pr-incubao dos anis de AP com L-NAME
ou com 1400W
aboliram as diferenas observadas entre os grupos estudados. O
pr-tratamento com
sinvastatina preveniu o prejuzo no relaxamento acetilcolina
assim como a hiporreatividade
fenilefrina nos anis de AP dos IR, sem modificar a reatividade
vascular dos SHAM.
Concluindo-se que a iIR modificou a reatividade vascular na AP,
porm sem alterar a mesma
na AMS. Na AP a iIR causou disfuno endotelial, por meio de uma
ativao da iNOS, a
qual, levou a diminuio da resposta vasodilatadora dependente do
endotlio e
hiporreatividade contrtil. Uma nica dose de sinvastatina pr-iIR
previne essas alteraes,
demonstrando o efeito benfico desse frmaco provavelmente via uma
ao anti-inflamatria
e/ ou anti-oxidante.
Palavras-chave: Reatividade vascular. Isquemia e reperfuso
intestinal. Endotlio.
Sinvastatina. Artria Pulmonar.
ABSTRACT
Peres EC. Study of vascular reactivity in rats subjected to
intestinal ischemia and reperfusion:
mechanisms involved and the protective role of simvastatin.
[dissertation (Masters thesis in
Human Physiology)] - Instituto de Cincias Biomdicas,
Universidade de So Paulo, So
Paulo; 2012.
Ischemia is a deficiency in blood flow for a given area during a
period of time, incompatible
with the metabolic requirements. Several complications are
present in intestinal ischemia and
reperfusion (iIR), lung damage being one of the most important.
It is known that statins are
drugs that have favorable results in the intestinal lesions
caused by iIR. However, it is
unknown whether the damages caused by iIR are related to changes
in vascular reactivity and
the beneficial effects of statins on iIR are correlated to these
vascular adjustments. The
objective of this study was to characterize the vascular
reactivity in mesenteric and pulmonary
bed and verify whether simvastatin is able to prevent these
possible changes. Wistar rats, ~2.5
months old, were anesthetized and subjected to occlusion of the
superior mesenteric artery
(SMA) for 45 min and reperfusion (IR) for 2 hours. The same
protocol was performed in the
control group, but without SMA occlusion (SHAM). SMA and
pulmonary artery (PA) rings
were dissected and mounted in an isolated organ system to
measure the isometric tension.
Concentration-response curves (CRC) to acetylcholine (10-10
3x10-5
M), to sodium
nitroprusside (SNP, 10-10
-3x10-5
M) and to phenylephrine (10-10
-3x10-5
M) were performed in
rings with (E+) and without (E-) endothelium. Some E+ rings of
PA were preincubated with
the inhibitor of nitric oxide synthase (NOS), L-NAME (100 M) or
with inhibitor of inducible
NOS (iNOS), 1400W (1M) prior to the CRC to acetylcholine and
phenylephrine. In a
subgroup: IR and SHAM pre-treatment with simvastatin (20mg/kg,
p.o.) or with vehicle 1
hour before the iIR was performed. After that in PA rings the
endothelium-dependent and -
independent, and contractile responses were evaluated. The iIR
did not alter vasodilatation to
SNP in either artery. In SMA rings, iIR did not change the
vasodilatation to acetylcholine or
the contraction to phenylephrine. However, both responses to
acetylcholine and to
phenylephrine were reduced in PA of IR when compared with SHAM.
The pre-incubation
with L-NAME and the E-, in both groups, decreased the
vasodilatation to acetylcholine and
increased constriction to phenylephrine. In turn, the 1400W
improved vasodilatation to
acetylcholine and hyporeactivity to phenylephrine observed in
rings of PA of IR, without
changing the reactivity of SHAM. Both the removal of endothelium
and the preincubation of
PA rings with L-NAME or with 1400W abolished the differences
observed between the
groups. Pre-treatment with simvastatin prevented loss in the
relaxation to acetylcholine and
the hyporeactivity to phenylephrine in the rings of PA of IR,
without modifying the vascular
reactivity of SHAM. In conclusion, the iIR modified vascular
reactivity in the PA; however, it
did not change it in the SMA. In the PA, iIR caused endothelial
dysfunction through an
activation of iNOS, which resulted in a decrease of
endothelium-dependent vasodilator
response and contractile hyporeactivity. A single dose of
simvastatin pre-iIR prevents these
changes, demonstrating the beneficial effect of this drug
probably via an anti-inflammatory
and/ or anti-oxidant action.
Keywords: Vascular reactivity. Intestinal ischemia and
reperfusion. Endothelium.
Simvastatin. Pulmonary Artery.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Curva concentrao-resposta acetilcolina 36
Figura 2 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis com
endotlio
preservado (E+) e sem endotlio (E-) 37
Figura 3 - Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio
39
Figura 4 - Curva concentrao-resposta fenilefrina 41
Figura 5 - Curva concentrao-resposta fenilefrina em anis com
endotlio
preservado (E+) e sem endotlio (E-) 42
Figura 6 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis de
artria pulmonar
pr-incubados com L-NAME ou com 1400W 45
Figura 7 - Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de
artria
pulmonar de ratos SHAM e IR pr-incubados com L-NAME ou com 1400W
48
Figura 8 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta acetilcolina 53
Figura 9 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta ao
nitroprussiato de sdio 54
Figura 10 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta fenilefrina 55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl)
nos anis de
artria mesentrica superior (Mesentrica) e nos anis de artria
pulmonar (Pulmonar)
na presena de endotlio preservado dos animais SHAM e IR
34
Tabela 2- Valores da porcentagem de pr contrao fenilefrina em
relao
contrao ao cloreto de potssio antes das curvas
concentrao-resposta acetilcolina
(ACh) ou ao nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria
mesentrica superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio
preservado dos animais
SHAM e IR
35
Tabela 3- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio
de curvas concentrao-reposta acetilcolina nos anis de artria
mesentrica superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio
preservado (E+) e sem
(E-) endotlio dos animais SHAM e IR
38
Tabela 4- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de
artrias mesentrica
superior e de artria pulmonar com (E+) e sem (E-) endotlio dos
animais SHAM e IR
43
Tabela 5- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) nos anis de
artria pulmonar
com endotlio (E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M) ou com
1400W
(1400W,1 M) dos animais SHAM e IR
46
Tabela 6- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de
artria pulmonar com
(E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M) ou incubados com 1400W
(1400W,1
M) dos animais SHAM e IR
49
Tabela 7- Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl,
75mM) nos anis
de artria pulmonar dos animais SHAM e IR, controle (CT) e nos
grupos SHAM e IR,
tratados com sinvastatina (SINV)
52
Tabela 8- Valores da porcentagem de contrao fenilefrina em relao
contrao
ao cloreto de potssio antes das curvas concentrao-resposta
acetilcolina (ACh) ou
ao nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria pulmonar com
endotlio dos
animais SHAM e IR, controle (CT) e nos grupos SHAM e IR,
tratados com
sinvastatina (SINV)
52
Tabela 9- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio
de curvas concentrao-reposta acetilcolina (ACh), ao
nitroprussiato de sdio (NPS)
e fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar dos animais SHAM,
SHAM tratado
com 20mg/kg de sinvastatina (SHAM SINV), IR e IR tratado com
20mg/kg de
sinvastatina (IR SINV)
56
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
XO- Xantina Oxidase
XD- Xantina Desidrogenase
SOD- Superxido Dismutase
MODS- Sndrome de disfuno mltipla de rgos
iIR- Isquemia e reperfuso intestinal
TN- Fator de Necrose Tumoral
IL- Interleucina
NO- xido ntrico
cNOS- xido ntrico sintase constitutiva
iNOS- xido ntrico sintase induzvel
eNOS- xido ntrico sintase endotelial
LPS- Lipopolissacardeo
nNOS- xido ntrico sintase neuronal
Gcs- Guanilato ciclase solvel
GMPc- Guanosina monofosfato ciclco
Ca+2
- Clcio
K+- Potssio
L-NAME- Ng-Nitroarginina Metil ster
HMG-CoA- 3-hidroxi-3 metilglutaril-coenzima A
PaO2- Presso parcial de oxignio no sangue
ALT- Alanina aminotrnasferase
AST- Asparagina aminotrnasferase
EDRFs- Fatores relaxantes derivado do endotlio
EDCFs- Fatores contrteis do endotlio
COX- Coclooxigenase
PKA- Protena quinase A
KCl- Cloreto de potssio
1400W- N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine
ANOVA- Anlise de varincia
NPS- Nitroprussiato de sdio
ACh- Acetilcolina
FE- Fenilefrina
SDRA- Sndrome do desconforto respiratrio agudo
ONOO-- Perxido nitrito
O2-- nion superxido
OH-- radical de hidroxila
LOOH- hidroperxido
TBARS- Substncias que reagem com o cido tiobarbitrico
SUMRIO
1 INTRODUO 15
2 OBJETIVOS 26
3 MATERIAIS E MTODOS 27
3.1 Animais experimentais 27
3.2 Obteno dos modelos experimentais 27
3.2.1 Tratamento com sinvastatina 27
3.3 Estudo de reatividade vascular da artria mesentrica e
pulmonar 28
3.4 Protocolos experimentais 29
3.4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio
(KCl) 29
3.4.2 Avaliao do relaxamento 29
3.4.2.1 Avaliao do relaxamento dependente do endotlio 29
3.4.2.2 Avaliao do relaxamento independente do endotlio 29
3.4.3 Avaliao da resposta contrtil 30
3.4.4 Efeito da retirada do endotlio sobre a resposta
vasodilatadora acetilcolina e
sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
30
3.4.5 Efeito do bloqueio da sntese de xido ntrico sobre a
resposta vasodilatadora
acetilcolina e sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
30
3.5 Protocolos experimentais aps o tratamento com sinvastatina
31
3.6 Expresso dos dados e anlises estatsticas 32
3.7 Drogas e diluies 32
4 RESULTADOS 34
4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio
(KCl) 34
4.2 Respostas vasodilatadora dependente e independente do
endotlio 35
4.3 Avaliao da resposta contrtil 40
4.4 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta
vasodilatadora
acetilcolina
44
4.5 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta
vasoconstritora
fenilefrina
47
4.6 Efeito do tratamento com sinvastatina sobre a reatividade
vascular 50
5 DISCUSSO 57
6 CONCLUSO 70
REFERENCIAS 71
15
1 INTRODUO
A isquemia a deficincia no fluxo de sangue para uma determinada
rea durante um
perodo, que ocasiona a interrupo do suprimento de oxignio e de
nutrientes, acarretando
em disfuno celular, morte celular e, finalmente, disfuno de
tecido e rgo (Scannel et al.,
1995). A isquemia considerada uma emergncia vascular, com taxas
de mortalidade que
podem chegar a 70% dos casos (Virgini-Magalhes; Mayall, 2009;
Vollmar; Menger, 2011).
Nos Estados Unidos, a isquemia intestinal, ou a ausncia ou
diminuio do fluxo
sanguneo arterial ou venoso nos tecidos intestinais (Debus et
al., 2011; Renner et al., 2011;
Ribeiro; Yoshida, 2005), incide em uma de 1.000 admisses
hospitalares (Brandt; Boley,
2000). No Brasil, o sistema DATASUS no discrimina a isquemia
intestinal de distrbios
circulatrios em outras partes do organismo. Entretanto, possvel
que a incidncia da
isquemia intestinal no Brasil seja mais elevada do que aquela
documentada nos Estados
Unidos.
Sua etiologia pode ser oclusiva, como embolia e trombose; ou
no-oclusiva, como
baixo fluxo sanguneo e vasoespasmo induzido por drogas
vasoativas (Debus et al., 2011;
Renner et al., 2010; Ribeiro; Yoshida, 2005). Na embolia
arterial, as principais causas da
isquemia oclusiva so trombos murais da cavidade cardaca
associados a infarto do miocrdio
e fibrilao atrial (Debus et al., 2011; Renner et al., 2010;
Ribeiro; Yoshida, 2005) . A
trombose arterial instala-se em placa aterosclertica, que pode
ser de origem degenerativa ou
inflamatria (Ribeiro; Yoshida, 2005). Na isquemia no-oclusiva, a
diminuio do fluxo
sanguneo intestinal ocorre em diferentes situaes clnicas, como
trauma, choque de qualquer
etiologia, queimaduras, ps-operatrio de cirurgias cardaca e
torcica, assim como no
transplante de intestino delgado (Debus et al., 2011; Kannan et
al., 2011; Renner et al., 2010;
Ribeiro; Yoshida, 2005;).
O procedimento para correo da isquemia ou de suas consequncias
depende da
extenso da isquemia e da causa da obstruo. De maneira geral,
procura-se restabelecer fluxo
ao intestino ainda vivel, geralmente com revascularizao da
artria mesentrica e resseco
das pores necrticas (Baptista-Silva; Souza-Moraes, 2006).
Entretanto, sabe-se que o tempo
entre a confirmao diagnstica e a introduo de mtodos teraputicos
para restabelecer o
fluxo sanguneo importante para reduzir as taxas de mortalidade
(Debus et al., 2011). Nas
isquemias no oclusivas, a causa deve ser identificada e removida
o mais brevemente possvel
(Renner et al., 2010). Porm sabe-se que a restaurao do
suprimento sanguneo, ou
16
reperfuso, pode ter efeitos deletrios que se somam aos da
isquemia, com consequncias
danosas para o tecido (Ribeiro; Yoshida, 2005; Scannel et al.,
1995).
Na isquemia, ocorre acmulo de hipoxantina e xantina oxidase (XO)
(Grace, 1994).
Isso porque durante a fase isqumica, a diminuio do aporte de
oxignio leva ao acmulo de
clcio no citosol, que, por sua vez, promove a quebra de uma
ponte peptdica da xantina
desidrogenase (XD), levando formao da enzima XO (Ribeiro;
Yoshida, 2005). A XO,
diferentemente da XD, necessita de oxignio para realizar a
converso da hipoxantina em
xantina (Grace, 1994). Com a reintroduo de oxignio por meio da
reperfuso, a hipoxantina
oxidada a xantina e esta, metabolizada a cido rico, gerando como
subproduto o nion
superxido. Este transforma-se em perxido de hidrognio
espontaneamente ou pela ao da
enzima superxido dismutase (SOD), e o perxido de hidrognio, por
sua vez, transformado
em gua pela ao da catalase e da glutationa peroxidase (Ribeiro;
Yoshida, 2005). Como a
hipoxantina ficou acumulada durante a isquemia, a produo de
radicais livres na reperfuso
acaba sobrepujando a capacidade de neutralizao pelos
antioxidantes endgenos, de modo
que os radicais livres passam a exercer livremente as suas aes
deletrias (Grace, 1994;
Horton; Walker, 1993). Desse modo, a reperfuso agrava as
alteraes celulares ocasionadas
pela isquemia, j que os radicais livres acumulados lesam as
membranas celulares, atraindo
neutrfilos e estimulando a liberao de mediadores inflamatrios
(Ribeiro; Yoshida, 2005;
Scannel et al., 1995).
Alm das alteraes e leses locais, acredita-se que, na vigncia da
reperfuso,
produtos txicos possam ter acesso circulao e promovam
importantes alteraes no estado
funcional do organismo (Deitch et al., 2001; Paterno; Longo,
2008; Ribeiro; Yoshida, 2005)
mesmo em stios distantes de onde foi desencadeada a isquemia. H
relatos de que a
Sndrome de Disfuno Mltipla de rgos (MODS) ocorra em decorrncia
de alteraes no
sistema gastrintestinal ocasionadas por processos de isquemia e
reperfuso (Carrico et al.,
1986; Clark e Coopersmith, 2007; Deicth et al., 2001; Hassoun et
al, 2001; Magnotti; Deicth,
2005).
A MODS caracterizada pela deteriorao aguda da funo de dois ou
mais rgos
(Mongardon et al., 2009). a maior causa de morbidade e
mortalidade em pacientes
criticamente doentes, com taxas de mortalidade superiores a 40%
(Deitch, 2010). No contexto
do trauma, a principal causa de morte em pessoas com idade
inferior a 40 anos e uma das
principais causas de morte em pacientes vtimas de trauma
(Deitch, 2010).
17
Considerando-se a gravidade das consequncias da isquemia
intestinal e de seu
tratamento, a compreenso dos mecanismos pelos quais o choque
hemorrgico no trauma e
condies pr-inflamatrias, como queimaduras e pancreatite, levam
sndrome da angstia
respiratria aguda (no-infecciosa) e MODS de grande relevncia
para o tratamento clnico
(Deitch, 2010). Vrios estudos buscam elucidar qual o papel do
intestino na origem e na
propagao de doenas crticas, como a sndrome do desconforto
respiratrio agudo (SDRA)
e a MODS (Carrico et al., 1986; Clark; Coopersmith, 2007;
Deitch, 2010; Deicth et al., 2001;
Hassoun et al., 2001; Magnotti; Deicth, 2005). Em 1986, Carrico
e colaboradores
consideraram a hiptese de que a deficincia da funo de barreira
do intestino permitia a
translocao de bactrias intestinais para a circulao portal e
sistmica, o que acarretaria a
propagao da MODS em situaes em que as defesas do hospedeiro se
apresentavam
comprometidas (Carrico et al., 1986).
Outros trabalhos demonstram que a hipoperfuso intestinal
induzida pelo choque,
seguida da reperfuso intestinal, origina mediadores inflamatrios
que podem causar a
Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica e, assim, contribuir
para a instalao da MODS
(Hassoun et al, 2001; Moore et al., 1994). Experimentalmente,
evidenciou-se que um perodo
de isquemia seguido por um perodo de reperfuso intestinal causa
inflamao pulmonar,
ativao intestinal da fosfolipase A2 e recrutamento intestinal de
neutrfilos, o que confirma
que o intestino gerador de mediadores inflamatrios que modulam a
injria pulmonar aguda
(Moore et al., 1994).
Em acordo com esses achados, diversos estudos sugerem que a
disfuno pulmonar, a
inflamao sistmica e a MODS causadas pelo trauma gastrointestinal
decorrem dos efeitos
dos mediadores inflamatrios provindos do intestino e drenados a
partir do sistema linftico
mesentrico (Deitch, 2001; Deitch, 2010; Magnotti et al., 1998;
Magnotti et al., 2005). Um
importante fundamento para essa hiptese o conceito de que o
leito vascular pulmonar seja o
primeiro leito exposto linfa mesentrica, uma vez que esta atinge
a circulao sistmica por
meio do ducto torcico e desemboca na veia subclvia, atingindo o
pulmo (Magnotti et al.,
2005). Assim, sugere-se que a ligao do ducto linftico mesentrico
previna a apoptose
pulmonar, o sequestro de neutrfilos e o aumento da
permeabilidade pulmonar provocados
pela isquemia e pela reperfuso intestinal (iIR) em situaes de
queimaduras e choque
hemorrgico (Deitch, 2001; Deitch, 2010; Magnotti et al., 1998;
Magnotti et al., 2005).
Adicionalmente, Cavriani e colaboradores (2005) tambm
demonstraram que o
sistema linftico mesentrico exerce funo primordial nas disfunes
intestinal e pulmonar
18
ocasionadas pela iIR (Cavriani et al., 2005). Esse estudo revela
que as leses causadas pela
iIR, tanto no pulmo quanto no intestino, so parcialmente
dependentes do fator de necrose
tumoral (TNF-), uma citocina pr-inflamatria gerada no tecido
intestinal lesado pela iIR e
transportada pelo sistema linftico (Cavriani et al., 2005). Alm
do TNF-, sabe-se que o
ducto linftico uma importante via de transporte para outras
citocinas inflamatrias, como
IL-1 e IL-10, ambas geradas pelo tecido intestinal durante a iIR
(Cavriani et al., 2005;
Deitch, 2001), que poderiam contribuir para a inflamao sistmica
e a MODS. Sugere-se que
a IL-1 gerada durante a reperfuso pode estar envolvida na
hiporreatividade do msculo liso
bronquial ocasionada pela iIR (Coelho et al., 2007). Alm disso,
esse estudo demonstra que a
IL-1 gerada na reperfuso alcana o pulmo atravs da linfa,
estimulando a gerao de xido
ntrico (NO) que desencadeia a hiporreatividade bronquial em
animais submetidos a iIR
quando comparados aos animais falso-operados (Coelho et al.,
2007).
O NO desempenha um papel crucial na regulao homeosttica dos
sistemas
cardiovascular, neuronal e imune (Moncada et al., 1991a e b).
Nos vasos, o NO protege contra
trombose e aterosclerose, induz relaxamento dos vasos sanguneos,
previne agregao
plaquetria, inibe a proliferao de clulas do msculo liso vascular
e diminui a expresso de
genes pr-inflamatrios (Forstermann et al., 1993; Forstermann;
Munzel, 2006). Nas clulas
endoteliais, sensores e receptores de membrana respondem a
estmulos fisiolgicos com
aumento da concentrao intracelular de clcio e/ ou fosforilao dos
stios alvo para a
ativao da enzima sintase de xido ntrico (NOS). A posterior
formao do complexo clcio-
calmodulina ativa a NOS, responsvel pela clivagem do aminocido
L-arginina em L-citrulina
e NO (Fleming, 2010), aumentando portanto a sntese de NO. A NOS
dividida em dois
grandes grupos de isoformas: a constitutiva (cNOS), dependente
da elevao dos nveis
intracelulares de clcio, e a induzvel (iNOS), independente das
elevaes de clcio, mas
dependente da ativao de citocinas ou estmulos patolgicos como
LPS (Lipopolissacardeo)
(Forstermann; Sessa, 2012). A cNOS apresenta a isoforma
endotelial (eNOS) e a isoforma
neuronal (nNOS) (Davel et al., 2011; Forstermann, 2010;
Forstermann; Sessa, 2012).
Uma vez liberado, o NO difunde-se rapidamente da clula geradora
para a clula alvo,
onde interage com o grupamento heme da guanilato ciclase solvel
(GCs) estimulando sua
atividade cataltica, o que leva formao de guanosina monofosfato
cclico (GMPc). O
GMPc, por sua vez, diminui os nveis intracelulares de clcio pela
recaptao para o retculo
sarcoplasmtico e pela extruso de clcio para o meio extracelular
por meio das Ca+2
-
ATPases (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro, 2009). H diminuio
dos nveis de clcio
19
tambm por meio da abertura de canais para K+ e da ativao da
Na
+, K
+-ATPase, com
consequente hiperpolarizao de membrana e posterior fechamento
dos canais para clcio
dependentes de voltagem (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro,
2009). Alm do mais, h
reduo da sensibilidade das protenas contrteis ao clcio, devido a
ativao da protena
quinase G (PKG) (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro, 2009).
Vrios estudos identificam o NO como um potencial mediador na iIR
que liga as
alteraes locais s alteraes sistmicas (Cavriani et al., 2004;
Coelho et al., 2007; Ward et
al., 2000; Yasmin et al., 1997). O tratamento de ratos com
inibidores da NOS minutos antes
da iIR aponta evidncias da modulao nitrrgica. Demonstrou-se que
a administrao do L-
NAME, inibidor no seletivo da NOS, causa aumento da magnitude
das alteraes induzidas
por iIR, como aumento do TNF- plasmtico, sequestro de neutrfilos
no pulmo e aumento
da permeabilidade microvascular pulmonar, podendo causar a morte
dos animais. Por outro
lado, o inibidor seletivo da iNOS inibiu o aumento da
permeabilidade microvascular
pulmonar, o que sugere que tanto a isoforma constitutva quanto a
induzvel da NOS
modulam as alteraes inflamatrias encontradas na iIR (Cavriani et
al., 2004). Assim, a
modulao exercida pelas isoformas da NOS ocorre diferentemente,
de acordo com a
isoforma.
Ward e colaboradores (2000) propuseram que durante o perodo de
reperfuso
intestinal h declnio da atividade da cNOS, como resultado,
observa-se o surgimento das
manifestaes clnicas da iIR, como leso da mucosa e aumento da
permeabilidade capilar.
Prope-se que no incio da isquemia ocorra a combinao de NO
derivado do endotlio com o
nion superxido (proveniente de neutrfilos ativados), formando
peroxinitrito, poderoso
oxidante (Ward et al., 2000; Yasmin et al., 1997) e que, durante
a reperfuso, ocorra queda da
produo de NO proveniente da cNOS, o que acarreta na resposta
inflamatria sistmica
(Ward et al., 2000). Portanto, a perda do balano entre as
atividades das sintases de NO
(cNOS e iNOS) pode ser sugerida como uma das causas dos prejuzos
ocasionados pela iIR
(Yasmin et al., 1997; Ward et al., 2000; Cavriani et. al,
2004).
Senthil e colaboradores (2007) demonstraram que a linfa retirada
de animais
submetidos a trauma e choque hemorrgico e administrada
intravenosamente em ratos
controles capaz de gerar leso pulmonar. Essa leso est associada
ao aumento plasmtico
das concentraes de nitrato/nitrito, bem como ao aumento da
expresso proteica da iNOS em
pulmo, fgado e intestino. Concluiu-se que a linfa de animais
submetidos a trauma e choque
20
hemorrgico suficiente para induzir leso pulmonar aguda, por
intermdio de uma via
dependente de iNOS.
Adicionalmente, foi demonstrado que a iIR induz alteraes no
funcionamento de
diferentes leitos vasculares e que tais alteraes vasculares
podem estar relacionadas a
mudanas na modulao nitrrgica (Chen et al., 2006; Koksoy et al.,
2000; Savoye et al.,
2005).
Koksoy e colaboradores (2000) demonstraram que existe uma menor
participao do
xido ntrico sobre a presso de perfuso mdia no leito vascular
pulmonar de ratos
submetidos iIR, quando comparados aos falso-operados, o que
indica menor modulao
nitrrgica basal nas artrias pulmonares aps a iIR (Koksoy et al.,
2000).
Em artria mesentrica superior, Chen e colaboradores (2006)
sugeriram que a iIR
reduz a resposta mxima fenilefrina (agonista seletivo
1-adrenrgico) em ratos, e que a
queda na reatividade vascular estava associada ao aumento da
expresso gnica e proteica da
eNOS e da iNOS no intestino delgado. Adicionalmente, Savoye e
colaboradores (2005), em
estudos com artria mesentrica de ratos, demonstraram que a
ativao da iNOS parece estar
envolvida na hiporreatividade ocasionada pelo choque hemorrgico
seguido de reposio
volmica. Os autores afirmam que a hiporreatividade prevenida
pelo uso de
mercatopropionil, um sequestrador no-seletivo de radicais
livres, defendendo a hiptese de
que NO produzido por meio da ativao da iNOS pode interagir com
nion superxido para
formar peroxinitrito, com alto poder oxidativo (Savoye et al.,
2005).
Como ressaltado anteriormente, a iIR conhecida por ser uma doena
que causa
prejuzo no funcionamento normal do intestino e tambm por causar
leses em rgos
distantes, especialmente o pulmo, um dos primeiros rgos
atingidos. Reconhece-se o efeito
do sistema linftico mesentrico na propagao de mediadores
inflamatrios gerados na iIR,
bem como no surgimento de resposta inflamatria sistmica. Pelos
dados encontrados na
literatura, conclui-se que o NO parece estar envolvido na
propagao da resposta sistmica e
nas leses causadas no intestino e no pulmo. As alteraes
vasculares na iIR parecem ser
dependentes do leito vascular estudado e da metodologia
empregada para o estudo; entretanto,
devido ao nmero reduzido de trabalhos e a falta de padronizao
quanto ao tempo de
isquemia e reperfuso, no possvel afirmar o quanto os ajustes
vasculares podem contribuir
para a gravidade da iIR.
21
Por outro lado, tm-se buscado possveis tratamentos que diminuam
as implicaes
locais e sistmicas associadas s altas taxas de mortalidade na
iIR e alguns estudos buscam
definir os efeitos das estatinas na isquemia e na reperfuso de
rgos.
As estatinas so inibidores seletivos e competitivos da
3-hidroxi-3 metilglutaril-
coenzima A (HMG-CoA) redutase, e so largamente usadas no
tratamento e no controle da
hipercolesterolemia, das dislipidemias e da doena arterial
coronariana (Maron et al., 2000).
Alm disso, propriedades pleiotrpicas das estatinas, como a
anti-inflamatria e a
antioxidante, esto sendo reveladas. H relatos de que as
estatinas so capazes de melhorar a
funo endotelial, aumentar a biodisponibilidade de xido ntrico,
apresentar aes
imunomodulatrias, estabilizar placas aterosclerticas, participar
no remodelamento vascular,
reduzir a apoptose e modular a funo plaquetria, entre outros
efeitos (Alvarez De
Sotomayor et al., 2000; Briones et al., 2009; Gelosa et al.,
2007).
As aes pleiotrpicas das estatinas tm sido exploradas tambm em
pacientes
expostos reperfuso cardaca por procedimentos percutneos ou
cirrgicos (Biccard et al.,
2005; Paraskevas et al., 2007; Paraskevas et al., 2008). A
terapia com estatina no pr-
operatrio de cirurgia de revascularizao do miocrdio melhora a
perfuso miocrdica da
rea enxertada no ps-operatrio, bem como reduz a liberao de
citocinas (IL-6 e IL-8) e a
adeso de neutrfilos no endotlio venoso, sendo o NO o possvel
mediador para esses
mecanismos (Paraskevas et al., 2007). Alm disso, o tratamento
pr-operatrio com estatina
tambm parece estar associado com menores taxas de mortalidade
ps-cirurgia cardaca
(Paraskevas et al., 2007). Com esses dados, pode-se inferir que
as estatinas podem ser
benficas para amenizar os prejuzos causados pela isquemia e pela
reperfuso de diferentes
rgos.
Alm dos estudos com humanos, em modelos animais de isquemia e
reperfuso de
rgos, as estatinas tambm apresentam resultados favorveis. Em
corao de ratos Wistar, o
tratamento com 15 mg/kg/dia de lovastatina, por 12 dias,
diminuiu a rea de infarto por
ocluso da artria coronria esquerda (Kocsis et al., 2008). Assim
como o tratamento crnico,
o tratamento agudo com estatinas tambm capaz de reduzir a rea de
infarto, como
verificado pela reduo do tecido necrtico em ratos submetidos
administrao de uma dose
intravenosa de sinvastatina (1 mg/kg) uma hora antes da ocluso
da artria coronria
descendente anterior (25 minutos de isquemia seguida de 2 horas
de reperfuso) (Wayman et
al., 2003). Adicionalmente, o pr-tratamento com 5 mg/kg de
sinvastatina, intravenoso, em
coelhos submetidos a 30 minutos de ocluso da artria coronria
esquerda seguidos de 48
22
horas de reperfuso diminuiu a rea infartada, efeito
correlacionado produo aumentada de
NO (Bao et al., 2009), que foi apontado como o provvel mediador
dos efeitos da
sinvastatina. Alm do mais, Lefer e colaboradores (1999)
demonstraram que a melhora do
fluxo coronariano associado a administrao de 25 g de
sinvastatina intraperitoneal, 18 horas
antes do processo de isquemia e reperfuso miocrdica em ratos,
parece estar relacionada a
um aumento da produo de NO.
Corroborando os dados acima citados, outros estudos apontam que
a reperfuso com
sinvastatina melhora a funo cardaca em corao isolado submetido
ao processo de
isquemia e reperfuso (Szrszoi et al., 2008; Zheng et al., 2006).
A funo ventricular
esquerda em animais submetidos a ocluso da artria coronria
descendente anterior foi
melhorada pelo tratamento por quatro semanas com sinvastatina
(40 mg/kg/por dia/por
gavagem), efeito este relacionado a uma queda dos nveis de
citocinas inflamatrias e a um
aumento dos nveis citocinas anti-inflamatrias nos micitos
cardacos (Zhang et al., 2005).
Tambm foi observada reduo na deposio de colgeno na rea
remanescente ao infarto e,
portanto, sugeriu-se que a reduo da deposio de colgeno e a
melhora a funo ventricular
se devem modulao da funo inflamatria ocasionada pelo tratamento
com sinvastatina
(Zhang et al., 2005). Adicionalmente, foi sugerido que os
efeitos benficos das estatinas no
infarto agudo do miocrdio so independentes da reduo dos nveis
plasmticos de colesterol
(Lefer et al.,1999; Wayman et al., 2003; Zhang et al.,
2005).
Em outros rgos submetidos ao processo de isquemia e reperfuso,
as estatinas
tambm tm se mostrado eficazes na reduo das injrias. Em pulmo de
ratos, o tratamento
com 0,5 mg/kg de sinvastatina, administrado por via oral por 5
dias antes do experimento,
preveniu o aumento da permeabilidade vascular pulmonar e o
sequestro de neutrfilos
causados pelo processo de isquemia e reperfuso, tanto no tecido
pulmonar quanto no lavado
broncoalveolar (Naidu et al., 2003). Alm disso, verificou-se que
os efeitos benficos da
sinvastatina sobre a permeabilidade vascular foram inibidos com
o uso de L-NAME e que a
reduo da expresso proteica da eNOS nos pulmes foi prevenida pelo
tratamento com
sinvastatina (Naidu et al., 2003). Exemplificando, ainda, os
efeitos benficos da sinvastatina
na iIR, demonstrou-se que o pr-tratamento com sinvastatina (10
mg/kg/dia) durante 3 dias,
com administrao da ltima dose uma hora antes da iIR, reduziu a
gravidade da leso aguda
pulmonar induzida pela iIR em ratos; tendo sido registradas
melhoras na presso parcial de
oxignio no sangue arterial (PaO2) e na saturao de oxignio e
diminuio da infiltrao de
neutrfilos no pulmo (Pirat et al., 2006).
23
No fgado de ratos, o processo de isquemia e reperfuso aumentou
os nveis da alanina
e da asparagina aminotransferase (ALT, AST, respectivamente),
indicadores de dano heptico
(Dibazar et al., 2008; Lai et al., 2008). Entretanto, tanto o
tratamento por via oral com
10mg/kg/dia de sinvastatina, administrada durante 3 dias antes
da isquemia e da reperfuso
heptica, como o pr-tratamento com administrao intraperitoneal de
5 mg/kg de
sinvastatina, 24 horas antes da isquemia e reperfuso heptica,
preveniram o dano heptico
(Dibazar et al., 2008; Lai et al., 2008).
Em rins de ratos, o pr-tratamento com uma nica dose de
sinvastatina (1 mg/kg/i.v.)
melhorou a disfuno renal causada por 45 minutos de isquemia e 4
horas de reperfuso,
reduzindo a frao de excreo de sdio e os nveis plasmticos de
ureia e creatinina,
aumentados em decorrncia da isquemia e reperfuso (Todorovic et
al., 2008).
Similarmente ao que ocorre em pulmo, fgado e rim, no intestino
de ratos foi
demonstrado que o pr-tratamento com sinvastatina (10 mg/kg/dia),
administrada oralmente
durante quatro dias antes da iIR, foi eficaz em reduzir os
danos. Esse efeito foi associado
diminuio do nvel srico do TNF- e do nvel tecidual de
malondialdedo, produto final da
peroxidao de lipdios utilizado na avaliao do estresse oxidativo,
e elevao dos nveis de
glutationa peroxidase e superxido dismutase intestinal, enzimas
que fazem parte do sistema
de defesa antioxidante (Hajipour et al., 2009). Agudamente, as
estatinas tambm demonstram
ser benficas na iIR intestinal: o tratamento com sinvastatina
imediatamente antes da
isquemia e aps 24 horas previne a destruio da mucosa intestinal
e diminui o ndice de
apoptose no jejuno e leo (Slijper et al., 2010). Adicionalmente,
em ratos submetidos a
isquemia e reperfuso da artria mesentrica, o tratamento agudo
com rouvastatina (10
mg/kg), uma hora antes da isquemia, bloqueia a gerao de
mediadores inflamatrios, como
TNF- e citocina induzida por neutrfilo quimioatraente-1
(CINC-1), e preserva a expresso
proteica da eNOS, suprimindo, assim, a inflamao intestinal
(Naito et al., 2006).
Recentemente, numerosos estudos tm demonstrado que as estatinas
parecem estar
envolvidas tambm no restabelecimento ou na melhoria da funo
endotelial nas doenas
cardiovasculares (Briones et al., 2009; Gelosa et al., 2007;
Omori et al., 2002; Tawfik et al.,
2006). Um estudo demonstrou que uma nica dose de pravastatina
(40 mg/dia) foi capaz de
melhorar a funo coronariana em pacientes portadores de disfuno
arterial coronariana, sem
que houvesse reduo significativa nos nveis de colesterol
(Wassmann et al., 2003).
A disfuno endotelial, presente em diversas doenas
cardiovasculares, uma
condio patolgica caracterizada pelo desbalano entre a liberao de
fatores relaxantes
24
derivados do endotlio (EDRFs) o xido ntrico, a prostaciclina e o
fator hiperpolarizante
derivado do endotlio e de fatores contrteis derivados do
endotlio (EDCFs) endotelina,
as prostaglandinas, a angiotensina II e as espcies reativas do
oxignio (Davel et al., 2011).
Em humanos, Omori e colaboradores (2002) demonstraram que a
administrao de
cerivastatina, em uma nica dose, capaz de aumentar a
responsividade endotelial em
humanos saudveis, sugerindo um efeito direto nos vasos
independentemente de diminuir os
lipdios. Adicionalmente, em culturas de clulas endoteliais, a
incubao com cerivastatina
por 24 horas aumenta a biodisponibilidade de xido ntrico
(Berkels et al., 2003).
Em ratos portadores de diabetes induzida por estreptozotocina, a
disfuno endotelial
presente no leito mesentrico foi atenuada aps a exposio aguda
com lovastatina (10 M,
por 20 minutos). Esse efeito foi mediado pelo xido ntrico, uma
vez que foi bloqueado pela
administrao de inibidor no-seletivo da sintase de xido ntrico
(Fatehi-Hassanabad et al.,
2006). Alm disso, a administrao aguda de estatinas ao banho de
rgos produziu
relaxamento vascular em artrias de condutncia e de resistncia
provenientes de ratos Wistar
e SHR, tanto por sua ao no msculo liso vascular como no endotlio
(Alvarez De
Sotomayor et al., 2000; Bravo et al., 1998; Perez-Guerrero et
al., 2000). Os estudos
demonstraram que o relaxamento dependente do endotlio induzido
pela sinvastatina envolve
um aumento da biodisponibilidade de xido ntrico por mecanismo
sensvel a superxido
dismutase e relacionado sntese de produtos vasodilatadores
derivados da ciclooxigenase
(COX) (Alvarez De Sotomayor et al., 2000).
Ainda no que se refere aos efeitos da sinvastatina, Rossoni e
colaboradores (2011)
demonstraram que sua administrao aguda (1 M, durante 2 horas) em
artrias mesentricas
de resistncia de ratos diminui a vasoconstrio induzida por
U46619, anlogo do
tromboxano A2. A sinvastatina, nessa condio, aumentou a sntese
de NO, via aumento da
fosforilao da eNOS por meio da ativao da protena quinase ativada
por AMP (AMPK).
Alm da ativao da AMPK, outros estudos demonstram que o
tratamento agudo com estatina
em clulas endoteliais tambm capaz de ativar a fosforilao da eNOS
por meio de protena
quinase A (PKA) e Akt (Harris et al., 2004; Sun et al.,
2006).
Portanto, considerando a literatura, pode-se dizer que as
estatinas agem no sistema
vascular, melhorando a disfuno endotelial nas doenas
cardiovasculares, alm de terem
aes benficas em modelos de isquemia e reperfuso de rgos.
Entretanto, pouco se sabe
sobre as alteraes vasculares na iIR, e no se conhece em que
extenso os benefcios das
estatinas na iIR so devidos a ajustes vasculares.
25
Assim, visto que as alteraes vasculares podem contribuir para a
gravidade da iIR,
condio com altas taxas de mortalidade, o presente estudo buscou
elucidar as alteraes
vasculares presentes nessa patologia e avaliar os efeitos da
administrao aguda de
sinvastatina nas alteraes vasculares presentes na iIR e, dessa
forma esclarecer se os
benefcios da sinvastatina, descritos na iIR, so devidos a
melhoras nos ajustes vasculares.
Portanto, a hiptese deste estudo de que existam alteraes
vasculares na iIR e que estas
possam ser revertidas pela administrao aguda de sinvastatina, de
forma a melhorar o
prognstico da doena.
26
2 OBJETIVOS
Tendo em vista a escassez de informaes sobre o papel da
reatividade vascular nas
alteraes locais desencadeadas pela isquemia e reperfuso
intestinal (iIR), bem como dos
mecanismos pelos quais a iIR induz modificaes patolgicas srias
em rgos distantes do
stio da isquemia, especialmente o pulmo, este estudo teve por
objetivo caracterizar a
reatividade vascular nos leitos mesentrico e pulmonar aps a iIR.
Adicionalmente, tendo sido
considerados os efeitos benficos da sinvastatina em doenas
cardiovasculares, este estudo
buscou avaliar o efeito da sinvastatina sobre os ajustes da
reatividade vascular aps a iIR.
27
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (280-340 g), com
aproximadamente dois
meses e meio de idade, provenientes do biotrio de criao Dra Lor
Cury do Departamento de
Fisiologia e Biofsica do Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo. Os
animais foram mantidos em gaiolas ventiladas sob condies
controle de temperatura e ciclo
claro-escuro de 12 horas, tendo livre acesso gua e alimentao no
biotrio de
experimentao animal do Departamento de Fisiologia e Biofsica,
ICB/USP, at que
atingissem a idade necessria para realizao dos experimentos.
Os presentes protocolos foram aprovados pela Comisso de tica do
Instituto de
Cincias Biomdicas da USP (Protocolo registrado sob n 018 fls. 83
do livro 02).
3.2 Obteno dos modelos experimentais
Em um primeiro momento, para caracterizao da reatividade
vascular na isquemia, os
animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos
experimentais: animais submetidos ao
procedimento isquemia e reperfuso intestinal (IR) e animais
falso operado (SHAM).
Para obteno dos modelos experimentais os animais foram
anestesiados com uma
mistura contendo ketamina, xilazina e acetopromazina (64,9; 3,20
e 0,78 mg/kg,
respectivamente, i.p.). Aps a confirmao do plano anestsico, o
abdmen foi submetido a
uma laparotomia na linha Alba e a artria mesentrica superior foi
exposta e ocluda com o
auxlio de um clampe para microcirurgia. Depois de 45 minutos de
ocluso (perodo de
isquemia), o clampe foi removido, a parede abdominal foi
suturada e a perfuso intestinal foi
restabelecida por um perodo de 2 horas (perodo de reperfuso),
conforme utilizado por
Cavriani e colaboradores (2004).
Cabe ressaltar que os animais SHAM foram submetidos aos mesmos
procedimentos
experimentais, exceto pela ocluso da artria mesentrica
superior.
3.2.1 Tratamento com sinvastatina
Em um sub-grupo de animais foi realizado gavagem, 1 hora antes
da induo anestsica
para realizao do procedimento cirrgico de isquemia e reperfuso
intestinal.
28
A sinvastatina foi administrada na dose de 20 mg/kg, via oral. A
escolha dessa dose, foi
realizada baseada no trabalho de Zhang e colaboradores (2010),
que analisam a
farmacocintica da sinvastatina (20 mg/kg, v.o.), em ratos, e
observaram que a concentrao
plasmtica mxima da sinvastatina atingida com aproximadamente 48
minutos ps-
administrao.
O tratamento com sinvastatina foi realizado em um grupo de ratos
aleatoriamente
escolhidos. Os animais foram separados em quatro grupos: os que
eram submetidos ao
procedimento de isquemia e reperfuso (conforme descrito acima) e
recebiam
carboxemetilcelulose (IR/ CT); os que eram submetidos IR e
recebiam sinvastatina (IR/
SINV); os que foram submetidos aos mesmos procedimentos
experimentais, exceto pela
ocluso da artria mesentrica superior e recebiam
carboxemetilcelulose (SHAM/ CT); e um
SHAM que recebia a sinvastatina (SHAM/ SINV).
3.3 Estudo de reatividade vascular da artria mesentrica e
pulmonar
Aps as duas horas de reperfuso, os ratos foram novamente
anestesiados, como
descrito acima, mortos e exsanguinados. A artria mesentrica
superior e o pulmo foram
cuidadosamente removidos e imersos em uma placa de Petri
contendo soluo de Krebs-
Henseleit (composio (em mM): NaCl 118,4; KCl 4,7; NaHCO3 25;
CaCl 2,5; glicose 11;
MgSO4 H2O 1,2; KH2PO4 2H2O 1,2 e EDTA 0,01); gaseificado com
mistura carbognica
(95% de O2 e 5% de CO2), mantendo pH estvel de 7,4. Em seguida,
as artrias mesentrica
superior e pulmonar foram dissecadas e limpas de tecido
conectivo.
Para os experimentos de reatividade vascular, as artrias foram
divididas em segmentos
de 2-3 mm de comprimento denominados anis vasculares. Em alguns
anis, a camada
endotelial foi removida mecanicamente atravs do uso de fios
metlicos.
Para obteno do registro de tenso isomtrica, cada anel vascular
foi montado em um
sistema para rgos isolados. As cubas continham 5 mL de soluo de
Krebs-Henseleit
aquecida a 37 C, continuamente gaseificada com mistura
carbognica, mantendo o pH
estvel em 7,4. Dois fios metlicos foram passados atravs do lmen
das artrias. Um fio
metlico foi fixado parede do banho e o outro conectado
verticalmente a um transdutor de
tenso isomtrica (Letica TRI 210, Barcelona, Espanha). A tenso
isomtrica foi registrada
por meio de um transdutor de fora, o qual estava conectado a um
pr-amplificador e a um
sistema de aquisio de dados (Biopac Systems, Santa Barbara,
California) e esse, a um
29
computador. Os anis foram submetidos a uma tenso de repouso de
0,5 g e essa tenso
reajustada a cada 15 minutos, durante os 45 minutos de
estabilizao.
3.4 Protocolos experimentais
3.4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio
(KCl)
Aps 45 minutos de estabilizao, foi administrado KCl (75 mM) para
comprovar a
viabilidade funcional de todas as artrias estudadas. Assim, os
anis que contraram menos
que 0,5 g, foram descartados. Aps 30 minutos de estabilizao,
novamente foi administrado
KCl (75 mM) e foram aguardados aproximadamente 30 minutos at que
fosse atingido a
estabilizao da resposta contrtil. A resposta mxima induzida pelo
KCl foi considerada
100% da resposta contrtil do anel vascular.
3.4.2 Avaliao do relaxamento
3.4.2.1 Avaliao do relaxamento dependente do endotlio
Depois da avaliao da resposta contrtil ao KCl 75 mM, os anis
foram lavados com
soluo de Krebs-Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30
minutos foi aguardada.
Aps essa, os anis de artria pulmonar e mesentrica foram
pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da
resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao
fenilefrina, foram
realizadas curvas concentrao-resposta, cumulativas ao agonista
muscarnico acetilcolina
(10-10
3x10-5
M), para avaliar o relaxamento dependente do endotlio.
3.4.2.2 Avaliao do relaxamento independente do endotlio
Em alguns anis, escolhidos aleatoriamente foi realizado teste da
viabilidade endotelial.
Para realizao desse teste, os anis de artria pulmonar e
mesentrica foram pr-contrados
com uma concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente
40-60 % da resposta
mxima de contrao ao KCl 75mM). Aps a obteno de um plat de
contrao fenilefrina,
a resposta vasodilatadora acetilcolina (10-5
M) foi avaliada para confirmao da presena de
30
endotlio. Se confirmada a presena do endotlio a partir de uma
resposta vasodilatadora
acetilcolina superior a 60%, os anis eram novamente lavados com
soluo de Krebs-
Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30 minutos era
aguardada. Em seguida, os
anis de artria pulmonar e mesentrica foram, novamente,
pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da
resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao curva
concentrao-
resposta ao nitroprussiato de sdio (10-10
-3x10-5
M), doador de xido ntrico, foi realizada
para avaliar o relaxamento independente do endotlio.
3.4.3 Avaliao da resposta contrtil
Aps 30 minutos da confirmao da viabilidade funcional do endotlio
(conforme
descrito acima, item 3.4.2.2), alguns anis de artria pulmonar e
mesentrica com endotlio
integro, foram separados para a realizao de curvas
concentrao-resposta ao agonista
seletivo 1-adrenrgico fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), de maneira cumulativa.
3.4.4 Efeito da retirada do endotlio sobre a resposta
vasodilatadora acetilcolina e sobre a
resposta vasoconstritora fenilefrina
Com a finalidade de avaliar a habilidade do endotlio em modular
a resposta
vasodilatadora acetilcolina e constritora fenilefrina, em alguns
experimentos o endotlio
foi removido mecanicamente por meio do uso de fios metlicos. A
ausncia do endotlio foi
confirmada a partir de uma resposta vasodilatadora acetilcolina
(10-5
M) inferior a 20 % da
resposta fenilefrina, a partir dessa confirmao, foi construda as
curvas concentrao
resposta cumulativas acetilcolina (10-10
3x10-5
M) ou fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), tanto
em anis de artria pulmonar, quanto em anis de artria
mesentrica.
3.4.5 Efeito do bloqueio da sntese de xido ntrico sobre a
resposta vasodilatadora
acetilcolina e sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
Diante dos resultados obtidos com as curvas concentrao-resposta
acetilcolina e
fenilefrina, com e sem endotlio, optou-se por realizar os
protocolos seguintes somente nos
anis de artria pulmonar.
31
Assim, para avaliar a funo do xido ntrico na modulao da resposta
vasodilatadora
acetilcolina (10-10
3x10-5
M) e constritora fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), curva concentrao-
resposta a estes agonistas foram realizadas em anis pr-incubados
durante 30 minutos com
Ng-Nitroarginina Metil ster (L-NAME 100 M), inibidor no seletivo
da NOS.
Para avaliar a funo do xido ntrico sintetizado pela sintase de
xido ntrico induzvel
(iNOS) na modulao da resposta vasodilatadora acetilcolina
(10-10
3x10-5
M) e constritora
fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), curva concentrao-resposta a estes agonistas foram
realizadas
em anis pr-incubados durante 40 minutos com
N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine
(1400W, 1 M) (Chiao et al., 2008).
3.5 Protocolos experimentais aps o tratamento com
sinvastatina
Assim, a avaliao dos efeitos da sinvastatina foi realizada
atravs da avaliao da
resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio, KCl (75 mM), o
qual foi administrado 45
minutos aps estabilizao para comprovar a viabilidade funcional
de todos os anis de artria
pulmonar. Dessa forma, os anis que contraram menos que 0,5 g,
foram descartados. Aps 30
minutos de estabilizao, novamente foi administrado KCl (75 mM) e
foram aguardados
aproximadamente 30 minutos at que fosse atingido a estabilizao
da resposta contrtil. A
resposta mxima induzida pelo KCl foi considerada 100% da
resposta contrtil do anel
vascular.
Depois da avaliao da resposta contrtil ao KCl 75 mM, os anis
foram lavados com
soluo de Krebs-Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30
minutos foi aguardada.
Aps essa, os anis de artria pulmonar foram pr-contrados com uma
concentrao
submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta
mxima de contrao ao
KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao fenilefrina,
foram realizadas curvas
concentrao-resposta, cumulativas ao agonista muscarnico
acetilcolina (10-10
3x10-5
M),
para avaliar o relaxamento dependente do endotlio.
Em alguns anis, escolhidos aleatoriamente foi realizado teste da
viabilidade endotelial.
Para realizao desse teste, os anis de artria pulmonar foram
pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da
resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao
fenilefrina, a resposta
vasodilatadora acetilcolina (10-5
M) foi avaliada para confirmao da presena de endotlio.
Se confirmada a presena do endotlio a partir de uma resposta
vasodilatadora acetilcolina
32
superior a 60%, os anis eram novamente lavados com soluo de
Krebs-Heinseleit e, em
seguida, uma estabilizao de 30 minutos era aguardada. Em
seguida, os anis de artria
pulmonar foram, novamente, pr-contrados com uma concentrao
submxima de fenilefrina
(aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de contrao ao KCl 75
mM). Aps a
obteno de um plat de contrao curva concentrao-resposta ao
nitroprussiato de sdio
(10-10
-3x10-5
M), doador de xido ntrico, foi realizada para avaliar o
relaxamento
independente do endotlio.
A reposta contrtil foi avaliada em alguns anis, escolhidos
aleatoriamente, aps 30
minutos da confirmao da viabilidade funcional do endotlio
(conforme descrito acima),
anis de artria pulmonar com endotlio integro, foram separados
para a realizao de curvas
concentrao-resposta ao agonista seletivo 1-adrenrgico
fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), de
maneira cumulativa.
3.6 Expresso dos dados e anlises estatsticas
Para cada curva concentrao-resposta foram calculados os valores
de pD2 (-log. EC50)
e resposta mxima (Rmax) utilizando o GraphPad Prism Software
(San Diego, CA, U.S.A).
A anlise estatstica dos resultados foi realizada por Teste-t ou
anlise de varincia
(ANOVA), uma via ou duas vias, medidas repetidas ou
completamente randomizadas, de
acordo com o desenho experimental de cada protocolo. Quando a
ANOVA apresentou
significncia estatstica, o teste post-hoc de Bonferroni foi
aplicado (GraphPad Prism
Software, San Diego, CA, E.U.A). Os resultados foram
considerados estatisticamente
significantes para valores de p
33
Para o tratamento com sinvastatina, a medicao foi comprada na
forma comercial, do
laboratrio Sandoz. A medicao foi macerada e suspensa em
carboximetilcelulose.
34
4 RESULTADOS
Na primeira parte da sesso resultados (itens de 4.1 a 4.3) sero
descritas as
caractersticas encontradas na reatividade vascular dos anis de
artria mesentrica superior e
pulmonar, aps a isquemia e reperfuso intestinal.
4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio
(KCl)
A resposta contrtil induzida pelo cloreto de potssio (75mM) no
diferiu entre os
grupos SHAM e IR nem nos anis de artria mesentrica superior nem
de artria pulmonar
(Tabela 1).
Tabela 1 - Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl)
nos anis de artria
mesentrica superior (Mesentrica) e nos anis de artria pulmonar
(Pulmonar) na
presena de endotlio preservado dos animais SHAM e IR.
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada
Teste-t.
Mesentrica
Pulmonar
SHAM IR SHAM IR
KCl 1,47 0,15 g (12) 1,42 0,12 g (14) 0,70 0,02 g (31) 0,70 0,03
g (36)
35
4.2 Respostas vasodilatadora dependente e independente do
endotlio
Os valores do plat de pr-contrao fenilefrina antes das curvas
concentrao-
resposta acetilcolina e ao nitroprussiato de sdio nos anis de
artria mesentrica superior e
artria pulmonar com endotlio preservado, provenientes de animais
dos grupos SHAM e IR,
esto representados na Tabela 2.
Tanto nos anis de artria mesentrica superior quanto nos de
artria pulmonar dos
animais SHAM e IR no foram observadas diferenas significativas
entre os grupos, na pr-
contrao fenilefrina antes da curva-concentrao resposta
acetilcolina ou ao
nitroprussiato de sdio, (Tabela 2).
Tabela 2 - Valores da porcentagem de pr-contrao fenilefrina em
relao contrao ao
cloreto de potssio antes das curvas concentrao-resposta
acetilcolina (ACh) ou ao
nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria mesentrica
superior (Mesentrica)
e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio preservado dos
animais SHAM e IR.
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1-via.
Mesentrica
Pulmonar
Pr-contrao Pr-contrao
NPS ACh NPS ACh
SHAM 55,1 3,32% (07) 40,4 4,70 % (05) 50,9 7,69% (05) 52,8 3,10
% (13)
IR 47,7 4,44% (08) 55,0 7,77 % (06)
54,3 9,12% (07) 52,0 3,32 % (18)
36
Na figura 1 est representada as curvas-concentrao resposta
acetilcolina nos anis
de artria mesentrica superior e artria pulmonar dos animais dos
grupos SHAM e IR. Em
ambas as artrias estudadas, de ambos os grupos a acetilcolina
induziu relaxamento na
dependncia da concentrao utilizada (Figura 1A e B).
No foram observadas diferenas significativas entre as curvas
concentrao-resposta
acetilcolina realizadas nas artrias mesentrica superior dos
grupos SHAM e IR (Figura
1A). J as artrias pulmonares do grupo IR apresentaram uma reduo
na resposta
vasodilatadora induzida pela acetilcolina quando comparada ao
grupo SHAM (Figura 1B e
Tabela 3).
Figura 1 - Curva concentrao-resposta acetilcolina
A) Mesentrica B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis com
endotlio preservado de artria
mesentrica superior (A) e de artria pulmonar (B) de ratos
submetidos a iIR e falso operados
(SHAM). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados
foram expressos como
mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias:* P
37
A remoo mecnica do endotlio nos anis de artrias mesentrica
superior e pulmonar,
de ambos os grupos estudados, reduziu a resposta de relaxamento
induzida pela acetilcolina
(Figura 2A e B). Alm disso, a remoo do endotlio nos anis de
artria pulmonar aboliu a
diferena na resposta mxima acetilcolina observada entre os
grupos SHAM e IR (Figura
2B e Tabela 3).
Figura 2 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis com
endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-)
A) Mesentrica B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis com
endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-) de artria mesentrica superior (A) e de artria
pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e
falso operados (SHAM). O n representa o nmero de animais
utilizados. Resultados foram expressos
como mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias:* P
38
Tabela 3 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima
(Rmax) obtidos por meio de curvas
concentrao-reposta acetilcolina nos anis de artria mesentrica
superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio
preservado (E+) e sem
(E-) endotlio dos animais SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
Mesentrica
E+
7,41 0,10
98,0 2,2 % (05)
7,26 0,15
91,1 3,6 % (06)
E- - 15,9 3,0 % (05) # - 13,8 3,1 % (05)
#
Pulmonar
E+
7,11 0,12
88,1 1,4 % (13)
6,94 0,11
77,7 2,4 % (18)*
E- - 9,1 4,9 % (04) # - 2,2 6,7 % (04)
#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1- via: * P
39
Similar ao observado no relaxamento acetilcolina, o
nitroprussiato de sdio (NPS)
promoveu um relaxamento de modo dependente da concentrao
utilizada, tanto nos anis de
artria mesentrica superior, quanto nos anis de artria pulmonar
de ambos os grupos
estudados (Figura 3A e 3B). Em ambas as artrias estudadas, no
foram observadas diferenas
significativas no relaxamento induzido pelo nitroprussiato de
sdio entre os grupos SHAM e
IR (Artria pulmonar: SHAM: Rmax.: 95,7 2,26, pD2: 7,92 0,16 ;
IR: Rmax.: 95,8 4,7,
pD2: 8,00 0,21 / Artria mesentrica: SHAM: Rmax.: 100,4 0,8, pD2:
7,93 0,09 ; IR:
Rmax.: 103,8 2,4, pD2: 8,21 0,07 ) (Figura 3).
Figura 3 - Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de
sdio
Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio (NPS) em
anis de artria mesentrica
superior (A) e de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR
e falso operados (SHAM). O
n representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram
expressos como mdiaEPM.
Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias.
A) Mesentrica B) Pulmonar
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-80
-60
-40
-20
0
IR (N=08)
SHAM (N=07)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-80
-60
-40
-20
0
SHAM (n=05)
IR (n=07)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
40
4.3 Avaliao da resposta contrtil
Na figura 4 est representado a curva-concentrao resposta
fenilefrina nos anis de
artria mesentrica superior e nos anis de artria pulmonar dos
animais dos grupos SHAM e
IR. A fenilefrina aumentou o tnus na dependncia da concentrao
utilizada tanto na artria
mesentrica superior quanto na artria pulmonar de ratos SHAM e
com IR da artria
mesentrica (Figura 4A e B).
Nos anis de artria mesentrica superior no foram observadas
diferenas significativas
na resposta de contrao mediada pela fenilefrina entre os grupos
SHAM e IR (Figura 4A e
Tabela 4). Porm, nos anis de artria pulmonar provenientes de
animais IR a resposta
contrtil fenilefrina foi de menor magnitude quando comparada aos
anis de artria
pulmonar dos animais SHAM (Figura 4B e Tabela 4).
Em ambos os grupos, remoo do endotlio tanto dos anis de artria
mesentrica superior
como os de artria pulmonar deslocou a curva concentrao resposta
fenilefrina para a
esquerda (Figura 5). Esse deslocamento da curva concentrao
resposta fenilefrina nos anis
de artria mesentrica superior proveniente dos animais SHAM e IR
foi de magnitude similar,
no induzindo alteraes significativas entre os grupos (Figura 5A
e Tabela 4). Por sua vez, a
remoo do endotlio aboliu a reduo da resposta contrtil
fenilefrina observada nos anis
de artria pulmonar dos animais submetidos a iIR quando comparado
aos SHAM (Figura 5B e
Tabela 5). Assim, a remoo do endotlio nos anis de artria
pulmonar bloqueou a diferena
que existia entre os grupos.
41
Figura 4 - Curva concentrao-resposta fenilefrina
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis com endotlio
de artria mesentrica
superior (A) e de anis de artria pulmonar (B) de ratos
submetidos a iIR e falso operados
(SHAM). Os resultados representam a % de contrao em resposta ao
KCl. O n representa o
nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como
mdia EPM. Anlise
estatstica utilizada ANOVA 2 vias: * P
42
Figura 5 - Curva concentrao-resposta fenilefrina em anis com
endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-)
A) Mesentrica
B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis com endotlio
preservado (E+) e sem
endotlio (E-) de artria mesentrica (A) e de artria pulmonar (B)
de ratos submetidos a iIR e falso
operados (SHAM). Os resultados representam a % de contrao em
resposta ao KCl. O n
representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram
expressos como mdia EPM.
Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias: * P
43
Tabela 4 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima
(Rmax) obtidos por meio de curvas
concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de artrias
mesentrica superior
e de artria pulmonar com (E+) e sem (E-) endotlio dos animais
SHAM e IR.
SHAM
IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
Mesentrica
E+
5,92 0,25
105,6 5,7 % (05)
5,65 0,39
104,2 4,4 % (05)
E- 6,52 0,18 146,9 7,4 % (05)# 6,40 0,14 150,8 10,8 % (04)
#
Pulmonar
E+
7,44 0,07
73,9 3,4 % (21)
7,22 0,05
55,8 3,3 % (22)*
E- 7,72 0,13 103,0 3,0 % (07)# 7,74 0,06
# 105,7 9,7 % (06)
#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1-via: * P
44
4.4 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta
vasodilatadora
acetilcolina
Como j referido anteriormente, a partir deste momento focou-se o
estudo somente na
artria pulmonar, pois os resultados observados nas artrias
pulmonares foram mais
expressivos que os observados nos anis de artria mesentrica
superior. Alm disso,
conhecido que o pulmo o principal orgo de choque na iIR
(Cavriani 2004; Koksoy et al.,
2001; Kuzu et al., 2002; Mitsuoka et al., 1999).
Para avaliar o papel do xido ntrico sobre a resposta de
relaxamento em artrias
pulmonares dos ratos SHAM e IR, os anis de artrias com endotlio
preservado foram
previamente incubados com L-NAME (100 M). Nas figuras 6A e B
esto representadas as
curvas concentrao-resposta acetilcolina, na presena de L-NAME,
nos anis de artria
pulmonar dos animais dos grupos SHAM e IR; respectivamente. Nos
anis de artria
pulmonar de ambos os grupos experimentais, a incubao com L-NAME
inibiu o relaxamento
mediado pela acetilcolina, alm de abolir a diferena observada
entre os grupos estudados
(Figura 6A e B e Tabela 5).
Para avaliar a modulao da iNOS sobre a resposta acetilcolina, os
anis de artria
pulmonar com endotlio preservado foram incubados com 1400W (1 M)
durante 40
minutos. Nas figuras 6C e D esto representadas a curvas
concentrao-resposta
acetilcolina, na presena de 1400W, nos anis de artria pulmonar
dos animais dos grupos
SHAM e IR, respectivamente. A incubao com 1400W no alterou a
resposta vasodilatadora
acetilcolina nos anis de artria pulmonar do grupo SHAM (Figura 6
C e Tabela 5). Porm,
nos anis de artria pulmonar do grupo IR a incubao com 1400W
aumentou a resposta
mxima acetilcolina sem modificar a pD2 a esse agonista (Figura
6D e Tabela 5).
importante ressaltar que na presena de 1400W, no se observou
diferena na resposta
vasodilatadora dependente do endotlio entre os anis de artria
pulmonar provenientes dos
animais SHAM e IR (Tabela 5).
45
Figura 6 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis de
artria pulmonar pr-
incubados com L-NAME ou com 1400W
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis de artria
pulmonar de ratos
submetidos a iIR (IR, direita) e falsos operados (SHAM,
esquerda). Curva realizada em anis
de artria pulmonar com endotlio preservado (E+), pr-incubados
com inibidor da sintase de
xido ntrico L-NAME (LN, 100 M) (A e B) ou com inibidor da
sintase de xido ntrico
induzvel (1400W, 1 M) (C e D). O n representa o nmero de animais
utilizados. Resultados
foram expressos como mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
2 vias: # P
46
Tabela 5 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima
(Rmax) obtidos por
meio de curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) nos
anis de artria pulmonar com endotlio (E+), incubados com L-
NAME (LN, 100 M) ou com 1400W (1400W,1 M) dos animais
SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
E+
7,11 0,12 88,1 1,4 % (13) 6,94 0,11 77,7 2,4 % (18)*
LN - 1,9 2,2 % (09)# - 3,7 3,2 % (09)
#
1400W 7,26 0,08 82,0 2,30 % (05) 7,13 0,11 89,8 2,07 % (06)#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre
parnteses. Os valores esto expressos como mdia EPM. Anlise
estatstica
utilizada ANOVA 1-via: * P
47
4.5 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta
vasoconstritora
fenilefrina
Para avaliar o papel do xido ntrico sobre a resposta de contrtil
induzida pela fenilefrina
em artrias pulmonares dos ratos SHAM e IR, os anis de artrias
com endotlio preservado
foram previamente incubados com L-NAME (100 M). Nas figuras 7A e
B esto
representadas as curvas concentrao-resposta fenilefrina, na
presena de L-NAME, nos
anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM e IR,
respectivamente. A incubao
dos anis de artria pulmonar com L-NAME desviou a curva
concentrao-resposta
fenilefrina para a esquerda (Figura 7A e B). No grupo SHAM, a
pr-incubao com L-
NAME, aumentou somente a resposta mxima a fenilefrina, sem
apresentar diferena
significativa na pD2 (Figura 7A e Tabela 6). Porm, no grupo IR a
incubao com L-NAME
aumentou tanto a pD2 quanto a resposta mxima fenilefrina (Figura
7B e Tabela 6). Alm
disso, como observado na resposta de relaxamento acetilcolina, a
incubao dos anis de
artria pulmonar com L-NAME aboliu a diferena na resposta
contrtil fenilefrina entre os
grupos SHAM e IR (Figura 7A e B e Tabela 6).
Para avaliar a modulao da iNOS sobre a resposta contrtil
fenilefrina, os anis de
artria pulmonar com endotlio intacto foram incubados com 1400W
(1400W,1 M) durante
40 minutos. Nas figuras 7C e D esto representadas as curvas
concentrao-resposta
fenilefrina, na presena de 1400W, nos anis de artria pulmonar
dos animais dos grupos
SHAM e IR, respectivamente. A incubao com 1400W no alterou a
resposta contrtil
fenilefrina nos anis de artria pulmonar do grupo SHAM (Figura 7C
e Tabela 6). J nos anis
de artria pulmonar do grupo IR, a incubao com 1400W desviou a
curva concentrao-
resposta fenilefrina para esquerda, aumentando somente a
resposta mxima a esse agonista
contrtil (Figura 7D e Tabela 6). importante ressaltar que assim
como na resposta
acetilcolina, na presena de 1400W no se observou diferena entre
as artrias proveniente
dos animais SHAM e IR (Figura 7C e D e Tabela 6).
48
Figura 7 - Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de
artria pulmonar de ratos SHAM e
IR pr-incubados com L-NAME ou com 1400W
SHAM
IR
A) B)
C) D)
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria
pulmonar de ratos submetidos
a iIR (IR, direita) e falsos operados (SHAM, esquerda). Curva
realizada em anis de artria
pulmonar com endotlio (E+), pr-incubados com inibidor da sintase
de xido ntrico L-NAME
(LN, 100 M) (A e B) ou com inibidor da sintase de xido ntrico
induzvel (1400W, 1 M) (C e
D). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados
foram expressos como
mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias: # P
49
Tabela 6 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima
(Rmax) obtidos por
meio de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis
de
artria pulmonar com (E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M)
ou incubados com 1400W (1400W,1 M) dos animais SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
E+ 7,44 0,07 73,9 3,41 % (21) 7,22 0,05 55,8 3,29 % (22)*
LN 7,73 0,09 103,5 2,8 % (11)# 7,67 0,12
# 109,5 3,89 % (09)
#
1400W 7,46 0,07 76,0 3,35 % (09) 7,47 0,05 71,5 4,96 % (09)#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses.
Os valores esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica
utilizada ANOVA
1-via: * P
50
4.6 Efeito do tratamento com sinvastatina sobre a reatividade
vascular
Os valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (75mM) dos
anis de artria
pulmonar, provenientes de animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/
SINV, IR/ CT e IR/
SINV esto representados na tabela 7. Nos quatro grupos estudados
no houve diferenas
significativas na resposta contrtil mxima induzida pelo cloreto
de potssio, ou seja o
tratamento com sinvastatina no alterou a resposta contrtil
induzida pelo cloreto de potssio
(Tabela 7).
Os valores de plat da pr-contrao fenilefrina antes das curvas
concentrao-
resposta acetilcolina ou ao nitroprussiato de sdio, nos anis de
artria pulmonar,
provenientes de animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/ CT
e IR/ SINV esto
representados na tabela 8. Assim como a resposta ao KCl 75mM, no
foram observadas
diferenas significativas nos quatro grupos estudados entre a
pr-contrao fenilefrina antes
das curvas concentrao-resposta acetilcolina e nem ao
nitroprussiato de sdio (Tabela).
Na figura 8 esto representados as curvas concentrao-resposta
acetilcolina nos
anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/
SINV, IR/ CT e IR/
SINV. Em todos os grupos avaliados, a acetilcolina induziu
relaxamento na dependncia da
concentrao utilizada. Como demonstrado anteriormente, a iIR
reduziu o relaxamento
acetilcolina quando comparado ao grupo SHAM (Tabela 9). O
tratamento com sinvastatina
no alterou resposta acetilcolina no grupo SHAM, sendo que no
foram observadas
diferenas significativas entre as curvas concentrao-resposta
acetilcolina realizadas na
artria pulmonar do grupo SHAM/ CT e SHAM/ SINV (Figura 8A e
Tabela 9). J nas artrias
pulmonares do grupo IR a sinvastatina preveniu a reduo na
resposta vasodilatadora induzida
pela acetilcolina (Figura 8B e Tabela 9). Sendo que a artria
pulmonar do grupo IR/ SINV
teve uma maior resposta mxima induzida pela acetilcolina quando
comparadas ao grupo
IR/ CT e igual aos grupos SHAM/ CT e SHAM/ SINV (Tabela 9).
Na figura 9 esto representadas as curvas concentrao-resposta ao
nitroprussiato de
sdio nos anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/
CT, SHAM/ SINV, IR/
CT e IR/ SINV. Similar ao observado no relaxamento acetilcolina,
o nitroprussiato de sdio
(NPS) promoveu um relaxamento de modo dependente da concentrao
utilizada em todos os
51
grupos estudados (Figura 9A e B). Porm, no foram observadas
diferenas significativas no
relaxamento induzido pelo NPS entre os grupos avaliados (Figura
9A e B e Tabela 9).
Na figura 10 esto representadas as curvas concentrao-resposta
fenilefrina nos anis
de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV,
IR/ CT e IR/ SINV.
A fenilefrina aumentou o tnus arterial na dependncia da
concentrao utilizada em todos os
grupos estudados (Figura 10A e B). Como demonstrado
anteriormente, a iIR reduziu
resposta de contrao induzida pela fenilefrina nos anis de artria
pulmonar quando
comparada cirurgia fictcia (SHAM) (Tabela 9). O tratamento com
sinvastatina no alterou a
resposta contrtil induzida pela fenilefrina nos anis de artria
pulmonar do grupo SHAM
(Figura 10). Porm, o mesmo aumentou a resposta contrtil induzida
pela fenilefrina nos anis
de artria pulmonar do grupo IR (Figura 10B e Tabela 9). Aps o
tratamento com sinvastatina
no observa-se mais a reduo da contrao induzida pela fenilefrina
entre os grupos SHAM/
SINV e IR/ SINV (Tabela 9).
52
Tabela 7 - Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl,
75mM) nos anis de
artria pulmonar dos animais SHAM e IR, controle (CT) e nos
grupos SHAM e
IR, tratados com sinvastatina (SINV).
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1-via.
Tabela 8 - Valores da porcentagem de contrao fenilefrina em
relao contrao ao cloreto de
potssio antes das curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh)
ou ao nitroprussiato
de sdio (NPS) nos anis de artria pulmonar com endotlio dos
animais SHAM e IR,
controle (CT) e nos grupos SHAM e IR, tratados com sinvastatina
(SINV).
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os valores esto
expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1-via.
SHAM
IR
CT SINV CT SINV
KCl 0,76 0,05 g (09) 0,65 0,04 g (11) 0,63 0,02 g (07) 0,70 0,05
g (08)
Pr-contrao ACh NPS
CT SINV CT SINV
SHAM 47,3 3,09 % (07) 47,6 4,02 % (07) 56,7 3,17 % (05) 42,7
4,51 % (05)
IR 46,3 3,46 % (08) 44,5 2,74 % (09) 41,6 6,54 % (05) 44,3 4,20
% (07)
53
Figura 8 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta acetilcolina
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis de artria
pulmonar provenientes
de animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou com
sinvastatina (SHAM/ SINV)
(A) e animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou com
sinvastatina (IR/ SINV) (B). O
nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre
parnteses. Os
resultados so expressos como mdia EPM. Anlise estatstica
utilizada ANOVA 2-vias.
A) SHAM B) IR
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
SHAM/ SINV (N=07)
SHAM/ CT (N=07)
ACh (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
IR/ CT (N=08)
IR/ SINV (N=09)
ACh (Log M)
% R
ela
xam
en
to
54
Figura 9 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio
A) SHAM B) IR
Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio (NPS) em
anis de artria pulmonar
provenientes de animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou
com sinvastatina
(SHAM/ SINV) (A) e animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou
com sinvastatina (IR/
SINV) (B). O nmero de animais analisados em cada grupo
experimental est entre
parnteses. Os resultados so expressos como mdia EPM. Anlise
estatstica utilizada
ANOVA 2-vias.
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
SHAM/ CT (N=05)
SHAM/ SINV (N=05)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
IR/ SINV (N= 07)
IR/ CT (N=05)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
55
Figura 10 - Efeito da sinvastatina sobre a curva
concentrao-resposta fenilefrina
SHAM IR
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria
pulmonar provenientes de
animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou com sinvastatina
(SHAM/ SINV) (A) e
animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou com sinvastatina (IR/
SINV) (B). O nmero de
animais analisados em cada grupo experimental est entre
parnteses. Os resultados so
expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
2-vias: # P
56
Tabela 9- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax)
obtidos por meio de curvas concentrao-reposta acetilcolina (ACh),
ao
nitroprussiato de sdio (NPS) e fenilefrina (FE) em anis de
artria pulmonar dos animais SHAM, SHAM tratado com 20mg/kg de
sinvastatina (SHAM SINV), IR e IR tratado com 20mg/kg de
sinvastatina (IR SINV)
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est
entre parnteses. Os resultados so expressos como mdia EPM.
ANOVA
1-via: *P
57
5 DISCUSSO
Apesar de continuamente e progressivamente a medicina apresentar
melhora de
recursos diagnsticos e tratamentos inovadores, a isquemia
intestinal ainda uma
doena com alta taxa de mortalidade. Alm disso, pode ter como
consequncia a SDRA
e a MODS, sendo que a MODS a principal causa de morte em
pacientes crticos.
Esses fatos justificam a importncia da busca pela compreenso dos
mecanismos que
atuam na isquemia intestinal, bem como de sua teraputica eficaz.
Como detalhado na
introduo, o sistema linftico uma das vias por meio das quais a
iIR promove
alteraes em rgos-alvo, como o pulmo (Cavriani et al., 2005;
Deitch, 2010; Deitch,
2001; Magnotti et al., 1998; Magnotti et al., 2005). Porm, o
conhecimento das
alteraes do sistema vascular e de sua contribuio para o
comprometimento de rgos
e desfechos indesejveis da iIR permanece insuficiente.
No presente estudo, a primeira resposta obtida foi a constatao
de que os
ajustes de reatividade vascular observados na iIR ocorrem na
dependncia do leito
vascular estudado. Surpreendentemente, na artria mesentrica
superior a iIR no
alterou a reatividade vascular dependente e independente do
endotlio nem a agentes
vasodilatadores, nem ao agonista seletivo 1-adrenrgico,
fenilefrina. J na artria
pulmonar, a iIR causou disfuno endotelial e hiporreatividade
fenilefrina. O xido
ntrico produzido por meio da ativao da iNOS parece ter papel
crucial nos ajustes na
artria pulmonar, os quais esto portanto associados com alteraes
na modulao
nitrrgica. Adicionalmente, confirmando a hiptese da presente
dissertao, o pr-
tratamento agudo com sinvastatina foi capaz de prevenir as
alteraes de reatividade
vascular provocadas pela iIR.
Sabe-se que o endotlio vascular constitui a monocamada celular
interna dos
vasos sangun